CN111678974B - 一种朱墨时序鉴别或辅助鉴别的质谱成像分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种朱墨时序鉴别或辅助鉴别的质谱成像分析方法。该方法可以在保持样品原貌的情况下，对朱墨样本进行微观化学成分分析。基于质谱成像技术的数据化输出结果，朱墨时序判定依据可适当向数据化、可量化转变，避免基于鉴定人思维方式和观察角度互有差别而造成的意见分歧，有利于促进司法鉴定技术的规范化与科学化。同时，朱墨时序质谱成像分析方法的建立增加了文书朱墨时序无损检验方法的种类，提高了朱墨时序检出率，使鉴定结论更为科学可靠。
Description
技术领域
本发明属于检测分析领域，涉及一种朱墨时序鉴别或辅助鉴别的质谱成像分析方法。
背景技术
朱墨时序检验一直是文书司法鉴定实践中的一项重要内容，其中互溶色料朱墨时序的鉴定更是文检领域较难解决的问题。传统的朱墨时序无损检验方法多基于表观形态或立体层次特征分析，互溶色料朱墨样本表观及层次特征不明显或消失，检出率较低。质谱成像(简称MSI)技术是一种结合质谱分析和影像可视化，深入到分子层面的无标记成像技术。它可在无损样品的情况下于样品表面进行多点取样、多维数据获取，实现不同分子的高灵敏度检测，并能够直接提供目标化合物空间分布和分子结构信息。在文书朱墨时序鉴定中应用质谱成像技术，可使检验方式由表观形态深入到物质内部。由于表观形态及立体层次特征不明显，互溶色料朱墨时序检验一直是文件检验领域一个较难解决的问题。基于检测原理，日渐成熟的质谱成像技术可以提供更丰富的微观结构及化学组成信息，有望作为新型检测手段用于互溶色料朱墨时序的检验，并提供更客观的检测结果。
目前关于朱墨时序的分析方法主要包括立体显微镜检验法、三维立体显微镜检验法、荧光显微镜检验法、生物显微镜检验法、文检仪检验法、拉曼技术、交叉点切面镜检法、扫描电子显微镜检验法、粉末吸附法、脱色法及溶压转移法。鉴于检材的唯一性和不可复制性，确保送检材料完整是建立文件检验方法的一个重要着眼点。因此，三维立体显微镜检验法、荧光显微镜检验法作为无损检验方法在实际案件中应用较广泛，但两种常用方法均有一定局限性。当朱墨色料均为油溶性或水溶性时，朱墨色料相互溶解、渗透,交叉处的空间立体层次特征无明显差别，不适于三维立体显微镜的观察鉴别。荧光显微镜法适用于书写压力比较轻、书写色料为水溶性或印文颜色比较浅淡的材料，但鉴于碳能大量吸收红色印迹所发荧光而使不同顺序形成的特征区分不明显，该法不适用于含碳比较多的黑色书写色料形成材料的区分鉴别。
朱墨时序检验是文件检验实务中一项重要问题，随着犯罪手段日渐高科技化、高智能化，文件朱墨时序检验不仅越来越受到重视，而且成为鉴定人员常常遇到却又难以解决的问题，其形成原因多为伪造者、变造者预留印文的空白纸页或盗盖印文，再适时添加所需正文内容。因此，检验文件上字迹与印文形成的先后顺序就成为判断该类文件真伪和相对制成时间的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种朱墨时序鉴别或辅助鉴别的质谱成像分析方法。
AFAI-MSI质谱成像技术具有原位取样，快速无损、直观可视化的特点，可以获得纸质文件上墨迹与印文印迹化学物质成分分布及相互覆盖的关系特征，并能提供一定量化关系的客观数据和信息，有望为朱墨时序的鉴定提供一种新的方法。
本发明提供的鉴别或辅助鉴别印文与字迹先后顺序的方法，包括：
1)制备可用于质谱成像的样品；
2)对步骤1)所得样品进行质谱成像，得到质谱图；
3)将采集的raw格式质谱数据文件转换为质谱像图文件，在质谱像图中根据展现的印文和字迹轮廓进行特征离子选择，提取强度级别接近的印文独有特征离子和字迹独有特征离子，分别进行单独图像重构及交叠图像重构，形成印文特征离子质谱像图和字迹特征离子质谱像图及其叠加像图，再按照如下步骤进行数据处理：
a)对总体质谱成像数据进行空白区域的背景离子扣除，然后设定像素点取样范围，在所述叠加质谱像图中印文和字迹的交叉位点中随机选取若干个交叉点作为待推断点，并在无交叉印文和字迹像图上各选取若干个点作为标准点，分别记为标准点A系列和标准点B系列，并以不同颜色标记所述待推断点和标准点，对同系列的标准点用同一颜色标记；
对所述待推断点和标准点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，采用无监督的PCA统计模式进行PCA聚类分析，若分析结果显示若干推断点聚集，说明样品不同部位交叉点主要物质成分及形成顺序无明显差异；
若样品不同部位交叉点主要物质成分及形成顺序无明显差异，对所述待推断点和标准点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，利用统计学偏最小二乘法判别分析PLS-DA方法，采用有监督的分组模式，根据得分图上所述待推断点与所述标准点A和标准点B的聚类趋向性鉴别印文与字迹先后顺序；
若所述待推断点更趋向于所述标准点A或与所述标准点A有数据交叠，则推断该样品为先签字后盖章；
若所述待推断点更趋向于所述标准点B或与所述标准点B有数据交叠，则推断该样品为先盖章后签字。
上述方法所述步骤1)制备样品的步骤包括：对拟进行印文和签字先后顺序鉴别的印文样品提取后，固定于空白载玻片上，再置于质谱成像平台上。
所述步骤2)中，所用质谱方法为空气动力辅助解析电喷雾离子化质谱成像方法(AFADESI-MSI)；
所用喷雾溶剂为乙腈；
系统参数如下：
喷雾电压为7000V；
传输管电压为0V；
喷雾气压力为0.5MPa；
抽气流速为40L/min；
喷雾溶剂流速为5μL/min；
X轴移动速率为0.2mm/s；
Y轴步长为0.2mm；
喷雾针与传输管距离为3mm；
喷雾针与样品表面距离为4mm；
扫描模式为全扫描模式；
质量范围m/z为100-1000；
极性为正；
最大注入时间为100ms；
AGC目标为5e6 for Full MS；
分辨率为70000；
毛细管温度为350℃；
样品扫描速率为0.2mm/s；
步进距离为0.2mm；
所述步骤3)中，将采集的raw格式质谱数据文件转换为质谱像图文件的步骤包括：将采集的raw格式质谱数据文件转换成cdf格式文件后，导入Massimage1.0软件，生成质谱像图文件。
所述步骤3)数据处理所用软件为MassImager1.0质谱成像数据处理软件；具体为MassImagerTM1.0(科迈恩科技有限公司，北京)质谱成像工作站软件；
所述步骤3)中，所述像素点取样范围为3×3；
在每个交叉点选取质谱数据的像素点平均为9个。
所述方法还包括：所述步骤3)步骤b)中，若所述样品不同部位交叉点主要物质成分和/或形成顺序存在明显差异，则需要在所述叠加质谱像图中印文和字迹的交叉位点中选取其他若干个交叉点作为待推断点，重复所述步骤a)和步骤b)，直至所述步骤b)分析结果显示样品不同部位交叉点(也即待推断点)主要物质成分和/或形成顺序无明显差异。
本发明先后对公安部物证鉴定中心提供的25个印文与字迹组合样品，进行了质谱成像分析，其成像结果见附图。从结果看24个样品中，有23个样品(除3-S7-Xzh-D)的交叉点聚类趋向性与实际结果相符。真实样品的分析结果判断该样品为先签字后盖章样品。
本发明提供的朱墨时序的质谱成像检验可以在保持样品原貌的情况下，对朱墨样本进行微观化学成分分析。基于质谱成像技术的数据化输出结果，朱墨时序判定依据可适当向数据化、可量化转变，避免基于鉴定人思维方式和观察角度互有差别而造成的意见分歧，有利于促进司法鉴定技术的规范化与科学化。同时，朱墨时序质谱成像分析方法的建立增加了文书朱墨时序无损检验方法的种类，提高了朱墨时序检出率，使鉴定结论更为科学可靠。
附图说明
图1为书写和打印墨迹与印章印文混合样品照片；
图2为不同溶剂条件下，朱墨样本交叉部位的质谱成像图；
图3为甲醇和乙腈做溶剂，样品1-S7的质谱成像图结果比较；
图4为样品1_S7_Xzh_D和1_S7_Xzi_D的质谱成像分析结果(2019年4月完成)；
图5为两类样品1-S7(2019.4)交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图6为两类样品1-S7(2019.4)交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图7为样品1_S7_Xzh_D和1_S7_Xzi_D的质谱成像分析结果(2019年10月完成)；
图8为两类样品1-S7(2019.10)交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图9为两类样品1-S7(2019.10)交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图10为样品1_S7_Xzh_L和1_S7_Xzi_L的质谱成像分析结果；
图11为两类样品1-S7-L交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图12为两类样品1-S7-L交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图13为样品1_S8_Xzh_D和1_S8_Xzi_D的质谱成像分析结果；
图14为两类样品1-S8交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图15为两类样品1-S8交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图16为样品1_S9_Xzh_D和1_S9_Xzi_D的质谱成像分析结果；
图17为两类样品1-S9交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图18为两类样品1-S9交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图19为样品3_S7_Xzh_D和3_S7_Xzi_D的质谱成像分析结果；
图20为两类样品3-S7交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图21为两类样品3-S7交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图22为样品3_S8_Xzh_D和3_S8_Xzi_D的质谱成像分析结果；
图23为两类样品3-S8交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图24为两类样品3-S8交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图25为样品3_S9_Xzh_D和3_S9_Xzi_D的质谱成像分析结果；
图26为两类样品3-S9交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图27为两类样品3-S9交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图28为样品PD1_1_Xzh和PD1_1_Xzi的质谱成像分析结果；
图29为两类样品PD1_1交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图30为两类样品PD1_1交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图31为样品PD1_2_Xzh和PD1_2_Xzi的质谱成像分析结果；
图32为两类样品PD1_2交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图33为两类样品PD1_2交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图34为样品PD1_3_Xzh和PD1_3_Xzi的质谱成像分析结果；
图35为两类样品PD1_3交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图36为两类样品PD1_3交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图37为样品PD2_1_Xzh和PD2_1_Xzi的质谱成像分析结果；
图38为两类样品PD2_1交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图39为两类样品PD2_1交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图40为样品PD2_2_Xzh和PD2_2_Xzi的质谱成像分析结果；
图41为两类样品PD2_2交叉点像素数据的PCA统计分析结果
图42为两类样品PD2_2交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果；
图43为样品1999-A2的质谱成像分析结果；
图44为样品1999-A2交叉点像素数据的PCA统计分析结果；
图45为样品1999-A2交叉点质谱图及与邻近取样点像素数据的PLS-DA统计分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、
1实验部分
1.1主要仪器与装置
AFAI-MSI系统：与Q-Orbitrap(QExactive，Thermofisher)质谱仪相兼容的AFAI离子源接口；离子传输管(Length 500mm，OD 4mm，ID 3mm)；气体流量计(0～45L min-1，LZB-10WB，天津流量仪表有限公司)；真空泵管路(0-60L/min，中国医学科学院药物研究所真空抽气系统)；高压电源(-10000～10000V，东文高压电源(天津)股份有限公司)；三维电控平移台(MTS225,北京光学仪器厂,北京,中国)；SC100步进电机控制器(北京北光世纪仪器有限公司，北京)。Longer Pump注射泵(LSP01-2A，保定兰格恒流泵有限公司，中国)；Xcalibur3.0数据处理系统及MassImagerTM1.0(科迈恩科技有限公司，北京)质谱成像工作站软件。
1.2主要材料与试剂
试剂：甲醇：色谱纯(Merck公司，Darmstadt,Germany)，乙腈：色谱纯(Merck公司，Darmstadt,Germany)，实验用水：娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
样品：不同种类、不同品牌型号、不同溶解性能的书写、打印墨迹与印文印迹交叉形成朱墨样品。代表性样品的光学照片见图1。
1.3用于成像分析的朱墨样品的制备
洁净空白载玻片上，粘贴2cm×5cm的双面胶条，与载玻片长度方向同向。从印文所在样品纸张上剪下长5cm，宽8mm的一条，包含印章和签字或打印墨迹，尽可能包含多的交叉点，将其平整粘贴于双面胶条上。
选取另一条由同样印油及签字笔制作，但书写顺序相反的样品，采用相同的处理方式。
将两条样品并排粘贴在载玻片上，样品周围用空白纸覆盖多余的双面胶条，用铅笔画出用于质谱成像的扫描范围，完成样品制作，用于质谱成像分析。
1.4墨迹与印文印迹质谱成像数据的采集
质谱成像实验采用与Q-Orbitrap型质谱仪相兼容的AFAI-MSI系统完成。调节三维样品移动台在X、Y、Z轴的水平位置以及喷雾针的角度，根据背景信号的强度和喷雾斑点的大小，使质谱成像的数据采集处于稳定状态，将粘附印文样品的载玻片固定于移动平台上，调节样品移动台使喷雾斑点与初始扫描点重合，平台设定以0.2mm/s的速度在X轴方向自右向左匀速移动，同时采集质谱数据；在每一行扫描结束后以10mm/s的速度回到同一行的初始点，接着沿Y轴步进0.2mm后；再按照上述步骤开始下一行的扫描分析，循环往复直到完成所有样品区域的扫描。每一行的扫描数据单独保存为一个原始数据文件。AFAI-MSI系统参数及质谱仪数据采集参数设置如下所示：
喷雾电压为7000V；
传输管电压为0V；
喷雾气压力为0.5MPa；
抽气流速为40L/min；
喷雾溶剂流速为5μL/min；
X轴移动速率为0.2mm/s；
Y轴步长为0.2mm；
喷雾针与传输管距离为3mm；
喷雾针与样品表面距离为4mm；
扫描模式为全扫描模式；
质量范围m/z为100-1000；
极性为正；
最大注入时间为100ms；
AGC目标为5e6 for Full MS；
分辨率为70000；
毛细管温度为350℃；
样品扫描速率为0.2mm/s；
步进距离为0.2mm；
1.5质谱成像系统样品解析关键参数优化
质谱成像的样品扫描过程对样品具有破坏性,为了获得纸质样品上笔迹和印章印文的最佳解析效果,同时保证最大程度对样品的原始状态保留,对样品解析结果影响最大的,喷雾溶剂的种类、流速和喷雾气压力进行了优化。
2实验结果
2.1针对纸质样品的质谱成像系统样品解析关键参数优化
AFAI-MSI方法使用敞开式解析电喷雾作为样品解析的方法，为尽可能多从样品表面解析出可离子化的样品，通常采用甲醇或乙腈与水的混合溶剂，在保持喷雾针与样品表面距离为0.7～1mm的范围内，以自制的均匀分布的朱墨样本为考察对象，先后对8种混合喷雾溶剂进行优化：A:乙腈：水＝8:2(V/V)；B:乙腈：异丙醇：水＝4：4：2(V/V)；C:甲醇：异丙醇：水＝4：4：2(V/V)；D:甲醇：水＝5：5(V/V)；E:乙腈：异丙醇：水＝6：2：2(V/V)；F:甲醇：异丙醇：水＝6：2：2(V/V)；G:甲醇：水＝8：2(V/V)；H:乙腈：水＝5:5(V/V)。成像结果见图6-2，相较之下，甲醇：水＝5：5和乙腈：水＝5：5的离子响应相对较强，但加入水的混合溶剂，由于纸张的虹吸效应，易引起印章样品出现扩散和晕染现象，通过优化喷雾溶剂流速(2～5uL/min)和喷雾气压力(0.1～0.4MPa)，仍不能根本解决该问题，且特征离子的像图轮廓不够清晰。因此，考虑采用单一的有机溶剂甲醇或乙腈作为喷雾溶剂，减少溶剂与样品的接触时间，避免溶剂对样品的浸润，同时提高喷雾针与样品表面距离到4mm，喷雾气压力设定为0.5Mpa，在保证离子信号强度的同时，降低对纸面上笔迹和印章样品交叉表面的剥蚀程度，以实现对不同书写顺序样品的区分。结果表明采用该实验条件参数，可以在保持样品原貌的情况下，获得轮廓清晰的特征离子的质谱像图，且采用乙腈相对于采用甲醇获得的像图轮廓更清晰，对印文和签字特有成分的区分更明显(图3)。
2.2签字与印文混合样品质谱成像结果及朱墨时序的推断
对于采用相同种类签字或印文，通过不同朱墨时序形成的混合样品，其差别主要在于印文与签字交叉部位，印文或签字哪一种成分更多地位于最外层面，对于有混合渗透的情况，由于采用浅表解析的采样方式，也应该获得有差异的特异成分分布情况，从而推断样品的特异属性。
基于这样的研究思路，本发明采用AFADESI-MSI系统及方法，采用上述优化的实验条件参数，开展了手写和打印墨迹与印章混合的24个混合样品及一个真实样品(1999-A2)的质谱成像分析。
每个样品选取一部分用于AFADESI-MSI成像分析，采用全扫描的数据采集方式，获得了普通纸张上墨迹与印章印文中特征化学物质的质谱数据，进而获得其直观可视化的分布结果。由于相同类型的笔迹或印章，其特异化学成分受到不同的化学环境影响，交叉部位的化学物质分子形成离子时，会发生离子化的抑制或促进作用，从而表现出不同的特征离子的分布情况。通过提取特征离子的质谱像图，发现部分样品的质谱像图中，印章和签字的交叉部位的像图，均发生了中断的现象，可以推断该特征离子是由于受到签字或印章的覆盖，或者是受到其它离子的抑制而导致被检出含量的降低，通过与邻近连续像图的比较，进而初步区分先盖章后签字和先签字后盖章两类样品。
对于没有明显区分结果的样品或者在两类样品的像图中都出现明显中断现象的情况，进一步通过统计分析方法，来推断印章或笔迹书写的先后顺序。
用于质谱成像分析实验的每一类样品都包括两种时序(先盖章后签字和先签字后盖章)的样品，且在一个扫描实验中完成，因此可对两种类型的样品进行统计学的比较。基于MassImager1.0质谱成像数据处理软件，首先，对总体质谱成像数据进行空白区域的背景离子扣除，然后设定3×3的像素点取样范围，在像图中印文和签字的的交叉位点中，每个交叉点选取平均约9个像素点的质谱数据，每种时序的样品随机选择两个交叉点(先盖章后签字的用绿色类方块标识，先签字后盖章的用红色类方块标识，例图4)，对四个交叉点的质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据预处理方式，采用无监督的PCA统计方法，通过数据点的聚类归属，对交叉点的属性进行推断，从结果看12对预先制作的样品，均可通过该方法实现区分，且不同取材部位的1-S7样品，分别在2019年4月和2019年10月完成质谱成像分析，均可通过分析像图中断情况和PCA统计分析的方法进行区分。
对于单一交叉点，通过在交叉点附近，在未交叉的印文和签字像图中分别各选取两个3×3像素点的质谱数据，采用上述同样的数据预处理方式，采用有监督的PLS-DA统计方法，通过交叉点的质谱数据，在得分图上与印文和签字数据点聚类分布的趋向性，来推断交叉点表面情况更符合先盖章后签字和先签字后盖章哪一种情况，进而推断样品的属性。从结果看24个样品中，有23个样品(除3-S7-Xzh-D)的交叉点聚类趋向性与实际结果相符。真实样品的分析结果判断该样品为先签字后盖章样品。
25个样品的质谱成像结果及交叉点属性推断的统计分析结果见图4-图45。
实施例2
以盲测样品1999-A2为例
1)制备可用于质谱成像的样品：
洁净空白载玻片上，粘贴2cm×5cm的双面胶条，与载玻片长度方向同向。从印文所在样品纸张上剪下长5cm，宽8mm的一条，包含印章和签字或打印墨迹，尽可能包含多的交叉点，将其平整粘贴于双面胶条上。
选取另一条由同样印油及签字笔制作，但书写顺序相反的样品，采用相同的处理方式。
将两条样品并排粘贴在载玻片上，样品周围用空白纸覆盖多余的双面胶条，用铅笔画出用于质谱成像的扫描范围，完成样品制作，用于质谱成像分析。
2)对步骤1)所得样品进行质谱成像，得到质谱图；
所用质谱方法为空气动力辅助解析电喷雾离子化质谱成像方法(AFADESI-MSI)；
所用喷雾溶剂为乙腈；
系统参数如下：
喷雾电压为7000V；
传输管电压为0V；
喷雾气压力为0.5MPa；
抽气流速为40L/min；
喷雾溶剂流速为5μL/min；
X轴移动速率为0.2mm/s；
Y轴步长为0.2mm；
喷雾针与传输管距离为3mm；
喷雾针与样品表面距离为4mm；
扫描模式为全扫描模式；
质量范围m/z为100-1000；
极性为正；
最大注入时间为100ms；
AGC目标为5e6 for Full MS；
分辨率为70000；
毛细管温度为350℃；
样品扫描速率为0.2mm/s；
步进距离为0.2mm；
3)将采集的raw格式数据文件转换成cdf格式文件后，导入Massimage1.0软件，生成质谱像图文件。在质谱像图中根据展现的印文和字迹轮廓进行特征离子选择。提取强度级别接近的印文独有特异离子(m/z 872.9833)和字迹独有特异离子(m/z 216.085)，分别进行单独图像重构及交叠图像重构，形成印文特征离子质谱像图和字迹特征离子质谱像图及其叠加像图，如图43所示，再按照如下步骤进行数据处理：
a)基于MassImager1.0质谱成像数据处理软件，首先对总体质谱成像数据进行空白区域的背景离子扣除，然后设定3×3的像素点取样范围，在叠加质谱像图印文和字迹的交叉位点中随机选取四个交叉点(分别标识为绿、蓝、红、黄)，作为待推断点，并在无交叉印文和字迹像图上各选取一个点(分别标识为紫色和褐色)作为标准点，分别记为标准点A和标准点B。
对上述六个取样点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，采用无监督的PCA统计模式进行PCA聚类分析，通过数据点的聚类归属，对交叉点的属性进行推断。PCA的聚类分析结果(如图44所示)显示，四个交叉点均与无交叉印文取样点的数据点紧密聚集，说明该样品不同部位交叉点主要物质成分及形成顺序无明显差异，则继续用如下方法进行数据处理：
以印文与字迹交叉点的像素数据为考察对象(在像图上标识为黄色)，在无交叉印文和签字像图上各选取两个点(在像图上分别标识为红色系列和绿色系列)。对五个取样点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，利用统计学偏最小二乘法判别分析PLS-DA方法，采用有监督的分组模式，红色系列的像素点设定为一组，绿色系列的像素点设定为另一组，将五个点经过处理后的像素数据共同导入软件进行模式识别计算，根据得分图上黄色数据点与红色系列和绿色系列数据点的聚类趋向性来推断书写顺序。样品1999-A2的得分图如图45所示，显示黄色数据点更趋向于红色系列数据点，表明交叉点部位主要被解析的离子组成情况与印文样品更接近，推断其是先打印后盖章形成的交叉点，与样品实际情况相符。
若所述样品不同部位交叉点主要物质成分和/或形成顺序存在明显差异，则需要在所述叠加质谱像图中印文和字迹的交叉位点中选取其他若干个交叉点作为待推断点，重复所述步骤a)和步骤b)，直至所述步骤b)分析结果显示样品不同部位交叉点主要物质成分和/或形成顺序无明显差异。
Claims (7)
1.一种鉴别或辅助鉴别印文与字迹先后顺序的方法，包括：
1)制备可用于质谱成像的样品；
2)对步骤1)所得样品进行质谱成像，得到raw格式质谱数据文件；
3)将采集的raw格式质谱数据文件转换为质谱像图文件，在质谱像图中根据展现的印文和字迹轮廓进行特征离子选择，提取强度级别接近的印文独有特征离子和字迹独有特征离子，分别进行单独图像重构及交叠图像重构，形成印文特征离子质谱像图和字迹特征离子质谱像图及其叠加质谱像图，再按照如下步骤进行数据处理：
a)对总体质谱成像数据进行空白区域的背景离子扣除，然后设定像素点取样范围，在所述叠加质谱像图中印文和字迹的交叉点中随机选取若干个交叉点作为待推断点，并在所述叠加质谱像图中无交叉印文和字迹部位各选取若干个点作为标准点，分别记为标准点A系列和标准点B系列，并以不同颜色标记所述待推断点和标准点，对同系列的标准点用同一颜色标记；
b)对所述待推断点和标准点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，采用无监督的PCA统计模式进行PCA聚类分析，若分析结果显示若干待推断点聚集，说明样品不同部位交叉点主要物质成分及形成顺序无明显差异；
c)若样品不同部位交叉点主要物质成分及形成顺序无明显差异，对所述待推断点和标准点的全扫描质谱数据，设定0.001的质荷比容差和0.1～1％的离子过滤，选用自然对数变换的数据处理方式，利用统计学偏最小二乘法判别分析PLS-DA方法，采用有监督的分组模式，根据得分图上所述待推断点与所述标准点A和标准点B的聚类趋向性鉴别印文与字迹先后顺序；
若所述待推断点更趋向于所述标准点A或与所述标准点A有数据交叠，则推断所述样品为先签字后盖章；
若所述待推断点更趋向于所述标准点B或与所述标准点B有数据交叠，则推断所述样品为先盖章后签字。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用质谱成像方法为空气动力辅助解析电喷雾离子化质谱成像方法；
所用喷雾溶剂为乙腈；
系统参数如下：
喷雾电压为7000V；
传输管电压为0V；
喷雾气压力为0.5MPa；
抽气流速为40L/min；
喷雾溶剂流速为5μL/min；
X轴移动速率为0.2mm/s；
Y轴步长为0.2mm；
喷雾针与传输管距离为3mm；
喷雾针与样品表面距离为4mm；
扫描模式为全扫描模式；
质量范围m/z为100-1000；
极性为正；
最大注入时间为100ms；
AGC目标为5e6 for Full MS；
分辨率为70000；
毛细管温度为350℃；
样品扫描速率为0.2mm/s；
步进距离为0.2mm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，将采集的raw格式质谱数据文件转换为质谱像图文件的步骤包括：
将采集的raw格式质谱数据文件转换成cdf格式文件后，导入Massimage1.0软件，生成质谱像图文件。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)数据处理所用软件为MassImager1.0质谱成像数据处理软件。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)制备样品的步骤包括：对拟进行印文和签字先后顺序鉴别的印文样品提取后，固定于空白载玻片上，再置于质谱成像平台上。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述像素点取样范围为3×3；
在每个交叉点选取质谱数据的像素点平均为9个。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：所述步骤3)步骤b)中，若所述样品不同部位交叉点主要物质成分和/或形成顺序存在明显差异，则在所述叠加质谱像图中印文和字迹的交叉点中选取其他若干个交叉点作为待推断点，重复所述步骤a)和步骤b)，直至所述步骤b)分析结果显示样品不同部位交叉点主要物质成分和/或形成顺序无明显差异。
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