CN111676219A - 一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA Lnc‑EPC1‑4及其应用。所述Lnc‑EPC1‑4核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明发现该lnc‑RNA在肝硬化或肝癌患者中的血清中均低表达，可通过检测病人血清中的lnc‑EPC1‑4含量进行肝癌，特别是早期(如肝硬化阶段)肝癌的筛查检测；同时发现lnc‑EPC1‑4是一种抑癌因子，过表达lnc‑EPC1‑4可促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，从而实现对肝癌的治疗和预防，为防治肿瘤提供新思路及策略。

Description

一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4及其应用。

背景技术

原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤，其发生率和死亡率分别占全球恶性肿瘤的第5位和第3位，占我国恶性肿瘤的第3位和第2位，在部分地区和农村其死亡率已经上升到第一位。一般来说，肝炎是肝癌发生的早期阶段，并逐渐发展为肝硬化，最后发展为肝癌。

在肝癌发生初期，外科手术是一种有效的治疗手段；然而，以目前的检测水平而言，大多数患者在确诊后不久均出现肝内和肝外转移，这限制了放疗和化疗的治疗。因此，HCC的早期诊断和干预治疗至关重要。

长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非蛋白质转录物。目前，一些报道已经指出，lncRNA参与各种生物学过程，其中包括肿瘤发生，转移和增殖，因此，lncRNA被认为是多种癌症的诊断生物标志物，例如胃癌，膀胱癌，结肠直肠癌，前列腺癌和肾细胞癌。目前，诊断HCC的最常用方法包括对血清中的肿瘤生物标记物(例如甲胎蛋白)进行成像或检测。但是，这些技术对早期HCC的诊断敏感性较低。因此，重要的是鉴定新的诊断和预后分子标记，以改善早期HCC的检测。最近的研究报道，在肝癌组织中，一些lncRNAs，如LINC00462，HOTAIR，MALAT1，CCAT1，CCAT2，LINC00161和SPRY4-IT1显著上调。但是，早期肝癌患者血清中lncRNA的表达尚不清楚。除外科手术外，其他有效的治疗方法也有待开发，因此需要找寻与早期HCC的检测诊断与治疗相关的lncRNA，为肿瘤诊断和治疗提供更多选择。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4。

本发明的另一目的在于提供所述RNA Lnc-EPC1-4的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组表达质粒。

优选地，所述质粒为pcDNA3.1(+)-Lnc-EPC1-4。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒。

含有权利要求2所述重组表达质粒的细胞系。

一种用于检测血清中lnc-EPC1-4含量的RT-PCR引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2～3所示。

本发明首先发现lnc-EPC1-4在肝硬化或肝癌患者中的血清中均低表达。因此可通过检测病人血清中的lnc-EPC1-4含量(病人的血清中lnc-EPC1-4相较正常人下调)，有助于肝癌，特别是早期(如肝硬化阶段)肝癌的筛查检测。

因此本发明首先请求保护所述长链非编码RNA Lnc-EPC1-4在制备诊断肿瘤的产品中的应用。

优选地，所述肿瘤为肝癌，尤其是早期原发性肝癌。

一种早期HCC的检测诊断试剂盒，包括用于检测血清中lnc-EPC1-4含量的试剂。

优选地，所述试剂盒包含用于检测血清中lnc-EPC1-4含量的RT-PCR引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2～3所示。

另外，本发明还发现，干扰肝癌细胞中lnc-EPC1-4的表达会提高其生存力并减少细胞凋亡，而过表达肝癌细胞中lnc-EPC1-4的表达会降低其生存力并促进细胞凋亡。由此可知，lnc-EPC1-4与HCC高度相关，lnc-EPC1-4是一种抑癌因子，lnc-EPC1-4可作为肝癌的治疗靶点，过表达lnc-EPC1-4可促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，从而实现对肝癌的治疗和预防，为防治肿瘤提供新思路及策略。

因此本发明还请求保护所述长链非编码RNA Lnc-EPC1-4在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

优选地，所述肿瘤为肝癌，尤其是为原发性肝癌。

优选地，所述产品为治疗肿瘤的药物制剂。

一种治疗肝癌的产品，包括可以提高Lnc-EPC1-4表达的试剂。

长链非编码RNA Lnc-EPC1-4的表达促进剂在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的长链非编码RNA Lnc-EPC1-4，该lnc-RNA在肝硬化或肝癌患者中的血清中均低表达，可通过检测病人血清中的lnc-EPC1-4含量进行HCC，特别是早期(如肝硬化阶段)HCC的筛查检测；同时发现lnc-EPC1-4是一种抑癌因子，过表达lnc-EPC1-4可促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，从而实现对HCC的治疗和预防。

附图说明

图1为健康个体、肝炎、、肝硬化、和HCC、患者的全血Lnc-EPC1-4 RT-PCR定量分析结果。

图2为lnc-EPC1-4抑制和过表达细胞系中的lnc-EPC1-4的mRNA的表达水平检测结果。

图3为lnc-EPC1-4抑制和过表达细胞系的细胞增殖分析结果。

图4为lnc-EPC1-4抑制和过表达细胞系的细胞凋亡分析结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

发明人团队发现了一个新的长链非编码RNA Lnc-EPC1-4，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，发现其可能与肿瘤的诊断治疗相关。通过以下实施例来验证其在肿瘤发生中的作用。

实施例1从血清中纯化外泌体进行Lnc-EPC1-4 RT-PCR定量分析

(1)收集45名健康个体(normal)以及肝炎(hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)和HCC(liver cancer)患者的全血，从全血中分离出血清；

(2)10℃下以100,000g的速率将血清超离心(Beckman L8超速离心机)20小时。弃去上清液，将含有外泌体的沉淀重悬于PBS中。

(3)确定外泌体的表型。对收集到的外泌体的大小通过纳米粒子跟踪分析(NTA)(Particle Metrix，Germany)进行了验证，并且膜蛋白含量(包括CD63和TSG101)通过Western blotting进行了验证。

(4)利用商品化的RNA提取试剂盒提取外泌体中的RNA，然后用商品化的RT-PCR试剂盒定量分析各种组织的RNA，检测Lnc-EPC1-4表达含量所用PCR引物如下：

F：5’-AAGTGTGGCCAGAGAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO：2)；

R：5’-TCAGTGGCAGTTGTTTCAGGTT-3’(SEQ ID NO：3)；

GAPDH-F：5’-TCCTCACAGTTGCCATGTAGACCC-3’；

GAPDH-R：5’-TGCGGGCTCAATTTATAGAAACCGGG-3’；

RT-PCR反应体系(20μL)：①10×扩增缓冲液2μL，②4种dNTP混合物(200umol/L)2μL，③引物(10～100pmol)0.5μL，④模板DNA 0.2μg，⑤Taq DNA聚合酶0.2μL，⑥Mg²⁺1.5mmol/L 1.5μL，⑦加三蒸水至20μL。

RT-PCR反应程序：①50℃×30min，②94℃×2min，③94℃×0.5min，④37-65℃×0.5min，25-35cycle，⑤72℃×8min，⑥72℃×10min。

RT-PCR的操作步骤按照RT-PCR试剂盒(Vazyme，Q223-01，南京，中国)操作进行，检测结果见图1，由RT-PCR检测结果可知：肝硬化和肝癌病人的血清中lnc-EPC1-4的表达相较于正常血清明显下调，表明可通过检测待测个体血清中lnc-EPC1-4的表达量，从而进行HCC，特别是早期(如肝炎、肝硬化阶段)HCC的筛查检测早期初步筛查检测、诊断。

实施例2lnc-EPC1-4的抑制和过表达细胞系的构建

1、lnc-EPC1-4的抑制和过表达体系构建

(1)设计并合成lnc-EPC1-4的siRNA

siRNA-1：5’-GCACTAATGGGAGCTCTGT-3’；

siRNA-2：5’-GAAGCAACATCAAGATGAA-3’；

siRNA-3：5’-GAGAAAGACAGTAGGTCAA-3’；

由锐博生物科技有限公司(广州，中国)合成，根据制造商的说明书的操作步骤，使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher，USA)将载体和siRNA转染到细胞中，获得lnc-EPC1-4抑制的细胞系。

(2)扩增lnc-EPC1-4引物：

F：5’-AAGTGTGGCCAGAGAAGAAGAC-3’；

R：5’-TCAGTGGCAGTTGTTTCAGGTT-3’；

使用Thermo Scientific Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix(Thermo)对全长lncRNA进行PCR扩增，然后根据制造商的说明书的操作步骤，将相应的cDNA亚克隆到pcDNA3.1(+)(Genepharma，中国)的NheI和KpnI位点中，获得lnc-EPC1-4过表达的细胞系。

通过RT-PCR确定lnc-EPC1-4的mRNA的表达水平，实验组为转染了siRNA的HepG2细胞(lnc-EPC1-4 siRNA-1)和lnc-EPC1-4过表达的MHCC-LM3细胞(lnc-EPC1-4)，对照组为安慰剂处理的HepG2细胞(siRNA NC)和MHCC-LM3细胞(PcDNA3.1)，各细胞的lnc-EPC1-4的mRNA的表达水平检测结果见图2，由图2结果分析可知，转lnc-EPC1-4 siRNA-1的HepG2细胞中lnc-EPC1-4的表达被抑制，转pcDNA3.1(+)-lnc-EPC1-4的MHCC-LM3细胞中lnc-EPC1-4的表达上调。

2、细胞增殖分析

(1)将细胞(100μL/孔)以1×10⁶/mL的密度接种到96孔板中，继续培养24、48和72小时。

(2)培养后的细胞加入MTS混合物(Promega，USA)3小时，并检测细胞在490nm的光密度。

检测结果见图3所示，相较于对照组(siRNA NC)，干扰lnc-EPC1-4后HepG2细胞第48h的增殖活性升高；相较于对照组(PcDNA3.1)，过表达lnc-EPC1-4后MHCC-LM3细胞的增殖活性降低。

4、细胞凋亡分析

将细胞重悬于1×结合缓冲液中，并加入5μL荧光素缀合的Annexin V和5μL 7-AAD染色溶液(ThermoFisher，MA，USA)，使用FACS Calibur流式细胞仪测量凋亡细胞的百分比。

检测结果如图4所示，相较于对照组(siRNA NC)，干扰lnc-EPC1-4后HepG2细胞的凋亡减少。相较于对照组(PcDNA3.1)，过表达lnc-EPC1-4后MHCC-LM3细胞的凋亡增加。上述结果表明，血清中lnc-EPC1-4的含量与HCC高度相关，lnc-EPC1-4是一种抑癌因子，lnc-EPC1-4可作为肝癌的治疗靶点，可通过过表达lnc-EPC1-4促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，从而实现对HCC的治疗和预防。

序列表

<110> 中山大学附属第三医院

<120> 一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4及其应用

<141> 2020-04-21

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

aataatggga gactttaaca acccactgtc aacattagac agatcaaaga gacagaaagt 60

taacaaggat atccaggaat tgaactcagc tctgcaccaa gtggacctaa tagacatcta 120

cagaactctc caccccaaat caaccgaata tacaatcttc tcagcaccac acagcactta 180

ttccaaaatt gaccacatag ttggaagtaa agcactcctc agcaaatgta aaagaacaga 240

aattataaca aactgtctct cagaccacag tgcaatcaaa ctagaactca ggattaagaa 300

actcactcaa aactgctcaa ctacatggaa actgaacaac ctgctcctga atgactactg 360

ggtaaataat gaaatgaagg caggaataaa gatgttcttt gaaaccaaca agaacaaaga 420

cataacatcc tagaatctct gggacacatt caaagcagtg tgtagaggga aatttatagc 480

actaaatgcc cacaagagaa agcaggaaag atctctaaaa agcaaaccag atgtaaacta 540

tggactttag ttaataataa tgtatcaaaa ttggttcatc aaccataaca aatgtatcac 600

attaatgcaa aatgttaata acaggggaag ctttatgcgg gaatgggggg actgcactaa 660

tgggagctct gtaatttctg ttcaattttt ctgtgaacct aaaacttctc taaaaaatag 720

tctattaatt attaaatgaa gcaacatcaa gatgaaattg tgacctgaaa gcaaaaccag 780

agtgcaatac aaaggtagct tttgtcttgc tggccaggct ataagattta atagaattta 840

gaaaacagga agggaagaga ggattaagtg tggccagaga agaagacagg aggtactttt 900

aaaagaaaat tatggtaaac aagtgaaata cagcaacaga gaaagacagt aggtcaatac 960

tagtaaagct aagaacctga aacaactgcc actgaaaaaa gatcttacga atttgcaaag 1020

cattttctcc atattgtaca atataattct gtcctctgtt cccctttaga actgtgatta 1080

ttctctatct ttaaaatgtt ggtcattcct aatgggtatg tagaactcct tttctgcaaa 1140

cttcttggca aaattcaggt caagagggat ttggttgggt tgagtaattt tctaagagga 1200

tcattttcat ggatgggaaa ttcattctga ggatataata agtactccaa aagaaaatat 1260

tttaaattta tatttttaaa aagaaaatcg acccttttca gtgttaatgt ctctatatta 1320

gggttgcata tacttacaga taaagataat tcttcatgtt catgctttac a 1371

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

aagtgtggcc agagaagaag ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

tcagtggcag ttgtttcagg tt 22

Claims (9)

1.一种长链非编码RNA Lnc-EPC1-4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组表达质粒。

3.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒。

4.含有权利要求2所述重组表达质粒的细胞系。

5.一种用于检测Lnc-EPC1-4的RT-PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2～3所示。

6.权利要求1所述长链非编码RNA Lnc-EPC1-4在制备诊断肿瘤的产品中的应用。

7.权利要求1所述长链非编码RNA Lnc-EPC1-4在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为原发性肝癌。

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