CN111676162B - 复合菌剂及其在艳山姜枝叶堆肥发酵中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合菌剂及其在艳山姜枝叶堆肥发酵中的应用，所述复合菌剂的活性成分为下列重量百分比的原料：嗜盐菌26％～34％、土壤极小单胞菌13％～17％、嗜热产孢菌13％～17％、丁酸梭菌13％～17％、荚膜甲基球菌8％～12％、乙酸氧化菌4％～6％、产乙醇食蛋白质菌4％～6％、瘤胃球菌4％～6％。本发明的复合菌剂，菌群之间互利共生、协同增效、无拮抗现象；经菌剂发酵后的艳山姜枝叶用于生物有机肥制备，可使堆肥高温期(≥50℃)提前8‑10天，并延长3‑5天，使生物有机肥更快腐熟。

Description

复合菌剂及其在艳山姜枝叶堆肥发酵中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种在生物有机肥发酵生产中用于艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂。
背景技术
艳山姜又名土砂仁，为姜科(Zingiberaceae)、姜亚科(Zin-giberoideae)、山姜属(AliniaRoxb)多年生草本植物，其果实作为一种重要的火锅底料，深受广大消费者喜爱，因此其价格和种植面积不断增加。但艳山姜的废弃物处理问题伴随而来，每季艳山姜果实采收后需砍掉大量枝叶，越来越多的艳山姜枝叶被简单的丢弃在田间，不仅造成了资源的浪费，也降低了土地的利用率，且艳山姜种植地两至三年内不适合栽种其他作物。目前最有效的利用方式是将艳山姜枝叶与畜禽粪便混合制成生物有机肥，但在制作过程中面临的最大问题是堆肥发酵无法顺利进行。这是因为艳山姜枝叶的主要化学成分包括挥发油类、酚类、吡喃酮类、黄酮类和二萜类等化合物，以有机酸类、碳烯类及醇类化合物为其挥发油的主要成分，其中4-松油醇、桉油醇含量最高；这些化学物质既具有SOD样作用及清除DPPH自由基作用，又具有较强的抑菌作用，因此在用于生物有机肥发酵生产时，大量微生物受到上述化学物质抑制而无法正常生长，从而使有机肥升温缓慢、高温期缩短，严重影响生物有机肥腐熟及质量。
基于以上因素，需要构建出一种可使艳山姜枝叶快速脱毒的菌剂，经该菌剂处理过的艳山姜枝叶可正常用于生物有机肥发酵生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种用于艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂，艳山姜枝叶经该菌剂处理后可正常用于生物有机肥发酵生产。
本发明的技术方案为：
一种复合菌剂，所述复合菌剂的活性成分为下列重量百分比的原料：嗜盐菌26％～34％、土壤极小单胞菌13％～17％、嗜热产孢菌13％～17％、丁酸梭菌13％～17％、荚膜甲基球菌8％～12％、乙酸氧化菌4％～6％、产乙醇食蛋白质菌4％～6％、瘤胃球菌4％～6％。
进一步地，所述复合菌剂的活性成分为下列重量百分比的原料：嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％。
上述所述的复合菌剂在艳山姜枝叶堆肥发酵上的应用。
艳山姜枝叶堆肥发酵的方法，将猪粪与艳山姜枝叶按体积比2︰1混合，接入本发明的复合菌剂，接种量为0.2％，堆肥发酵35天以上。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明8种菌株形成的复合菌剂，菌群之间互利共生、协同增效、无拮抗现象；在50℃下可将艳山姜枝叶中香芹酚、长叶烯、冰片、戊基环丙烷、二乙基二甲基铅、苄基丙酮、3,5-二甲基苯甲醛等生物毒性物质完全分解，可将强好氧微生物抑制剂2,4-二叔丁基苯酚含量减少70.3％。菌剂接种艳山姜枝叶与猪粪混合的生物有机肥发酵，可使堆肥高温期(≥50℃)提前8-10天，并延长3-5天，使生物有机肥更快腐熟。
附图说明
图1为实施例3接种复合菌剂艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程温度变化。
图2为实施例4接种复合菌剂艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程温度变化。
图3为实施例5接种复合菌剂艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程温度变化。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1复合菌剂的筛选
初筛：从艳山姜枝叶长期堆置的底层土壤中，称取5g土样置于100mL无菌水中，用铝箔纸封顶，置于30℃摇床中24h，获得浸提液。吸取浸提液10mL于100mL PCS液体培养基(蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，碳酸钙2g/L，酵母粉1g/L)，再加入2.5g艳山姜枝叶，瓶中放入约1cm宽的滤纸条，置于50℃培养箱中静置培养，可使滤纸条分解说明该组菌剂可分解艳山姜枝叶所含毒性物质从而发挥纤维素分解功能，通过50次连续传代，将分解效率差的处理淘汰，获得较优的几组艳山姜枝叶脱毒复合菌剂。
复筛：将初筛获得的几组艳山姜枝叶脱毒复合菌剂，通过气相色谱-质谱法检测经菌剂处理后的艳山姜枝叶中毒性成分含量，以含量最少的处理作为最优艳山姜枝叶脱毒复合菌剂。
菌剂组成确定：从培养第4天的旺盛复合菌剂培养液中取0.5mL菌液，转入装有无菌水的试管中，充分混匀，依此方法稀释直到10-6倍，然后取0.1mL涂布在PCS固体平板上(蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，碳酸钙2g/L，酵母粉1g/L，蔗糖50g/L，琼脂150g/L)，50℃静止培养。从平板中选择典型的菌落在同样的平板上划线分离培养，直到得到纯的单个菌株。对于得到的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定菌株。
经鉴定，得到8种菌株，分别为嗜盐菌(Haloplasma contractile)、土壤极小单胞菌(Pusillimonas soli)、嗜热产孢菌(Lutisporathermophila)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)、乙酸氧化菌(Tepidanaerobacteracetatoxydans)、产乙醇食蛋白质菌(Proteiniborusethanoligenes)、瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)。
比例确定：将组成复合菌剂的8种菌株依次分别剔除，置于含有1cm宽的滤纸条的PCS液体培养基中50℃静置培养，以含有全部8种菌株的复合菌剂为对照，通过观察滤纸条分解时间发现：缺少任何一种菌其脱毒效果均会出现不同程度的下降，滤纸条分解情况见表1；将所有菌按不同比例混合，通过气相色谱-质谱法检测发现它们的重量比例为嗜盐菌26％～34％、土壤极小单胞菌13％～17％、嗜热产孢菌13％～17％、丁酸梭菌13％～17％、荚膜甲基球菌8％～12％、乙酸氧化菌4％～6％、产乙醇食蛋白质菌4％～6％、瘤胃球菌4％～6％时，脱毒效果较好。当重量比例为嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％时，脱毒效果最佳。
表1各处理滤纸条分解时间
Figure BDA0002545449380000031
注：“-”表示缺少某种菌株
实施例2艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂脱毒效果分析
选择重量比例为嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％的复合菌剂，于PCS液体培养基中50℃静置培养4天至生长旺盛期。精确称取粉碎的新鲜艳山姜枝叶5.000g，置于100mL带有1cm宽滤纸条的无菌PCS液体培养基中，接种上述培养至旺盛期的复合菌剂10mL，以接种10mL无菌PCS液体培养基为对照，50℃静置培养7天至滤纸条完全分解。各处理分别取5mL培养液于25mL顶空瓶中，加入1g氯化钠，40℃水浴加热10min，插入萃取头吸附40min，250℃解吸10min后，上机检测。
GC条件：色谱柱HP-5MS 5％Phenyl Methyl Silox；升温程序：60℃保持0min，以10℃/min升温到190℃保持2min，后以5℃/min升温到210℃保持2min，再以10℃/min到220℃保持8min。载气为He，总流速19mL/min，进样口250℃，不分流。
MS参数采集：全扫描，溶剂延迟2.5min；结果EM电压1812；离子源230℃，最大250℃；四极杆150℃，最大值200℃。
表2复合菌剂处理艳山姜枝叶后化学成分检测
Figure BDA0002545449380000041
实施例3艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂脱毒效果分析
选择重量比例为嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％的复合菌剂，所述嗜盐菌采用编号为DSM 18853的嗜盐菌，所述土壤极小单胞菌采用编号为CGMCC1.10919的土壤极小单胞菌，所述嗜热产孢菌采用编号为DSM 19022的嗜热产孢菌，所述丁酸梭菌采用编号为ATCC 19398的丁酸梭菌，所述荚膜甲基球菌采用编号为ATCC 19069的荚膜甲基球菌，所述乙酸氧化菌采用编号为DSM 21804的乙酸氧化菌，所述产乙醇食蛋白质菌采用编号为CGMCC 1.5055的产乙醇食蛋白质菌，所述瘤胃球菌采用编号为ATCC 19208的瘤胃球菌。菌剂培养及脱毒检测方法同实施例2中方法。得到结果如表3所示，脱毒效果与施例2中所述效果类似，说明该复合菌剂微生物组成无菌种差异。
表3复合菌剂处理艳山姜枝叶后化学成分检测
Figure BDA0002545449380000042
Figure BDA0002545449380000051
实施例4艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂脱毒效果分析
选择重量比例为嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％的复合菌剂，所述嗜盐菌采用编号为JCM 14575的嗜盐菌，所述土壤极小单胞菌采用编号为CGMCC1.10913的土壤极小单胞菌，所述嗜热产孢菌采用编号为DSM 22680的嗜热产孢菌，所述丁酸梭菌采用编号为CGMCC1.5205的丁酸梭菌，所述荚膜甲基球菌采用编号为ATCC 33009的荚膜甲基球菌，所述乙酸氧化菌采用编号为JCM 16047的乙酸氧化菌，所述产乙醇食蛋白质菌采用编号为JCM 14574的产乙醇食蛋白质菌，所述瘤胃球菌采用编号为ATCC 49949的瘤胃球菌。菌剂培养及脱毒检测方法同实施例2中方法。得到结果如表4所示，脱毒效果与施例2中所述效果类似，说明该复合菌剂微生物组成无菌种差异。
表4复合菌剂处理艳山姜枝叶后化学成分检测
Figure BDA0002545449380000052
实施例5艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂接种堆肥效果
将重量比例为嗜盐菌30％、土壤极小单胞菌15％、嗜热产孢菌15％、丁酸梭菌15％、荚膜甲基球菌10％、乙酸氧化菌5％、产乙醇食蛋白质菌5％、瘤胃球菌5％的复合菌剂接种于猪粪与艳山姜枝叶按体积比2︰1混合的堆肥中，接种量为0.2％，以接种清水为CK，进行35天的堆肥发酵。堆肥温度变化情况见图1所示，在艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程中接种该配方复合菌剂，可使堆肥高温期(≥50℃)提前8-10天，并延长3-5天，使生物有机肥更快腐熟。
实施例6艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂接种堆肥效果
将重量比例为嗜盐菌27％、土壤极小单胞菌17％、嗜热产孢菌14％、丁酸梭菌17％、荚膜甲基球菌9％、乙酸氧化菌6％、产乙醇食蛋白质菌4％、瘤胃球菌6％的复合菌剂接种于猪粪与艳山姜枝叶按体积比2︰1混合的堆肥中，接种量为0.2％，以接种清水为CK，进行35天的堆肥发酵。堆肥温度变化情况见图2所示，在艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程中接种该配方复合菌剂，可使堆肥高温期(≥50℃)提前7-9天，并延长3-4天，使生物有机肥较快腐熟。
实施例7艳山姜枝叶脱毒的复合菌剂接种堆肥效果
将重量比例为嗜盐菌33％、土壤极小单胞菌13％、嗜热产孢菌16％、丁酸梭菌13％、荚膜甲基球菌11％、乙酸氧化菌4％、产乙醇食蛋白质菌6％、瘤胃球菌4％的复合菌剂接种于猪粪与艳山姜枝叶按体积比2︰1混合的堆肥中，接种量为0.2％，以接种清水为CK，进行35天的堆肥发酵。堆肥温度变化情况见图3所示，在艳山姜枝叶生物有机肥发酵过程中接种该配方复合菌剂，可使堆肥高温期(≥50℃)提前7-9天，并延长3-4天，使生物有机肥较快腐熟。

Claims (4)

1.一种复合菌剂，所述复合菌剂的活性成分为下列重量百分比的原料：嗜盐菌（Haloplasma contractile）26%~34%、土壤极小单胞菌（Pusillimonas soli）13%~17%、嗜热产孢菌（Lutisporathermophila）13%~17%、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）13%~17%、荚膜甲基球菌（Methylococcuscapsulatus）8%~12%、乙酸氧化菌（Tepidanaerobacteracetatoxydans）4%~6%、产乙醇食蛋白质菌（Proteiniborusethanoligenes）4%~6%、瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens）4%~6%。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的活性成分为下列重量百分比的原料：嗜盐菌（Haloplasma contractile）30%、土壤极小单胞菌（Pusillimonas soli）15%、嗜热产孢菌（Lutisporathermophila）15%、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）15%、荚膜甲基球菌（Methylococcuscapsulatus）10%、乙酸氧化菌（Tepidanaerobacteracetatoxydans）5%、产乙醇食蛋白质菌（Proteiniborusethanoligenes）5%、瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens）5%。
3.权利要求1或2所述的复合菌剂在艳山姜枝叶堆肥发酵中的应用。
4.艳山姜枝叶堆肥发酵的方法，其特征在于，将猪粪与艳山姜枝叶按体积比2︰1混合，接入权利要求1或2所述的复合菌剂，接种量为0.2%，堆肥发酵35天以上。
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