CN111670256B - 与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点及其应用 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Abstract
本文公开了与主要不良心血管事件(MACE)相关的17个单核苷酸多态性(SNP)位点及其应用。本申请提供的17个SNP位点是基于对冠心病病人的大规模跟踪访问及数据分析而得到，可以作为预测主要不良心血管事件发生的标记物。另外，本申请还提供了用于预测受试者发生MACE的试剂盒，其包含用于扩增和检测上述17个SNP位点的引物对和探针对，能够预测受试者发生MACE的风险。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，更具体地，涉及与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点及其应用。
背景技术
随着全球老龄化的趋势日趋显著，心脏疾病已经成为人类死亡的主要原因之一。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)的主要治疗手段，但术后病人血小板的凝血作用容易造成支架内血栓等心脏不良事件。氯吡格雷和阿司匹林双联抗血凝疗法能显著降低病人PCI术后不良心脏事件的发生，目前已成为相关治疗的金标准。然而，尽管双联抗血凝疗法疗效显著，但仍有部分病人在PCI术后出现支架内狭窄、支架内血栓等缺血性事件，不完全的血小板抑制可能与这部分病人体内的氯吡格雷不应答有关。当内皮细胞受损时，二磷酸腺苷可以作为一种血小板激动剂，周围的血小板通过释放二磷酸腺苷从而激活更多的血小板参与血凝反应。氯吡格雷是一种药物前体，通过肝脏细胞色素P450酶系统产生二磷酸腺苷受体P2Y12的拮抗剂，从而抑制血小板功能。因此，当病人体内的氯吡格雷不应答时，PCI术后病人的血小板活动无法受到合理控制。目前已有大量报道证实这些术后差异与病人个体基因型有着密切关系，其中CYP2C19基因的报道最为广泛。
药物基因组学方面已有大量和氯吡格雷用药安全性相关的研究。现已证明CYP2C19和CYP2C9基因的多态性会影响氯吡格雷的药代动力学和药效学响应，研究己证实CYP2C19功能缺失基因(Loss-of function，LOF)*2和*3变异会导致酶催化活性降低，致使氯吡格雷代谢率低，导致抗血小板作用减弱，并可能造成缺血事件增加，尤其是发生支架内血栓；CYP2C19*17功能获得基因(Gain—of function，GOF)与出血风险相关；也有类似的报道显示ABCB1基因的多态性与氯吡格雷在人体内药物代谢有关。有文献报道，ABCB1低表达型(TT型)患者较高表达型(CC型)、中间表达型(CT型)氯吡格雷吸收减少，且与支架内早期血栓形成相关。同样，另一个与PCI术后不良心脏事件高度相关的基因PON1与氯吡格雷的相关性也已经被报道。PONI Q192R基因的QQ型较RR型、QR型对氧磷酸酶活性、氯吡格雷活性代谢产物浓度及血小板抑制力最低，且更易出现早期支架内血栓形成。
虽然已有研究使用基因芯片或者PCR扩增技术寻找患者服用氯吡格雷后发生不良反应的遗传因子，并且找到了一些新的位点。但目前大部分研究只是集中在具体几个基因型与疾病的关系上，并没有针对PCI术后发生主要不良心血管事件(major adversecardiovascular event,MACE)的全外显子研究或者目标区域研究。其次，大部分冠状动脉疾病易感位点研究集中在西方人群，全基因组关联性分析(genome-wide associationstudy,GWAS)已经在高加索人群中鉴定出多个相关变异位点，然而直到2011年才有中国人群冠状动脉疾病的GWAS研究。随后有研究在东亚人群验证了一些位点，虽有在中国人群中发现新位点的研究，但国内尚缺乏这方面的大型临床资料和大样品研究，而且大部分已发现的易感位点在中国人群中的适用性仍不清楚。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
针对上述现有技术中存在的缺陷，本申请提供了17个与主要不良心血管事件(MACE)发生显著相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，这些SNP位点对预测受试者是否发生主要不良心血管事件(MACE)有很重要的指导作用。
第一方面，本发明提供了与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点，其选自MYOM2基因的rs17064642位点、WDR24基因的rs11640115位点、NECAB1基因的rs74569896位点、EFR3A基因的rs4736529位点、EFCAB13基因的rs3851808位点、CDC27基因的rs188799位点、TMEM43基因的rs2340917位点、GBP1基因的rs1048425位点、NHLRC2基因的rs7913176位点、OR9G4基因的rs11228762位点、CYP4B1基因的rs4646487位点、CAST基因的rs754615位点、MUC12基因的rs4729631位点、GPA33基因的rs28384507位点、GP2基因的rs60257337位点、IL17RA基因的rs2241046位点和DOCK1基因的rs1060561位点中的任意一个或至少两个的组合；其中：
所述MYOM2基因的rs17064642位点为SEQ ID NO:1所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为C/T；
所述WDR24基因的rs11640115位点为SEQ ID NO:2所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为A/G；
所述NECAB1基因的rs74569896位点为SEQ ID NO:3所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为G/A；
所述EFR3A基因的rs4736529位点为SEQ ID NO:4所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为G/C；
所述EFCAB13基因的rs3851808位点为SEQ ID NO:5所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为C/T；
所述CDC27基因的rs188799位点为SEQ ID NO:6所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为T/C；
所述TMEM43基因的rs2340917位点为SEQ ID NO:7所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为T/C；
所述GBP1基因的rs1048425位点为SEQ ID NO:8所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为G/C；
所述NHLRC2基因的rs7913176位点为SEQ ID NO:9所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为A/G；
所述OR9G4基因的rs11228762位点为SEQ ID NO:10所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为A/G；
所述CYP4B1基因的rs4646487位点为SEQ ID NO:11所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为T/C；
所述CAST基因的rs754615位点为SEQ ID NO:12所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为C/G；
所述MUC12基因的rs4729631位点为SEQ ID NO:13所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为T/C；
所述GPA33基因的rs28384507位点为SEQ ID NO:14所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为T/G；
所述GP2基因的rs60257337位点为SEQ ID NO:15所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为C/G；
所述IL17RA基因的rs2241046位点为SEQ ID NO:16所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为C/T；
所述DOCK1基因的rs1060561位点为SEQ ID NO:17所示序列自5’末端起第61位，等位基因型为A/G。
进一步地，所述主要不良心血管事件选自心源性死亡，中风，心肌梗死和血运重建。
进一步地，所述主要不良心血管事件为心源性死亡，与其相关的单核苷酸多态性位点为IL17RA基因的rs2241046位点；或者
所述主要不良心血管事件为中风，与其相关的单核苷酸多态性位点选自EFR3A基因的rs4736529位点和CDC27基因的rs188799位点；或者
所述主要不良心血管事件为心肌梗死，与其相关的单核苷酸多态性位点选自MYOM2基因的rs17064642位点、WDR24基因的rs11640115位点、EFCAB13基因的rs3851808位点、TMEM43基因的rs2340917位点、GBP1基因的rs1048425位点、NHLRC2基因的rs7913176位点、OR9G4基因的rs11228762位点、CYP4B1基因的rs4646487位点、MUC12基因的rs4729631位点、GPA33基因的rs28384507位点、GP2基因的rs60257337位点和DOCK1基因的rs1060561位点；或者
所述主要不良心血管事件为血运重建，与其相关的单核苷酸多态性位点选自NECAB1基因的rs74569896位点和CAST基因的rs754615位点。
第二方面，本申请还提供了用于扩增第一方面所述的单核苷酸多态性位点的引物对，其选自如下所示序列对的任意一种或至少两种的组合：
用于扩增rs17064642位点的引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；
用于扩增rs11640115位点的引物对SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
用于扩增rs74569896位点的引物对SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
用于扩增rs4736529位点的引物对SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；
用于扩增rs3851808位点的引物对SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
用于扩增rs188799位点的引物对SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；
用于扩增rs2340917位点的引物对SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；
用于扩增rs1048425位点的引物对SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；
用于扩增rs7913176位点的引物对SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；
用于扩增rs11228762位点的引物对SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；
用于扩增rs4646487位点的引物对SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；
用于扩增rs754615位点的引物对SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；
用于扩增rs4729631位点的引物对SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43；
用于扩增rs28384507位点的引物对SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45；
用于扩增rs60257337位点的引物对SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47；
用于扩增rs2241046位点的引物对SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；
用于扩增rs1060561位点的引物对SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
第三方面，本申请还提供了用于检测第一方面所述的单核苷酸多态性位点的探针对，其选自如下所示探针对的任意一种或至少两种的组合：
用于检测rs17064642位点的探针对SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53；
用于检测rs11640115位点的探针对SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55；
用于检测rs74569896位点的探针对SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57；
用于检测rs4736529位点的探针对SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59；
用于检测rs3851808位点的探针对SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61；
用于检测rs188799位点的探针对SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63；
用于检测rs2340917位点的探针对SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；
用于检测rs1048425位点的探针对SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67；
用于检测rs7913176位点的探针对SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69；
用于检测rs11228762位点的探针对SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71；
用于检测rs4646487位点的探针对SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73；
用于检测rs754615位点的探针对SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75；
用于检测rs4729631位点的探针对SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77；
用于检测rs28384507位点的探针对SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79；
用于检测rs60257337位点的探针对SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81；
用于检测rs2241046位点的探针对SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83；
用于检测rs1060561位点的探针对SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85。
第四方面，本申请还提供了第一方面所述的单核苷酸多态性位点、第二方面所述的引物对或第三方面所述的探针对在预测受试者发生主要不良心血管事件中的用途。
进一步地，所述受试者接受了经皮冠状动脉介入治疗。
进一步地，所述主要不良心血管事件包括心源性死亡，中风，心肌梗死和血运重建中的任意一种或至少两种的组合。
进一步地，所述受试者为中国人群，优选地，为汉族人群。
第五方面，本发明还提供了一种预测受试者发生主要不良心血管事件的风险的方法，其包括：检测待测受试者中第一方面所述的单核苷酸多态性位点的基因型；基于所得基因型预测受试者发生主要不良心血管事件的风险。
其中，根据本发明的具体实例，在所述受试者中检测得到一些单核苷酸多态性位点的基因型与其发生主要不良心血管事件的风险之间的关系：
在MYOM2基因中的rs17064642位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有T等位基因的受试者的2.76倍；
在WDR24基因中的rs11640115位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的0.47倍；
在NECAB1基因中的rs74569896位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有A等位基因的受试者的1.93倍；
在EFR3A基因中的rs4736529位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的2.33倍；
在EFCAB13基因中的rs3851808位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具T等位基因的受试者的1.65倍；
在CDC27基因中的rs188799位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的1.91倍；
在TMEM43基因中的rs2340917位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的0.56倍；
在GBP1基因中的rs1048425位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的1.61倍；
在NHLRC2基因中的rs7913176位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的1.56倍；
在OR9G4基因中的rs11228762位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的0.61倍；
在CYP4B1基因中的rs4646487位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的0.53倍；
在CAST基因中的rs754615位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的1.87倍；
在MUC12基因中的rs4729631位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有C等位基因的受试者的0.46倍；
在GPA33基因中的rs28384507位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的0.48倍；
在GP2基因中的rs60257337位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的1.56倍；
在IL17RA基因中的rs2241046位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有T等位基因的受试者的1.64倍；
在DOCK1基因中的rs1060561位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险是在该位点具有G等位基因的受试者的1.67倍。
进一步地，本领域技术人员可以理解的是，基于统计学意义的考虑，上述的所有不良心血管事件发生风险倍数，均可在95％置信区间内进行左右延伸。具体地：
例如，在MYOM2基因中的rs17064642位点具有C等位基因的受试者其主要不良心血管事件发生风险是具有T等位基因的受试者的2.76倍，其95％置信区间范围为1.98-3.87倍，因此应当理解为，1.98-3.87倍的风险倍数范围落在了本发明所要求保护的范围之内。
例如，在WDR24基因中的rs11640115位点具有A等位基因的受试者其主要不良心血管事件发生风险是具有G等位基因的受试者的0.47倍，其95％置信区间范围为0.35-0.63倍，因此应当理解为，0.35-0.63倍的风险倍数范围落在了本发明所要求保护的范围之内。
……
由此，可以确定的是：
进一步地，在所述受试者中检测到的以下单核苷酸多态性位点的基因型与其发生主要不良心血管事件的风险之间的关系包括：
在MYOM2基因中的rs17064642位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有T等位基因的受试者，优选地，是其1.98-3.87倍，更优选2.76倍；
在WDR24基因中的rs11640115位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其0.35-0.63倍，更优选0.47倍；
在NECAB1基因中的rs74569896位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有A等位基因的受试者，优选地，是其1.49-2.51倍，更优选1.93倍；
在EFR3A基因中的rs4736529位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其1.65-3.31倍，更优选2.33倍；
在EFCAB13基因中的rs3851808位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具T等位基因的受试者，优选地，是其1.32-2.06倍，更优选1.65倍；
在CDC27基因中的rs188799位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其1.43-2.55倍，更优选1.91倍；
在TMEM43基因中的rs2340917位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其0.43-0.72倍，更优选0.56倍；
在GBP1基因中的rs1048425位点具有G等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其1.30-1.99倍，更优选1.61倍；
在NHLRC2基因中的rs7913176位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其1.26-1.93倍，更优选1.56倍；
在OR9G4基因中的rs11228762位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其0.48-0.77倍，更优选0.61倍；
在CYP4B1基因中的rs4646487位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其0.40-0.72倍，更优选0.53倍；
在CAST基因中的rs754615位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其1.38-2.53倍，更优选1.87倍；
在MUC12基因中的rs4729631位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有C等位基因的受试者，优选地，是其0.31-0.67倍，更优选0.46倍；
在GPA33基因中的rs28384507位点具有T等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险低于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其0.34-0.69倍，更优选0.48倍；
在GP2基因中的rs60257337位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其1.25-1.94倍，更优选1.56倍；
在IL17RA基因中的rs2241046位点具有C等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有T等位基因的受试者，优选地，是其1.28-2.10倍，更优选1.64倍；
在DOCK1基因中的rs1060561位点具有A等位基因的受试者发生主要不良心血管事件的风险高于在该位点具有G等位基因的受试者，优选地，是其1.29-2.16倍，更优选1.67倍。
如上所述，本领域技术人员可以理解，按照统计学的方法，将根据本发明实施例统计所得的所有不良心血管事件发生风险倍数，在95％置信区间内进行左右延伸，得到的具体风险倍数的95％置信区间范围的风险倍数范围，能够落在本发明所要求保护的范围之内。进一步地，该方法具体包括：
1)提取受试者的基因组DNA；
2)针对权利要求1所述的单核苷酸多态性位点进行PCR扩增；
3)检测扩增产物并对扩增产物进行基因分型；以及
4)基于基因型预测受试者发生不良心血管事件的风险。
进一步地，所述受试者接受了经皮冠状动脉介入治疗。
进一步地，所述主要不良心血管事件包括心源性死亡，中风，心肌梗死和血运重建中的任意一种或至少两种的组合。
进一步地，所述受试者为中国人群，优选地，为汉族人群。
进一步地，所述方法还可以与基于流行病学因素的预测方法相结合，优选地，所述流行病学因素包括以下中的任意一种或至少两种的组合：病人的性别、年龄、身体质量指数、既往心肌梗死史、糖尿病、高血压；终点事件发生前施用血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、β-受体阻滞剂、钙通道抑制剂、质子泵抑制剂、他汀类药物的情况；高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂、糖化血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、肌酸激酶及其同工酶的临床指标检测值。
第六方面，本发明还提供了一种预测受试者发生主要不良心血管事件的试剂盒，其包括用于扩增第一方面所述的单核苷酸多态性位点的引物对和/或用于检测第一方面所述的单核苷酸多态性位点的探针对。
进一步地，所述试剂盒包括第二方面所述的引物对和/或第三方面所述的探针对。
本申请提供的与主要不良心血管事件(MACE)相关的17个单核苷酸多态性位点是以本发明人基于中国范围内最大规模的对冠心病病人服用氯毗格雷后18个月进行跟踪访问的记录结果来定义终点事件，以MACE样品和对照样品进行全外显子和目标区域测序得到的基因型数据为基础，然后结合临床表型数据进行cox回归分析而得到的。正是基于大样品量的临床信息和高通量的基因测序数据，使得本申请提供的17个单核苷酸多态性位点是目前最完整的、最准确的可以用于预测不良心血管事件(MACE)发生的标记物。本申请为进一步检测基因的表达调控、代谢途径和蛋白功能，深入研究MACE的发病机制，开发新型治疗药物和基因治疗，实现基于遗传学背景的个体化诊疗奠定了重要基础。
本申请提供的试剂盒是以基于上述新发现的17个单核苷酸多态性(SNP)位点进行制备的，针对每个位点的引物序列都是经过特异性筛选的。采取受检者外周血来源的基因组DNA，在本发明所述的试剂盒上进行基因分型检测，再利用PCR扩增和Taqman探针进行基因分型，检测单核苷酸位点，综合分析病人临床表型信息(性别，年龄，BMI，是否患有糖尿病，高血压，使用药物治疗及临床检测指标等等)及17个单核苷酸多态性(SNP)信息，利用结合遗传风险因素和流行病学因素的综合模型，能够预测个体发生主要不良心血管事件(MACE)的风险，可以对PCI术后暂时未出现MACE事件但具有MACE发生高风险的人群进行早期的预测和筛查，早期发现MACE事件的高危人群，使其采取相应的保健措施并定期去医院进行检查，降低MACE的发生率或者发生时间。同时，也可以为医生判断MACE的发生和选择用药提供指导和帮助。
附图说明
图1为实施例1中所描述的具有MYOM2基因的rs17064642位点的不同基因型个体相对于MACE的生存曲线图；其中，纵坐标显示未发生MACE事件的个体生存率，横坐标显示以月计的时间以及各基因型在与横坐标相对应的时间点的未发生MACE事件的个体数目；
图2为实施例2中所描述的三种模型预测MACE的准确性的AUC结果图；其中，横坐标代表(1-特异度)(即，1减去特异度)，纵坐标代表灵敏度。
具体实施方式
为便于理解本申请，本申请列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。
实施例1与主要不良心血管事件(MACE)有显著关联的单核苷酸多态性位点的确定
一、MACE样品和对照样品的入选标准
所有病人样本均来自广东省人民医院，且均属于汉族人群。各个病人在PCI术后都接受氯吡格雷及阿司匹林双重抗血小板凝集疗法，氯吡格雷用药剂量：首次负荷剂量300mg，维持剂量75mg/每天。本研究定义的主要终点事件为主要不良心血管事件，包括心源性死亡，中风，心肌梗死和血运重建。所有在PCI术后1.5年内发生主要不良心血管事件的病人会被定义为MACE病例组，其余病人归为MACE对照组。
二、方法
本申请的研究设计分为两个阶段：
第一个阶段是针对发现数据集进行的研究，选取51个发生MACE事件病人和117个对照病人为研究对象，使用NimbleGen seqcap EZ外显子(44M)芯片对170个病人中每一个人的基因组DNA进行靶向捕获。然后使用Illumina HiSeq 2000平台独立地对每个样品捕获数据进行测序。每个样本都设计为～210倍的覆盖以得到高质量的碱基。所有Illumina测序数据都用soap2软件比对到GRCh37/hg19人类参考基因组上，之后运用soapsnp软件分析比对结果，检测SNPs变异。针对SNPs变异，我们采取如下过滤条件：碱基测序质量≥20，测序深度≥8×，测序深度≤500×，非参考型等位基因≥4×。初始的SNPs检测完成后，我们对群体变异数据集进一步进行过滤：(1)SNPs检出率≥90％；(2)哈迪-温伯格检验(Hardy-Weinberg test)的P值>1×10-6；(3)它们的次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.01。plink软件进行logistic回归分析评估每个SNP位点与MACE终点事件的显著性，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio,OR)和95％的可信区间，分析中直接获得OR值、可信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。
第二阶段是针对验证数据集进行的研究，选取了123个发生MACE事件病人和1580个对照病人为研究对象，针对上述第一阶段中得到的6168个与MACE显著相关的SNPs和798个与MACE显著相关的基因，我们设计了6M目标区域芯片，然后使用CG测序平台对这1703个验证样品进行高深度测序。每个样本都设计为～210倍的覆盖以得到高质量的碱基。所有CG测序数据都比对到GRCh37/hg19人类参考基因组上，之后运用CG分析工具(CGATools，http://cgatools.sourceforge.net/)分析比对结果，检测SNPs变异。初始的SNPs检测完成后，我们对群体变异数据集进一步进行过滤：(1)SNPs检出率≥90％；(2)哈迪-温伯格检验(Hardy-Weinberg test)的P值>1×10-6；(3)它们的次要等位基因频率(minor allelefrequency，MAF)>0.01。多变量的COX回归分析模型被使用来评价SNPs和MACE的相关性。计算危险等位基因的相对危险度(hazards ratio,HR)和95％的可信区间，分析中直接获得HR值、可信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。
最终，将第一阶段的168个病人和第二阶段的1703个病人样品合并起来做关联分析，这样合并数据中就得到了1871个病人的基因型数据，同样采用多变量的COX回归分析模型来计算这些SNPs和MACE的相关性。计算危险等位基因的相对危险度(HR)和95％的可信区间，分析中直接获得HR值、可信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。最后，我们选取同时符合如下条件的SNPs作为最终的显著位点：(1)第一阶段中P<0.05的SNPs(2)第二阶段中P<0.05的SNPs(3)在合并数据分析中P<10-4的SNPs。
三、结果
第一个阶段是针对发现数据集进行的研究，选取51个发生MACE事件病人和117个对照病人为研究对象，采用Illumina外显子芯片进行测序，每个样品都达到了～210的测序深度，数据质量很好，如表1所示。
表1.第一阶段样品测序数据总结
| 第一阶段 | MACE病例组 | MACE对照组 | 总计 |
| 个体数 | 51 | 117 | 168 |
| 原始碱基(Gb) | 19.23(2.40) | 18.32(2.59) | 18.60(2.56) |
| 比对上的碱基(Gb) | 15.77(2.13) | 15.42(2.14) | 15.53(2.14) |
| 目标区域比对上的碱基(Gb) | 9.58(1.69) | 9.14(1.62) | 9.27(1.65) |
| 捕获特异性(％) | 61.10(10.03) | 59.78(9.92) | 60.19(9.94) |
| 平均覆盖度深度 | 216.53(38.20) | 206.36(37.00) | 209.45(37.55) |
| 覆盖度>＝1x(％) | 99.57(0.07) | 99.58(0.08) | 99.58(0.08) |
| 覆盖度>＝2x(％) | 99.39(0.09) | 99.41(0.10) | 99.40(0.10) |
| 覆盖度>＝4x(％) | 99.11(0.12) | 99.13(0.12) | 99.12(0.12) |
| 覆盖度>＝8x(％) | 98.66(0.19) | 98.68(0.17) | 98.67(0.18) |
| 覆盖度>＝10x(％) | 98.45(0.23) | 98.47(0.21) | 98.46(0.21) |
第二个阶段是针对发现数据集进行的研究，选取123个发生MACE事件病人和1580个对照病人为研究对象，采用CG测序平台进行测序，每个样品都达到了～93X的测序深度，数据质量很好，如表2所示。
表2.第二阶段样品测序数据总结
| 第二阶段 | MACE病例组 | MACE对照组 | 总计 |
| 个体数 | 123 | 1580 | 1703 |
| 原始碱基(Gb) | 2.49±0.68 | 2.48±0.70 | 2.48±0.71 |
| 比对上的碱基(Gb) | 1.20±0.39 | 1.21±0.39 | 1.21±0.40 |
| 目标区域比对上的碱基(Gb) | 0.56±0.18 | 0.56±0.18 | 0.56±0.19 |
| 捕获特异性(％) | 47.82±7.50 | 48.89±7.99 | 48.85±7.98 |
| 平均覆盖度深度 | 92.74±29.80 | 93.29±30.26 | 93.64±30.90 |
| 覆盖度>＝1x(％) | 94.26(0.78) | 94.31(0.78) | 94.32(0.80) |
| 覆盖度>＝2x(％) | 92.86(1.13) | 92.94(1.11) | 92.94(1.12) |
| 覆盖度>＝4x(％) | 90.40(1.77) | 90.51(1.71) | 90.52(1.73) |
| 覆盖度>＝8x(％) | 86.02(2.98) | 86.20(2.85) | 86.22(2.88) |
| 覆盖度>＝10x(％) | 83.94(3.56) | 84.15(3.39) | 84.17(3.43) |
通过对1871个病人(包括174个发生MACE的病人样品和1697个对照病人样品)的基因型数据集进行多变量COX回归分析，找到了17个SNP位点与MACE发生显著相关。
这17个SNP位点及其等位基因是：MYOM2基因的rs17064642，等位基因为C/T；WDR24基因的rs11640115，等位基因为A/G；NECAB1基因的rs74569896，等位基因为G/A；EFR3A基因的rs4736529，等位基因为G/C；EFCAB13基因的rs3851808，等位基因为C/T；CDC27基因的rs188799，等位基因为T/C；TMEM43基因的rs2340917，等位基因为T/C；GBP1基因的rs1048425，等位基因为G/C；NHLRC2基因的rs7913176，等位基因为A/G；OR9G4基因的rs11228762，等位基因为A/G；CYP4B1基因的rs4646487，等位基因为T/C；CAST基因的rs754615，等位基因为C/G；MUC12基因的rs4729631，等位基因为T/C；GPA33基因的rs28384507，等位基因为T/G；GP2基因的rs60257337，等位基因为C/G；IL17RA基因的rs2241046，等位基因为C/T；DOCK1基因的rs1060561，等位基因为A/G。这17个SNP位点与MACE的关联结果见表3。其中，MYOM2基因的rs17064642位点与MACE的发生最相关(P＝2.95×10-9)，并且达到全基因组显著性水平。如图1中所示，具有TT基因型的患者的累积复发率为8.1％，具有CC基因型或CT基因型的患者的累积复发率为17.8％，相比于具有TT基因型的患者的累积复发率，在MYOM2基因中的672C/T(rs17064642)位点具有C等位基因(CC基因型或CT基因型)的情况下的累积复发率显著地高(HR＝2.76)。此外，在WDR24基因中的rs11640115位点具有A等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的0.47倍；在NECAB1基因中的rs74569896位点具有G等位基因的患者其MACE发生风险是具有A等位基因患者的1.93倍；在EFR3A基因中的rs4736529位点具有G等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的2.33倍；在EFCAB13基因中的rs3851808位点具有C等位基因的患者其MACE发生风险是具T等位基因患者的1.65倍；在CDC27基因中的rs188799位点具有T等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的1.91倍；在TMEM43基因中的rs2340917位点具有T等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的0.56倍；在GBP1基因中的rs1048425位点具有G等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的1.61倍；在NHLRC2基因中的rs7913176位点具有A等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的1.56倍；在OR9G4基因中的rs11228762位点具有A等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的0.61倍；在CYP4B1基因中的rs4646487位点具有T等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的0.53倍；在CAST基因中的rs754615位点具有C等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的1.87倍；在MUC12基因中的rs4729631位点具有T等位基因的患者其MACE发生风险是具有C等位基因患者的0.46倍；在GPA33基因中的rs28384507位点具有T等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的0.48倍；在GP2基因中的rs60257337位点具有C等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的1.56倍；在IL17RA基因中的rs2241046位点具有C等位基因的患者其MACE发生风险是具有T等位基因患者的1.64倍；在DOCK1基因中的rs1060561位点具有A等位基因的患者其MACE发生风险是具有G等位基因患者的1.67倍。最后，这17个SNP位点的序列如下表4所示。
表3. 17个SNP位点与MACE的关联结果
其中，“等位基因”表示次要等位基因/主要等位基因，“基因频率”表示次要等位基因的频率。“HR(95％CI)”，表示与携带主要等位基因的个体相比，携带次要等位基因的个体发生MACE的相对风险。“功能注释”中UTR3表示3’非编译区，UTR5表示5’非编译区。
表4.本申请所确定的与主要不良心血管事件(MACE)显著相关的17个SNP位点的序列
实施例2.用于预测受试者发生主要不良心血管事件(MACE)的试剂盒
本实施例所述的用于预测受试者发生主要不良心血管事件(MACE)的试剂盒，是通过检测上述的17个与主要不良心血管事件(MACE)显著相关的SNP位点来进行风险预测的试剂盒。
本申请所述的试剂盒包括：用于检测人基因组的17个SNP位点的PCR扩增引物(单碱基正向引物和反向引物)和进行基因分型的探针。所述17个SNP位点是rs17064642、rs11640115、rs74569896、rs4736529、rs3851808、rs188799、rs2340917、rs1048425、rs7913176、rs11228762、rs4646487、rs754615、rs4729631、rs28384507、rs60257337、rs2241046和rs1060561。
一、试剂盒的制备：
设计和合成所述SNP位点的PCR扩增引物(单碱基正向引物和反向引物)和进行基因分型的两条Taqman-MGB探针。设计引物用于特异性扩增包含每个SNP位点的PCR产物，同时设计两条探针，分别针对每个SNP位点的两个等位基因。荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。下表5是所述的设计的引物和探针序列。
表5. 17个SNP位点的PCR扩增引物(正向引物和反向引物)及两条Taqman-MGB探针序列
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进一步地，试剂盒还可以包括其他成分，例如包括：Taq酶、dNTP混合液、稀释液、缓冲液等，详见下面的检测方法。
二、检测方法(即，试剂盒的使用方法)
1.配置PCR反应mix溶液
用多重PCR对包含单核苷酸多态性位点的区域进行扩增。更具体而言，首先，从临床样品中分离出基因组DNA，并作为PCR反应的DNA模板加以使用。按表6中所示配制PCR反应Mix溶液。在以下PCR反应中，将在上述表5中所述的针对各单核苷酸多态性位点的正向引物和反向引物以及两条Taqman-MGB探针用作PCR反应的引物。
表6. PCR反应Mix溶液配方
2.进行PCR反应
配制好反应体系后，在ABI 9700 PCR仪器上选用StepOnePlusTMSystem，按下表7中所示的PCR反应条件进行PCR反应程序：在约95℃下预变性约10分钟(1个循环)；在约95℃下变性约15秒，在约60℃下退火和延伸约1分钟，将之作为1个循环(共40个循环)。反应完成后，将反应物储存在约4℃下。
表7. PCR反应条件
3、基因型结果输出
PCR反应完后，应用Taqman基因分型软件，根据单核苷酸多态性位点的不同等位基因的荧光信号强度进行聚类分析并报告基因型。基因分型结果以excel表格输出。
三、试剂盒的效果分析
对于本申请所述的试剂盒的效果，本申请人通过灵敏度(Sensitivity)、特异度(Specificity)和受试者工作特性(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线等对基于遗传因素和环境因素构建的主要不良心血管事件(MACE)预测模型的拟合效果进行分析。
1、募集受试者
募集的受试者为1837个冠心病病人，包括具有完整临床表型信息的171例主要不良心血管事件(MACE)病人和1666例未出现MACE终点病人，其中，病人的临床表型信息包括：1.病人特征：性别、年龄、身体质量指数(body-mass index，BMI)、既往心肌梗死史(previous myocardial infarction，MI)、糖尿病(diabetes mellitus)、高血压(hypertension)；2.终点事件发生前的用药情况：血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting-enzyme inhibitor，ACEI)、血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptorblocker，ARB)、β-受体阻滞剂(β-blocker inhibitor，BBI)、钙通道抑制剂(calciumchannel blocker，CCB)、质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)、他汀类药物(statins)；3.住院期间的临床指标检测值：高密度脂蛋白胆固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol，LDLC)、甘油三脂(Triglyceride)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，CREA)、肌酸激酶及其同工酶(creatinekinase and creatine kinase MB，CK and CKMB)。加起来总共有20个临床表型数据信息。
2、构建预测模型
我们使用机器学习中的支持向量机(SVM)方法来进行建模，在机器学习领域，支持向量机SVM(Support Vector Machine)是一个有监督的学习模型，通常用来进行模式识别、分类、以及回归分析。SVM涉及的知识面非常广，目标函数、优化过程、并行方法、算法收敛性、样本复杂度等。在本实施例中，我们使用SVM建模方法来构建MACE分类器，进而实现预测病人是否发生主要心血管不良事件(MACE)。我们使用R语言的SVM建模方法来实现此过程。使用SVM需安装e1071包。然后就是调用svm功能函数：
svm(x,y＝NULL,scale＝TRUE,type＝NULL,kernel＝"radial",degree＝3,gamma＝if(is.vector(x))1else 1/ncol(x),coef0＝0,cost＝1,nu＝0.5,subset,na.action＝na.omit)
此处，x可以是一个数据矩阵，也可以是一个数据向量，同时也可以是一个稀疏矩阵。y是对于x数据的结果标签，它既可以是字符向量也可以为数值向量。x和y共同指定了将要用来建模的训练数据以及模型的基本形式。在本实施例中，我们是这么定义x和y的：(1)y表示MACE是否发生，是字符变量，用0和1表示，1代表发生MACE，0代表未发生MACE；(2)x表示特征值数据矩阵，那么用于训练的特征值分成3部分，分别是1)流行病学因素，也就是上述提到的所有的20个临床表型数据信息；2)遗传风险因素，也就是本发明所述的与MACE显著相关的17个SNPs位点的基因型数据；3)综合因素，即结合了流行病学因素和遗传风险因素的综合因素，也就是结合了所有的20个临床表型数据和17个SNPs位点的基因型数据的综合数据。在本实施例中，依据数据特征，type参数选取C-classification，kernel参数选取radial，gamma值为0.015625，cost值为2，其余参数为默认值。然后，如实施例1中所述，选取第一阶段和第二阶段所有的1871个病人样品(174个发生MACE事件病人和1697个对照病人)作为训练集分别对3部分特征值的数据进行训练，然后得到三种预测模型，分别是(1)流行病学因素预测模型；(2)遗传风险因素预测模型；(3)结合流行病学因素和遗传风险因素的综合因素预测模型。
3、评估预测模型准确性
运用本发明提供的检测试剂盒得到上述1中提到的1837个受试者的用于预测MACE的17个SNPs位点的基因型，然后把这1837个受试者的17个SNPs位点的基因型数据作为遗传风险因素代入遗传风险因素预测模型，把1837个受试者的20个临床表型数据作为流行病学因素代入流行病学因素预测模型，把1837个受试者的17个SNPs位点的基因型数据作为遗传风险因素和20个临床表型数据作为流行病学因素代入综合因素预测模型，从而分别基于这3种模型获得预测MACE发生风险的数据，然后将所预测的MACE的发生风险数据和受试者是否真的发生MACE的真实情况进行比较，从而评估这3种模型的准确性。三种模型的ROC曲线拟合准确性见图2，预测的综合特性结果如表8所示；图2及表8结果显示：三种模型的预测准确性都很好；具体地，基于本发明所述的17个SNP位点的遗传风险因素的预测模型的AUC为86％，比基于流行病学因素的预测模型的AUC(79％)要高7个百分点，而同时基于流行病学因素和17个SNP位点遗传风险因素的综合因素预测模型的灵敏度和特异度分别达到了较高的值，其模型准确度也最好，AUC值为87％。
表8. AUC(曲线下面积)评估基于不同因素的发病风险预测模型
综上可得，包含了受试者流行病学因素和遗传风险因素的综合因素预测模型的预测准确度最高；也即，使用该综合因素预测模型并且基于本发明所述的17个SNP位点的基因型数据以及相应的临床表型数据，可以准确地预测受试者发生主要不良心血管事件(MACE)的风险，其准确性可达87％。
使用上述综合因素预测模型，发明人预测了多名受试者发生主要不良心血管事件(MACE)的风险，其预测准确性可高达87％，表明：本发明所述的17个SNP位点的基因型数据可以用于预测主要不良心血管事件(MACE)的发生风险，具有高的预测准确性。
综上所述，本申请所述的试剂盒可应用于预测主要不良心血管事件(MACE)的发生，将所得到的17个SNP位点的基因型数据和临床表型数据代入本申请提及的综合因素模型，能够预测受试者发生主要不良心血管事件(MACE)的风险，其准确性已达到了87％。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点及其应用
<130> BY20DX1456FGPC-CN
<160> 85
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或t
<400> 1
acaacagtcc cgcagacttt ctcttgtttt tttctctcca agggcagact ttgacgacac 60
ntgcgacata ctcagcagtg gccaccaatg cccacggaca agtgtccacc aacgcggcgg 120
t 121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为a或g
<400> 2
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<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为a或g
<400> 3
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<211> 121
<212> DNA
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<220>
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<222> (61)..(61)
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<400> 4
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<212> DNA
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<220>
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<223> n为c或t
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<212> DNA
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<220>
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<222> (61)..(61)
<223> n为c或t
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<212> DNA
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<400> 7
ccggtgccca tctctgacag cttcctctct cccacagtgc catggcagtg gagtcattca 60
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<211> 121
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<220>
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atattttaat gttttaaata tgacttattg aacttaattg aactacagaa atgcaaatga 60
ncacatttat aagccaataa tctggaaaat tcaataacag catttgcaaa gagaataacc 120
t 121
<210> 11
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或t
<400> 11
atcgcctcct acacattgcc tcctatccct ggactccagg acaagtggga agagaaagct 60
ngggagggta agtcctttga catcttctgc gatgtgggtc acatggcgct gaacacactc 120
a 121
<210> 12
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或g
<400> 12
cttgtgtctt tcctcaggaa tctaaggccg ctgctccagc tcctgtgtcg gaggctgtgt 60
ntcggacctc catgtgtagt atacagtcag caccccctga gccggctacc ttggtgagtg 120
a 121
<210> 13
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或t
<400> 13
gtgaggaatc aaaagcatcc cacagcagcc cagatgcaat ggcaacaaca gtcttacctg 60
ncggctctac accctcagtt cttgttggag actcgacgcc ctcacccatc agttcaggct 120
c 121
<210> 14
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为g或t
<400> 14
tccccaccat ggtcttgctt cttctctgcc ctaaacctaa cctgtcactg gcagcctcca 60
nacaggtctg agctgtctgg ttaaagctac agcagcttct ggcctggccc aactggaggt 120
c 121
<210> 15
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或g
<400> 15
attattaccc aaagcatctc aaagaatagg tttttcagta agggtcagac tgaggtggta 60
naagagccct gagaagttga gttggtgacc ccaggcatct gtggttaact gtcaacactc 120
a 121
<210> 16
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为c或t
<400> 16
ttgtgtttct tgtgatgact gggaagggtt aagaatgcta ttttcccttt ttcctctgtt 60
ntcattgcag aaccaattcc gggtaagctt ggatctctct ccgacagcac tgcagccctc 120
a 121
<210> 17
<211> 121
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 等位基因
<222> (61)..(61)
<223> n为a或g
<400> 17
ccagattatc atggagaaac ttctccggac cgtgaaccga accgtcattt ccatgggacg 60
ngattctgaa ctcattgtaa gtgcttggtg acatatgttt ggatatttaa ctggggctga 120
c 121
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 18
tacacaacag tcccgcagac 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 19
gtggccactg ctgagtatgt 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 20
cagacgaccc tgaatgccc 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 21
agcaggtagt cggcaggta 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 22
tcagggaaga gatcttcatg cg 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 23
tcagggaaga gatcttcatg cg 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 24
tgcccaatac caatctgtcc c 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 25
cctgaaagct cagcttggcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 26
ttggctccct ttttagtgat 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 27
ttacaggctt tatgaagtgc 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 28
ctgtgcatta caaaactcaa c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 29
taggcagata gtgactctcg t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 30
ggtgcccatc tctgacagct t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 31
ctgagactta cctgacgaga g 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 32
ctattgccca ctatgaacag c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 33
tccacatctt tgaaggaact c 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 34
attgacctag aagctgagaa g 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 35
gttgttctcc ttttgctcca c 21
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 36
ggagtcatgt ggtcaatatt tta 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 37
ctatacaacc acaaacatga agg 23
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 38
atcgcagaag atgtcaaagg ac 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 39
ctggactcca ggacaagtgg g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 40
gtgtctttcc tcaggaatct a 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 41
ttctcaagcc actgctcaaa t 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 42
tcaggccgta gtgaggaatc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 43
ctccaacaag aactgagggt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 44
tctgccctaa acctaacctg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 45
tgctgtagct ttaaccagac 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 46
ccaaagcatc tcaaagaata gg 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 47
tggggtcacc aactcaactt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 48
gactgggaag ggttaagaat 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 49
tggctgaggc agggacttct 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 50
agttggagaa ggatgctgtc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 51
cagaggcacg tccagattat 20
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 52
tgacgacacc tgcgac 16
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 53
tgacgacact tgcgac 16
<210> 54
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 54
ccccactgtc ggc 13
<210> 55
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 55
ccccattgtc ggc 13
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 56
ccaaattacg ttgggtttc 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 57
ccaaattaca ttgggtttc 19
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 58
acctcaggat atgatt 16
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 59
acctcagcat atgatt 16
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 60
tgattaacta actaaatg 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 61
tgattaatta actaaatg 18
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 62
agaggtttca aattttacat 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 63
agaggtttta aattttacat 20
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 64
tcattcatgg caacagc 17
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 65
tcattcacgg caacagc 17
<210> 66
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 66
cagaaaccct ccag 14
<210> 67
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 67
cagaaagcct ccag 14
<210> 68
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 68
agcactatag ctgg 14
<210> 69
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 69
agcactgtag ctgg 14
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 70
caaatgaaca catttat 17
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 71
caaatgagca catttat 17
<210> 72
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 72
ccctcccaag ctttc 15
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 73
ccctcccgag ctttc 15
<210> 74
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 74
ctgtgtctcg gacc 14
<210> 75
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 75
ctgtgtgtcg gacc 14
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 76
ttacctgccg gctcta 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 77
ttacctgtcg gctcta 16
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 78
cctccagaca ggtctg 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 79
cctccataca ggtctg 16
<210> 80
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 80
tggtacaaga gccc 14
<210> 81
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 81
tggtagaaga gccc 14
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 82
ctctgttctc attgc 15
<210> 83
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 83
ctctgttttc attgc 15
<210> 84
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 84
cagaatctcg tccc 14
<210> 85
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 85
cagaatcccg tccc 14
Claims (2)
1.引物对和探针对在制备用于预测受试者发生主要不良心血管事件的试剂盒中的用途，所述引物对用于扩增与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点，所述探针对用于检测与主要不良心血管事件相关的单核苷酸多态性位点，所述引物对为：
用于扩增rs17064642位点的引物对SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19；
用于扩增rs11640115位点的引物对SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21；
用于扩增rs74569896位点的引物对SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23；
用于扩增rs4736529位点的引物对SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25；
用于扩增rs3851808位点的引物对SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27；
用于扩增rs188799位点的引物对SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29；
用于扩增rs2340917位点的引物对SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
用于扩增rs1048425位点的引物对SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
用于扩增rs7913176位点的引物对SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；
用于扩增rs11228762位点的引物对SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37；
用于扩增rs4646487位点的引物对SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
用于扩增rs754615位点的引物对SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；
用于扩增rs4729631位点的引物对SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43；
用于扩增rs28384507位点的引物对SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；
用于扩增rs60257337位点的引物对SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47；
用于扩增rs2241046位点的引物对SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
用于扩增rs1060561位点的引物对SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；
所述引物对用于接受了经皮冠状动脉介入治疗的受试者；
所述探针对为：
用于检测rs17064642位点的探针对SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53；
用于检测rs11640115位点的探针对SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；
用于检测rs74569896位点的探针对SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57；
用于检测rs4736529位点的探针对SEQ ID NO: 58和SEQ ID NO: 59；
用于检测rs3851808位点的探针对SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 61；
用于检测rs188799位点的探针对SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 63；
用于检测rs2340917位点的探针对SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65；
用于检测rs1048425位点的探针对SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67；
用于检测rs7913176位点的探针对SEQ ID NO: 68和SEQ ID NO: 69；
用于检测rs11228762位点的探针对SEQ ID NO: 70和SEQ ID NO: 71；
用于检测rs4646487位点的探针对SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 73；
用于检测rs754615位点的探针对SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75；
用于检测rs4729631位点的探针对SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 77；
用于检测rs28384507位点的探针对SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79；
用于检测rs60257337位点的探针对SEQ ID NO: 80和SEQ ID NO: 81；
用于检测rs2241046位点的探针对SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 83；
用于检测rs1060561位点的探针对SEQ ID NO: 84和SEQ ID NO: 85；
所述探针对用于接受了经皮冠状动脉介入治疗的受试者；
所述主要不良心血管事件为心源性死亡，中风，心肌梗死和血运重建。
2.一种预测受试者发生主要不良心血管事件的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对和探针对。
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