CN111657861A - 基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法 - Google Patents

基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，包括以下步骤：(1)、建立活体动物清醒状态下的脑血栓动物模型；脑血栓动物模型包括动脉血栓模型和静脉血栓模型；(2)、采用异硫氰酸荧光素对溶栓药物进行荧光标记，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；(3)、在脑血栓动物模型的尾静脉注射异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；(4)、检测溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化，观察溶栓药物处理后血氧压力的变化；(5)、观察溶栓药物处理后脑梗死区域的变化，判断血栓影响的脑区范围；(6)、根据上述结果判断溶栓药物药效。本发明具有能够直接对溶栓药物药效作出评价的特点。

Description

基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法
技术领域
本发明涉及一种溶栓药效评价方法，特别是一种基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法。
背景技术
随着我国人口老龄化进程不断加快，脑中风发病率逐年增多，2018年我国脑中风患者已达1242万，其中脑血栓引起的中风占中风病人比例的50％，成为危害我国中老年人健康水平的重大疾病,该病致残率较高，给病人造成巨大的痛苦，给家人和社会也造成极大的负担。血栓的主要成分之一是纤维蛋白，溶栓药物能够直接或者间接激活纤溶酶原变成纤溶酶，纤溶酶能够降解纤维蛋白(原)，促进血栓的裂解并达到开通血管的目的。溶栓治疗是通过溶解动脉或者静脉血管中的新鲜血栓使血管再通，从而部分或者完全恢复组织和器官的血流灌注，达到减轻患者症状并改善患者预后的目的。在溶栓药物开发过程中，形成了多种溶栓药效评价方法，主要有体外细胞培养法、组织染色法和体内试验法：细胞培养法为塑料和玻璃表面培养内皮细胞，血管内皮细胞作为一种抗血栓形成细胞，其分泌的生物活性物质在抗凝、纤溶和抗血小板活化方面具有重要意义。细胞内加入溶栓药物后，检测药物对内皮细胞的抗凝和纤溶功能的影响；组织染色法是利用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈现红色，梗塞组织呈白色，通过计算梗塞面积间接确定溶栓效果；体外试验方法简便，敏感性高，比体内试验法用药量少，结果判断更加直接，尤其适用于大样本筛选，可初步确定被研究对象能否产生药理作用；但体外方法不能提供细胞正常发育所需的微环境，信号转导、分化机制和药物应答方面与实际存在不同；体内试验法主要利用疾病动物模型，即建立血栓动物模型，观察动物行为障碍程度，然后对血栓动物施加药物，观察四肢肌张力的变化等行为。体内试验反映的药效结果可靠性大，与临床实际治疗应用比较接近，所以体内试验结果往往是药效评价的主要指标，但是只能通过动物动作行为的变化间接判断药物的疗效，不能实时观察药物处理后到脑内血栓的动态变化，血流动力学的变化以及血管形态的变化。因此，现有的技术存在着无法直接对溶栓药物药效作出评价的问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法。本发明具有能够直接对溶栓药物药效作出评价的特点。
本发明的技术方案：基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，包括以下步骤：
(1)、建立活体动物清醒状态下的脑血栓动物模型；脑血栓动物模型包括动脉血栓模型和静脉血栓模型；
(2)、采用异硫氰酸荧光素对溶栓药物进行荧光标记，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(3)、在脑血栓动物模型的尾静脉注射异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(4)、实时观察溶栓药物流向、聚集位置和作用过程，检测溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化，观察溶栓药物处理后血氧压力的变化；
(5)、观察溶栓药物处理后脑梗死区域的变化，判断血栓影响的脑区范围；
(6)、根据溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化情况、溶栓药物处理后血氧压力的变化情况以及溶栓药物处理后脑梗死区域的变化情况，判断溶栓药物药效。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，脑血栓动物模型的具体建立方法为：在活体动物的脑内150-200μm处选择目标血管进行飞秒脉冲激光光刺激，利用脉冲激光的能量灼烧内皮细胞，使血管内产生血栓级联反应，形成微血栓；
飞秒脉冲激光光刺激的具体过程为：采用800nm的激光对目标血管进行光刺激，初始刺激时间为5s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激3s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激2s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激1s，直至形成血栓。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分方法：采用双光子显微镜XT扫描模式，对目标血管的血流进行线扫描，扫描线段与血管走向平行，先确定线扫描起始点位置，再根据无荧光信号的红细胞运动轨迹确定血流方向；采用双光子显微镜的XYZ三维序列扫描模式对目标血管进行三维扫描，根据XYZ三维扫描结果确定血管分布以及与周围血管的分支情况；最后根据目标血管的血流方向以及它与周围血管的位置关系，判断动静脉，以此来达到动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，所述溶栓药物为阿替普酶；
步骤(2)中，溶栓药物经异硫氰酸荧光素进行荧光标记方法为：在pH值为9.0-9.3的碱性条件下，将异硫氰酸荧光素中的异硫氰基与溶栓药物中的自由氨反应，生成异硫氰酸荧光素连接的溶栓药物；
具体的荧光标记过程为：首先，使用反应溶液溶解溶栓药物，配制成终浓度为10mg/ml的蛋白溶液，再加入异硫氰酸荧光素，置于暗室，避光4℃反应2-12h后，加入5mol/L的NH4Cl至终浓度为50mmol/L后终止反应，得到终止溶液；将终止溶液置于透析袋中，1XPBS透析，每隔2h更换透析液，至透析液清亮，酶标仪下检测无异硫氰酸荧光素信号检出，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，异硫氰酸荧光素与溶栓药物之间的质量比为1：50-1：80。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，反应溶液为碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液的pH值为9.0-9.3，碳酸盐缓冲液包括以下组分：Na2CO3，8.6g；NaHCO3，17.3g；蒸馏水，1000ml。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，测量溶栓药物处理后血流动力学变化的具体方法：通过计算红细胞的运动距离量化血流速度，确定血栓形成后血流速变化的程度；
血流速度测量方法如下：尾静脉注射Texas-red dextran荧光染料，利用Texas-red dextran荧光染料特异性标记血浆，血浆部分发出红色荧光，红细胞则呈现黑色；当采用双光子显微镜XT扫描模式进行线扫描，扫描速度为10us/pix,扫描桢数大于1000，扫描线段与血管走向平行，根据线扫描后，红细胞的运动形成了一条黑色暗影，通过计算单位时间内红细胞的运动距离确定血流速度。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，溶栓药物处理后血管形态变化的检测方法：利用双光子显微镜时间序列扫描实时观察溶栓药物的流向和聚集位置，扫描速度为2us/pix,扫描时间为10min；观察目标血管分别在溶栓药物处理后的1小时、2小时和6小时三个时间段观察溶栓药物流向和分布的变化，栓塞部位溶栓药物浓度的变化；同时，利用双光子显微镜分别在上述三个时间段进行三维Z序列扫描，重建脑内血管的三维结构，观察血栓溶解情况以及血管形态变化，观察溶栓药物对不同血栓类型的作用效果。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，测量溶栓药物处理后目标血管氧压变化的具体方法：利用公式计算局部区域的氧压P02，1/T＝1/T0+kq P02，其中，kq为光敏剂分子淬灭常数，T为有氧环境下的荧光淬灭时间，T0为无氧环境下的荧光淬灭时间；
荧光淬灭时间的获取方法：通过尾静脉注射ptp-c343,将光敏剂置于待测环境中，用860nm的激发光照射，在激发光停止时记录磷荧光的淬灭过程，淬灭过程中的荧光信号被转化成电信号并利用双光子显微镜进行采集，通过计算信号开始到信号消失的时间差，即可获得荧光淬灭时间。
前述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法中，判断血栓影响的脑区范围的具体方法为：在血栓建立时和溶栓药物处理24小时后这两个阶段分别制作血栓脑切片和处理后脑切片，对血栓脑切片和处理后脑切片分别进行TTC组织染色，在双光子显微镜下观察染色后的血栓脑切片和处理后脑切片，判断血栓影响的脑区范围。
与现有技术相比，本发明以脑血栓小鼠模型为研究对象，通过运用双光子显微镜光操纵技术，实现脑内100-200μm处单根血管的堵塞，分别建立与人类想接近的脑动脉和静脉血栓动物模型；利用双光子显微镜量化形成血栓前后血流速度和血氧含量的降低程度，确定血栓周围受影响的脑区范围。然后施加溶栓药物，测量上述参数的变化和溶栓效果，并实时观察溶栓过程，从而建立一套能够直接对溶栓药物药效作出评价的方法。
具体的，本发明利用双光子激发产生的热能，利用双光子脉冲波的能量冲击血管，用血浆介导的烧灼，其产生的能量破坏内皮细胞，产生血栓级联反应，在目标血管上形成血栓；并通过采用双光子显微镜的XT线扫描和XYZ序列扫描相结合的方式确定动静脉血管，从而可以精确的建立动脉血栓和静脉血栓动物模型。
本发明利用双光子显微镜具有的纵向分辨率和时间分辨率高以及光毒性小等优势，用于检测溶栓药物的疗效；并通过测量单根血管的血流动力学、血管形态和血氧压力的变化实时观察溶栓效果。
本发明通过实时观察溶栓过程，血管形态变化，血流动力学变化等参数，从而可以综合评价药物的溶栓疗效，为药物在临床试验中的有效性和安全性提供充分的实验依据，提升我国自主产权创新药物的研发能力。
综上所述，本发明具有能够直接对溶栓药物药效作出评价的特点。
附图说明
图1是活体小鼠脑内微血管壁的双光子显微镜成像；
图2是活体小鼠脑内微血管三维成像；
图3是血流的线扫描成像。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，包括以下步骤：
(1)、建立活体动物清醒状态下的脑血栓动物模型；脑血栓动物模型包括动脉血栓模型和静脉血栓模型；
(2)、采用异硫氰酸荧光素对溶栓药物进行荧光标记，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(3)、在脑血栓动物模型的尾静脉注射异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(4)、实时观察溶栓药物流向、聚集位置和作用过程，检测溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化，观察溶栓药物处理后血氧压力的变化；
(5)、观察溶栓药物处理后脑梗死区域的变化，判断血栓影响的脑区范围；
(6)、根据溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化情况、溶栓药物处理后血氧压力的变化情况以及溶栓药物处理后脑梗死区域的变化情况，判断溶栓药物药效。
脑血栓动物模型的具体建立方法为：在活体动物的脑内150-200μm处选择目标血管进行飞秒脉冲激光光刺激，利用脉冲激光的能量灼烧内皮细胞，使血管内产生血栓级联反应，形成微血栓；
飞秒脉冲激光光刺激的具体过程为：采用800nm的激光对目标血管进行光刺激，初始刺激时间为5s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激3s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激2s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激1s，直至形成血栓。
动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分方法：采用双光子显微镜XT扫描模式，对目标血管的血流进行线扫描，扫描线段与血管走向平行，根据无荧光信号的红细胞运动轨迹确定血流方向；采用双光子显微镜的XYZ三维序列扫描模式对目标血管进行三维扫描，先确定线扫描起始点位置，再根据XYZ三维扫描结果确定血管分布以及与周围血管的分支情况；最后根据目标血管的血流方向以及它与周围血管的位置关系，判断动静脉，以此来达到动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分。
所述溶栓药物为阿替普酶；
步骤(2)中，溶栓药物经异硫氰酸荧光素进行荧光标记方法为：在pH值为9.0-9.3的碱性条件下，将异硫氰酸荧光素中的异硫氰基与溶栓药物(阿替普酶IgG)中的自由氨反应，生成异硫氰酸荧光素连接的溶栓药物；
具体的荧光标记过程为：首先，使用反应溶液溶解溶栓药物，配制成终浓度为10mg/ml的蛋白溶液，再加入异硫氰酸荧光素，置于暗室，避光4℃反应2-12h后，加入5mol/L的NH4Cl至终浓度为50mmol/L后终止反应，得到终止溶液；将终止溶液置于透析袋(3kd)中，1X PBS透析，每隔2h更换透析液，至透析液清亮，酶标仪下检测无异硫氰酸荧光素信号检出，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物。
还可以将异硫氰酸荧光素标记溶栓药物冻干，得异硫氰酸荧光素标记溶栓药物冻干粉，方便后续使用。
异硫氰酸荧光素与溶栓药物之间的质量比为1：50-1：80(m:m)。
反应溶液为碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液的pH值为9.0-9.3，碳酸盐缓冲液包括以下组分：Na2CO3，8.6g；NaHCO3，17.3g；蒸馏水，1000ml。
测量溶栓药物处理后血流动力学变化的具体方法：通过计算红细胞的运动距离量化血流速度，确定血栓形成后血流速变化的程度；
血流速度测量方法如下：尾静脉注射Texas-red dextran荧光染料，利用Texas-red dextran荧光染料特异性标记血浆，血浆部分发出红色荧光，红细胞则呈现黑色；当采用双光子显微镜XT扫描模式进行线扫描，扫描速度为10us/pix,扫描桢数大于1000，扫描线段与血管走向平行，根据线扫描后，红细胞的运动形成了一条黑色暗影，通过计算单位时间内红细胞的运动距离确定血流速度。
黑色暗影斜率的倒数即为血流速度。
溶栓药物处理后血管形态变化的检测方法：利用双光子显微镜时间序列扫描实时观察溶栓药物的流向和聚集位置，扫描速度为2us/pix,扫描时间为10min；观察目标血管分别在溶栓药物处理后的1小时、2小时和6小时三个时间段观察溶栓药物流向和分布的变化，栓塞部位溶栓药物浓度的变化；同时，利用双光子显微镜分别在上述三个时间段进行三维Z序列扫描，重建脑内血管的三维结构，观察血栓溶解情况以及血管形态变化，观察溶栓药物对不同血栓类型的作用效果。
测量溶栓药物处理后目标血管氧压变化的具体方法：利用公式计算局部区域的氧压P02，1/T＝1/T0+kq P02，其中，kq为光敏剂分子淬灭常数，T为有氧环境下的荧光淬灭时间，T0为无氧环境下的荧光淬灭时间；
荧光淬灭时间的获取方法：通过尾静脉注射ptp-c343,将光敏剂置于待测环境中，用860nm的激发光照射，在激发光停止时记录磷荧光的淬灭过程，淬灭过程中的荧光信号被转化成电信号并利用双光子显微镜进行采集，通过计算信号开始到信号消失的时间差，即可获得荧光淬灭时间。
判断血栓影响的脑区范围的具体方法为：在血栓建立时和溶栓药物处理24小时后这两个阶段分别制作血栓脑切片和处理后脑切片，对血栓脑切片和处理后脑切片分别进行TTC组织染色，在双光子显微镜下观察染色后的血栓脑切片和处理后脑切片，判断血栓影响的脑区范围。
本发明的具体过程为：
(1)、建立稳定的脑血栓动物模型，并区分动脉血栓和静脉血栓：在脑内150-200μm处选择目标血管进行飞秒脉冲激光光刺激，利用脉冲激光的能量灼烧内皮细胞，使血管内产生血栓级联反应，形成微血栓。在刺激过程中，如果能量过高则会导致血管破裂，如果能量过低只能引起血液外渗，达到在血管内形成牢固血栓的目的。采用双光子显微镜XT扫描模式，对目标血管的血流进行线扫描，扫描线段与血管走向平行，根据无荧光信号的红细胞运动轨迹确定血流方向，根据目标血管的血流方向以及它与周围血管的位置关系，判断动静脉。判断依据如下：动脉是运送血液离开心脏的血管，从心室发出后，反复分支，越分越细，最后到达毛细血管，静脉起于毛细血管，在回心过程中逐渐汇合成中静脉、大静脉，最后注入心房。
(2)测量溶栓药物阿替普酶Alteplase处理前后血流动力学的变化：脑血栓形成后血流受阻，血流速度将发生改变，通过计算红细胞的运动距离量化血流速度，确定血栓形成前后血流速变化的程度。血栓形成后，实验组静脉注射溶栓药物阿替普酶Alteplase，对照组注射生理盐水，测量血流速度的变化情况。血流速度测量方法如下：尾静脉注射Texas-red荧光染料，染料特异性标记血浆，而不进入红细胞，所以血浆部分发出红色荧光，而红细胞则呈现黑色，当进行线扫描时，红细胞的运动形成了一条黑色暗影，黑色暗影斜率的倒数为血流速度。
(3)检测Alteplase处理前后血管形态的变化：脑内形成血栓时，在显微镜下表现为无荧光的栓塞部位被红色荧光包围并且血管直径增加，经药物处理后，分别在1小时，2小时，3小时后观察栓塞是否溶解，以及血管直径的变化情况。
(4)测量Alteplase处理前后目标血管氧压的变化：血栓形成后，微血管运输氧的能力下降，通过测量微血管的氧压的变化评价溶栓效果。通过尾静脉注射ptp-c343,将光敏剂置于待测环境(有氧环境和无氧环境)中，用相应的激发光照射，在激发光停止时记录磷荧光的淬灭过程，这一过程中的荧光信号被转化成电信号并高速采样，通过分析采样数据即可获得荧光淬灭时间T,荧光寿命与氧压关系可以用Stern-Volmer方程来描述：1/T＝1/T0+kqPO2,其中kq为光敏剂分子淬灭常数(Stern—Volmer常数)，T为有氧环境下的荧光淬灭时间，T0为无氧环境下的荧光淬灭时间，通过测量荧光淬灭的时间，即可计算出局部区域的氧压。荧光淬灭法能够精确的检测氧压值，分辨率达到微米级。
(5)观察溶栓药物处理前后脑梗死区域的变化：微血管形成血栓后，周围组织由于缺氧将会产生损伤，为了确定血栓影响的范围，分别在血栓建立和药物处理24后小时后制作脑切片，进行TTC组织染色，双光子显微镜下观察脑片，判断血栓影响的脑区范围。
所用到的设备：正置双光子显微镜(MaiTai飞秒激光器，波长700-1000连续可调，Olymupus正置双光子显微镜型号：BX61W1-FV1000,四通道多光子荧光探测器，25X双光子显微镜专用镜头，fv1000驱动软件)；倒置共聚焦显微镜；转盘式共聚焦显微镜；脑立体定位仪。
活体动物采用模式生物TIE2-GFP转基因小鼠用于研究脑微血管损伤，作为重要的转基因工具小鼠，TIE2-GFP转基因小鼠具有稳定的微血管绿色荧光蛋白表达，可以采用双光子在体实时脑微血管血流检测并结合免疫荧光组化方法开展脑微循环关联研究。
颅骨开窗手术时，将麻醉的小鼠用剃须刀剃去头部表面的毛发，剪去头皮，除去表面的筋膜，立体定位仪进行固定，用牙科电钻小心的打磨待观察区域的头骨，打磨区域大约为6x6mm的圆孔，待头骨边缘呈半透明状态后轻轻按压头骨，观察到边缘软化即可停止，用眼科弯镊小心地从边缘夹取头骨边缘将其轻轻地掀掉，期间用人工脑脊液多次清洗窗口，直至没有血液出现。将配好的琼脂糖凉至室温，滴到开窗的脑表面，盖上盖玻片。
图2为活体小鼠大脑皮层以下300μm处检测的血管壁，利用双光子显微镜25X专用物镜(NA 1.05)成像，扫描参数为：激光强度22％，PMT电压值581,offset 8。
图2为尾静脉注射Texas-red dyes后对血流进行双光子成像，860nm激发光激发，用不同探测器接收荧光信号，血管壁显示绿色荧光(如图3中白色部分)，血浆显示红色荧光(如图3中灰色部分)。
图3为血流的线扫描成像：利用双光子显微镜对血流进行XT线扫描，扫描结果如图3所示，其中黑色部分为红细胞的定位，红细胞随着时间发生位置改变，根据黑色区域的斜率计算红细胞的运动速度，得出血流速度，红色区域为被标记上颜色的血清。
上述方法也可以应用于新药筛选：根据重大疾病的发病机制和解析重要分子事件，结合荧光探针和转基因动物，围绕硝化应激等药物靶标开展药物筛选，目前已经成功发现了候选小分子化合物并开展了临床前试验。一直以来，我国在新药研制和评价脑血栓手段上有限，如果能将双光子应用于此领域，实时跟踪药物对脑血流灌注的影响和药物代谢过程，将大大扩展新药的评价手段，同时也能确保医药更加安全有效。

Claims (10)

1.基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、建立活体动物清醒状态下的脑血栓动物模型；脑血栓动物模型包括动脉血栓模型和静脉血栓模型；
(2)、采用异硫氰酸荧光素对溶栓药物进行荧光标记，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(3)、在脑血栓动物模型的尾静脉注射异硫氰酸荧光素标记溶栓药物；
(4)、实时观察溶栓药物流向、聚集位置和作用过程，检测溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化，观察溶栓药物处理后血氧压力的变化；
(5)、观察溶栓药物处理后脑梗死区域的变化，判断血栓影响的脑区范围；
(6)、根据溶栓药物处理后血流动力学和血管形态变化情况、溶栓药物处理后血氧压力的变化情况以及溶栓药物处理后脑梗死区域的变化情况，判断溶栓药物药效。
2.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，脑血栓动物模型的具体建立方法为：在活体动物的脑内150-200μm处选择目标血管进行飞秒脉冲激光光刺激，利用脉冲激光的能量灼烧内皮细胞，使血管内产生血栓级联反应，形成微血栓；
飞秒脉冲激光光刺激的具体过程为：采用800nm的激光对目标血管进行光刺激，初始刺激时间为5s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激3s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激2s；若无法形成血栓，采用同等强度的激光再对目标血管刺激1s，直至形成血栓。
3.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分方法：采用双光子显微镜XT扫描模式，对目标血管的血流进行线扫描，扫描线段与血管走向平行，先确定线扫描起始点位置，再根据无荧光信号的红细胞运动轨迹确定血流方向；采用双光子显微镜的XYZ三维序列扫描模式对目标血管进行三维扫描，根据XYZ三维扫描结果确定血管分布以及与周围血管的分支情况；最后根据目标血管的血流方向以及它与周围血管的位置关系，判断动静脉，以此来达到动脉血栓模型和静脉血栓模型的区分。
4.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于：所述溶栓药物为阿替普酶；
步骤(2)中，溶栓药物经异硫氰酸荧光素进行荧光标记方法为：在pH值为9.0-9.3的碱性条件下，将异硫氰酸荧光素中的异硫氰基与溶栓药物中的自由氨反应，生成异硫氰酸荧光素连接的溶栓药物；
具体的荧光标记过程为：首先，使用反应溶液溶解溶栓药物，配制成终浓度为10mg/ml的蛋白溶液，再加入异硫氰酸荧光素，置于暗室，避光4℃反应2-12h后，加入5mol/L的NH4Cl至终浓度为50mmol/L后终止反应，得到终止溶液；将终止溶液置于透析袋中，1X PBS透析，每隔2h更换透析液，至透析液清亮，酶标仪下检测无异硫氰酸荧光素信号检出，得到异硫氰酸荧光素标记溶栓药物。
5.根据权利要求4所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于：异硫氰酸荧光素与溶栓药物之间的质量比为1：50-1：80。
6.根据权利要求4所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于：反应溶液为碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液的pH值为9.0-9.3，碳酸盐缓冲液包括以下组分：Na2CO3，8.6g；NaHCO3，17.3g；蒸馏水，1000ml。
7.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，测量溶栓药物处理后血流动力学变化的具体方法：通过计算红细胞的运动距离量化血流速度，确定血栓形成后血流速变化的程度；
血流速度测量方法如下：尾静脉注射Texas-red dextran荧光染料，利用Texas-reddextran荧光染料特异性标记血浆，血浆部分发出红色荧光，红细胞则呈现黑色；当采用双光子显微镜XT扫描模式进行线扫描，扫描速度为10us/pix,扫描桢数大于1000，扫描线段与血管走向平行，根据线扫描后，红细胞的运动形成了一条黑色暗影，通过计算单位时间内红细胞的运动距离确定血流速度。
8.根据权利要求7所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，溶栓药物处理后血管形态变化的检测方法：利用双光子显微镜时间序列扫描实时观察溶栓药物的流向和聚集位置，扫描速度为2us/pix,扫描时间为10min；观察目标血管分别在溶栓药物处理后的1小时、2小时和6小时三个时间段观察溶栓药物流向和分布的变化，栓塞部位溶栓药物浓度的变化；同时，利用双光子显微镜分别在上述三个时间段进行三维Z序列扫描，重建脑内血管的三维结构，观察血栓溶解情况以及血管形态变化，观察溶栓药物对不同血栓类型的作用效果。
9.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，测量溶栓药物处理后目标血管氧压变化的具体方法：利用公式计算局部区域的氧压
Figure FDA0002523820880000041
其中，kq为光敏剂分子淬灭常数，T为有氧环境下的荧光淬灭时间，T0为无氧环境下的荧光淬灭时间；
荧光淬灭时间的获取方法：通过尾静脉注射ptp-c343,将光敏剂置于待测环境中，用860nm的激发光照射，在激发光停止时记录磷荧光的淬灭过程，淬灭过程中的荧光信号被转化成电信号并利用双光子显微镜进行采集，通过计算信号开始到信号消失的时间差，即可获得荧光淬灭时间。
10.根据权利要求1所述的基于双光子显微镜技术的溶栓药效评价方法，其特征在于，判断血栓影响的脑区范围的具体方法为：在血栓建立时和溶栓药物处理24小时后这两个阶段分别制作血栓脑切片和处理后脑切片，对血栓脑切片和处理后脑切片分别进行TTC组织染色，在双光子显微镜下观察染色后的血栓脑切片和处理后脑切片，判断血栓影响的脑区范围。
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