CN111655283A

CN111655283A - 用于人体的针对淋病奈瑟氏球菌脂寡糖(los)表位的人源化2c7单克隆抗体

Info

Publication number: CN111655283A
Application number: CN201880073736.8A
Authority: CN
Inventors: 皮特·A·赖斯; 苏尼塔·古拉蒂; 桑贾伊·莱姆
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2020-09-11
Also published as: EP3710048A4; WO2019099852A8; US20210188952A1; EP3710048A1; WO2019099852A1

Abstract

提供了能结合淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的2C7表位的人源化抗体。还提供了用于治疗有需要的受试者中的淋病奈瑟氏球菌感染的组合物和方法。

Description

用于人体的针对淋病奈瑟氏球菌脂寡糖(LOS)表位的人源化 2C7单克隆抗体

相关申请数据

本申请要求2017年11月17日提交的美国临时专利申请号62/588,001的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

联邦资助研究声明

本发明是由政府支持在国家健康研究院授予的资助号AI032725、AI058198、AI084048、AI114710、AI114790、AI118161和AI132296下完成的。政府享有本发明的某些权利。

领域

本公开涉及针对淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的小鼠2C7单克隆抗体的人源化变体及其使用方法。

背景

淋病奈瑟氏球菌是第二常见的细菌性传播感染(STI)；全世界发病率为每年7800万例。抗微生物剂用作淋病奈瑟氏球菌感染的常规治疗。然而，近来出现了对常用抗微生物剂的抗性。随着无法治疗的淋病奈瑟氏球菌感染的时代的可能性，迫切需要用于淋病奈瑟氏球菌感染的新治疗，特别是不是传统抗生素的治疗。

淋病奈瑟氏球菌的2C7表位是淋球菌表面上的糖结构，其先前被鉴定为用于预防淋病奈瑟氏球菌感染的有希望的靶标，因为淋球菌感染在人类受试者中引起IgG抗2C7表位抗体的显著增加(Gulati,S.等人，J Infect Dis 19961223-1237)。已经发现能结合淋病奈瑟氏球菌的2C7表位的小鼠单克隆抗体在体外研究中诱导淋球菌的杀伤和吞噬。先前的研究已经表明，小鼠2C7抗体的增强的杀菌活性是由于增强了对细菌的补体激活(Gulati,S.,PLoS Pathogens 2013 e1003559)。另外的研究鉴定了几个Fc区突变，其通过在不相关的IgG抗体中诱导六聚化来增强补体依赖性细胞毒性(WO2014/108198，在此通过引用并入)。

这些体外研究，以及该表位存在于94％的人生殖道中的淋球菌上，使得2C7成为治疗抗体的有希望的靶标(Gulati,S.等人,J Infect Dis 19961223-1237)。然而，先前发现的2C7抗体是鼠抗体，因此，考虑到在其中引起的人抗小鼠抗体(HAMA)应答，其不适合于在人受试者中重复施用。

因此，本领域存在对淋病奈瑟氏球菌进行非抗生素治疗的迫切需要。本领域还存在具有潜在治疗用途的鼠抗体的人源化变体的需要。

内容

本公开是基于发现用于治疗淋病奈瑟氏球菌感染的能结合淋病奈瑟氏球菌的特定表位(例如，2C7)的人源化单克隆抗体。在一个方面，本公开提供了能结合淋病奈瑟氏球菌抗原的2C7表位的人源化抗体，其中抗体包含可变重链(VH)结构域、可变轻链(VL)结构域和人Fc区，其中所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的HCDR-1、HCDR-2和HCDR3，和包含选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列的VH人受体框架，并且其中所述VL结构域包含选自SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3，和包含选自SEQ ID NO:8-12的氨基酸序列的VL人受体框架。

在另一方面，本文提供了能结合淋病奈瑟氏球菌抗原的2C7表位的人源化抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域、可变轻链(VL)结构域和人Fc区，其中所述VH结构域包含选自SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HCDR-1、HCDR-2和HCDR3，和包含与选自SEQ IDNO：2-6的氨基酸序列具有至少约90％同一性至约99％同一性的氨基酸序列的VH人受体框架，并且其中所述VL结构域包含选自SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3，和包含与选自SEQ ID NO:8-12的氨基酸序列具有至少约90％同一性至约99％同一性的氨基酸序列的VL人受体框架。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在人源化抗体的一实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在人源化抗体的其它实施方案中，人Fc区是包含改变一个或多个Fc功能的一个或多个突变的IgG1 Fc区。

在人源化抗体的其它实施方案中，一种或多种Fc功能选自Fc聚集、C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。

在人源化抗体的其它实施方案中，一个或多个Fc突变在选自345、430和440的一个或多个氨基酸残基处。

在人源化抗体的其它实施方案中，一个或多个Fc突变选自E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y和S440W。

在人源化抗体的其它实施方案中，一个或多个Fc突变选自E345R和E430G。

在人源化抗体的另一个实施方案中，一个或多个Fc突变增加CDC。

在人源化抗体的另一个实施方案中，一个或多个Fc突变增加Fc聚集。

在人源化抗体的另一个实施方案中，Fc聚集诱导聚集抗体的六聚化。

在人源化抗体的另一个实施方案中，一个或多个Fc突变增加CDC和Fc聚集。

在一个方面，本文提供了包含本文公开的人源化抗体和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

在另一方面，本文提供了编码本文公开的人源化抗体的氨基酸序列的核酸。

在另一方面，本文提供了包含本文公开的核酸的载体。

在另一方面，本文提供了包含本文公开的载体的宿主细胞。

在一实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

在一实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。

在一实施方案中，真核细胞选自酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

在一实施方案中，植物细胞是烟草植物细胞。

在一实施方案中，哺乳动物细胞是人胚肾(HEK)细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在一实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。

在另一方面，本文提供了产生能结合淋病奈瑟氏球菌抗原的2C7表位的人源化抗体的方法，该方法包括在足以产生人源化抗体的条件下在培养基中培养本文公开的宿主细胞的步骤。

在又一方面，本文提供了治疗有需要的受试者中的淋病奈瑟氏球菌感染的方法，其包括向受试者施用本文公开的抗体或本文公开的药物组合物。

在所述方法的一实施方案中，所施用的抗体或药物组合物改善淋病奈瑟氏球菌感染的清除。

在所述方法的一实施方案中，所施用的抗体或药物组合物保护受试者免受随后的淋病奈瑟氏球菌感染。

在所述方法的另一实施方案中，所施用的抗体或药物组合物改善淋病奈瑟氏球菌感染的清除并保护受试者免受随后的淋病奈瑟氏球菌感染。

在所述方法的另一实施方案中，淋病奈瑟氏球菌感染对抗生素具有抗性。

在所述方法的另一实施方案中，所述受试者是人。

上述公开内容的概述是非限制性的，并且从以下附图，本公开的详细描述和权利要求书中，所公开的装置和方法的其它特征和优点将是显而易见的。

附图的简要说明

图1A-C显示以等比例混合并接种到非免疫小鼠中的FA1090wt％和FA10901gtG％的选择性存活。图1A是显示FA1090wt％和FA10901gtG-在小鼠中的清除的卡普兰-梅尔图。图1B是显示FA1090wt％和FA10901gtG-在每日间隔的定殖的图。图1C是显示FA1090wt％和FA10901gtG％随时间变化的细菌负担的点图。

本公开的详细描述

本公开涉及小鼠单克隆抗体的人源化变体，其对淋病奈瑟氏球菌的2C7表位具有结合特异性。在某些实施方案中，人源化抗体在IgG1 Fc区中具有改变一种或多种Fc功能的一个或多个突变。

本公开还涉及用本文公开的人源化抗体治疗淋病奈瑟氏球菌感染的方法。在某些实施方案中，本发明的人源化抗体用于治疗抗生素抗性淋病奈瑟氏球菌。

应理解，本公开中描述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件；因为这样的方法和条件可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制。

此外，除非另有说明，本文所述的实验使用本领域技术人员内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这样的技术是本领域技术人员所熟知的，并且在文献中被充分解释。参见，例如，Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有补充物，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第四版)by MR Green和J.Sambrook以及Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,Chapter 14,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor(2013，第二版)。

除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在的多义性的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其它形式，例如“包括(includes)”和“包含(included)”的使用不是限制性的。如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数引用。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质分子。

通常，本文所述的与细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学，以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名法是本领域熟知和常用的命名法。本文提供的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述，除非另有说明。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常实现的或如本文所述。本文所述的与分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学相关使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备，配制和患者的递送和治疗。

定义

为了可以更容易地理解本公开，下面定义选择术语。

除非另有说明，术语“抗体”用于指完整的抗体以及这种抗体的抗原结合片段。例如，该术语包括四链IgG分子，以及抗体片段。

如本文所用，术语“抗体片段”是指完整全长抗体的部分，例如，如下文进一步描述的。抗体可以是任何种类，例如IgG,IgA或IgM；和任何亚类，例如IgG1或IgG4。免疫球蛋白的不同种类和亚类具有不同的性质，这在不同的应用中可能是有利的。例如，IgG4与Fc受体的结合降低。

如本文所用，术语“VH”是指抗体重链的可变区。

如本文所用，术语“VL”是指抗体轻链的可变区。

天然存在的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两条相同的轻链(约24kD)和两条相同的重链(约55或70kD)形成四聚体。每条链的氨基末端部分被称为可变区(V)，并且可以与每条链的其余部分的更保守的恒定区(C)区分开。在轻链的可变区(即VL结构域)内是称为J区的C-末端部分。在重链的可变区(即，VH结构域)内，除了J区之外还存在D区。免疫球蛋白中的大部分氨基酸序列变异限于V区中被称为高变区或互补决定区(CDR)的三个独立的位置，它们直接参与抗原结合。从氨基末端开始，将这些区域分别命名为CDR1,CDR2和CDR3。CDR由更保守的框架区(FR)保持在适当位置。从氨基末端开始，将这些区域分别命名为FR1,FR2,FRS和FR4。CDR和FR区的位置和编号系统已由Kabat等人定义(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991))。

在SEQ ID NO:2-6和8-12中列出了根据所述实施方案的人受体框架，其可用作本文所述的人源化2C7抗体的框架。可以从任何人抗体恒定区获得恒定区。例如，人IgG1 CH1,CH2和CH3恒定区的氨基酸序列在UniProt登录号P01857中示出。人抗体框架和恒定区可以从序列数据库中得到。例如，免疫球蛋白序列可在IMGT/LIGM数据库中获得(Giudicelli等人，(2006)Nucleic Acids Res.34:(增补1):D781-D784)或Vbase(vbase,mrc-cpe.cam.ac.uk)。

可以将根据所述实施方案的人源化抗体的可变区基因克隆到表达载体中与恒定区基因同框，从而表达重链和轻链免疫球蛋白链。可以使用的合适的载体是本领域熟知的，并且包括能够在宿主细胞生物体中复制的任何分子，人源化抗体的可变区基因可以插入其中。例如，人源化VL和VH区可以分别克隆到pMAZ-IGL和pMAZ-IGH表达载体中(Mazor Y,Barnea I,Keydar I等人，Antibody internalization studied using a novel IgGbinding toxin fusion.J Immunol Methods.2007；321:41–59)。在一实施方案中，pMAZ-IGL的k恒定区可以用λ恒定区序列替代以表达包含λ轻链的人源化抗体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可用于表达本文所述的人源化抗体的任何合适的宿主细胞生物体。合适的宿主细胞包括原核(例如大肠杆菌)和真核(例如酵母，植物，昆虫和哺乳动物)细胞。在一实施方案中，合适的宿主细胞是真核细胞。在特定的实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括HEK细胞和CHO细胞。在某些示例性实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。适于表达本文所述的人源化抗体的CHO细胞是本领域已知的，并且可从多种商业供应商获得，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA),PerkinElmer(Waltham,MA,USA),ThermoFisher Scientific(Waltham,MA,USA),Lonza(Basel,CH)等。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指由人抗体框架组成的抗体，其中移植了来自非人抗体的互补CDR。也可在人受体框架中进行改变。用于设计和生产人源化抗体的方法是本领域熟知的，并且已经在例如Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请0125 023；Boss等人，美国专利号4,816,397；Boss等人，欧洲专利申请0120 694；Neuberger,M.S.等人，WO86/01533；Neuberger,M.S.等人，欧洲专利申请0 194 276B1；Winter，美国专利号5,225,539；Winter，欧洲专利申请0 239 400；Padlan，E.A.等人，欧洲专利申请0 519 596中描述。关于抗体，人源化抗体，人工程化抗体及其制备方法的进一步细节可见于Kontermann,R.和Dubel,S.编辑，(2001,2010)Antibody Engineering，第二版，Springer-Verlag,New York,NY。

CDR移植抗体包含来自人抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区被鼠抗体的CDR序列替代。来自任何人抗体的框架序列可以用作CDR移植的模板。然而，在这种框架上的直链置换经常导致对抗原的结合亲和力的一些损失。人抗体与原始鼠抗体的同源性越高，鼠CDR与人框架结合将在CDR中引入可能降低亲和力的畸变的可能性越小。因此，在一实施方案中，经选择以取代除CDR以外的鼠可变框架的人可变框架与鼠抗体可变区框架具有至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，约100％的序列同一性。生产CDR-移植抗体的方法是本领域已知的，并且结合实施例中的这种CDR-移植抗体的人源化(还参见EP专利号EP 0 239 400；PCT公开号WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；贴面化(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP专利号EP 0 592 106和EP 0 519 596；Padlan(1991)mol.Immunol.28(4/5):489-498；Studnicka等人(1994)Protein Eng.7(6):805-814；Roguska等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973)和链改组(美国专利号5,565,352)进行了详细描述。

在本文所述的抗体的上下文中，特异性是指所要求保护的抗体能够选择性地结合其确定的同源抗原，例如淋病奈瑟氏球菌的2C7表位。

如本文所用，术语“2C7表位”是指淋病奈瑟氏球菌上高度保守的寡糖结构，即脂寡糖(LOS)的一部分。LOS是淋病奈瑟氏球菌外膜的关键成分。2C7表位由94％的人生殖道中的淋球菌表达。2C7表位的结构需要在LOS结构的庚糖I和II上取代乳糖(Gulati,S.等人，PLoS病原体2013e1003559)。已知2C7表位对于淋球菌感染是关键的，并且已知抗2C7表位的抗体引起细菌杀伤(Gulati,S.等人，PLoS病原体2013e1003559)。本文公开的人源化抗体对2C7表位具有结合特异性。

如本文所用，术语“Fc区”是指人源化抗体的Fc区。免疫球蛋白的Fc结构域被定义为抗体的片段，其通常在用木瓜蛋白酶消化抗体后产生，并且其包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。除非本文另有说明，Fc区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。

如本文所用，术语“六聚化”是指将IgG1单体转化为抗体六聚体的方法。如WO2014/108198(其通过引用并入本文)中所述，Fc-结构域的六聚化发生在通过含有Fc-结构域的多肽(例如抗体)，优选但不限于在细胞表面的靶标结合之后。抗体的六聚化可例如使用细胞表面C1q结合测定，C1q功效测定和补体依赖性细胞毒性测定来评估。

如本文所用，术语“C1q结合”是指在C1q与结合其抗原的抗体结合的上下文中C1q的结合。结合其抗原的抗体在本文所述的上下文中应理解为发生在体内和体外。C1q结合可例如通过使用固定在人工表面(例如，用于ELISA的板中的塑料，如实施例3中所述)上的抗体来评估。C1q与抗体寡聚物的结合在本文中应理解为导致高亲合力结合的多价相互作用。

如本文所用，术语“补体激活”是指经典补体途径的激活，其通过补体成分C1q与结合其抗原的抗体的结合来触发。C1q是涉及一系列切割反应的经典补体级联的早期事件中的第一蛋白质，所述切割反应在称为C3转化酶的酶活性(其将补体成分C3切割成C3b和C3a)的形成中结束。C3b与膜上的C5共价结合以形成C5b，其继而触发补体激活的晚期事件，其中末端补体成分C5b、C6、C7、C8和C9组装成膜攻击复合物(MAC)。由于引起细胞裂解，补体级联导致孔的产生，也称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。补体激活可通过使用C1q功效、CDC动力学、CDC测定(如WO2014/108198中所述，其通过引用并入本文中)或通过Beurskens等人在2012年4月1日的vol.188no.7 3532-3541中描述的C3b和C4b的细胞沉积的方法来评估。

如本文所用，术语“补体依赖性细胞毒性”(“CDC”)是指抗体介导的补体激活过程，该过程由于膜中由MAC组装产生的孔而导致与其靶结合的抗体对细胞或细菌的裂解。CDC可以通过体外测定来评估，例如如WO2014/108198(其通过引用并入本文中)中所述的正常人血清用作补体源的CDC测定，或者如WO2014/108198中所述的C1q功效测定，其中正常人血清被限制在C1q中。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“ADCC”)是指通过表达识别结合的抗体的恒定区的Fc受体的细胞杀伤抗体包被的靶细胞或细菌的机制。ADCC可以使用例如在WO2014/108198(其通过引用并入本文中)中描述的ADCC测定的方法测定。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞吞噬”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞内化而消除抗体包被的靶细胞或细菌的机制。内化的抗体包被的靶细胞或细菌包含在被称为吞噬体的囊泡中，其然后与一种或多种溶酶体融合以形成吞噬溶酶体。ADCP可以通过使用体外细胞毒性测定，利用作为效应细胞的巨噬细胞和视频显微术来评估，如van Bij等人在Journalof Hepatology Volume 53,Issue 4,October 2010,Pages 677-685中所述，或如WO 2014/108198(其通过引用并入本文中)中所述。

如本文所用，术语“补体依赖性细胞毒性”(“CDCC”)是指通过表达补体受体的细胞杀伤靶细胞或细菌的机制，所述补体受体识别由于抗体-介导的补体激活而共价结合至靶细胞或细菌的补体3(C3)切割产物。CDCC可以以与ADCC所述类似的方式进行评估。

如本文所用，术语“效应细胞”是指参与免疫应答的效应阶段(与免疫应答的识别和激活阶段相对)的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))，杀伤细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，多形核细胞，如嗜中性粒细胞，粒细胞，肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达Fc受体(FcR)或补体受体并执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞例如自然杀伤细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，树突细胞和枯否细胞参与靶细胞的特异性杀伤，并将抗原呈递给免疫系统的其它成分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，可以通过抗体驱动的经典补体激活从而导致激活的C3片段沉积在靶细胞上来进一步增强ADCC。C3切割产物是在髓样细胞上表达的补体受体(CR)如CR3的配体。效应细胞上的CR对补体片段的识别可促进Fc受体介导的ADCC的增强。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活在靶细胞上产生C3片段。这些C3切割产物可促进直接的补体依赖性细胞毒性(CDCC)。在一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原，靶颗粒或靶细胞。效应细胞上的特定FcR或补体受体的表达可以通过体液因子如细胞因子来调节。例如，已经发现FcyRI的表达被干扰素γ(IFNγ)和/或G-CSF上调。这种增强的表达增加了携带FcyRI的细胞对靶标的细胞毒性活性。效应细胞可吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活在靶细胞上产生C3片段。这些C3切割产物可通过效应细胞促进直接的吞噬作用，或通过增强抗体介导的吞噬作用间接促进吞噬作用。

在本发明的上下文中，变体中的取代或突变表示为：原始氨基酸-位置-取代的氨基酸。为了指示每个氨基酸，使用三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X。因此，符号“E345R”或“Glu345Arg”是指变体在对应于亲本抗体的第345位氨基酸的变体氨基酸位置上包含谷氨酸被精氨酸的取代。同样，如果位置不存在于抗体中，而是变体包含氨基酸的插入，则例如：位置-取代的氨基酸；符号，例如“448E”。这种符号与一系列同源多肽或抗体中的修饰特别相关。类似地，当取代氨基酸残基的身份不重要时：原始氨基酸位置；或“E345”。对于其中原始氨基酸和/或取代的氨基酸可包含一种以上但不是全部氨基酸的修饰，在第345位谷氨酸被精氨酸、赖氨酸或色氨酸取代：“Glu345Arg、Lys、Trp”或“E345R、K、W”或“E345R/K/W”或“E345至R、K或W”，在本发明的上下文中可以互换使用。此外，术语“取代”包括至其它19种天然氨基酸中的任一种的取代，或至其它氨基酸，例如非天然氨基酸的取代。例如，第345位的氨基酸E的取代包括以下取代中的每一种：345A,345C,345D,345G,345H,345F,3451,345K,345L,345M,345N,345Q,345R,345S,345T,345V,345W和345Y。顺便提及，这等同于命名345X，其中X表示任何氨基酸。这些取代也可以称为E345A,E345C等，或E345A,C等，或E345A/C/等。这同样适用于本文提及的每个位置的类似的情况，尤其包括本文中的任何一种这样的取代。

对于本领域技术人员来说，很明显，在不脱离本文所公开的实施方案的范围的情况下，可以使用适当的等同物进行本文所描述的方法的其他适当的修改和改动。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施方案，这些实施例仅出于说明的目的而被包括在内，并且不旨在是限制性的。

抗体

本发明包括用于治疗淋病奈瑟氏球菌感染的能结合淋病奈瑟氏球菌的特定表位(例如，2C7)的人源化抗体。一方面，本文公开的人源化抗体是SEQ ID NO:1(VH)和SEQ IDNO:2(VL)所示的鼠单克隆2C7抗体(如以下表1所示)的人源化形式。

表1：小鼠单克隆2C7抗体可变区的序列

在另一方面，本文提供了能结合淋病奈瑟氏球菌抗原的2C7表位的人源化抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域、可变轻链(VL)结构域和人Fc区，其中所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的HCDR-1、HCDR-2和HCDR3，和包含选自SEQ ID NO:2-6(表2)的氨基酸序列的VH人受体框架，并且其中VL结构域包含选自SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的LCDR-1,LCDR-2和LCDR-3，和包含选自SEQ ID NO:8-12(表3)的氨基酸序列的VL人受体框架。

表2：人源化2C7抗体重链可变区的序列

表3：人源化2C7抗体轻链可变区的序列

改变Fc功能的方法

在根据所公开的发明的任何用途中，没有任何额外突变的人源化2C7抗体被称为“亲本人源化抗体”。因此，本文的用途提供了这种亲本人源化抗体的任何变体。

在一实施方案中，亲本人源化抗体可以是包含Fc结构域，免疫球蛋白和抗原结合区的亲本抗体。根据本发明的方法或用途将突变引入人源化抗体，产生变体人源化抗体(其在本文中也可称为“变体”)。因此，可以进行本发明的方法以获得如本文所述的任何变体或变体人源化抗体。

在一实施方案中，从本发明的方法或用途获得的变体人源化抗体与亲本人源化抗体相比具有增加的CDC。通常，人源化抗体对效应子功能的影响可以通过EC₅₀值来确定，EC₅₀值是获得最大裂解值的一半所需的抗体浓度。

最大裂解是当使用饱和量的人源化抗体时获得的裂解，其中饱和是指人源化抗体的所有靶标均被抗体结合的抗体量。

在一实施方案中，效应子功能是Fc-受体结合，例如包括Fc-γ受体结合。在一实施方案中，效应子功能是含有Fc的抗体内化。在一实施方案中，效应子功能是补体CDC和ADCC的组合。

如本文所用，术语“C1q结合”，当用于亲本人源化抗体的变体或抗体的上下文中时，包括通过变体或抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞))的结合介导的补体激活的经典途径上的第一成分的任何机制。可以使用ELISA(例如C1q结合ELISA)来评估抗体的C1q结合，或者可以通过CDC测定(例如实施例3中使用的CDC测定)来评估C1q功效。

在本发明的人源化抗体的一实施方案中，IgG1 Fc区中的一个或多个突变导致效应子或Fc功能增加。在人源化抗体的一实施方案中，IgG1 Fc区中的一个或多个突变导致针对淋病奈瑟氏球菌的CDC增加。

在一个方面，本发明涉及增加包含免疫球蛋白的Fc结构域和结合区的人源化抗体的CDC的方法，所述方法包括在人源化抗体的IgG1 Fc区中引入选自E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基的突变。在人源化抗体的一些实施方案中，一个或多个Fc突变选自E430G,E430S,E430F,E430T,E345K,E345Q,E345R,E345Y和S440W。在人源化抗体的其它实施方案中，一个或多个Fc突变选自E345R和E430G(参见下表4中的IgG1序列)。

表4：人IgG1序列

术语“增加CDC”、“改善CDC”、“增加效应子功能”或“改善效应子功能”在本发明的上下文中是指与亲本人源化抗体相比变体人源化抗体的EC₅₀值降低。EC₅₀值的降低可以是例如至少或约2倍，例如至少或约3倍，或至少或约5倍，或至少或约10倍。或者，“增加CDC”、“改善CDC”、“增加效应子功能”或“改善效应子功能”是指在人源化抗体裂解少于100％的所有细胞的条件下，裂解的细胞的最大量(其中细胞的总量设定为100％)增加例如所有细胞的10％至100％，例如约10％、约20％、约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％和约100％。

通过将可变结构域克隆到变体中并测试其在CDC测定中的效力，例如在实施例3中描述的，可以测试变体的增加的或改善的效应子功能。

使用本文公开的人源化抗体和淋球菌，在研究的条件下，增加将被定义为比没有Fc突变的人源化抗体的EC₅₀低超过2倍的EC₅₀，例如低约2倍，约3倍，约5倍，约10倍或超过10倍的EC₅₀值(即观察到半数最大裂解的浓度)。

CDC的增加也可定义为最大裂解的增加，范围为所有细胞的10％至100％，例如增加约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％和约100％。

本发明的发明人发现，与鼠亲本抗体相比，在本发明的人源化抗体中使用一种或多种先前公开的Fc突变(WO2014/108198，其通过引用并入本文中)导致针对淋病奈瑟氏球菌感染的杀菌活性增加。不受理论的束缚，据信通过取代上述位置组中的一个或多个氨基酸，刺激抗体寡聚化(例如，六聚化)。抗体的Fc区以较高的亲合力结合一个或多个Fc配体，从而实现不同的效应子功能，例如CDC,ADCC和ADCP。Fc配体包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同系物(FcRH)，它是与FcγRs同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,Immunological Reviews 190:123-136，在此通过引用全文并入)。Fc配体可以包括未发现的能结合Fc的分子。

人IgG1重链的Fc区中选自对应于E430X，例如E430G、E430S、E430F或E430T；E345X，例如E345K、E345Q、E345R或E345Y；S440Y和S440W的那些的氨基酸残基突变，在本发明的上下文中，也可被称为“单一突变体”方面或“CDC增强突变”。

在一实施方案中，在增加CDC的方法中，一个或多个氨基酸残基的突变选自人IgG1重链Fc区中的E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y和S440W。

在一优选的实施方案中，在增加CDC的方法中，一个或多个氨基酸残基的突变选自人IgG1重链Fc区中的E430G、E430S、E345K和E345R。

另一方面，本发明还涉及增加包含免疫球蛋白的Fc结构域和结合区的人源化抗体的CDC和ADCC的方法，所述方法包括在人源化抗体中引入对应于人IgG1重链Fc区的E430X、E345X和S440W的一个或多个氨基酸残基的突变，其中X是任何氨基酸，例如天然存在的氨基酸。在一实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变选自人IgG1重链Fc区中的E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y和S440W。

在一优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变选自人IgG1重链Fc区中的位置E345R和E430G。

在一实施方案中，抗体的至少一种其它效应子功能，例如C1q结合，补体激活，ADCC,Fc-γ受体结合，ADCP,CDCC，补体增强的细胞毒性，ADCP，内化，细胞凋亡和/或与人源化抗体的补体受体的结合也增加。

在一实施方案中，当亲本抗体与其抗原表达细菌上的抗原结合时，亲本抗体的CDC增加。

在本发明的方法和/或用途的一实施方案中，亲本人源化抗体可以含有除本发明那些已发现影响效应子功能的突变之外的其它突变。这样的其它突变可以与本发明的影响效应子功能的突变同时引入，或者它们可以顺序引入，本发明的方法或用途不限于同时或顺序引入突变。

本文所述的任何突变或其组合可以根据WO2014/108198(其通过引用并入本文)中公开的方法引入。

IgG抗体在抗原结合后在细胞表面上组织成有序的六聚体。本领域已知增加的六聚化导致增加的补体激活和细胞杀伤活性。这些IgG六聚体结合并激活C1,其是经典补体途径中的第一成分，其经破坏细胞膜的膜攻击复合物(MAC)通过补体依赖性细胞毒性(CDC)导致靶细胞杀伤。此外，补体激活产生化学引诱物，过敏毒素和调理素，它们用于吸引和激活免疫效应细胞并诱导额外的杀伤(de Jong,R.等人，PLoSBiol.2016,e1002344)。如WO2014/108198(其通过引用并入本文)中所述，可以对抗体进行工程改造以增强其激活效应子功能的能力，例如CDC,ADCC和ADCP。

可以在允许抗原结合抗体形成六聚体并检测增强的C1q结合，补体激活，CDC,ADCC和/或内化的适当测定中测试选自示例性或优选的氨基酸取代的突变，如WO 2014/108198(其通过引用并入本文)和实施例3中所述的那些。

在一实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变可以是氨基酸取代，氨基酸缺失或氨基酸插入。在一实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变是氨基酸缺失。在一实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变是氨基酸插入。在一具体的实施方案中，一个或多个氨基酸残基的突变是氨基酸取代。

因此，在一实施方案中，E345X可以是E345R、Q、N、K、Y、A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、S、T、V、W或Y；尤其是E345A、D、G、H、K、N、Q、R、S、T、Y或W，或更尤其是E345D、K、N、Q、R或W；或者甚至更尤其是，E345R、Q、N、K或Y。在进一步优选的实施方案中，E345X是E345K或E345Q。

在另一个进一步的实施方案中，E430X可以是E430T、S、G、F、H、A、C、D、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W或Y；尤其是E430T、S、G、F或H。在另一个优选的实施方案中，E430X是E430G或E430S。

在一实施方案中，一个或多个突变是一个突变，即不超过一个突变被引入亲本人源化抗体。在另一个实施方案中，根据本发明的方法或用途包括引入至少两个，例如两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸的突变。

本文描述的突变的任何组合可以根据本发明的方法引入。

在一实施方案中，所述方法包括向亲本人源化抗体引入选自人IgG1重链Fc-区中E345X、E430X、S440Y和S440W的氨基酸残基的一个以上突变，例如两个，三个，四个或五个，特别是两个或三个突变。例如，在人IgG1重链的Fc区中对应于E345X,E430X,S440Y和S440W的至少一个氨基酸残基可以突变，例如E345X,E430X,S440Y和S440W中的两个或全部，任选地与一个或多个其它氨基酸的突变组合。至少两个突变可以是位置E345的任何氨基酸残基取代与位置E430或S440Y或S440W的任何氨基酸残基取代组合，或者可以是位置E430的任何氨基酸取代与位置S440Y或S440W的任何氨基酸残基组合。在另一个实施方案中，将两个或三个突变在选自人IgG1重链Fc-区中的E430G,E430S,E345K,E345R和E345Q的氨基酸残基引入亲本人源化抗体。氨基酸残基的这种两个突变的组合选自人IgG1重链的Fc区的E345X/E430X,E345X/S440Y,E345X/S440W,E430X/S440Y和E430X/S440W。

在本文公开的人源化抗体的实施方案中，Fc区中的E345R突变增强六聚化、C1q结合和CDC。

在本文公开的人源化抗体的另一个实施方案中，Fc区中的E430G突变增强六聚化，C1q结合和CDC。

在根据本发明的方法或用途中，当抗体与其抗原结合时，CDC增加。不受任何理论的束缚，据信当抗体与其抗原结合时，CDC增加，其中抗原在淋球菌上。

在主要方面，本发明涉及诱导针对表达2C7表位的淋病奈瑟氏球菌的CDC的方法，所述2C7表位能与包含免疫球蛋白的Fc结构域和结合区的亲本人源化抗体结合，所述方法包括(i)提供已经根据本文公开的任何一个实施方案突变的亲本人源化抗体；和(ii)在人补体或效应细胞存在下，使步骤(i)的突变的亲本人源化抗体的制剂与表达2C7表位的淋病奈瑟氏球菌接触。

在另一个实施方案中，所述方法还诱导ADCC。

在另一个实施方案中，所述方法还诱导含Fc的抗体内化。

在一实施方案中，接触步骤(ii)在体外进行。

在一实施方案中，接触步骤(ii)在体内进行。

在另一个实施方案中，步骤(ii)包括对患有淋病奈瑟氏球菌感染的受试者施用所述变体。

在另一个实施方案中，步骤(ii)包括向患有抗生素抗性淋病奈瑟氏球菌感染的受试者施用所述变体。

不受任何理论的束缚，据信CDC的增强可限于同时表达两种特异性靶标/抗原的靶细胞，条件是第一和第二抗体结合在同一细胞上存在的表位，从而利用靶标的组合表达来提高增强的CDC诱导的选择性。

淋病奈瑟氏球菌治疗方法

在所述方法的另一个实施方案中，所施用的抗体或药物组合物改善淋病奈瑟氏球菌感染的清除并保护受试者免受随后的淋病奈瑟氏球菌感染。

在所述方法的另一个实施方案中，淋病奈瑟氏球菌感染对抗生素具有抗性。

在所述方法的另一个实施方案中，所述受试者是人。

对于治疗和预防用途，本发明的抗体和抗体片段可以配制为药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的免疫治疗或免疫预防有效量的抗体或抗体片段，该量在补体存在下有效地显著杀死感染生物体，或调理感染生物体以允许宿主PMN的吞噬杀伤。

本发明优选的药物组合物将悬浮在用于治疗用途的无菌溶液中。可选地，可以配制药物组合物以控制活性成分的释放或延长它们在患者系统中的存在。多种合适的药物递送系统是已知的，并且包括例如可植入的药物释放系统、水凝胶、羟甲基纤维素、微胶囊、脂质体、微乳液、微球等。

本发明的药物组合物可以通过任何合适的方式施用，例如口服，鼻内，皮下，肌内，静脉内，动脉内或肠胃外。通常，静脉内(i.v.)或肠胃外施用将是优选的。

对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明的抗体或其片段的免疫治疗有效量或免疫预防有效量将尤其取决于施用方案，所施用的抗体或片段的单位剂量，抗体或片段是否与其它治疗剂组合施用，患者的免疫状态和健康，所施用的抗体或抗体片段的治疗活性和治疗医师的判断。

本发明的抗体或其片段也可以被标记，并用于筛查方法，诊断方法或体外或体内检测与淋病奈瑟氏球菌的寡糖抗原反应的抗体的测定中。这些包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)。例如，可以通过将样品与本发明的标记抗体接触并检测标记物来筛选样品是否存在与淋病奈瑟氏球菌的寡糖抗原反应的抗体。类似地，也可以制备抗体并将其用于检测临床样品中存在的淋球菌寡糖(OS)抗原的存在。因此，本发明包括诊断试剂盒，其包含作为试剂的可检测标记的抗体或片段或本发明的抗体或片段，以及使用该试剂检测与淋病奈瑟氏球菌的寡糖抗原或寡糖抗原本身反应的抗体的完整说明书。根据本发明的检测方法可以包括以下步骤：将抗免疫球蛋白抗体施加到固体支持物；将生物样品施加到固体支持物上；从所述固体支持物去除过量的生物样品；将根据本发明的可检测标记的抗体或片段施加到固体支持物；洗涤固体支持物并测定固体支持物上标记物的存在。

合适的标记物可以是放射性的，酶促的，荧光的，磁性的或化学发光的。放射性标记的抗体以已知的方式通过偶联放射性同位素如³H,³²P,³⁵S,⁵⁹Fe,¹²I来制备，然后可以通过γ计数器，闪烁计数器或通过放射自显影来检测。本发明的抗体可适当地用酶如酵母乙醇脱氢酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等标记，然后显色并通过分光光度法或目视检测。合适的荧光标记物包括异硫氰酸荧光素，荧光胺，若丹明等。合适的化学发光标记物包括鲁米诺，咪唑，草酸酯，荧光素等。

实施例

实施例1：人源化2C7单克隆抗体变体的设计和生产

人源化2C7

本文所述的人源化2C7单克隆抗体是2C7小鼠单克隆抗体的变体。设计人源化的2C7变体，使得2C7小鼠Fc被人IgG1 Fc替代，而Fab区的2C7小鼠恒定重链和轻链结构域被人IgG1的恒定重链和轻链结构域替代。本文描述了人源化2C7 mAb的多种变体。通过应用本领域熟知的标准方法，将单克隆抗体2C7的VH和VL链的CDR序列(见表1)移植到不同的人重链和轻链受体序列中。如前所述，将人源化抗体的重链和轻链可变区克隆到免疫球蛋白G1(IgG1)表达载体中。使用定点诱变分别将Glu345至Arg(E345R)突变和Glu430至Gly(E430G)突变引入人源化抗体的Fc区。

生产

使用标准细胞培养方法和纯化技术产生人源化2C7抗体。将CDR移植的VL和VH序列分别克隆到pMAZ-IGL和pMAZ-IGH表达载体中(Antibody internalization studied usinga novel IgG binding toxin fusion.J Immunol Methods.2007；321:41–59)。pMAZ-IGL的κ恒定区将被λ恒定序列(鼠mAb 2C7是IgG3λ)取代以表达具有λ轻链的mAb。

包含25种轻链-重链组合中的每一种的质粒将被用于转染ExpiCHO-S^TM细胞(ThermoFisher Scientific,Cat#A29127)。分泌的抗体将在蛋白A/G琼脂糖上纯化，并测试其i)在ELISA测定中与淋球菌LOS结合和通过流式细胞术与完整细菌结合的能力，和ii)在补体依赖性杀菌测定中介导杀伤的能力。嵌合mAb 2C7将用作阳性对照。

实施例2人源化2C7单克隆抗体的结合活性

本文公开的人源化单克隆抗体的结合活性通过ELISA测定来分析。通过ELISA测定比较小鼠和人源化2C7抗体与2C7表位的结合。将每种mAb在含有0.05％Tween 20的PBS中稀释，并分配到用FA1090wt(或突变体F1090IgtG-)的全细菌裂解物包被的微量滴定孔(Immulon 1B)中，在室温下孵育1小时。用抗人碱性磷酸酶二抗和PNPP底物检测抗体结合。

实施例3：人源化2C7单克隆抗体的杀菌活性

细菌菌株的感染率

分析敲除2C7表位的淋病奈瑟氏球菌菌株在小鼠中的感染率。将敲除(FA1090IgtG-)和野生型(FA1090wt)淋病奈瑟氏球菌菌株等比例混合，并接种在非免疫小鼠(n＝5)中。分析感染的清除。感染的所有5只小鼠在感染后第5天清除FA1090IgtG-感染。相比之下，所有感染的小鼠在第10天仍被FA1090wt菌株感染(图1A)。以每天间隔测量每种菌株的定殖。在第5天完全不存在FA1090IgtG-菌株的定殖，而FA1090wt菌株在第10天保持定殖(图1B)。曲线下面积分析显示FA1090wt菌株与FA1090IgtG-菌株相比在非免疫小鼠中导致显著更高的细菌负担(图1C)。

CDC分析

比较小鼠和人源化2C7 mAb的补体(C)依赖性淋病奈瑟氏球菌杀伤活性。用抗体浓度系列或固定的抗体浓度进行CDC测定。提供正常人血清(20％最终浓度，除非另有说明)作为补体来源。将mAb各自与淋球菌和血清混合，将反应混合物在37℃孵育，取出等分试样并在冷BSA-PBS中淬灭。将细胞洗涤三次，等分，并在室温下用FITC抗C1q,Al488mAb 7C12或1H8(以监测C3b沉积)探测30分钟。然后将混合物洗涤并重悬于含有1μg/ml PI的BSA-PBS中并立即分析。

体内攻击

几种小鼠品系用活的淋病奈瑟氏球菌攻击并给予多种治疗剂量的人源化2C7变体。这些实验证明，在2C7人源化抗体中的E430G补体增强突变提高了杀菌活性并提高了在测试的动物品系中的保护。

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本文中已经广泛和一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的较窄种类和次一般性分组中的每一个也形成所述方法的一部分。这包括对方法的一般描述，附带条件或负面限制是从该类中去除任何主题，而不管所切除的材料在本文中是否具体地陈述。

其它实施方案在以下权利要求范围内。此外，在方法的特征或方面根据马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何单个成员或成员亚组进行描述。

Claims

1.能结合淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)抗原的2C7表位的人源化抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域、可变轻链(VL)结构域和人Fc区，

其中所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：2-6的氨基酸序列，并且

其中所述VL结构域包含选自SEQ ID NOs:8-12的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

12.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

14.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

15.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

16.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

17.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

18.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

19.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

20.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

21.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

22.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

23.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

24.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

25.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

26.如权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

27.如权利要求1-26中任一项所述的人源化抗体，其中所述人Fc区是IgG1 Fc区，其包含改变一种或多种Fc功能的一个或多个突变。

28.如权利要求27所述的人源化抗体，其中所述一种或多种Fc功能选自Fc聚集、C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。

29.药物组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的人源化抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。

30.核酸，其编码权利要求1-28任一项所述的人源化抗体氨基酸序列。

31.载体，其包含权利要求30所述的核酸。

32.宿主细胞，其包含权利要求31所述的载体。

33.如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

34.如权利要求33所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。

35.如权利要求33所述的宿主细胞，其中所述真核细胞选自酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

36.如权利要求35所述的宿主细胞，其中所述植物细胞是烟草植物细胞。

37.如权利要求35所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是人胚肾(HEK)细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

38.如权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

39.产生能结合淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)抗原的2C7表位的人源化抗体的方法，所述方法包括在足以产生所述人源化抗体的条件下在培养基中培养权利要求32至38中任一项所述的宿主细胞的步骤。

40.治疗有需要的受试者中的淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-28中任一项所述的抗体或权利要求29所述的药物组合物。

41.如权利要求40所述的方法，其中所施用的抗体或药物组合物改善淋病奈瑟氏球菌感染的清除。

42.如权利要求40所述的方法，其中所施用的抗体或药物组合物保护所述受试者免受随后的淋病奈瑟氏球菌感染。

43.如权利要求40所述的方法，其中所施用的抗体或药物组合物改善淋病奈瑟氏球菌感染的清除并保护所述受试者免受随后的淋病奈瑟氏球菌感染。

44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述淋病奈瑟氏球菌感染对抗生素具有抗性。

45.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。