CN111652848A - 一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法 - Google Patents

一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开机器人化的贴壁细胞三维定位方法，包括以下步骤：微针针尖的三维定位：对微针针尖进行垂直定位和水平定位；贴壁细胞的水平定位：利用显微镜对贴壁细胞进行自动聚焦，再利用正负方向的细胞离焦图像定位贴壁细胞水平位置，确定每个贴壁细胞的中心位置；贴壁细胞的垂直定位：微针针尖从目标细胞中心位置上方下降，微针阻值超过一定数值时，认为微针接触到贴壁细胞的上表面，完成贴壁细胞的垂直定位。本发明定位过程中无需人为干预，实现了贴壁细胞的全自动三维定位；细胞水平定位的成功率和误差分别是94.7％和0.3μm，细胞垂直定位的精度是0.2μm，在贴壁细胞膜片钳封接应用中，细胞封接的成功率可以达到80％，定位速度和准确率都要高于现有技术。

Description

一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法
技术领域
本发明属于细胞级别的定位技术领域，特别涉及一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法。
背景技术
贴壁细胞的三维定位在自动化膜片钳和细胞微注射领域有着重要作用，不精确的细胞定位将会影响细胞注射和封接等微操作的成功率，甚至损坏微针和损伤细胞。为了更好的定位细胞的三维位置，科学家们研发了多种细胞定位方法。细胞的水平定位即细胞分割方法主要有分水岭算法，阈值法和深度学习方法，其中分水岭算法对图像的噪声比较敏感，而阈值法对透光性比较好的贴壁细胞很难进行精准的图像分割，深度学习方法则需要大量的数据集，不利于在线实时水平定位。细胞的垂直定位方法主要有原子力显微镜扫描法和基于细胞形变接触检测法，由于原子力显微镜比较昂贵，而且和基于细胞形变接触检测法都是用微针接触细胞产生力反馈或者细胞形变才能定位细胞的垂直位置，这样造成了很大的定位误差。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法，采用基于离焦图像的水平定位和基于微针电阻信号的接触检测的垂直定位，不仅能够简单、快速的定位贴壁细胞三维位置，而且还比其他目前方法更加准确。
本发明采用的技术方案是：一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法，包括以下步骤：
a.微针针尖的三维定位，对显微镜下离焦的微针利用清晰度评价函数进行自动聚焦完成针尖的垂直定位，再利用针尖模板匹配方法完成微针的水平定位；
清晰度评价函数是将微针显微图像进行OTSU二值化后，绘制针尖区域的最小外接矩形，并把矩形的长作为清晰度评价指标。由于微针是倾斜安装的，造成传统的NormalizedVariance(VAR)和TenengradGradient(TEN)清晰度评价函数并不是单峰曲线，所以这些自动聚焦算法达不到很好的效果。随后再按照爬山算法对清晰度评价函数进行搜索最大值。搜索的过程是：首先设置显微镜自动对焦的步长，按照同一方向采集三幅图像，并计算对应的清晰度评价函数值。假设计算出的清晰度评价值分别为FV1、FV2、FV3，如果FV1＜FV2＜FV3，说明镜头正在向微针针尖焦平面靠近，应该按照此方向继续搜索；如果FV1＞FV2＞FV3，说明镜头正在远离微针针尖位置，应该向相反方向搜索；如果FV1＞FV2且FV2＜FV3，说明曲线存在局部最小值，应该按照此方向继续搜索；如果FV1＜FV2＞FV3，则认为找到一个对焦区间[V1，V3]，则针尖的焦平面在此区间内，然后在这个区间进行针尖模板匹配搜索，从V1位置移动到V3位置，直到成功匹配到针尖模板为止，针尖模板是预先手动存储的模板图片。根据匹配结果就可以获得微针针尖图像上的水平位置以及针尖的垂直位置。
b.贴壁细胞的水平定位，将微针移动到显微镜视野以外并记录微针的位置，显微镜继续向下运动对贴壁细胞进行自动聚焦，把图像的对比度作为对焦评价指标，自动对焦的搜索算法是爬山算法。根据离焦显微镜模型，当贴壁细胞图像的对比度最小时，认为是贴壁细胞的焦平面，然后采集正负40μm的细胞离焦图像，两幅离焦图像直接做差，随后对做差结果图像进行OTSU二值化处理，根据目标细胞的长宽比，筛选出符合条件的细胞区域，目的是剔除粘连在一起的细胞区域，最后对目标细胞区域进行轮廓检测，并计算出每个细胞的中心位置；
贴壁细胞图像对比度可以用像素归一化方差表示，并由以下公式给出：
Figure BDA0002480233530000021
其中F表示图像的像素归一化方差，W和H表示显微图像的宽度和高度，I(x，y)表示图像(x，y)位置的灰度值，μ表示图像的平均灰度值。
离焦显微镜模型由以下公式给出：
Figure BDA0002480233530000022
其中C(x，y)是离焦图像对比度，Δf是离焦距离，Δn是贴壁细胞与培养液的折射率差，
Figure BDA0002480233530000031
是贴壁细胞表面的曲率，由于贴壁细胞具有一个平坦的表面，细胞的表面曲率很小，基本恒定，并且Δn也可以看做是一个恒定值。所以C(x，y)和Δf成正比，当Δf增大时，离焦图像的对比度也将增大，但是Δf过大离焦图像将会模糊，经过不同离焦量细胞分割实验对比，40μm的离焦量可以达到细胞分割的最好效果。
由于微针对焦是搜索对焦函数的最大值而贴壁细胞是搜索图像对比度的最小值，则贴壁细胞的自动对焦搜索算法和步骤a中的爬山算法相反。该搜索算法为：首先设置显微镜自动对焦的步长，按照同一方向采集三幅图像，并计算对应的清晰度评价函数值。假设计算出的清晰度评价值分别为FV1、FV2、FV3，如果FV1＞FV2＞FV3，说明镜头正在向贴壁细胞焦平面靠近，应该按照此方向继续搜索；如果FV1＜FV2＜FV3，说明镜头正在远离贴壁细胞焦平面，应该向相反方向搜索；如果FV1＜FV2且FV2＞FV3，说明曲线存在局部峰值，应该按照此方向继续搜索；如果FV1＞FV2＜FV3，则认为找到一个对焦区间[V1，V3]，则贴壁细胞的焦平面在此区间内，然后减小搜索步长按上述步骤继续在[V1，V3]区间搜索，直至找出贴壁细胞的焦平面。
对二值化图像筛选目标细胞的方法是，通过对二值化图像的每一个细胞区域进行绘制最小外接矩形，然后计算矩形的长宽比，把在目标细胞长宽比范围内以及细胞轮廓面积范围内的细胞留下，并剔除不符合要求的细胞区域，细胞的中心位置则是细胞轮廓点的平均位置。
c.贴壁细胞的垂直定位，将微针针尖移动到目标细胞中心位置上方10μm处，以每步0.2μm的步伐下降，当检测到微针阻值的上升幅度超过入液阻值的百分之二时停止微针运动，为了防止假阳性的细胞接触，将微针撤回再下降，能够重复2-3次检测到阻值的上升即可认为微针接触到贴壁细胞的上表面，完成贴壁细胞的垂直定位。
微针电阻是将微针插入银丝并通过Multi-Clamp700B放大器和数模转换器测量得到，在测量过程中细胞培养皿中放入氯化银参比电极当做地线。测量的微针电阻可以由以下公式表示：
R＝Rs+Rm*Re/(Rm+Re)
其中R是微针测量的电阻，Rs是串联电阻，Rm是细胞膜电阻，Re是漏电阻，当微针和细胞接触时微针电阻会上升，通过接触检测来定位贴壁细胞上表面，上升阈值设定为微针阻值浮动范围的两倍即百分之二。假阳性接触是在微针下降过程中针口附着上了培养液中的悬浮杂质或者细胞膜碎片等，造成测量电阻的上升，为了排除这种假阳性接触，系统将重复进行2-3次接触检测。
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：本发明定位过程中无需人为干预，先利用自动聚焦算法和模板匹配算法对微针尖端进行三维定位，再利用贴壁细胞的离焦图像对贴壁细胞进行水平定位，最后利用微针和细胞的接触检测对筛选的贴壁细胞进行垂直定位，实现了贴壁细胞的全自动三维定位；
本发明的细胞水平定位方法的成功率和误差分别是94.7％和0.3μm，而阈值法对贴壁细胞水平定位的成功率和定位误差分别为65％和1.4μm；细胞垂直定位的精度是0.2μm，相比基于细胞形变定位方法平均少下降了2μm；在贴壁细胞膜片钳封接应用中，细胞封接的成功率是传统人工方法的2倍，可以达到80％。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是本发明的程序控制界面图；
图3是本发明的爬山搜索算法的流程图；
图4是本发明的微针针尖的聚焦评价函数曲线；
图5是本发明的微针图像；
图6是本发明的小鼠贴壁成骨细胞的像素归一化方差曲线；
图7是本发明的贴壁细胞离焦图像水平定位结果图；
图8是本发明的贴壁细胞离焦图像水平定位的流程图；
图9是本发明的贴壁细胞接触检测时微针阻值上升曲线。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
本发明所述的贴壁细胞自动三维定位方法流程如图1示。
(1)小鼠成骨贴壁细胞的获取：
本实例所用的小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)是从上海冠导生物工程有限公司购买的。收到干冰冻存的细胞后，先用75％乙醇对其表面进行消毒，然后放入37℃温水中摇晃融化，时间1分钟左右；再于1000rpm离心1分钟，弃冻存液，并加入1ml新的完全培养基(89％DMEM+10％FBS+1％双抗)重悬细胞。最后接种至新培养皿(直径60mm)中，补加足量的完全培养基，放入37℃，5％CO2，湿度100％的培养箱中培养至细胞密度达到30％。
(2)微针的拉制与安装：
本实例中，所用的微针是用型号BF150-86-10，内径0.8mm，外径1.5mm的玻璃管在P-97拉针仪上拉制而成，然后向拉制好的微针内填充20μl的电极溶液(mmol/L：KCl140，NaCl10，HEPES10，EGTA5，用KOH调节PH到7.3)，并将微针装配到MP-285微操手臂上，微针末端的气管连接到气压控制箱的输出端口，微针的吸持压开始设置为0.5psi，随后测量微针的入液阻值为7.2MΩ，在3-9MΩ范围之间，如果不在阻值要求范围内则调整拉制参数重新拉制微针。最后把微针针尖移动到显微镜视野下方。
(3)微针的三维定位：
图2是Labview程序控制界面，首先设置显微镜的自动对焦步伐为2μm，再点击Labview程序的开始按钮，系统将按照上述步骤中的针尖聚焦评价函数及爬山算法对微针尖端进行自动对焦，图3是爬山算法的流程图，图4是微针尖端的清晰度评价函数曲线，图5的(a)是微针正离焦图像，(b)是微针模板匹配成功的图像，(c)是微针负离焦图像，(d)是微针正离焦OTSU二值化结果，(e)是微针对焦时OTSU二值化结果，(f)是微针负离焦OTSU二值化结果。最终把微针尖端定位在[1340，1344]区间内，随后显微镜将按照1μm的步伐从1340μm运动到1345μm，这时对显微镜采集的每帧图像进行针尖模板匹配，由于微针都是用相同的参数拉制而成，所以模板匹配系数设置为0.8，直到显微镜运动到1342μm位置模板匹配成功，如图5(b)，并记录下显微镜的坐标以及微操手臂的坐标。
(4)小鼠成骨贴壁细胞中心位置的水平定位：
微针针尖的三维位置校准后，将针尖移到显微视野外。显微镜继续下降寻找贴壁细胞的焦平面位置，此时聚焦评价指标为像素值的归一化方差，图6是贴壁细胞像素归一化方差曲线。并按照相反的爬山搜索算法搜索贴壁细胞焦平面，开始显微镜的自动对焦步伐为10μm，经过第一次搜索确定贴壁细胞的焦平面在[300，320]区间内，然后将显微镜的自动对焦步伐改为1μm，从320μm位置开始向300μm位置搜索，直到找到图像对比度最小的位置312μm。在此位置的基础上，显微镜正负移动40μm，采集贴壁细胞正负离焦40μm的图像，用正离焦图像减去负离焦图像，得到的结果进行OTSU二值化处理，然后对二值化区域进行目标细胞的筛选，这些筛选是为了剔除多个粘连在一起的贴壁细胞，图7是离焦图像处理的过程图，其中(a)是细胞正离焦40μm图像，(b)是细胞负离焦40μm图像，(c)是正负离焦图像做差结果，(d)是OTSU二值化及筛选结果，(e)是轮廓检测结果，(f)是目标细胞中心位置结果。图8是贴壁细胞图像处理的流程图。通过对每一个细胞区域进行绘制最小外接矩形，然后计算外接矩形的长宽比，把细胞长宽比在[1，2]范围内以及细胞轮廓面积在[500，1000]范围内的细胞留下，并剔除不符合范围内的细胞，每个细胞的中心位置则是细胞轮廓点的平均位置。
(5)小鼠成骨贴壁细胞上表面的垂直定位：
将微针针尖移动到目标细胞上方的10μm处，按照0.2μm的步伐下降微针，当测量的微针电阻超过入液阻值的102％时即7.35MΩ，停止微针的运动，随后将微针向上撤回2μm，并给微针5psi的正压使电极阻值回到入液阻值7.2MΩ附近。再次下降微针，可以重复观察到微针电阻超过入液阻值的102％。则微针针尖的Z轴坐标19141.6μm是此成骨贴壁细胞的上表面坐标，图9是接触检测微针阻值上升曲线。
基于贴壁细胞三维定位的细胞封接应用：
微针和贴壁细胞的自动三维定位技术有利于全细胞膜片钳的精准封接，提高了膜片钳的成功率。为了保证贴壁细胞的可靠封接，通常微针将继续向下移动2μm，实施例中电极阻值上升为7.5MΩ。随后将微针吸持压设为-0.5psi，并把钳制电压切换至-70mV，等待电极阻值上升到1000MΩ以上，形成GΩ封接之后，吸持压改为大气压使GΩ封接稳定10S，最后达到3456MΩ。我们分别用该方法和传统人工方法对20个贴壁细胞进行了细胞封接操作，基于该方法细胞封接的成功率是传统人工方法的2倍(传统人工方法：40％，新方法：80％)。
以上通过实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的示例性实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。凡利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，在本发明的实质和保护范围内，设计出类似的技术方案而达到上述技术效果的，或者对申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖保护范围之内。

Claims (10)

1.一种机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.微针针尖的三维定位：对微针针尖进行垂直定位和水平定位；
b.贴壁细胞的水平定位：利用显微镜对贴壁细胞进行自动聚焦，再利用正负方向的细胞离焦图像定位贴壁细胞水平位置，并筛选出符合要求的目标细胞，确定每个贴壁细胞的中心位置；
c.贴壁细胞的垂直定位：微针针尖从目标细胞中心位置上方下降，微针阻值超过一定数值时，认为微针接触到贴壁细胞的上表面，完成贴壁细胞的垂直定位。
2.如权利要求1所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：步骤a中，对显微镜下离焦的微针利用清晰度评价函数进行自动聚焦完成微针针尖的垂直定位，再利用针尖模板匹配方法完成微针针尖的水平定位。
3.如权利要求2所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：清晰度评价函数是将微针显微图像进行OTSU二值化后，绘制针尖区域的最小外接矩形，并把矩形的长作为清晰度评价指标，然后再按照爬山算法对清晰度评价函数进行搜索最大值即针尖的垂直位置；在针尖对焦的基础上，对微针图像进行针尖模板匹配搜索，根据匹配结果就可以获得微针图像上的针尖水平位置。
4.如权利要求1所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：步骤b中，把图像的对比度作为对焦评价指标，自动对焦的搜索算法采用爬山算法，根据离焦显微镜模型，当贴壁细胞图像的对比度最小时，认为是贴壁细胞的焦平面，然后采集正负一定离焦量的细胞离焦图像，两幅离焦图像直接做差，随后对做差结果图像进行OTSU二值化处理，再筛选出符合条件的细胞区域，并计算出每个细胞的中心位置作为细胞的水平位置。
5.如权利要求4所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：离焦量为40μm。
6.如权利要求4所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：筛选目标细胞的方法是，通过对二值化图像的每一个细胞区域进行绘制最小外接矩形，然后计算矩形的长宽比，把在目标细胞长宽比范围内以及细胞轮廓面积范围内的细胞留下，并剔除不符合要求的细胞区域，细胞的中心位置则是细胞轮廓点的平均位置。
7.如权利要求1所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：步骤c中，微针阻值的上升幅度超过入液阻值的百分之二时停止微针运动，认为微针接触到贴壁细胞的上表面。
8.如权利要求7所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：微针电阻是将微针插入银丝并通过Multi-Clamp 700B放大器和数模转换器测量得到，在测量过程中细胞培养皿中放入氯化银参比电极当做地线，测量的微针电阻可用已下公式表示：
R＝Rs+Rm*Re/(Rm+Re)
其中R是微针测量的电阻，Rs是串联电阻，Rm是细胞膜电阻，Re是漏电阻，当微针和细胞接触时微针电阻会上升，通过接触检测来定位贴壁细胞上表面，上升阈值设定为微针阻值浮动范围的两倍即百分之二。
9.如权利要求1所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：微针针尖从目标细胞中心位置上方10μm处，以每步0.2μm的步伐下降。
10.如权利要求1所述的机器人化的贴壁细胞三维定位方法，其特征在于：微针重复不止一次的下降、检测到阻值、上升的过程，以排除假阳性的细胞接触结果。
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