CN111647658A - Linc00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Linc00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及LINC00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治疗中的应用。本发明研究发现，长的非编码RNA‑LINC00963在CRPC组织中高度上调，并伴有不良预后，促进了PCa细胞的体外迁移及其在体内的转移，LINC00963通过与miR‑542‑3p结合从而促进NOP2充当PCa转移的诱导剂，LINC00963/miR‑542‑3p/NOP2是致癌轴，该轴具有晚期PCa的诊断和治疗潜力。

Description

LINC00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治 疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是 lncRNA-LINC00963/miR-542-3p/NoP2致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断 和治疗中的应用。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer，PCa)是美国男性与癌症相关的第二大死亡原 因。雄激素剥夺疗法(ADT)是生化复发和转移性PCa患者的主要治疗方法。 不幸的是，研究表明，大多数患者最初对ADT具有敏感性，之后会产生耐药 性，从而发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。新型治疗药物卡巴他赛，阿比 特龙和恩杂鲁胺，可延长CRPC患者的生存期。但是，CRPC患者的预后仍然 不令人满意。CRPC是前列腺癌远处转移的重要原因，但其机制仍不清楚。因 此，了解PCa转移的内在机制对于将来的临床治疗至关重要。
几十年来，已经观察到不编码蛋白质的RNA可能具有重要的细胞功能。 高分辨率测序技术的飞速发展使得可以检测成千上万种新颖的转录本，现在这 些转录本被鉴定为长的非编码RNA(lncRNA)，它们参与了从基因转录到蛋白 质翻译的广泛的生物途径。最近的研究已经确定，lncRNA的异常调节在各种 恶性肿瘤的细胞增殖，化学耐药性和癌症转移中起关键作用。此外，lncRNA 可以充当竞争性内源RNA(ceRNA)，通过与miRNA竞争性结合然后调控 miRNA的靶标，从而导致下游基因的异常表达。就CRPC而言，多项研究表 明，lncRNAHOXD-AS1(也称为HAGLR)，PCAT1和HORAS5可促进肿瘤 增殖和去势抵抗，并可作为潜在的治疗靶点。同样，ceRNA反馈环(如HOTAIR /EZH2/miR-193a，lncRNA CCAT1/DDX5/miR-28-5p)已显示出对CRPC进 展的实质性影响。与以前的观点相反，Chen和Gu提出lncRNA LBCS可通过 抑制雄激素受体(AR)信号来强烈抑制CRPC的活力。进一步探索lncRNA 及相关信号通路与CRPC的关系，对于阐明PCa进展机制，开发PCa转移的 诊断标志物和治疗靶标具有重要意义。
LINC00963是一种lncRNA，其在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中 的作用还在进一步研究中。文献(Linc00963:A novel,long non-coding RNA involved in thetransition of prostate cancer from androgen-dependence to androgen-independence,International Journal of Oncology,2014)报道了linc00963 在在LNCaP和C4-2细胞系之间存在差异表达，敲低linc00963可减弱C4-2细 胞的增殖，运动性，侵袭能力，EGFR的表达和AKT的磷酸化水平，并促进 细胞凋亡，Linc00963通过EGFR信号通路参与了前列腺癌从雄激素依赖性向 雄激素非依赖性和转移的转变。
关于miR-542-3p，文献(前列腺癌血清miRNAs表达谱的检测和miR-101 靶向EZH2调控作用的初步研究，苏州大学，2013)采用miRNA芯片技术 (miRNA microarray)筛选激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)、激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)和前列腺增生(benign prostatichyperplasia,BPH)患者血清中差异表达的 miRNA，结果AIPC组与BPH组血清相比，有9个miRNA表达上调 (miR-181a-2、miR-3664、miR-519e、miR-144、miR-603、miR-187、miR-491-3p、 miR-BART20-5p、miR-3139)，有6个miRNA表达下调(miRPlus-A1073、 miR-542-3p、miR-660、miR-134、miR-15b、miR-H4-3p)，AIPC组与ADPC 组血清相比，分别有4个miRNA表达上调和下调，其中上调的miRNA为 miR-BART16、miR-3142、miR-491-3p、miR-214，下调的miRNA为miR-369-3p、miR-371-3p、miR-495、miR-671-3p。但并未深入研究miR-542-3p 在PCa中的作用。
关于核仁蛋白NOP2，文献(长链非编码RNA在肝细胞癌中的研究进展， 肝脏，2019年)公开了：lncRNA-Hpvt1具有促进细胞增殖，调节细胞周期的 功能，并且还可以作为HCC细胞中干细胞样内容物发挥作用；lncRNA-Hpvt1 通过增强NOP2蛋白的稳定性上调核仁蛋白p120(NOP2)；研究表明，转化生 长因子(TGF)-β1/lncRNA-Hpvt1/NOP2通路在HCC的进展中异常。然而在前列 腺癌中未见相关研究。
总的来说，目前关于LINC00963通过与miR-542-3p结合从而促进NOP2 充当PCa转移的诱导剂，以及miR-542-3p和NOP2在PCa中的作用未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种与前列腺癌远处转移相 关的致癌轴及其用途。
第一方面，本发明提供了用于检测lncRNA-LINC00963、miR-542-3p和 NoP2水平的试剂或试剂组合在制备前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒或去势 抵抗性前列腺癌诊断试剂盒中的应用，所述前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒 和去势抵抗性前列腺癌诊断试剂盒的诊断原理是基于 lncRNA-LINC00963/miR-542-3p/NoP2致癌轴。
作为一个优选例，所述前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒和去势抵抗性前 列腺癌诊断试剂盒的检测样品为前列腺癌组织。
第二方面，本发明提供了具有lncRNA-LINC00963抑制作用、miR-542-3p 上调作用和NoP2抑制作用的试剂或试剂组合在制备治疗去势抵抗性前列腺癌 的药物中的应用。
第三方面，本发明提供了NoP2的抑制剂在制备治疗去势抵抗性前列腺癌 的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了检测个体前列腺组织中NoP2基因或蛋白表达水 平的试剂在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。
第五方面，本发明提供了miR-542-3p的上调剂的用途，所述用途选自：
a)制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物；
b)制备延长去势抵抗性前列腺癌个体的存活时间的药物；
c)制备降低去势抵抗性前列腺癌个体的肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转 移发生率的药物；
d)制备抑制去势抵抗性前列腺癌细胞侵袭的实验试剂；和
e)制备降低去势抵抗性前列腺癌细胞中NOP2表达量的实验试剂。
本发明优点在于：
1、我们发现长的非编码RNA-LINC00963在CRPC组织中高度上调，并 伴有不良预后，促进了PCa细胞的体外迁移及其在体内的转移。功能丧失和功 能增强试验表明，LINC00963通过充当miR-542-3p的ceRNA发挥作用，从而 增加CRPC细胞的生长并阻止细胞凋亡，从而阻止了其与NOP2 mRNA的结合。 总之，我们的结果表明，LINC00963/miR-542-3p/NOP2是致癌轴，是CRPC 进展的驱动力，该致癌轴可作为CRPC的诊断标志物或治疗靶标。
2、本发明发现在CRPC细胞中过表达miR-542-3p，降低了CRPC细胞的 侵袭能力；体内过表达miR-542-3p，明显延长CRPC动物模型的存活时间，导 致这些小鼠中肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移的发生率显著降低。因此， miR-542-3p的上调剂可作为治疗CRPC的药物。
3、本发明发现在CRPC细胞中下调NOP2的表达，降低了CRPC细胞的 侵袭能力；体内敲低NOP2，明显延长CRPC动物模型的存活时间。因此，NOP2 的抑制剂可作为治疗CRPC的药物。
4、本发明发现与正常组织相比，PCa组织中NOP2显著升高，ROC曲线 分析表明组织中NOP2可被视为PCa的潜在诊断指标，诊断准确率AUC＝0.701。
附图说明
图1：长的非编码RNA LINC00963在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)组织 中上调。A，B：建立CRPC小鼠模型的实验方法；TRAMP鼠(A)和 ProbCre/Ptenfl/fl鼠(B)。C，D：从正常前列腺癌(PCa)和CRPC小鼠模型 (C.TRAMP小鼠；D.ProbCre/Ptenfl/fl鼠)分离的细胞中的长非编码RNA (lncRNA)的差异表达的热图。通过RT-qPCR分析了10个最明显上调和下调 的lncRNA在CRPC组织中的表达，并与正常PCa组织中的表达进行了比较 (E.TRAMP小鼠；F.ProbCre/Ptenfl/fl小鼠)。G：根据测序测定法，差异表达 lncRNA的交叉。H：根据RT-qPCR的差异表达lncRNA的交叉。平均值±标准 误。
图2：非编码RNA LINC00963在体外和体内对PCa细胞转移的影响。A： 与正常前列腺细胞系RWPE-1相比，在PCa细胞系DU 145和PC-3中 LINC00963表达的RT-qPCR分析。B：使用RT-qPCR检测SH-LINC00963慢 病毒和空慢病毒载体处理的DU145细胞中LINC00963的表达。C：进行 Transwell侵袭实验测定以确定SH-LINC00963慢病毒转染或空慢病毒载体转染的DU 145细胞的侵袭。D：SH-LINC00963慢病毒感染的PCa小鼠前列腺 中LINC00963-GFP表达(绿色)和DAPI(蓝色)的荧光图像的代表。比例尺 ＝20μm。E：RT-qPCR分析SH-LINC00963慢病毒转染或空慢病毒载体转染的 PCa组织中LINC00963的表达。F：注射SH-LINC00963慢病毒或空慢病毒载 体的PCa小鼠的存活时间。G：在去势的TRAMP小鼠中敲低LINC00963的实 验方法。H：在去势的TRAMP小鼠中注射SH-LINC00963慢病毒或空慢病毒 载体后肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移的发生率(每组n＝10)。I：敲除去 势的ProbCre/Ptenfl/fl小鼠中LINC00963的实验方法。J.在去势的ProbCre/Ptenfl/fl小鼠中注射SH-LINC00963慢病毒或空慢病毒载体后，肿瘤引流淋巴结，肝， 肺和骨转移的发生率(每组n＝10)。平均值±标准误，****P<0.001。
图3：长非编码RNA LINC00963与miR-542-3p之间的关系。A：DU 145 细胞质和细胞核组分中LINC00963的质量。用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测纯化核部分的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA和U6 snRNA水平。B：在DU 145细胞中进行RIP实验，对共沉淀的RNA进行 RT-qPCR以检测LINC00963。相对于其匹配的免疫球蛋白(IgG)对照，argonaute2(Ago2)RIP中LINC00963的富集倍数更高。C：将荧光素酶报道质粒 (RLuc-LINC00963)与6个miRNA编码质粒共转染到293T细胞中。D、E： 将含有野生型(WT)或突变体(Mut)LINC00963(D)的荧光素酶报道质粒 与miR-542-3p或空质粒载体(E)共转染到293T细胞中。F：Ago2免疫沉淀 物中的RNA水平，以相对于IgG免疫沉淀的倍数富集表示。G：用空的慢病 毒载体或SH-LINC00963慢病毒转染的DU 145和PC3细胞中miR-542-3p表达 的RT-qPCR分析。H：来自TRAMP(H)和ProbCre/Ptenfl/fl(I)鼠的CRPC 组织中LINC00963和miR-542-3p的相关性。平均值±标准误，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.001。
图4：肿瘤抑制因子miR-542-3p在体外和体内对PCa细胞转移的影响。A： 与正常前列腺细胞系RWPE-1相比，PCa细胞DU 145和PC-3中miR-542-3p 表达的RT-qPCR分析。B：通过RT-qPCR测试在OE-miR-542-3p慢病毒和空 慢病毒载体转染的DU145中的MiR-542-3p表达。C：进行Transwell侵袭实验 测定，以确定OE-miR-542-3p慢病毒或空慢病毒载体转染的DU145细胞的侵 袭。D：在PCa小鼠的OE-miR-542-3p-GFP-或空的慢病毒载体感染的前列腺中，miR-542-3p表达(绿色)和DAPI(蓝色)的代表性荧光图像。比例尺＝20μm。 E：RT-qPCR分析OE-miR-542-3p慢病毒或空慢病毒载体转染的PCa组织中 miR-542-3p的表达。F：用OE-miR-542-3p慢病毒或空的慢病毒载体转染的PCa 小鼠的存活时间。G：在去势的TRAMP小鼠中敲低miR-542-3p的实验方法。 H：去势的TRAMP小鼠经OE-miR-542-3p慢病毒转染或pcDNA-miR-542-3p 慢病毒转染后肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移的发生率(每组n＝10)。I： 敲除去势的ProbCre/Ptenfl/fl鼠中miR-542-3p的实验方法。J：去势的 ProbCre/Ptenfl/fl鼠在OE-miR-542-3p慢病毒转染或pcDNA-miR-542-3p慢病毒 转染后肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移的发生率(n＝10，每组)。平均值± 标准误，****P<0.001。
图5：NOP2是肿瘤抑制因子miR-542-3p的靶标，并被长的非编码RNA LINC00963缺失所抑制。A：几种生物信息学数据库预测的miR-542-3p交会靶 基因的维恩图。B：用OE-miR-542-3p慢病毒转染后DU 145细胞中前20个下 调基因的热图。C：通过使用TCGA数据集，分析了PCa组织中NOP2相对于 正常组织的相对表达。D：与正常前列腺细胞系RWPE-1相比，PCa细胞系DU 145和PC-3细胞中NOP2表达的RT-qPCR分析。E：在NOP2的WT和Mut 3'- 非翻译区(UTR)中的miR-542-3p假定靶向位点的示意图。F：在转染了萤光 素酶报告质粒的293T细胞中进行萤光素酶活性测定，该质粒含有NOP2 3’UTR(WT或Mut)，并具有miRNA或miR-542-3p对照。G：用对照载体或 OE-miR-542-3p慢病毒转染的DU 145和PC-3细胞中NOP2的相对mRNA水 平。平均值±标准误，**P<0.01，****P<0.001，NS：无统计学意义。
图6：长的非编码RNA LINC00963充当竞争性内源RNA(ceRNA)，并抑 制肿瘤抑制剂miR-542-3p来上调NOP2。A：用空载体慢病毒或OE-miR-542-3p 慢病毒转染的DU 145细胞中NOP2的相对蛋白水平。B：用空载体慢病毒或 SH-LINC00963慢病毒转染的DU 145细胞中NOP2的相对蛋白水平。C、D： 敲除LINC00963和/或抑制miR-542-3p后，293T细胞中的NOP2mRNA(C) 和DU 145细胞和PC-3细胞中的蛋白水平(D)。平均值±标准误，****P<0.001。
图7：NOP2通过上皮-间质转化(EMT)途径促进前列腺癌(PCa)细胞 的进展。A：经OE-NOP2慢病毒转染的DU 145细胞中上调基因的热图。B： 基因富集分析显示信号通路被NOP2过表达激活或抑制。C：采用western blot 方法检测转染载体或OE-NOP2慢病毒的细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、 N-cadherin、vimentin)，并定量分析。D：通过RT-qPCR检测在SH-NOP2慢病 毒和pcDNA-NOP2慢病毒转染的DU145细胞中NOP2的表达。E：进行 Transwell侵袭实验测定以确定SH-NOP2慢病毒或pcDNA-NOP2慢病毒转染 的DU 145细胞的入侵。F：用SH-NOP2慢病毒或pcDNA-NOP2慢病毒转染 的PCa小鼠的存活时间。G：正常前列腺组织和PCa组织中NOP2的转录水平 和格里森评分差异。H：受试者工作特征(ROC)曲线分析NOP2与PCa诊断的 相关性(AUC＝0.701)。平均值±标准误，***P＜0.005，****P＜0.001。
图8：LINC00963/miR-542-3p/NOP2轴介导的上皮-间质转化(EMT)途 径激活模型可促进前列腺癌(PCa)的转移。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。若未特别指明， 实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照 《分子克隆实验指南》第3版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为 可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所 用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明， 其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
1材料与方法
1.1动物
所有动物研究均获得上海交通大学动物保护与使用委员会的批准。所有小 鼠均保持无病原体状态，并根据上海市第一人民医院的道德规范进行管理。除 非另有说明，转基因小鼠前列腺癌(TRAMP)和ProbCre/Ptenfl/fl小鼠由上海模式 生物中心(上海，中国)提供，去势后12周处死。随后采集前列腺、肿瘤引 流淋巴结、肝、肺、骨进行苏木精、伊红(H&E)及免疫组化染色。肿瘤转移的 诊断由两位病理学家独立完成。本研究所有小鼠的遗传背景均为C57BL/6。
1.2细胞培养
两株人前列腺癌细胞株(DU 145、PC-3)和一株正常前列腺癌细胞株 (RWPE-1)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。在含10％胎牛血清 (FBS)、100mg/mL链霉素(Invitrogen)和100U/mL青霉素的Ham’s F12培养基 中培养DU 145和PC-3，在上述添加条件下的K-SFM培养基中培养RWPE-1， 以上细胞均于37℃、5％CO2的潮湿培养箱中培养。所有细胞系均经短串联重 复序列DNA分析鉴定。
1.3 RNA提取和定量RT-qPCR测定
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织或培养的细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa)在标准条件下使用随机引物将RNA(1mg) 逆转录成最终体积为20mL。使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)进行实时 PCR分析。LINC00963(引物：正向5'-TGGACACCACTTTGCCCTTT-3'(SEQ ID NO:1)，反向5'-AGATGGGGCCCTTATCACCT-3'(SEQ IDNO:2))和NOP2(引 物：正向5'-AAATGGGAGAAGGTGGCGTC-3'(SEQ ID NO:3)，反向 5'-CTCTCGGACATTAACCCGCA-3'(SEQ ID NO:4))的水平根据甘油醛-3-磷酸 脱氢酶(GAPDH)的表达进行标准化。miR-542-3p的引物(引物：正向 5'-TCGGGGATCATCATGTCACG-3'(SEQ IDNO:5)，反向 5'-GAGTGGCTCCCAGACCTTTC-3'(SEQ ID NO:6))和U6(miRNA0002-1-200) 购自RiboBio。RT-qPCR和数据收集是在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行的。分析RT-qPCR结果并相对于阈值循环(Ct)值进行表 达，然后转换为倍数变化。
1.4PCa细胞系的转染和RNA提取
短发夹RNA(shRNA)和绿色荧光蛋白(GFP)标记的慢病毒载体，包含 miR-542-3p模拟慢病毒(OE-miR-542-3p)，LINC00963过表达慢病毒 (OE-LINC00963)，NOP2过表达慢病毒(获得OE-NOP2)，miR-542-3p抑制 剂慢病毒(SH-miR-542-3p)，LINC00963沉默慢病毒(SH-LINC00963)，NOP2 沉默慢病毒(SH-NOP2)和相应的对照慢病毒(NC)，以上均来自GeneChem(中国上海)。转染前，将细胞接种在6孔板中(5×105细胞/孔)。根据制造商 的说明(Qiagen)，使用HiPerFect转染试剂进行shRNA转染。使用转染试剂 和8mg/ml聚凝胺(GeneChem)进行慢病毒载体的转染12h。为了进行病毒 转染，以10,100或1,000的感染复数(MOI)转染细胞。然后建立过表达，沉 默和相应的对照稳定细胞系，并通过RT-qPCR证实转染效率。
1.5细胞迁移和细胞侵袭试验
通过Transwell实验进行迁移和侵袭测定。将DU 145接种在上室中，并将 条件培养基放入下室中。细胞用结晶紫染色并在光学显微镜下观察。所有实验 均重复三次。
1.6蛋白免疫印迹测定和抗体
用RIPA提取试剂(Beyotime)裂解DU 145细胞，该试剂补充有蛋白酶 抑制剂混合物(Roche)。细胞蛋白裂解物用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到0.22mm的聚偏二氟乙烯膜(Millipore) 上，并用特异性抗体进行探测。通过ECL生色底物检测特定条带，并通过光 密度法(Quantity One软件，Bio-Rad)进行定量。GAPDH抗体用作对照。针 对NOP2，GAPDH，E-钙粘着蛋白，N-钙粘着蛋白，波形蛋白和β-肌动蛋白的抗体购自Cell Signaling Technology。
1.7RNA免疫沉淀
RNA免疫沉淀用于研究LINC00963是否可以与DU 145和PC-3细胞中的 潜在结合蛋白argonaute 2(Ago2)相互作用或结合。我们根据制造商的说明使 用了EZMagna RIP试剂盒(Millipore)。裂解DU 145和PC-3细胞，并与A蛋 白磁珠孵育，并在4℃下与抗体偶联。3至6小时后，将珠子用洗涤缓冲液洗 涤，然后与0.1％SDS/0.5mg·mL-1蛋白酶K在55℃温育30分钟以去除蛋白质。 最后，对免疫沉淀的RNA进行RT-qPCR分析，以证明LINC00963的存在。
1.8萤光素酶测定
包含野生型或突变型LINC00963片段和NOP2的3'-非翻译区(UTR)的 互补DNA片段被亚克隆到pGL3-基本荧光素酶报道载体(Promega)中的荧光 素酶基因的下游。将在24孔板中生长的人293T细胞(1.0*105)与150ng的 空载体或miR-542-3p，50ng的包含野生型或突变型LINC01234片段的完整荧 光素酶报告基因共转染，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)的NOP2片段 的3'-UTR。转染后48小时，使用双重萤光素酶试剂盒(Promega)测定萤光 素酶含量。相对完整的萤光素荧光素酶活性被标准化为海肾萤光素荧光素酶的相对活性。上述转染重复三次。
1.9RNA测序
通过Qubit 2.0(Life Technologies)和Bioanalyzer 2100(Agilent)分析RNA 的质量和完整性。对于文库制备，将NEBNext Oligo d(T)25珠(NEB)捕 获3μg总RNA，剪切以产生约250bp的片段，并使用NEBNext RNA第一和 第二条链合成模块(美国NEB)进行反转录。将产物末端修复，A尾，连接至 Illumina测序衔接子，并通过PCR扩增。测序文库的质量通过使用Qubit 2.0 荧光计(Life Technologies，USA)和Bioanalyzer 2100(Agilent)进行测定， 然后使用Illumina Hiseq X Ten进行测序，该序列具有2×150bp配对末端测序， 由HiSeq Control控制软件(HCS)。最初使用FastQC检查原始序列读数以进 行质量控制。使用Trimmomatic处理原始读数以修剪低质量的序列和衔接子。 然后使用STAR将干净的读数映射到人类样品的hg19和小鼠样品的mm9，并 且仅保留唯一映射的读数。读取计数通过htseq-count计算。使用DESeq2进行 差异表达分析。
1.10统计分析
组间差异的显著性通过配对的两尾学生t检验进行评估。单变量和多变量 Cox比例风险模型用于确定变量对生存的影响。Kaplan-Meier方法检验用于生 存分析。Spearman相关分析用于计算LINC00963，miR-542-3p和NOP2之间 的相关性。所有统计分析均使用SPSS 17.0软件进行。P值小于0.05表示具有 统计学意义。
2结果
2.1 LINC00963在CRPC组织中上调
过渡到CRPC后，PCa容易发生远处转移。因此，我们探索了PCa和CRPC 之间lncRNA的变化。我们使用了TRAMP小鼠模型作为CRPC小鼠模型，其 中致癌基因SV40标签在probasin启动子的控制下表达。如前述，在12周龄时 去势的TRAMP小鼠在约24周龄时逐渐发展为CRPC(图1A)。这些现象在 ProbCre/Ptenfl/fl前列腺癌模型中也得到了验证(图1B)。为了鉴定可能参与 CRPC出现的lncRNA，我们首先分析了TRAMP和ProbCre/Ptenfl/fl小鼠模型中 3个CRPC组织和3个正常PCa组织的RNA测序(RNA-seq)数据。我们发 现，相比于正常的PCa组织，TRAMP小鼠(图1C)和ProbCre/Ptenfl/fl小鼠(图 1D)CRPC组织中159和185个lncRNA的表达水平发生了显著变化(倍数变 化＞2，P＜0.05)。通过RT-qPCR检查前10个上调和下调的lncRNA的表达 水平。来自TRAMP小鼠(图1E)和ProbCre/Ptenfl/fl小鼠(图1F)的CRPC 组织中lncRNA的表达趋势与RNA-seq数据一致。为了探索关键的lncRNA， 我们将两组差异表达的lncRNA放在一起。结果显示，在RNA序列数据中有 36个重复的lncRNA(图1G)，在RT-qPCR分析中有单个重复的lncRNA(图 1H)。
2.2 LINC00963沉默抑制CRPC细胞转移
为了研究LINC00963在前列腺癌细胞转移中的作用，我们检测了DU 145(从脑转移中提取的PCa细胞)和PC-3(从骨转移中提取的PCa细胞)中 LINC00963的表达水平，并与正常前列腺细胞RWPE-1进行了比较。RT-qPCR 分析表明，DU 145和PC-3细胞中LINC00963的水平显著高于RWPE-1细胞 中的LINC00963(图2A)。然后，我们通过用SH-LINC00963慢病毒(以hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin(GV248，吉凯基因)为基本载体构建 表达LINC00963 shRNA的慢病毒重组质粒，再与辅助质粒共转染293T细胞制 备得到)转染敲低DU 145细胞中的LINC00963。与用空慢病毒载体转染的细 胞相比，用SH-LINC00963慢病毒转染的细胞中LINC00963的表达被有效地 下调(图2B)。此外，transwell侵袭实验表明，LINC00963的敲低显著抑制了 DU 145细胞的入侵(图2C)。AAV慢病毒可以用作在体内调节lncRNAs水平 的载体。为了检查LINC00963的体内功能，我们将SH-LINC00963慢病毒注 射到鼠尾静脉后，SH-LINC00963慢病毒有效感染前列腺，产生大量的 LINC00963-GFP信号(图2D)并显著减少了体内LINC00963的量(图2E)。 低水平的LINC00963也导致生存时间显著延长(图2F)。为了研究LINC00963 在CRPC和PCa转移发作中的作用，我们在阉割的TRAMP小鼠致癌过程中使 用了SH-LINC00963慢病毒来敲除LINC00963(图2G)。去势后，每3天注射 一次SH-LINC00963慢病毒，共3次。组织病理学分析显示，与同型载体对照 相比，LINC00963的下调显著降低了肿瘤引流淋巴结(TdLNs)，肝，肺和骨 转移的发生率(图2H)。为了验证这些结果，我们使用SH-LINC00963慢病毒 在去势的ProbCre/Ptenfl/fl小鼠癌变过程中敲除LINC00963(图2I)，得到了类 似的结果(图2J)。综上所述，这些结果表明沉默LINC00963可以有效抑制 PCa-CRPC转移的进展。
2.3 LINC00963可作为ceRNA结合miR-542-3p
最近的研究表明，lncRNA可以通过与RNA结合蛋白(例如多梳阻遏复合 物2(PRC2))相互作用，或通过充当miRNA的ceRNA来调节靶基因的表达。 为了研究LINC00963促进PCa细胞转移的分子机制，我们首先分析了其亚细 胞定位。通过RT-qPCR测定核和细胞质组分中LINC00963的水平。分离出的 核部分显示出高水平的核标志物(U6 snRNA)，但低水平的细胞质标志物 (GAPDH)。此外，发现LINC00963在细胞质中比细胞核中丰富(图3A)，这表明LINC00963可能在转录后水平上调节靶基因的表达。确实，使用PCa细 胞提取物的RNA结合蛋白免疫沉淀试验表明LINC00963直接与Ago2结合， Ago2是参与miRNA介导的mRNA抑制的RNA诱导沉默复合物的组成部分 (图3B)。这表明LINC00963可能充当miRNA的ceRNA。为了检验这一假设， 我们使用了在线生物信息学数据库(DIANA工具： http://diana.imis.athena-innovation.gr和Starbase：http://starbase.sysu.edu.cn/)，并 观察到LINC00963序列包含潜在的miR-4731-5p，miR-511-3p，miR-542-3p， miR-1266-3p，miR-532-3p和miR-10a-5p结合位点。然后，我们进行了双重荧 光素酶报告基因检测，以确认预测分析。293T细胞用带有LINC00963序列的 荧光素酶质粒和编码上述miRNA或控制序列的质粒转染。我们发现 miR-4731-5p，miR-511-3p，miR-542-3p，miR-1266-3p，miR-532-3p和miR-10a-5p 可以抑制LINC009634驱动的萤光素酶活性，且miR-542-3p的抑制能力较强(图 3C)。因此，我们选择了miR-542-3p进行进一步研究，并构建了一个报告基因 构建体，其中LINC009634序列中推定的miR-542-3p结合位点通过定点诱变突 变(图3D)。如预期的那样，突变体LINC009634消除了miR-542-3p介导的荧 光素酶活性抑制(图3E)。另外，RNA结合蛋白免疫沉淀实验表明，与对照IgG相比，LINC009634和miR-542-3p富含Ago2免疫沉淀(图3F)。接下来， 我们在敲低LINC009634的表达后评估了DU 145和PC-3细胞中miR-542-3p的水平。值得注意的是，敲低LINC009634显著提高了miR-542-3p的表达水平 (图3G)。此外，我们收集了TRAMP和ProbCre/Ptenfl/fl小鼠的CRPC组织， 并通过RT-qPCR测试了LINC009634/miR-542-3p的水平。结果表明， LINC009634与miR-542-3p之间存在负相关关系(图3H)。综上所述，这些结 果表明LINC00963起到了减少miR-542-3p的作用。
2.4 miR-542-3p过表达抑制PCa细胞转移
为了研究miR-542-3p在PCa细胞中的功能，我们检查了PCa细胞DU 145 和PC-3中miR-542-3p的表达水平，并将它们与正常前列腺细胞RWPE-1进行 了比较。RT-qPCR分析表明，miR-542-3p在DU 145和PC-3细胞中的表达明 显低于RWPE-1细胞(图4A)。然后，我们用OE-miR-542-3p慢病毒(以 hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin(GV251，吉凯基因)为基本载体、 miR-542-3p转录本号：MI0003686，构建表达miR-542-3p的慢病毒重组质粒， 再与辅助质粒共转染293T细胞制备得到)或空的慢病毒载体转染DU 145，发 现OE-miR-542-3p慢病毒有效地上调了miR-542-3p(图4B)。此外，transwell 侵袭实验检测表明miR-542-3p过表达显著抑制了DU 145细胞的侵袭(图4C)。 为了检查miR-542-3p过表达的体内效应，我们制备了慢病毒载体 LV-miR-542-3p-GFP以过表达miR-542-3p。尾静脉注射LV-miR-542-3p-GFP可 有效感染前列腺，产生可观的miR-542-3p-GFP信号(图4D)并显著增加体内 miR-542-3p的量(图4E)。此外，注射的小鼠显示出明显延长的存活时间(图 4F)。为了研究miR-542-3p在CRPC发作中的作用，我们在去势的TRAMP小 鼠癌变过程中敲低了miR-542-3p(图4G)。去势后每3天注射 LV-miR-542-3p-GFP，共三次。组织病理学分析表明，与同型载体对照相比， miR-542-3p的过表达导致这些小鼠中肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移的发生 率显著降低(图4H)。为了验证这些结果，我们在去势的ProbCre/Ptenfl/fl小鼠 癌变过程中使用LV-miR-542-3p-GFP过量表达miR-542-3p(图4I)。在 ProbCre/Ptenfl/fl前列腺癌小鼠模型中也验证了这些结果(图4J)。综上所述，这 些结果表明miR-542-3p的过表达可以有效抑制PCa的转移。
2.5 NOP2是miR-542-3p的靶基因
为了确定PCa中miR-542-3p的靶基因，我们使用了RNA22 (http://cm.jefferson.edu/rna22v1.0/)、miRmap(http://mirmap.ezlab.org/)、microT (http://www.microrna.gr/microT)、miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)和TargetScan (http://www.targetscan.org/)来预测潜在的miR-542-3p靶基因(图5A)。该分 析表明，NOP2是所有数据库交叉处的唯一基因，也是LINC00963的潜在靶基 因。接下来，这些观察结果与RNA-seq相呼应，发现转染了OE-miR-542-3p 慢病毒的DU 145中，NOP2的表达降低(图5B)。然后，我们分析了癌症基 因组图谱(TCGA)RNA-seq数据，发现PCa组织中的NOP2上调(图5C)。 因此，我们选择NOP2进行进一步研究，并检查其在PCa细胞DU 145和PC-3中的表达水平，并将其与正常前列腺细胞RWPE-1中的表达水平进行比较。 RT-qPCR分析表明，DU 145和PC-3中NOP2的表达明显高于RWPE-1细胞中 的表达(图5D)。然后，我们构建了一个报告基因构建体，其中通过定点诱变 使NOP2序列中推定的miR-542-3p结合位点突变(图5E)。如预期的那样，突 变体NOP2消除了miR-542-3p介导的萤光素酶活性抑制(图5F)。接下来我们 评估了miR-542-3p过表达后DU 145和PC-3细胞中NOP2的表达水平。值得 注意的是，miR-542-3p的过表达显著降低了NOP2的表达水平(图5G)。总体 而言，这些数据表明miR-542-3p降低了NOP2的表达水平。
2.6 NOP2是miR-542-3p的靶基因，由LINC00963间接调控
由于LINC00963可以使miR-542-3p发挥作用，因此我们接下来研究了 LINC00963是否可以通过与miR-542-3p结合来调节NOP2的表达。我们发现 miR-542-3p的过表达上调了DU 145细胞中NOP2的蛋白水平(图6A)。接下 来，我们敲低了LINC00963，发现下调的LINC00963还显著降低了DU 145细 胞中的NOP2蛋白水平(图6B)。为了确定miR-542-3p在LINC00963和NOP2 之间的关系中是否起作用，我们将细胞与SH-LINC00963慢病毒和 SH-miR-542-3p慢病毒(以hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin(GV249，吉 凯基因)为基本载体，插入敲降miR-542-3p的序列，构建慢病毒重组质粒，再 与辅助质粒共转染293T细胞制备得到)共转染。SH-LINC00963慢病毒对293T 细胞中NOP2 mRNA的抑制以及DU 145和PC-3细胞中蛋白质水平的抑制被 SH-miR-542-3p慢病毒有效逆转(图6C和D)。总体而言，这些数据表明 LINC00963通过miR-542-3p的转录后调控来调节NOP2的表达。
2.7 NOP2通过上皮-间质转化(EMT)途径促进PCa转移
为了研究NOP2在PCa中的致癌作用，在DU 145细胞中过表达，并分析 了正调控的基因。热图显示在OE-NOP2慢病毒(以 CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin(GV230，吉凯基因)为基本载体、NOP2转录 本号：NM_001258309，构建表达NOP2的慢病毒重组质粒，再与辅助质粒共 转染293T细胞制备得到)转染的细胞中有82个基因上调(倍数＞2，P＜0.05) (图7A)。我们进一步分析了这些上调基因的信号传导途径，发现EMT信号 传导途径被显著激活(图7B)。同样，用OE-NOP2慢病毒转染DU 145细胞， EMT信号通路正相关蛋白E-钙粘蛋白增加，负相关蛋白N-钙粘蛋白和波形蛋 白减少(图7C)。为了验证NOP2的促癌功能，用SH-NOP2慢病毒(以 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin(GV248，吉凯基因)为基本载体，插 入敲降NOP2的shRNA序列，构建慢病毒重组质粒，再与辅助质粒共转染293T 细胞制备得到)转染DU 145细胞以降低其表达，这被RT-qPCR证实(图7D)。 然后，transwell侵袭实验表明，NOP2的下调显著抑制了DU 145细胞的侵袭 (图7E)。NOP2敲低还导致小鼠的存活时间显著延长(图7F)。为了检查其 临床意义，我们分析了PCa和正常组织中NOP2的表达。根据TCGA测序数 据，发现与正常组织相比，PCa样品中NOP2的表达增加，并且NOP2水平与 格里森评分呈正相关(图7G)。此外，ROC曲线分析表明NOP2可被视为PCa 的潜在诊断指标(图7H)。这些发现表明，NOP2充当促进PCa细胞增殖的癌 基因，并可以作为临床指标。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市第一人民医院
<120> LINC00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治疗中的应用
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Claims (6)

1.用于检测lncRNA-LINC00963、miR-542-3p和NoP2水平的试剂或试剂组合在制备前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒或去势抵抗性前列腺癌诊断试剂盒中的应用，所述前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒和去势抵抗性前列腺癌诊断试剂盒的诊断原理是基于lncRNA-LINC00963/miR-542-3p/NoP2致癌轴。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述前列腺癌远处转移早期诊断试剂盒和去势抵抗性前列腺癌诊断试剂盒的检测样品为前列腺癌组织。
3.具有lncRNA-LINC00963抑制作用、miR-542-3p上调作用和NoP2抑制作用的试剂或试剂组合在制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物中的应用。
4.NoP2的抑制剂在制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物中的应用。
5.检测个体前列腺组织中NoP2基因或蛋白表达水平的试剂在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。
6.miR-542-3p的上调剂的用途，其特征在于，所述用途选自：
a)制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物；
b)制备延长去势抵抗性前列腺癌个体的存活时间的药物；
c)制备降低去势抵抗性前列腺癌个体的肿瘤引流淋巴结，肝，肺和骨转移发生率的药物；
d)制备抑制去势抵抗性前列腺癌细胞侵袭的实验试剂；和
e)制备降低去势抵抗性前列腺癌细胞中NOP2表达量的实验试剂。
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