CN111643677A - 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111643677A
CN111643677A CN202010454372.7A CN202010454372A CN111643677A CN 111643677 A CN111643677 A CN 111643677A CN 202010454372 A CN202010454372 A CN 202010454372A CN 111643677 A CN111643677 A CN 111643677A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoliposome
liposome
phosphate buffer
buffer solution
shogaol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010454372.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111643677B (zh
Inventor
朱熠
张国楠
黄建鸣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Cancer Hospital
Original Assignee
Sichuan Cancer Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Cancer Hospital filed Critical Sichuan Cancer Hospital
Priority to CN202010454372.7A priority Critical patent/CN111643677B/zh
Publication of CN111643677A publication Critical patent/CN111643677A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111643677B publication Critical patent/CN111643677B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用；其中，所述纳米脂质体的磷脂双分子层之间载有6‑姜烯酚分子，所述纳米脂质体的亲水性内腔之中载有相变材料液态氟碳。上述方案提供一种新的药物递送系统，可以解决6‑姜烯酚及其现有剂型所存在的在体内不稳定性、易被体内清除、生物利用度低以及毒副作用较大的问题。

Description

一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
6-姜烯酚(6-shogaol,6S)是干姜中活性很高的一种提取物；有研究发现，6-姜烯酚作为TLR4/MyD88信号通路拮抗剂、通过损伤微管蛋白或降低肿瘤细胞纺锤体装配蛋白的表达，使有丝分裂阻滞，从而阻断细胞分裂限制肿瘤细胞的增殖，发挥其抗肿瘤作用。
但是，由于6-姜烯酚是一种脂溶性药物，所以其存在体内不稳定性、易被体内清除以及疏水性药物难溶性带来的生物利用度低的缺点；而现有的6-姜烯酚非水溶媒剂型(如6-姜烯酚的聚氧乙烯醚蓖麻油溶媒剂型)则存在生物利用度相对较低且毒副作用较大的问题。
发明内容
本发明公开一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用，以提供一种新的药物递送系统、解决6-姜烯酚及其现有剂型所存在的在体内不稳定性、易被体内清除、生物利用度低以及毒副作用较大的问题。
为了解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体，所述纳米脂质体的磷脂双分子层之间载有6-姜烯酚分子，所述纳米脂质体的亲水性内腔之中载有相变材料液态氟碳。
可选地，所述磷脂双分子层的外表面修饰有MUC16抗体，且所述MUC16抗体通过共价键与所述磷脂双分子层的外表面的分子连接。
第二方面，本发明提供了一种上述纳米脂质体的制备方法，其包括以下步骤：
脂膜制备：将磷脂类化合物、附加剂和6-姜烯酚溶于有机溶剂中，再经溶解混合后除去所述有机溶剂制得脂膜，并对所述脂膜进行干燥；
脂质体分散液制备：将干燥后的所述脂膜于加热条件下与磷酸盐缓冲溶液混合进行水化，使所述脂膜分散于所述磷酸盐缓冲溶液中；然后放置至室温，再于冰浴下超声制得载有6-姜烯酚的脂质体分散液；
相变材料载入：将所述脂质体分散液冷却至3-5℃后加入液态氟碳，并于冰浴条件下进行超声均质乳化，使所述液态氟碳载入脂质体的亲水性内腔中，制备得到纳米脂质体。
可选地，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述脂膜的质量比为1:4-20；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，浓度为0.01mol/L。
可选地，所述磷脂类化合物为二棕榈酰磷脂酰胆碱；所述附加剂为二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基；所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液；所述有机溶剂为氯仿。
可选地，所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基中聚乙二醇的分子量为2000、3400或5000；所述二棕榈酰磷脂酰胆碱与所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基聚合形成的共聚物的分子量为12000-24000，且所述共聚物的聚乙二醇亲水链段占所述共聚物的质量百分数为20-40％。
可选地，所述制备方法还包括靶向修饰步骤：将所述纳米粒脂质体用所述磷酸盐缓冲液重悬，并于室温搅拌条件下加入羧基活化剂进行活化；经活化后再加入MUC16抗体，于3-5℃的条件下搅拌反应3-5h后孵育过夜、使所述MUC16抗体通过共价键连接修饰于纳米脂质体的表面，制备得到具有靶向的纳米脂质体。
可选地，所述羧基活化剂包括EDC和NHS，所述的EDC和所述NHS的质量比为2:5；所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基与所述EDC的摩尔比为1:20。
第三方面，本发明提供了一种上述纳米脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种上述纳米脂质体在制备紫杉醇耐药性逆转药物中的应用。
本发明采用的技术方案能够达到以下有益效果：
本发明公开的包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用，通过将6-姜烯酚载入脂质体的磷脂双分子层之中、并在脂质体的亲水性内腔中载入液态氟碳作为相变材料，从而克服了游离TLR4/MyD88信号通路拮抗剂在体内不稳定、易被体内清除和疏水性药物难溶性带来的生物利用度低的缺点；并且，在到达肿瘤局部后，能通过超声使其相变而快速释放药物，从而提高治疗效果并降低毒副作用；同时，载于纳米脂质体中的6-姜烯酚可以嵌入到MD2蛋白疏水性口袋中、该位点与紫杉醇的结合位点重叠进而可竞争性从MD2蛋白上解离紫杉醇，逆转紫杉醇的耐药性、使紫杉醇增敏。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例6中所述的荧光显微镜的观察图片；
图2为本发明实施例7中所述的细胞存活率结果示意图；
图3为本发明实施例8中所述的荧光显微镜的观察图片；
图4为本发明实施例9中所述的各组检测的定量数据结果示意图；
图5为本发明实施例9中所述的肿瘤冰冻切片共聚焦荧光图像；
图6为本发明实施例10中所述的各组肿瘤生长大小的测量结果示意图；
图7为本发明实施例10中所述的各组肿瘤细胞凋亡检测示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合附图，详细说明本发明各个实施例公开的技术方案。
实施例1
本发明实施例提供了一种空白的纳米脂质体的制备方法，其包括以下具体步骤：
(1)分别称取DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)5mg和DPPE-PEG(2000)-COOH(二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基，其内聚乙二醇的分子量为2000)2mg；然后，将DPPC和DPPE-PEG(2000)-COOH充分溶于2-3ml的三氯甲烷(氯仿)中，再采用旋转蒸发仪旋转蒸发除去三氯甲烷、使之于反应器的内壁形成一层均匀的薄膜，制备得到脂膜；为了更好地除去脂膜中残留的有机溶剂，可以将脂膜放入真空干燥箱中真空干燥1-2小时，从而保证后续步骤的制备效果。
(2)配制pH为7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)；将步骤(1)中干燥后的脂膜混合分散于3ml的PBS溶液中，并于60-65℃的加热条件下水化1小时；然后，放置至室温，再于冰浴下通过超声波细胞破碎仪(探头为5mm、Ampl(振幅)设置为30％)超声30min，制得到均匀、稳定的空白的脂质体分散液。
(3)将步骤(2)中制得的脂质体分散液冷却至3-5℃，再加入75μl液态氟碳、于冰浴条件下用超声波细胞分碎仪(工作频率为24KHz、超声功率为35w、振幅为14％、占空比3s/6s)进行均质乳化10min、使液态氟碳载入脂质体的亲水性内腔中，制备得到未载有6-姜烯酚的空白的纳米脂质体产品、并于3-5℃保存
实施例2
本发明实施例提供了一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体的制备方法，其包括以下具体步骤：
(1)分别称取DPPC5mg、DPPE-PEG(2000)-COOH2mg和6-姜烯酚2mg；然后，将DPPC、DPPE-PEG(2000)-COOH和6-姜烯酚充分溶于2-3ml的三氯甲烷(氯仿)中，再采用旋转蒸发仪旋转蒸发除去三氯甲烷、使之于反应器的内壁形成一层均匀的薄膜，制备得到脂膜；将脂膜放入真空干燥箱中真空干燥1-2小时。
(2)配制pH为7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液；将步骤(1)中干燥后的脂膜混合分散于3ml的PBS溶液中，并于60-65℃的加热条件下水化1小时；然后，放置至室温，再于冰浴下通过超声波细胞破碎仪(探头为5mm、Ampl(振幅)设置为30％)超声30min，制得到均匀、稳定的载有6-姜烯酚的脂质体分散液。
(3)将步骤(2)中制得的脂质体分散液冷却至4℃，再加入75μl液态氟碳、于冰浴条件下用超声波细胞分碎仪(工作频率为24KHz、超声功率为35w、振幅为14％、占空比3s/6s)进行均质乳化10min、使液态氟碳载入脂质体的亲水性内腔中，制备得到纳米脂质体产品、并于4℃保存。
通过本实施例方法制备的纳米脂质体具有良好的生物相容性、生物可降解性；其中，在纳米脂质体的磷脂双分子之中载入了6-姜烯酚、在纳米脂质体的亲水性内腔中载入了液态氟碳，利用肿瘤的EPR效应可以有效地将药物运输到病理区域、使肿瘤细胞快速摄取药物，增加药物生物利用度；并在到达肿瘤局部后，能通过超声使纳米脂质体中的液态氟碳发生相伴、控制药物快速释放，从而提高治疗效果并降低毒副作用。
同时，载于纳米脂质体中的6-姜烯酚可以嵌入到MD2蛋白疏水性口袋中、该位点与紫杉醇的结合位点重叠进而可竞争性从MD2蛋白上解离紫杉醇，逆转紫杉醇的耐药性、使紫杉醇增敏。
而且，DPPC和DPPE-PEG(2000)-COOH聚合后的聚合物(DPPC-DPPE-PEG(2000)-COOH)、使得其形成的磷脂双分子层的亲水层表面具有柔性的PEG链段，进而使得纳米脂质体具备了长循环特性和空间稳定性，可以有效地延长其在血液中的循环时间。
其中，共聚物DPPC-DPPE-PEG(2000)-COOH的分子量可以为12000-24000，且共聚物的聚乙二醇亲水链段占所述共聚物的质量百分数可以为20-40％。
本发明实施例中，磷酸盐缓冲溶液的体积(单位mL)与载体材料质量(单位mg)的用量比可以根据实际进行适应性的调整，其在1:4-20的范围之间均可以形成均匀的纳米脂质体分散液。
同时，所用的磷酸盐缓冲液可以为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液等；优选为磷酸钾缓冲液，其相较于磷酸钠缓冲液在低温时易溶；磷酸盐缓冲液的pH和浓度也可以根据实际使用情况进行适应性调整，例如pH为6.5-7.8或浓度为0.008-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液等；但是，磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为0.011mol/L，该浓度的磷酸盐缓冲溶液更有利于形成均匀的纳米脂质体分散液。
当然，DPPC还可以选用卵磷脂等其他的磷脂类化合物代替，DPPE-PEG(2000)-COOH还可以选用DPPE-PEG(3400)-COOH或DPPE-PEG(5000)-COOH等磷脂酸类或其他种类的附加剂代替，以使磷脂类化合物与附加剂混合形成脂质体的磷脂双分子层；氯仿还可以选用二氯甲烷等其他的有机溶剂代替。
步骤(2)和步骤(3)中的超声波细胞破碎仪的设置参数可以根据实际使用情况对其进行适应性调整；本发明实施例不限制步骤(2)和步骤(3)中的超声波细胞破碎仪的设置参数。
实施例3
本发明实施例提供了一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的具有靶向的纳米脂质体的制备方法，其包括以下具体步骤：
(1)按实施例1中的制备方法制得纳米脂质体产品；
(2)将上述制得的纳米脂质体产品用磷酸盐缓冲液重悬，加入适量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)后再立即加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，并于室温条件下搅拌15min；然后，加入适量MUC16抗体，于3-5℃、优选为4℃的条件下搅拌反应3-5h、优先为4h，孵育过夜制备得到具有靶向的纳米脂质体。
其中，EDC和NHS作为羧基活化剂可以活化共聚物DPPC-DPPE-PEG(2000)-COOH的羧基，从而可以促进其与MUC16抗体反应、使所述MUC16抗体通过共价键连接修饰于纳米脂质体的表面。
具体地，本发明实施中的EDC和所述NHS的投料质量比可以为2:5；EDC与DPPE-PEG(2000)-COOH的投料摩尔比为20:1，即羧基与EDC的摩尔比为1:20。
当然，根据实际反应需求可以对各物料的投料量进行适应性调整；同时，也可以采用其他的羧基活化剂促进共聚物DPPC-DPPE-PEG(2000)-COOH与MUC16抗体的反应。
本发明实施例中制得的纳米脂质体在其表面采用MUC16(Mucin16)抗体修饰，从而能够提高纳米脂质体对卵巢癌细胞等MUC16高表达的癌细胞的主动靶向性，达到精准释药的目的。
其中，MUC16抗体可以优选为MUC16蛋白近膜端的羧基末端片段的单克隆抗体，以规避血清中CA125对具有靶向的纳米脂质体中的MUC16抗体可能产生的中和效应、更好地保证纳米脂质体的靶向作用。
实施例4
取实施例1、实施例2和实施例3中制得的纳米脂质体产品，分别测试其粒径分布和电位，结果见表1所示；可见，实施例1中空白的纳米脂质体的平均粒径为158.6±0.96nm、电位为-14.6±1.42；实施例2中载有药物的纳米脂质体的平均粒径为；实施例3中载有药物并具有靶向的纳米脂质体的平均粒径为。
因此，说明通过本发明公开的制备方法制备出的纳米脂质体粒径均一，适合做为药物载体；并且，制得的纳米脂质体在4℃存放21天时的粒径大小仍然保持着原有粒径大小，说明该纳米脂质体具有很好的稳定性，利于长时间保存。
样品 粒径(nm) 电位(mV)
实施例1 158.6±0.96 -14.6±1.42
实施例2 191.1±0.99 -15.8±1.62
实施例3 287.1±0.91 -15.5±1.57
表1各样品粒径及电位
实施例5
纳米脂质体的包封率和载药量检测：
取适量实施例2中新鲜制备的已知浓度的纳米脂质体，经离心洗涤后将所得沉淀用二氯甲烷溶解破乳，再采用高效液相色谱法(HPLC)检测6-姜烯酚含量。
其中，HPLC的液相条件：
流动相为乙腈：水＝56：44，使用UV2489C18Xbridge(150×4.6mm，5μm)检测仪器，λ＝277nm。按照以下公式计算：6-姜烯酚载药量(％)＝检测量/纳米粒总质量×100％；6-姜烯酚包封率(％)＝检测量/总投放量×100％。
检测后，实施例2中直达的纳米脂质体包封的6-姜烯酚的包封率为85.8％、载药量为10.6％；因此，说明对于疏水性药物6-姜烯酚，通过本发明的制备方法可以有效地将疏水性药物6-姜烯酚包载在脂质体的疏水性磷脂双分子膜层中，展现了该纳米脂质体很好的载药性能。
实施例6
MUC16抗体与纳米脂质体的连接情况检测
取适量实施例3中制得的纳米脂质体，通过DiI荧光染料标记后移入EP管中，作为实验组；取等量实施例2中制得的纳米脂质体，通过DiI荧光染料标记后移入EP管中，作为对照组。
实验组和对照组均经PBS稀释至2ml；避光条件下，分别向EP管内加入10μl携带荧光AlexaFluor-488山羊抗鼠IgG(可与MUC16抗体)特异性结合，以间接标记MUC16；4℃振荡孵育1h，经双蒸水多次洗涤、离心(3000r/s)，去除过量的山羊抗鼠IgG。
实验组和对照组各取少量处理后的纳米粒溶液经PBS稀释后，于载玻片涂抹少许，在荧光显微镜下观察载有6-姜烯酚的纳米脂质体与MUC16的连接情况；如图1所示，通过荧光显微镜观察，经Dil染色的靶向纳米脂质体的PEG外壳呈红色荧光，靶向纳米脂质体表面的MUC16抗体连接的二抗呈绿色荧光，融合后两种荧光重叠为黄色；因此，表明MUC16抗体已成功连接修饰至纳米脂质体的表面。
实验组和对照组各取200μl处理后的纳米脂质体，并于PBS稀释后采用流式细胞术检测靶向与非靶向的载药纳米脂质体与抗体的结合率；其中，经流式细胞仪测得具有靶向的纳米脂质体的MUC16抗体连接率为56.4±2.2％。
实施例7
(1)按照实施例1中的制备方法制得空白纳米脂质体(记为NB)，按实施例2中的制备方法制得载有6-姜烯酚的纳米脂质体(记为6S@NB)，按实施例3中的制备方法制得具有靶向的载有6-姜烯酚的纳米脂质体(记为6S@NB-MUC16A)。
(2)将步骤(1)制得的各纳米脂质体分别按2、4、6、8倍比例稀释，并分别加入OVCAR3和A2780人卵巢癌细胞株接种于96孔板中(每孔约2000个细胞)，置于5％CO2、37℃细胞培养箱孵育24小时；吸弃孔内培养上清液，除调零组外，每孔均加入0.5％结晶紫100μl，染色20-30min后，洗脱，50℃烘干；每孔加入10％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液150μl，摇床上振荡15-20分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在540nm处测定吸光度。
细胞存活率＝(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100％，经各纳米脂质体处理后的细胞存活率结果见图2；其中，由图2A可见，6S@NB组和6S@NB-MUC16A组对OVCAR3和A2780人卵巢癌细胞具有抑制效果，且6S@NB-MUC16A组对OVCAR3人卵巢癌细胞抑制效果相较于6S@NB对OVCAR3人卵巢癌细胞抑制效果较为明显；由图2B可见，当6S@NB-MUC16A的浓度大于2×1012个/ml；6S@NB-MUC16A组对OVCAR3人卵巢癌细胞抑制效果开始明显优于对A2780人卵巢癌细胞的抑制效果。
同时，经检测发现，6S@NB组和6S@NB-MUC16A对SKOV3人卵巢癌细胞也具有抑制效果，且6S@NB-MUC16A对SKOV3人卵巢癌细胞的抑制效果优于6S@NB。
实施例8
本实施例对实施例3中制得的纳米脂质体的体外细胞寻靶能力进行检测：
(1)将OVCAR3和A2780人卵巢癌细胞接种于6孔板，细胞密度为1×105个/孔，置于5％CO2、37℃细胞培养箱孵育；
(2)待细胞生长至70-80％，用100μl实施例3中制得的纳米脂质体处理，37℃孵育1h。
(3)吸出培养基，PBS洗2-3次，每次1min；用4％多聚甲醛1ml固定10min，PBS洗涤3次，每次5min；加入0.1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)1ml，室温孵育7min，PBS洗涤3次，每次5min；加入5μg/ml的FITC-鬼笔环肽/PBS溶液1ml，室温避光染色30min，PBS洗涤3次，每次5min；加入5μg/ml的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)1ml，室温避光染核5min，PBS洗涤3次，每次5min；抗荧光淬灭剂封片并于激光共聚焦显微镜下观察。
(4)经DiI标记的纳米粒呈红色荧光；经FITC鬼笔环肽染色的细胞骨架呈绿色荧光；经DAPI染色的细胞核呈蓝色荧光；如图3所示，实施例3中制备的具有靶向的纳米脂质体大量红色颗粒围绕在绿色的CA125表达阳性的OVCAR3人卵巢癌细胞边缘，而CA125表达阴性的A2780细胞边缘仅见极少量的红色颗粒；因此，该实验结果均表明实施例3中制备的具有靶向的纳米脂质体可特异性结合MyD88+卵巢癌细胞，具有良好的靶向能力。
实施例9
本实施例对实施例2-实施例3中制得的纳米脂质体的体内细胞寻靶能力进行检测
(1)建立人卵巢癌OVCAR3(MyD88+/CA125+)细胞系裸鼠(BALc)皮下移植瘤模型、并分为6S@NB组和6S@NB-MUC16A组；
(2)6S@NB组中，经裸鼠尾静脉注入DiI荧光染料标记的实施例2中制得的纳米脂质体100μl；6S@NB-MUC16A组，经裸鼠尾静脉注入DiI荧光染料标记的实施例3中制得的纳米脂质体100μl；将各组裸鼠采用异氟烷吸入麻醉后，分别在10min、1h、2h、4h和24h后将裸鼠分别放入显影仓内，使用仪器对准裸鼠进行荧光显影(激发波长549nm，发射波长565nm)分析肿瘤区的显影强度值，比较各组间荧光显影的差异。
(3)取各组裸鼠的肿瘤组织冰冻切片，在光学显微镜下观察肿瘤组织内纳米粒聚集情况；可见，6S@NB-MUC16A组的裸鼠肿瘤部位显示强荧光信号，表明这些带MUC16抗体的纳米脂质体被MyD88+卵巢癌瘤体有效吸收；相反，6S@NB组的裸鼠卵巢癌瘤体中仅在2小时检测到荧光信号。
同时，如图4定量数据所示，经尾静脉注射纳米粒2小时，6S@NB-MUC16A组，实施例3中制得的具有靶向的纳米脂质体的肿瘤吸收率是实施例2中制得的纳米脂质体的38.2倍，而其余时间点6S@NB组均未检测到荧光信号；6S@NB-MUC16A组在注入1小时后即可检测到荧光信号(4.218e9)，2小时荧光强度及范围最大(4.093e10)，随后逐渐减弱，但24小时后检测仍有较强荧光信号(2.730e10)，说明实施例3中制得的具有靶向的纳米脂质体可在瘤体内较长时间滞留。
此外，如图5所示，肿瘤冰冻切片(1小时)共聚焦荧光图像显示，6S@NB-MUC16A组的红色荧光显著高于6S@NB组，进一步证实了实施例3中制得的纳米脂质体对MyD88+卵巢癌的靶向性，并且有效改善了肿瘤对纳米脂质体的吸收效力。
实施例10
本实施例对实施例3制得的具有靶向的纳米脂质体的体内治疗效果进行检测
(1)治疗：根据有效载药量计算以保证实验各组6-姜烯酚浓度为10mg/kg，每隔3天分别通过尾静脉注射药物200μl；其中，实验组1注射药物为紫杉醇(PTX)，实验组2注射药物为紫杉醇+6-姜烯酚，实验组3注射药物为紫杉醇+实施例2中制得的纳米脂质体，实施例4注入药物为紫杉醇+实施例3制得的具有靶向的纳米脂质体，对照组注射等量的生理盐水；紫杉醇5mg/kg通过腹腔注射给药；治疗超声辐照条件设置为：频率1MHz，输出功率3W/cm2，占空比20％，时长3min；
(2)治疗评价指标：肿瘤生长及体重变化情况；毒性实验：乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、肌酐，以及心、肝、脾、肺和肾进行H&E染色；肿瘤细胞增殖(PCNA染色)、凋亡(TUNEL染色)；裸鼠生存分析。
(3)如图6所示，治疗后实验组1-实验组4的肿瘤均有所缩小，且实验组4的治疗超声组最明显，抑瘤率达到84.9％。
在治疗期间，实验组3和实验组4裸鼠平均体重升高约1g，而对照组裸鼠平均体重下降约1g，实验组2裸鼠体重下降更明显约3g；可见，6-姜烯酚的纳米脂质体递药系统的毒性明显低于游离的6-姜烯酚治疗；上述各治疗组心脏、肝、脾、肺和肾脏未见明显病理形态学变化。
如图7所示，实验组4的凋亡指数明显高于其它治疗组，裸鼠的存活时间也明显优于其他治疗组；因此，表明包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的具有靶向的纳米脂质体能靶向裸鼠MyD88+卵巢癌移植瘤，联合局部低频超声辐照明显增加了MyD88+卵巢癌对紫杉醇的敏感性，抑制了肿瘤的生长，延长了载瘤裸鼠存活时间。
其中，各组统计量参数的置信区间如下表2所示。
组别 中间值 置信区间
对照组 24 (22，26)
实验组1 29 (23，35)
实验组2 39 (37，42)
实验组3 43 (40，46)
实验组4 51 (50，52)
表2各组统计量参数表
本发明上文实施例中重点描述的是各个实施例之间的不同，各个实施例之间不同的优化特征只要不矛盾，均可以组合形成更优的实施例，考虑到行文简洁，在此则不再赘述。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的磷脂双分子层之间载有6-姜烯酚分子，所述纳米脂质体的亲水性内腔之中载有相变材料液态氟碳。
2.根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于，所述磷脂双分子层的外表面修饰有MUC16抗体，且所述MUC16抗体通过共价键与所述磷脂双分子层的外表面的分子连接。
3.一种权利要求1所述的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
脂膜制备：将磷脂类化合物、附加剂和6-姜烯酚溶于有机溶剂中，再经溶解混合后除去所述有机溶剂制得脂膜，并对所述脂膜进行干燥；
脂质体分散液制备：将干燥后的所述脂膜于加热条件下与磷酸盐缓冲溶液混合进行水化，使所述脂膜分散于所述磷酸盐缓冲溶液中；然后放置至室温，再于冰浴下超声制得载有6-姜烯酚的脂质体分散液；
相变材料载入：将所述脂质体分散液冷却至3-5℃后加入液态氟碳，并于冰浴条件下进行超声均质乳化，使所述液态氟碳载入脂质体的亲水性内腔中，制备得到纳米脂质体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述脂膜的质量比为1:4-20；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，浓度为0.01或0.011mol/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂类化合物为二棕榈酰磷脂酰胆碱；所述附加剂为二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基；所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液；所述有机溶剂为氯仿。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基中聚乙二醇的分子量为2000、3400或5000；所述二棕榈酰磷脂酰胆碱与所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基聚合形成的共聚物的分子量为12000-24000，且所述共聚物的聚乙二醇亲水链段占所述共聚物的质量百分数为20-40％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括靶向修饰步骤：将所述纳米粒脂质体用所述磷酸盐缓冲液重悬，并于室温搅拌条件下加入羧基活化剂进行活化；经活化后再加入MUC16抗体，于3-5℃的条件下搅拌反应3-5h后孵育过夜、使所述MUC16抗体通过共价键连接修饰于纳米脂质体的表面，制备得到具有靶向的纳米脂质体。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化剂包括EDC和NHS，所述的EDC和所述NHS的质量比为2:5；所述二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基与所述EDC的摩尔比为1:20。
9.根据权利要求1所述的纳米脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的纳米脂质体在制备紫杉醇耐药性逆转药物中的应用。
CN202010454372.7A 2020-05-26 2020-05-26 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用 Active CN111643677B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010454372.7A CN111643677B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010454372.7A CN111643677B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111643677A true CN111643677A (zh) 2020-09-11
CN111643677B CN111643677B (zh) 2023-06-27

Family

ID=72342772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010454372.7A Active CN111643677B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111643677B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117982667A (zh) * 2024-04-02 2024-05-07 四川省肿瘤医院 靶向TLR4-MD2/MyD88信号通路的递送系统、其制备方法及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007100650A2 (en) * 2006-02-23 2007-09-07 Yale University Drug resistance to plant alkaloids based upon myd88 status in a cell and methods of inhibiting signaling through the tlr-4:myd88 pathway
US20110104258A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-05 Brigham Young University Technique for drug and gene delivery to the cell cytosol
CN103263433A (zh) * 2013-05-22 2013-08-28 中国药科大学 6-姜烯酚增强胰腺癌对吉西他滨化疗敏感性及其复方药物
CN104623698A (zh) * 2015-02-13 2015-05-20 中国科学院上海硅酸盐研究所 用于多模式成像与光热治疗的脂质体基纳米诊疗剂及其制备方法
CN106729774A (zh) * 2016-11-03 2017-05-31 重庆医科大学 甘草次酸修饰的载丹参酮相变型纳米超声造影剂及其制备方法
US20180140654A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-24 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treatment of alcohol induced liver injury
CN108743980A (zh) * 2018-07-06 2018-11-06 重庆医科大学 一种叶酸靶向可视化光热-化疗治疗剂及其制备方法
CN110237276A (zh) * 2019-07-10 2019-09-17 香港大学深圳医院 一种纳米粒及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007100650A2 (en) * 2006-02-23 2007-09-07 Yale University Drug resistance to plant alkaloids based upon myd88 status in a cell and methods of inhibiting signaling through the tlr-4:myd88 pathway
US20110104258A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-05 Brigham Young University Technique for drug and gene delivery to the cell cytosol
CN103263433A (zh) * 2013-05-22 2013-08-28 中国药科大学 6-姜烯酚增强胰腺癌对吉西他滨化疗敏感性及其复方药物
CN104623698A (zh) * 2015-02-13 2015-05-20 中国科学院上海硅酸盐研究所 用于多模式成像与光热治疗的脂质体基纳米诊疗剂及其制备方法
CN106729774A (zh) * 2016-11-03 2017-05-31 重庆医科大学 甘草次酸修饰的载丹参酮相变型纳米超声造影剂及其制备方法
US20180140654A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-24 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treatment of alcohol induced liver injury
CN108743980A (zh) * 2018-07-06 2018-11-06 重庆医科大学 一种叶酸靶向可视化光热-化疗治疗剂及其制备方法
CN110237276A (zh) * 2019-07-10 2019-09-17 香港大学深圳医院 一种纳米粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG JIAN-MING等: "Atractylenolide-I Sensitizes Human Ovarian Cancer Cells to Paclitaxel by Blocking Activation of TLR4/MyD88-dependent Pathway" *
SUN HONG PARK等: "Inhibition of LPS binding to MD-2 co-receptor for suppressing TLR4-mediated expression of inflammatory cytokine by 1-dehydro-10-gingerdione from dietary ginger" *
WANG QILONG等: "Enhanced oral bioavailability and anti-gout activity of [6]-shogaol-loaded solid lipid nanoparticles" *
YONG GAO，MD，PHD等: "Ultrasound molecular imaging of ovarian cancer with CA-125 targeted nanobubble contrast agents" *
ZHANG HUIYUN等: "Enhanced Oral Bioavailability, Anti-Tumor Activity and Hepatoprotective Effect of 6-Shogaol Loaded in a Type of Novel Micelles of Polyethylene Glycol and Linoleic Acid Conjugate" *
侯以森等: "6-姜烯酚药理作用的研究进展" *
王敏等: "液态氟碳纳米粒作为药物载体在肿瘤治疗方面的研究进展" *
贾晓娟: "6-姜烯酚对人卵巢癌SKOV-3和A2780细胞生长和促炎因子表达的抑制作用" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117982667A (zh) * 2024-04-02 2024-05-07 四川省肿瘤医院 靶向TLR4-MD2/MyD88信号通路的递送系统、其制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111643677B (zh) 2023-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ye et al. Bioinspired nanoplatelets for chemo-photothermal therapy of breast cancer metastasis inhibition
Zhao et al. Exosome-mediated siRNA delivery to suppress postoperative breast cancer metastasis
Wang et al. Orthogonal near-infrared upconversion co-regulated site-specific O2 delivery and photodynamic therapy for hypoxia tumor by using red blood cell microcarriers
Ouyang et al. A Trojan horse biomimetic delivery strategy using mesenchymal stem cells for PDT/PTT therapy against lung melanoma metastasis
Duan et al. Biomimetic nanocomposites cloaked with bioorthogonally labeled glioblastoma cell membrane for targeted multimodal imaging of brain tumors
Guo et al. Dandelion‐like tailorable nanoparticles for tumor microenvironment modulation
Harfouche et al. Nanoparticle-mediated targeting of phosphatidylinositol-3-kinase signaling inhibits angiogenesis
CN104497171B (zh) 基于透明质酸的两亲聚合物、其制备方法与应用
CN105997880B (zh) 一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其制备方法
CN108354901A (zh) 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
Sun et al. Codelivery of sorafenib and GPC3 siRNA with PEI-modified liposomes for hepatoma therapy
Zhao et al. Extracellular vesicle mimics made from iPS cell-derived mesenchymal stem cells improve the treatment of metastatic prostate cancer
Du et al. Intracellular tracking of drug release from pH-sensitive polymeric nanoparticles via FRET for synergistic chemo-photodynamic therapy
CN107551277A (zh) 用于包载抗肿瘤药物的pH敏感靶向磷脂聚组氨酸纳米粒
Rampado et al. Nanovectors design for theranostic applications in colorectal cancer
CN105434347A (zh) 一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用
CN105534896B (zh) 一种多肽和化疗药物联合的载药胶束及其制备方法和应用
Zhuang et al. Two-photon AIE luminogen labeled multifunctional polymeric micelles for theranostics
Lokerse et al. Comparing the therapeutic potential of thermosensitive liposomes and hyperthermia in two distinct subtypes of breast cancer
Li et al. iRGD peptide-mediated liposomal nanoparticles with photoacoustic/ultrasound dual-modality imaging for precision theranostics against hepatocellular carcinoma
CN107875140A (zh) 一种双靶向药物递送系统及其在制备肿瘤治疗制剂中的应用
CN111643677A (zh) 一种包封TLR4/MyD88信号通路拮抗剂的纳米脂质体及其制备方法和应用
CN108126210A (zh) 一种单靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
Zhu et al. Tumor-microenvironment-responsive poly-prodrug encapsulated semiconducting polymer nanosystem for phototherapy-boosted chemotherapy
Jing et al. Nanoradiosensitizer with good tissue penetration and enhances oral cancer radiotherapeutic effect

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant