CN111630379A - 单克隆抗体的简化的定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，该方法包括以下步骤：(a)捕捉样品中的单克隆抗体并将其固定在多孔体的细孔内的步骤；(b)使固定有该单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触，用30分钟以上进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及(c)通过液相色谱质谱联用(LC‑MS)对由选择性蛋白酶消化得到的肽片段进行检测的步骤，在反应开始初期的10秒～5分钟的搅拌条件下以及之后的静置条件下实施步骤(b)。根据本发明，可以简化使用质谱分析的单克隆抗体的检测方法并在多样品分析中应用。

Description

单克隆抗体的简化的定量方法
技术领域
本发明涉及单克隆抗体的简化的定量方法，具体而言，涉及更适合于利用质谱分析的自动化定量系统的定量方法。更具体而言，本发明涉及对已确立的用于定量单克隆抗体的规程的改良。
背景技术
近年来，作为代替ELISA法的定量方法，正在积极开展使用LC-MS/MS法的抗体药物的生物分析的开发。
本发明人等的小组发现，通过将测定对象的单克隆抗体以及可将其作为底物进行消化的蛋白酶双方固定在固相，可以基于区域选择性的固相-固相反应进行单克隆抗体的蛋白酶消化，并成功取得了单个单克隆抗体所特有的肽(专利文献1～6和非专利文献1～8)。该方法是使将单克隆抗体固定在细孔内的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触来进行单克隆抗体的Fab区选择性蛋白酶消化的、质谱分析的前处理方法，是能够通过液相色谱质谱联用(LC-MS)有效检测和定量所得肽片段的划时代的技术。本发明人等将本方法命名为“纳米表面和分子取向限制蛋白水解(nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis)方法(nSMOL法)”。
基于nSMOL法的血中抗体药物的定量是如下方法：可以仅限定于抗体药物的具有特异性序列的Fab区进行蛋白酶消化，抑制在LC-MS/MS分析中最被视为问题的离子抑制效应，提供更稳定且可靠性高的定量值。本发明人等已确认到，将nSMOL法和LC-MS/MS法组合使用的单克隆抗体的定量方法在多达15种以上的抗体药物的血药浓度测定中符合日本、美国和欧州的用于校验生物学分析方法的指南的标准。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/033479号
专利文献2：国际公开WO2016/143223号
专利文献3：国际公开WO2016/143224号
专利文献4：国际公开WO2016/143226号
专利文献5：国际公开WO2016/143227号
专利文献6：国际公开WO2016/194114号
非专利文献
非专利文献1：Analyst.2014Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a
非专利文献2：Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j
非专利文献3：Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
非专利文献4：Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018
非专利文献5：Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230
非专利文献6：J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038
非专利文献7：Clin Pharmacol Biopharm 2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164
非专利文献8：J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
发明内容
发明要解决的问题
nSMOL法具有如下反应机理：通过使固定在直径约200nm的纳米颗粒表面的蛋白酶与固定在细孔直径约100nm的多孔体的抗体分子接触，在受限制的反应场所中将抗体分子的Fab选择性切断。因此认为，为了进行基于nSMOL法的抗体分子的选择性蛋白酶消化，需要纳米颗粒表面与多孔体均匀接触，必须在反应中通过混合或搅拌将它们均匀地分散在反应液中。
例如，为了实施nSMOL法，市售有LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BAKit(nSMOL抗体BA试剂盒)”(岛津制作所)，在与试剂盒一并提供的规程中记载了：在纳米颗粒与多孔体接触时进行使用旋涡混合器等的搅拌。将微升级的微量样品置于旋涡混合器上，边搅拌边反应，成功实现了再现性高的反应。
另一方面，在使用旋涡混合器的情况下，反应后的收率在很大程度上依赖于容器形状的影响、特别是培养器的形状，会产生某种机种依赖性。因此，nSMOL法的实施即使在常规的研究室是可能的，在初始导入、在医院内设置的临床实验室等也存在难以实施的可能性。
在nSMOL法中使用的容器必须为微管的形态，认为以特殊形状的管或低容量的管难以实施。此外，在多样品的分析中可以使用微孔板，但通过使用旋涡混合器的搅拌，有可能无法实现均匀的反应环境。因此，还存在必须严格控制搅拌速度等缺乏通用性的部分。
为了进行低速下的搅拌，上述专利文献4(WO16/143226号)中公开了进行轻敲旋转搅拌(tapping rotation stirring)的方法，该改良方法在通用性方面也留有要解决的点。
用于解决问题的方案
鉴于上述问题，我们以提高nSMOL法的通用性为目的，实施了对反应条件的进一步研究。
具体而言，以排除容器特殊性为目的，研究了nSMOL反应能够适用于任何实验设备的条件。例如，以除了箱形且可设置水箱的培养器以外还能够使用块加热器、热循环仪、节省空间的培养器、水浴等各种设备实施nSMOL为目的进行了研究。
结果发现，在使纳米颗粒与多孔体接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的情况下，即使在消化反应中不进行不断搅拌、在样品中双方的颗粒沉淀的状态下，也可以进行定量检测而不会大幅损害检测结果。
即，本发明提供以下方案。
1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，上述方法包括以下步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并将其固定在多孔体的细孔内的步骤；
(b)使固定有该单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触，用30分钟以上进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及
(c)通过液相色谱质谱联用(LC-MS)检测由选择性蛋白酶消化得到的肽片段的步骤，
在反应开始初期的10秒～5分钟的搅拌条件下以及之后的静置条件下实施步骤(b)。
2.根据上述第1项所述的方法，其中，在步骤(b)中，在反应开始初期的10秒～1分钟的搅拌的基础上，还包括10秒～1分钟的1次以上的追加搅拌。
3.根据上述第1或2项所述的方法，其中，搅拌通过利用自动化的分液器的吹打操作来实现。
4.根据上述第1～3项中的任一项所述的方法，其中，在设定为规定的反应温度的加热容器内实施步骤(b)。
5.根据上述第1～4项中的任一项所述的方法，其对于样品中的0.05～300μg/ml的抗体浓度范围得出能定量的结果。
发明的效果
根据本发明，能够简化反应技术，并且扩大了可用于基于nSMOL法的单克隆抗体检测的容器的范围，同时还扩大了可实施的实验设施。此外，特别是可以使用用于多样品处理的微孔板，可期待应用于自动化的多样品分析。
附图说明
图1示出3种反应条件下的曲妥珠单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，B_1、B_3和B-5示出每隔1小时搅拌10秒时的结果，C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
图2示出3种反应条件下的贝伐单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，B_1、B_3和B-5示出每1小时搅拌10秒时的结果，C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
图3示出2种反应条件下的阿达木单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，C_1、C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
图4示出2种反应条件下的纳武单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，C_1、C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
图5示出2种反应条件下的英夫利昔单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，C_1、C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
图6示出2种反应条件下的利妥昔单抗的分析结果。(A)是实施1小时的步骤(b)时的结果，(B)是进行3小时的步骤(b)时的结果，(C)是进行5小时的步骤(b)时的结果，A_1、A_3和A_5示出一直搅拌时的结果，C_1、C_3和C_5示出最初的搅拌后静置时的结果。纵轴表示相对峰强度。
具体实施方式
本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，上述方法包括以下步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并将其固定在多孔体的细孔内的步骤；
(b)使固定有该单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触，用30分钟以上进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及
(c)通过液相色谱质谱联用(LC-MS)检测由选择性蛋白酶消化得到的肽片段的步骤，
在反应开始初期的10秒～5分钟的搅拌条件下以及之后的静置条件下实施步骤(b)。
<步骤(a)>
本发明的方法的步骤(a)相当于捕捉样品中的单克隆抗体并将其固定在多孔体的细孔内的步骤。
在本说明书中，“样品”是指要检测单克隆抗体的存在的液体样品，并没有特别限定，一般为来自小鼠、大鼠、兔子、山羊、牛、人类等哺乳动物、特别是人类受试者、主要是人类患者的生物学样品，优选为血浆或血清、或组织匀浆提取物。或者，例如为了证实发明的效果，样品可以是包含人为添加的单克隆抗体和血浆的液体样品。为了检测本发明的方法中的单克隆抗体，样品中的单克隆抗体的浓度在0.05～300μg/ml的范围内即可。
作为可作为测定对象的单克隆抗体，并没有限定，例如可列举出：帕尼单抗、奥法木单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、纳武单抗、雷莫芦单抗、阿达木单抗等人类抗体；托珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1、贝伐单抗、奥马珠单抗、美泊利单抗、吉妥珠单抗、帕利珠单抗、雷珠单抗、塞妥珠单抗、奥瑞珠单抗、莫加珠单抗、依库珠单抗、托珠单抗、美泊珠单抗等人源化抗体；利妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗等嵌合抗体等。
此外，在维持单克隆抗体的特异性的同时附加了进一步的功能的偶联物、例如Fc融合蛋白质(依那西普、阿巴西普等)、抗体-药物偶联物(例如布伦妥昔单抗维多汀、吉妥珠单抗-奥唑米星、曲妥珠单抗-美坦新等)也可作为测定对象的单克隆抗体。在测定之前，可以使偶联物的结合离解、仅将抗体部分供于分析，也可以以偶联物的形态原样供于分析。
单克隆抗体的氨基酸序列的信息等例如可以从京都基因-基因组百科事典(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)获取。
作为本发明的方法中使用的多孔体，可以使用具有很多细孔、可位点特异性地结合抗体的物体。多孔体的平均细孔直径可以在10nm～200nm左右的范围且小于纳米颗粒的平均粒径的范围适当设定。
本发明的步骤(a)中，将测定对象的单克隆抗体固定在多孔体的细孔内。出于该目的，优选使用在多孔体的细孔内固定有位点特异性地与抗体相互作用的连接分子的多孔体。
作为连接分子，优选使用位点特异性地与抗体的Fc区结合的蛋白A、蛋白G等。通过使用在细孔内固定有这些连接分子的多孔体，从而在细孔内将抗体的Fc区固定，Fab区位于细孔的表层附近，因此可以进行基于蛋白酶的Fab区的区域选择性消化。
作为在本发明中可适宜使用的多孔体，并没有特别限定，例如可列举出：ProteinG Ultralink树脂(Pierce公司制造)、TOYOPEARL TSKgel(东曹株式会社制造)、TOYOPEARLAF-rProtein A HC-650F resin(东曹株式会社制造)、Protein A Sepharose(GE医疗)、KanCapA(KANEKA CORPORATION)等。
将抗体固定在多孔体的细孔内的方法没有特别限定，例如在将抗体固定于在细孔内固定有蛋白A、蛋白G的多孔体的情况下，通过将多孔体的悬浊液与包含抗体的溶液混合，可以容易地将抗体固定在细孔内。多孔体与抗体的量比可以根据目的而适当设定。
<步骤(b)>
本发明的方法的步骤(b)相当于使上述步骤(a)中得到的固定有单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触、用30分钟以上进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤。
固定于纳米颗粒的蛋白酶的种类根据作为基于质谱分析的定量或鉴定的对象的单克隆抗体的种类而适当选择即可，没有限定，例如可以将胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内肽酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶单独或组合使用。作为蛋白酶，特别优选使用胰蛋白酶。作为在本发明的方法中可以适宜使用的蛋白酶，例如可列举出Trypsin Gold(Promega Corporation制造)、TrypsinTPCK-treated(Sigma-Aldrich Co.LLC.制造)等。
纳米颗粒的平均粒径大于多孔体的平均细孔直径，形状没有特别限定，从蛋白酶接近多孔体的细孔的均匀化的角度来看，优选球状的纳米颗粒。此外，纳米颗粒优选分散性高、平均粒径均匀。
作为纳米颗粒的种类，优选能够分散或悬浊于水性介质且能够容易地通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浊液回收的磁性纳米颗粒。此外，在不容易发生聚集的方面，更优选其表面被有机聚合物包覆的磁性纳米颗粒。作为被有机聚合物包覆的磁性纳米珠的具体例子，可列举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，例如可适宜使用多摩川精机株式会社制造的FG beads(用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)包覆铁氧体颗粒而得的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
为了非特异性的蛋白质的吸附抑制和蛋白酶的选择性固定，上述纳米颗粒优选用可与蛋白酶结合的间隔分子进行了修饰。通过借助间隔分子来固定蛋白酶，从而可抑制蛋白酶从纳米颗粒表面脱离，可提高蛋白酶消化的区域选择性。此外，通过调整间隔物的分子尺寸，还能够使蛋白酶选择性接近抗体的期望位置、从而提高区域选择性。
用这种间隔分子进行了表面修饰的纳米颗粒也有销售，例如，用具有被N-羟基琥珀酰亚胺活化了的酯基(活性酯基)的间隔分子进行了修饰的纳米颗粒以商品名“FG beadsNHS”(多摩川精机株式会社)进行销售。
对将蛋白酶固定在纳米颗粒的表面的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶和纳米颗粒(或者修饰纳米颗粒表面的间隔分子)的特性等采用适当的方法。需要说明的是，上述LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)中包含固定有胰蛋白酶作为蛋白酶的纳米颗粒、即FG beads Trypsin DART(注册商标)，也可以适宜地用于本发明的方法。
通过使固定有上述单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触，单克隆抗体选择性地被蛋白酶消化，产生肽片段。
蛋白酶消化例如在调节至蛋白酶的最佳pH附近的缓冲溶液中实施。用于进行蛋白酶消化的反应温度为37℃左右即可，优选在饱和蒸气压下、约50℃下进行。反应时间可以设定为30分钟～20小时、例如1小时～8小时、3～5小时的范围。
本发明的方法中，反应开始初期的10秒～5分钟、例如10秒～1分钟在搅拌条件下并且之后在静置条件下实施步骤(b)。在此，“反应开始初期”是指用30分钟以上实施的步骤(b)中的最初的时间，应理解：在各种实验环境下，并不一定能在多孔体与纳米颗粒的严格意义上的刚接触后进行搅拌。然而，通常在向固定有单克隆抗体的多孔体中添加固定有蛋白酶的纳米颗粒的阶段、或在向固定有蛋白酶的纳米颗粒中添加固定有单克隆抗体的多孔体的阶段进行搅拌。
搅拌的方法并没有特别限定，可以采用基于旋涡混合器、搅拌器、旋转混合器、轻敲旋转混合器的搅拌。搅拌还可以通过例如自动化的分液器的吹打操作、即用微量移液管吸入和吐出反应液来获得搅拌效果。
如实施例中证实的那样确认到，令人惊讶的是，步骤(b)的反应通过在反应前预先充分搅拌，即使不在迄今被认为是必要的进行不断搅拌的条件下，也可以充分进行，实现定量检测样品中的单克隆抗体的目的。
因此，在反应开始初期进行搅拌即可、之后的搅拌并非必要，但本发明的方法并不排除在步骤(b)中例如反应开始初期的10秒～1分钟进行搅拌、进一步进行10秒～1分钟的1次以上的追加搅拌的情况。
如此，本发明通过反应开始初期在搅拌条件并且之后在静置条件下进行步骤(b)的反应，能够提供进一步简化的单克隆抗体的检测方法。
为了防止反应液蒸发，优选将反应维持在饱和蒸气压下。出于该目的，例如对于节省空间的培养器，设想放置装有水的小箱等。对于加热块，例如可以将用水打湿的擦拭物与样品一起用保鲜膜等密封并加热。即使以这种常用的技术，nSMOL反应也充分进行，可以进行抗体药物的生物分析。此外，例如可以在设定为规定的反应温度的加热容器内实施步骤(b)，这对于检测方法的自动化会是有效的。
通过蛋白酶消化被消化的肽会溶解并释放到反应液中。因此，为了将目标的肽片段供于质谱分析，需要去除多孔体和纳米颗粒。这可以通过对蛋白酶消化后的样品进行过滤、离心分离、磁性分离、透析等操作来实现。
例如，通过使用聚偏氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF(低结合亲水性PVDF)、孔径0.2μm、Millipore公司制造)、聚四氟乙烯(PTFE)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、Millipore公司制造)等进行过滤，能够简便地去除多孔体和纳米颗粒。过滤如果采用离心过滤，则可以进行迅速且简便的过滤。
<步骤(c)>
本发明的方法的步骤(c)相当于通过液相色谱质谱联用(LC-MS)检测由选择性蛋白酶消化得到的肽片段的步骤。
对质谱分析中的离子化法和经离子化的试样的分析方法没有特别限定。此外，可以使用三重四极杆质谱仪等进行MS/MS分析、或者MS3以上的多级质谱分析、多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。
在本发明的方法中特别适合的装置并没有特别限定，例如可列举出LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060(均为岛津制作所)、LCMS-IT-TOF(岛津制作所)。
通过利用质谱分析等检测包含对于目标的单克隆抗体而言为特异性的Fab区、例如重链和/或轻链的CDR1区、CDR2区、CDR3区的氨基酸序列的肽片段，可以进行目标的单克隆抗体的鉴定和/或定量。
对于意欲作为抗体药物使用的单克隆抗体，其氨基酸序列信息等已被公开，可以获取到重链和轻链的氨基酸序列、Fab和Fc区、互补决定区(CDR)、二硫键等信息。因此，由基于nSMOL法的蛋白酶消化得到多个肽，而只要获得关于各个肽的氨基酸序列信息，则能够容易地理解该肽存在于单克隆抗体的哪一个位置。因此，能够选择来自Fab区的多个肽中特别适宜的肽作为分析对象。如此选择的肽被称为“特征肽(signature peptide)”。
nSMOL法的细节例如在WO15/033479号；WO2016/143223号；WO2016/143224号；WO2016/143226号；WO2016/143227号；WO2016/194114号；Analyst.2014Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a；Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j；Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004；Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018；Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230；J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038；Clin Pharmacol Biopharm 2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164；和J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032等中公开。这些文献的公开内容通过参照而纳入本说明书。
实施例
通过以下的实施例来对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于实施例。
首先，以下记载本实施例中进行的nSMOL法的步骤。需要说明的是，所使用的试剂和容器等可以使用与操作说明书一起作为“nSMOL Antibody BA Kit”由岛津制作所提供的试剂和容器等。
需要说明的是，nSMOL(注册商标)Antibody BA Kit中包括以下试剂。
Immunoglobulin Collection Resin(免疫球蛋白收集树脂；本发明中的多孔体的悬浊液)
Wash Solution 1(洗涤溶液)
Wash Solution 2(洗涤溶液)
Reaction Solution(反应溶液)
Enhanced Reaction Solution(反应促进溶液)
Reaction Stop Solution(反应停止溶液)
FEG Beads Trypsin DART(注册商标、固定有蛋白酶的纳米颗粒(粒径200nm)的悬浊液)
nSMOL法的常规方法如下。
<步骤(a)>
取Immunoglobulin Collection Resin(悬浊液)25μL。
取Wash solution 1 90μL，加入到上述中。
取包含单克隆抗体的样品(例如人类血浆)10μL，加入到上述中。
轻轻搅拌5分钟左右。
将悬浊液移至滤杯或滤板。
离心(10,000g×1分钟、或3,000g×2分钟)并去除上清液。
加入Wash solution 1 200μL，同样离心并去除上清液(2次)。
加入Wash solution 2 200μL，同样离心并去除上清液(2次)。
<步骤(b)>
加入Reaction buffer或Enhanced reaction buffer 75μL。
加入FG beads Trypsin DART 10μL。
在饱和蒸气压下、50℃下搅拌5小时。
加入Reaction Stop Solution 10μL。
离心过滤，回收溶液。回收是进行磁性分离，或将滤板层叠两层进行离心过滤。
<步骤(c)>
进行LC-MS分析。
[实施例1]
使用曲妥珠单抗作为测定对象，在以下的3种条件下分别实施5小时的现有的常规nSMOL法的步骤(b)中的50℃下的反应。需要说明的是，搅拌用旋涡混合器(200-1000rpm)进行。
条件A：持续搅拌
条件B：重复进行在搅拌1分钟后静置1小时(每1小时搅拌一次)
条件C：搅拌1分钟后静置
样品使用添加了50μg/ml浓度的曲妥珠单抗(中外制药株式会社制造)的人类血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOL Antibody BA Kit中包括的Enhanced ReactionSolution作为反应液。
在步骤(b)的进行中以目视观察反应液。结果，随着静置时间变长，观察到Immunoglobulin Collection Resin和FG beads Trypsin DART沉降到容器底部。
在反应了1小时、3小时和5小时的样品中迅速添加Reaction Stop Solution(10％甲酸)并回收溶液，使用NexeraX2系统(岛津制作所)和LCMS-8050/8060(岛津制作所)进行LC-MS测定。作为用于定量曲妥珠单抗的肽片段(特征肽)，选择存在于重链的CDR2区的IYPTNGYTR(序列编号1)。
LC-MS测定的结果示于图1。由图1的结果可知，在持续进行搅拌的条件A下，获得了最高的离子收率。然而，条件B和条件C的结果显示出仅比条件A低10～20％的值，确认到为可没有问题地用于测定的水平。此外，在任一条件下，通过延长反应时间均会使值升高，由此可知，通过调节步骤(b)的反应时间也可以应对。
[实施例2]
使用贝伐单抗作为测定对象实施与实施例1同样的研究。样品使用添加了50μg/ml浓度的贝伐单抗(中外制药株式会社)的人类血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOLAntibody BA Kit中包括的Reaction Solution作为反应液。作为用于定量贝伐单抗的特征肽，选择存在于重链的CDR2区的FTFSLDTSK(序列编号2)。
LC-MS测定的结果示于图2。本实施例中，基于不同搅拌条件的检测结果未出现显著差异。
[实施例3]
使用阿达木单抗作为测定对象在条件A和C下实施与实施例1同样的研究。样品使用添加了50μg/ml浓度的阿达木单抗(AbbVie GK)的人类血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOL Antibody BA Kit中包括的Enhanced Reaction Solution作为反应液。作为用于定量阿达木单抗的特征肽，选择存在于轻链的CDR3区的APYTFGQGTK(序列编号3)。
LC-MS测定的结果示于图3。由图1的结果可知，在持续进行搅拌的条件A下获得了高的离子收率。然而，条件C的结果显示出仅比条件A低10～20％的值，确认到为可没有问题地用于测定的水平。此外，在任一条件下，通过延长反应时间均会使值升高，由此可知，通过调节步骤(b)的反应时间也可以应对。
[实施例4]
使用纳武单抗作为测定对象在条件A和C下实施与实施例1同样的研究。样品使用添加了50μg/ml浓度的纳武单抗(小野药品工业株式会社)的人类血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOL Antibody BA Kit中包括的Enhanced Reaction Solution作为反应液。作为用于定量纳武单抗的特征肽，选择存在于重链的CDR1区的ASGITFSNSGMHWVR(序列编号4)。
LC-MS测定的结果示于图4。本实施例中，基于不同搅拌条件的检测结果未出现显著差异。
[实施例5]
使用英夫利昔单抗作为测定对象在条件A和C下实施与实施例1同样的研究。样品使用添加了50μg/ml浓度的英夫利昔单抗(田边三菱制药株式会社)的人类血浆(KohjinBio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOL Antibody BA Kit中包括的Enhanced Reaction Solution作为反应液。作为用于定量英夫利昔单抗的特征肽，选择存在于重链的CDR2区的SINSATHYAESVK(序列编号5)。
LC-MS测定的结果示于图5。本实施例中，基于不同搅拌条件的检测结果未出现显著差异。
[实施例6]
作为测定对象使用利妥昔单抗在条件A和C下实施与实施例1同样的研究。样品使用添加了50μg/ml浓度的利妥昔单抗(全药工业株式会社)的人类血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制造)，使用nSMOL Antibody BA Kit中包括的Enhanced Reaction Solution作为反应液。作为用于定量利妥昔单抗的特征肽，选择存在于重链的CDR2区的GLEWIGAIYPGNGDTSYNQK(序列编号6)。
LC-MS测定的结果示于图6。由图6的结果可知，在持续进行搅拌的条件A下获得了高的离子收率。然而，条件C的结果显示出仅比条件A低10～20％的值，确认到为可没有问题地用于测定的水平。此外，在任一条件下，通过延长反应时间均会使值升高，由此可知，通过调节步骤(b)的反应时间也可以应对。
产业上的可利用性
根据本发明，改良了nSMOL法的规程，可以期待简化使用质谱分析的单克隆抗体的检测方法，以及应用于多样品分析、自动化分析、特别是自动分液器。特别是可以在药代动力学试验、治疗药物监测试验中广泛应用。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用而原样纳入本说明书。

Claims (5)

1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并将其固定在多孔体的细孔内的步骤；
(b)使固定有该单克隆抗体的多孔体与固定有蛋白酶的纳米颗粒接触，用30分钟以上进行单克隆抗体的选择性蛋白酶消化的步骤；以及
(c)通过液相色谱质谱联用(LC-MS)检测由选择性蛋白酶消化得到的肽片段的步骤，
在反应开始初期的10秒～5分钟的搅拌条件下以及之后的静置条件下实施步骤(b)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中，在反应开始初期的10秒～1分钟的搅拌的基础上，还包括10秒～1分钟的1次以上的追加搅拌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，搅拌通过利用自动化的分液器的吹打操作来实现。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的方法，其中，在设定为规定的反应温度的加热容器内实施步骤(b)。
5.根据权利要求1～4中的任一项所述的方法，其对于样品中的0.05～300μg/ml的抗体浓度范围得出能定量的结果。
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