CN111630166A

CN111630166A - 条件性-siRNA及其在治疗心肌肥大中的用途

Info

Publication number: CN111630166A
Application number: CN201880066486.5A
Authority: CN
Inventors: 索姆亚·达斯; 艾尼·米伦·萨尔瓦多·加里卡诺; 韩四平; 丽莎·谢雷尔; 朱莉娅·德罗加蒂斯; 罗宾·胡; 萨希尔·萨加尔; 威廉·A·戈达德三世; 约翰·罗西
Original assignee: General Hospital Corp; California Institute of Technology CalTech; City of Hope
Current assignee: General Hospital Corp; California Institute of Technology CalTech; City of Hope
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2038-08-10
Also published as: US20230107117A1; EP3665281A1; EP3665281A4; WO2019033079A1; CN111630166B

Abstract

本文公开了可由促肥大性RNA序列激活的条件性siRNA及其用于治疗诸如心肌肥大的病症的用途。条件性siRNA以钙调磷酸酶或HDAC2作为靶向。

Description

条件性-siRNA及其在治疗心肌肥大中的用途

优先权声明

本申请要求于2017年8月10日提交的美国临时专利申请号62/543,882的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文，如同在此完整阐述。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国家科学基金会通过研究与创新的新兴领域，用于工程创新的自组装系统集成的折叠设计(EFRI-ODISSEI)授予的资助号1332411，以及美国国立卫生研究院(NIH)授予的资助号AI029329下的政府支持而完成。政府拥有本发明的某些权利。

背景

RNA干扰(RNAi)是由siRNA双链体介导的序列特异性mRNA降解途径，是细胞免疫和发育调节的关键。研究人员已通过抑制一种特定的基因产物来利用合成的RNAi触发器进行治疗，该基因产物在疾病驱动途径中是必需的，但对于正常功能却不是必需的。

然而，考虑到疾病进展中必不可少的一些基因可能在正常细胞中具有重要功能，将其作为靶向是危险的。同时，其他上调的基因对于疾病的进展不是必需的，但可作为有效的指示物。因此，本领域需要开发有效的疗法以在多种适应症中利用该差异表达。下文所述的条件性活性siRNA复合物是研究那些适应症(例如心肌肥大)的治疗的候选物。

心力衰竭(HF)是一种慢性心脏病症，影响全球的数百万人，并被认为是美国医疗保健支出的主要开支。代偿性心肌肥大是病理性心室重构的初始标志(hallmark)之一，其特征是介导和调节心肌肥大并最终导致HF的多种基因和miRNA的上调。即使在HF治疗方面取得了重要进展，但迄今为止尚未开发出没有不良反应的心脏特异性疗法。因此，本领域需要开发一种针对HF的有效疗法。

附图简要说明

本申请包含至少一个彩色附图。在向专利商标局(the Office)提出请求并支付必要费用后，会提供带有彩色附图的本申请副本。

图1显示了根据一个实施方式的Cond-siRNA构建体的二级和三级结构的比较(来自完整的原子MD模拟)。黑色箭头表示2D和3D展示之间的对应特征。

图2是显示RNAi途径的图。

图3示出了条件性siRNA的立足点(toehold)介导的链置换(displacement)过程。在步骤I中，c-siRNA遇到具有正确激活序列(输入)的RNA转录物。在步骤II中，输入RNA结合至支点。步骤III显示了支点介导的链置换。步骤IV示出了传感器链和输入，形成与pro-siRNA分离的废弃双链体。在步骤V中，XRN1，外泌体和其他胞质RNA酶迅速降解未保护的突出端(overhang)，从而将pro-siRNA转变为有效的Dicer底物。在步骤VI中，由Dicer处理siRNA以并入RISC。支点介导的链置换的基本生物物理过程包括快速的1D随机游走：每个N^2步骤中从uS到mS。这导致了支点和双链体这两者的序列特异性。热力学稳定的化学修饰仅限于传感器链，以避免动力学陷阱(traps)。

图4：A)cond-siRNA的一般构建体设计，其中绿色传感器链设计为与信号基因mRNA反向互补，从传感器侧的支点端开始有11或12bp的缺口的红色核心链设计为与传感器和向导互补，且黄色向导链设计为与靶向基因mRNA反向互补。B)cond-siRNA模型。C)cond-siRNA的分子模拟。

图5示出了根据一个实施方式的Cond-siRNA的设计过程的概述。

图6示出了根据一个实施方式的针对mRNA的假想传感器双链体，用于检查传感器的热力学稳定性。

图7示出了根据一个实施方式的结构计算，示出了具有低内部二级结构的传感器链。

图8示出了根据一个实施方式的直方图，示出了假想的传感器双链体和正确二级结构的97％预测形成。

图9示出了根据一个实施方式的针对miRNA的假想传感器双链体，用于检查传感器的热力学稳定性。

图10示出了根据一个实施方式的RNAi靶向双链体的结构。

图11是涉及调节肥大的心脏基因程序的信号途径的示意图。

图12是描绘体内和体外筛选方法的示意图。

图13：A)NuPack生成的选定NPPB 31bp传感器链的二级结构。最小二级结构，约有40-50％的自身折叠的概率。B)结合至5′和3′核心的NPPB传感器链99％的时间有突出。

图14：A)NuPack生成的选定的MYH7 31bp传感器链的二级结构。最小二级结构，约有30％的自身折叠的概率。B)结合至5′和3′核心的NPPB传感器链97％的时间有突出。

图15：A)NuPack生成的HDAC2 25bp向导链的二级结构。结合的平衡概率表明了明显的二级结构。B)NuPack生成的HDAC2向导的二级结构结合至具有与适当的传感器链结合的5′和3′突出端的核心链。尽管向导链具有显著且牢固的二级结构，但与核心链一起放置时，向导链会100％结合至核心。

图16示出了根据某些实施方式的检测鼠ANP mRNA并以鼠钙调磷酸酶作为靶向的测试构建体。

图17示出了根据某些实施方式的检测鼠和人mir-23a-3p并以鼠钙调磷酸酶作为靶向的测试构建体。

图18是描述根据本发明的方法可靶向治疗的损伤部位的示意图。

图19是一系列柱状图，描绘了在体内稳态(homeostasis)中野生型小鼠组织中差异基因表达的实验结果。

图20：低氧下NRVM中的基因表达。

图21：低氧下NRVM中的差异化miRNA表达。

图22：PE处理后NRVM中的基因表达。

图23：PE处理后，NRVM中的差异化miRNA表达。

图24：具有非缺血性(TAC)和缺血性(I/R)HF的小鼠中的基因表达。

图25：具有非缺血性(TAC)和缺血性(I/R)HF的小鼠中的miRNA表达。

图26示出了MFE结构的平衡概率。

图27示出了MFE结构的平衡概率。

图28示出了MFE结构的平衡概率。

图29示出了MFE结构的平衡概率。

图30显示了在TBE中的10％非变性PAGE凝胶上的(ANP：钙调磷酸酶)和(mir-23a-3p：钙调磷酸酶)Cond-siRNA。正确的组件在绿框中指示。

图31显示了根据某些实施方式的mir-23a-3p：钙调磷酸酶Cond-siRNA的双重荧光素酶测定的结果。

图32是根据一个实施方式的柱状图，显示了在PE刺激下NRVM细胞中针对钙调磷酸酶的RNAi活动。

图33显示了根据一个实施方式的用加扰的siRNA(阴性对照)，(ANP：钙调磷酸酶)Cond-siRNA，和市售钙调磷酸酶siRNA(阳性对照)处理时具有和不具有PE刺激的NRVM细胞的图像。

图34显示了根据一种实施方式的细胞尺寸定量的结果。

图35A显示了MI后心脏重构和左心室扩大。

图35B是显示实验结果的柱状图，其中具有任何模式的MI后LV重构的患者发生心血管(CV)死亡，MI，心力衰竭(HF)，中风，或复苏的心脏骤停的综合风险更高。

图36是流程图，伴有相应的示意图，显示了从核中的pri-miRNA处理开始的RNA干扰途径。

图37是示出MI后重构的示意图。

图38是一系列柱状图，描绘了体内稳态中野生型小鼠组织中差异化miRNA表达的实验结果。

图39是包括针对人myh7基因3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母(3-Letteredness)；NBP是坏点数(Number Bad Points)；P是位置。

图40是包括针对大鼠myh7基因的3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母；NBP是坏点数；P是位置。

图41是包括针对人nppa基因的3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母；NBP是坏点数；P是位置。

图42是包括针对大鼠nppa基因的3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母；NBP是坏点数；P是位置。

图43是包括针对人nppb基因的3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母；NBP是坏点数；P是位置。

图44是包括大鼠nppb基因的3′UTR的候选传感器链的表。列的缩写如下：BS是坏片段；3LN是3字母；NBP是坏点数；P是位置。

图45显示了根据一个实施方式的Cond-siRNA构建体的3D示意图的俯视图。

发明详述

条件性-siRNA的概述

本文描述了条件性siRNA复合物(本文中也称为Cond-siRNA，条件性RNA传感器，或RNA传感器)，其包括通过核心分子与分子传感器相关联的治疗性成分(例如，siRNA分子)。条件性siRNA复合物在正常条件下是无活性的，但在分子传感器和生物标志物相互作用后会被激活。这样的分子是合成的核糖开关分子，其允许输入基因或RNA分子针对靶向输出基因“开启”RNAi途径。

RNA-传感器分子或复合物包括彼此结合以形成具有图1和45所示的双链体结构的多链分子复合物的传感器链，向导链，和核心链。在某些实施方式中，这三条链(核心，传感器，和向导)形成两个平行的寡核苷酸双链体，以双交叉(crossover)构型连接。[14](见图1)。在一些方面，每个寡核苷酸双链体的长度足以在RNA干扰(RNAi)途径内操作(参见图2，36)。例如，双链体的长度可在约15至30个碱基对之间。在一些实施方式中，双链体的长度为15至20个碱基对，长度为20至25个碱基对，长度为25至30个碱基对。在其他实施方式中，双链体的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、25、26、27、28、29、30，或超过30个碱基对。

如图1所示的双交叉构型表示RNA传感器复合物的非活性或“关闭”状态，其中传感器双链体抑制siRNA双链体的RNAi装载，充当RNAi活性的“锁”。在关闭状态下，向导链结合核心链的第一部分(或“乘客(passenger)”片段)以形成充当pro-RNA分子的siRNA双链体。pro-RNA分子在靶细胞的RNAi途径中操作，以改变与病理性病症相关的靶基因或靶RNA分子(即“治疗性靶分子”)的表达。通过与核心链的第二部分(或“保护”片段)结合的传感器链形成第二双链体，以形成传感器双链体。在一些实施方式中，核心链具有结合传感器链的第三部分(或“保护”片段)。在某些这样的实施方式中，核心链包括乘客链(P)，该乘客链(P)在每个端部通过接头(L1，L2)连接到第一和第二保护片段(A，B)，其结构如下：

5’B—L2—P—L1—A 3’

核心链的序列由传感器链和向导链的序列决定，并可以与传感器链，向导链，或这两者完全或互补。根据本文所述的实施方式，可使用任何合适的接头，包括但不限于内部C3间隔子，C6接头，三乙二醇接头。

当与细胞中的生物标志物相互作用时，RNA-传感器复合物被激活至“开启”状态，所述生物标志物表达与siRNA双链体的向导链所靶向的病理性病症相关的表型。该激活主要归因于传感器链的设计，充当RNAi活性的激活信号。在这种情况下，可以说RNA传感器复合物检测生物标志物。

传感器链包括被设计为结合与病理性病症相关的生物标志物(即，“病理性生物标记”)的核苷酸序列。如图3所示，通过将至少一个支点片段(单链)与编码至少一部分病理性生物标志物的输入RNA链结合，启动与生物标志物的结合。在传感器链置换时，传感器链和来自从pro-siRNA分子分离的废弃双链体的输入链使得pro-siRNA能够被靶细胞的RNAi系统加工。在美国专利号9,725,715中进一步解释了本文所述的条件性-siRNA的结构和结合动力学，其内容通过引用整体并入本文。

传感器链的序列可与病理性生物标志物中存在的RNA序列完全或部分互补。在某些实施方式中，传感器链与病理性生物标志物中存在的RNA序列100％互补。其他实施方式可包括与病理性生物标志物中存在的RNA序列在很大程度上互补的传感器链，例如，传感器链与病理性生物标志物中存在的RNA序列的互补可为大于70％的互补，大于75％的互补，大于80％的互补，大于85％的互补，大于90％的互补，大于95的％的互补，大于96％的互补，大于97％的互补，大于98％的互补，或大于99％的互补。

在一些实施方式中，病理性生物标志物是形成或编码与病理性病症相关的分子的RNA序列。在一些方面，病理性生物标志物是在病理性条件下存在于靶细胞中但在正常条件下基本不存在的RNA序列。或者，病理性生物标志物是与正常条件相比在病理性条件下的靶细胞中上调的RNA序列。

向导链在3′端部附近包括Dicer切开(cleavage)位点。Dicer切开位点和向导链的3′末端之间的序列与治疗性靶分子(例如靶基因，靶mRNA或靶miRNA)中发现的核苷酸序列完全或部分互补。在这种情况下，Cond-siRNA可以说会靶向基因或RNA分子。在某些实施方式中，向导链与治疗性靶分子中发现的核苷酸序列100％互补。其他实施方式可包括与治疗性靶分子中存在的核苷酸序列在很大程度上互补的向导链，例如，向导链与治疗性靶分子中发现的核苷酸序列的互补可为大于70％的互补，大于75％的互补，大于80％的互补，大于85％的互补，大于90％的互补，大于95的％的互补，大于96％的互补，大于97％的互补，大于98％的互补，或大于99％的互补。

在体内使用寡核苷酸的挑战在于防止RNA核苷酸的核酸酶降解。传感器链中的几种化学修饰可用于克服该挑战。例如，锁核酸(LNA)包括RNA核苷酸的修饰，在2′O和4′C之间额外的桥增加RNA双链体的热稳定性，并使得对核酸酶的具有抗性。2′O-甲基修饰可赋予稳定性，增加对RNA核苷酸的结合亲和力并防止核酸酶降解。并且，对于硫代磷酸酯：通过用硫替代碱基之间的磷酸酯键中的一个非桥连氧进行修饰来减少核解(nucleolytic)降解；但是也会降低结合亲和力。

因此，在某些实施方式中，RNA-传感器复合物包括对传感器链，核心链，和/或向导链的核苷酸序列的一种或多种修饰。可使用的示例性修饰包括但不限于锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，2′-O-甲基修饰，吗啉代修饰，硫代磷酸酯修饰，末端(terminal)修饰，和其他接头或骨架修饰或连接。可根据US9725715B2中描述的方法选择其他的化学修饰，其公开内容在此全部并入本文。

使用cond-siRNA传感器复合物来设计用于治疗疾病或其他病理性病症的cond-siRNA传感器复合物的方法的优势在于，它允许复合物仅在患病细胞中具有生物活性，并在健康细胞中保持关闭(OFF)状态。此外，该方法可提高患病细胞的特异性，并防止毒性传递至非意向性(unintended)的靶外目标(off-target)。进一步，该方法将来自一个基因的疾病特异性与来自第二个基因的治疗功效相结合，以创建针对特定基因表达模式的精确定制的疗法。更进一步，由于以平行构型(图4)定位的两个RNA双链体的空间位阻，该方法是有利的。传感器链抑制siRNA的RNAi装载，并且仅在患病细胞中激活后才会置换(displace)。

设计条件性siRNA复合物的方法的概况

基于对每种细胞类型，病理性条件，和/或适应症具有特异性的生物标志物和治疗靶分子来设计siRNA复合物。根据某些实施方式，如下所述，用于设计和测试每个条件性siRNA复合物的方法包括几个步骤。

图5显示了设计过程的概述。在某些实施方式中，用于设计条件性siRNA复合物的方法(“设计方法”)包括确定将充当激活输入和RNAi抑制的治疗靶标的生物标志物的步骤。该步骤可包括使用本领域已知的方法确定差异化表达(即，与正常细胞相比在患病细胞中上调或存在)的一种或多种因子。

该设计方法还包括以下步骤：生成可以充当结合传感器链的生物标志物片段的生物标志物的候选靶片段的列表(即，标靶mRNA序列或标靶miRNA序列)，然后针对各个生物标志物设计传感器链。

设计方法还包括以下步骤：通过使用本领域[15]中使用的二级结构预测工具，预估所得的传感器链-由标靶片段和传感器链产生的生物标志物双链体(传感器双链体)的热力学稳定性。

该设计方法还包括以下步骤：检查最稳定的传感器双链体与待测试其条件性siRNA复合物的动物的已知转录组(transcriptome)的结合位点的唯一性。

该设计方法还包括以下步骤：通过使用可包括但不限于标准siRNA设计工具，文献参考，或启发式规则(heuristic rules)的方案来生成向导链序列列表。

该设计方法还包括从所选的向导链序列产生Dicer底物的步骤。

该设计方法还包括生成将传感器链连接至向导链的核心链的序列的步骤。

该设计方法还包括检查传感器：向导配对不会产生不期望的相互作用。

该设计方法还包括以下步骤：选择本文所述的合适的化学修饰的模式，并任选地使用本领域[16]中使用的分子模拟方法来模拟构建体，从而模拟构建体(可选的)。

该设计方法还可包括从商业供应商(例如Qiagen，Dharmacon，或IDT)合成或购买传感器，核心，和向导链的方法，然后使用凝胶电泳组装，表征，和纯化其构建体。

该设计方法还包括以下步骤：进行初步生物学测试和构建体功能的验证，然后可选地在病理性条件的体外和体内模型中进行测试，所述病理性条件包括但不限于MI诱发的适应不良的肥大(maladaptive hypertrophy)，如下所述。

下面说明与设计所述向导，所述传感器和所述核心链有关的其他实施方式。

用于mRNA生物标志物的传感器链的设计方法

根据某些实施方式，用于设计和测试靶向mRNA生物标志物的传感器链的方法包括算法，该算法包括几个步骤，如下所述。

在某些实施方式中，一种用于设计用于mRNA生物标志物的传感器链的方法(“mRNA传感器设计方法”)包括识别每个信使RNA生物标志物的3′UTR的步骤。

mRNA传感器设计方法还包括为以上识别的每个3′UTR生成所有可能的连续31个碱基序列的步骤。

mRNA传感器设计方法还包括以下步骤：通过识别每个序列的反向互补(全部或部分)，从前一步骤获得每个序列片段的预期(prospective)传感器链序列。

mRNA传感器设计方法还包括检查每个传感器链序列的以下不期望特征的步骤：(i)三个或更多个连续的G，和(ii)四个或更多个连续的A或U碱基。

mRNA传感器设计方法还包括检查每个传感器链序列的以下期望特征的步骤：(i)高于50％的G/C碱基-这与热力学稳定性相关，(ii)“三字母(three letteredness)”，(iii)传感器链5′端的第一个碱基为C或G；以及(iv)从传感器链的3′端开始的第9个碱基是C或G。根据本文所述的实施方式，“三字母”定义为包含三个数量最多的碱基的序列的比例(例如，序列主要由A，U，C；或C，G，A；或A，U，G组成的程度)。较高的三字母得分与较低的内部二级结构相关。示例性排名表可见图39和44，对应于在此提交的附录C-H中的基因或核苷酸序列。

mRNA传感器设计方法还包括对所有可能的传感器链进行分级的步骤。特征数量最少(来自4)和得分最高(来自5)的链排名最高。

mRNA传感器设计方法还包括从最高排名的链开始使用图6所示的模式产生假想的传感器双链体的步骤。

RNA传感器设计方法还包括以下步骤：从排名最高的链开始，使用Nupack或类似的二级结构预测编码来计算以下内容：(i)传感器链的内部二级结构(期望较少的内部二级结构的量)(图7)，(ii)来自7的假想的双链体的热力学稳定性。理想情况下，在1nM的链浓度下，Nupack应预测＞90％或＞95％的成分链应形成假想的传感器双链体(图8)；以及(iii)如果传感器双链体不稳定，则可在传感器序列5′末端调节1至5个碱基以增加稳定性，代价是要降低与假定生物标志物上相应结合位点的互补性。

RNA传感器设计方法还包括根据以下参数使用NCBI BLAST筛选传感器链中的热力学稳定的双链体的步骤：(i)使用“稍有相似”搜索选项，(ii)对于传感器序列，3′末端的8个碱基(构成3′支点)与目标动物(例如人或小鼠)中已知的转录物互补的碱基应不超过5个，除了意图的生物标志物之外；以及(iii)如果不符合前两个标准，则将1中考虑的序列扩大至编码区或整个mRNA。

用于miRNA生物标志物的传感器的设计方法

根据某些实施方式，用于设计和测试靶向miRNA生物标志物的传感器链的方法包括一种算法，该算法包括几个步骤，如下所述。

在某些实施方式中，用于miRNA生物标志物的传感器链的设计方法(“miRNA传感器设计方法”)包括识别每个miRNA生物标志物的向导序列的步骤，该传感器链被设计为与各个miRNA生物标志物结合(根据一个方面，通常约21个碱基)。

miRNA传感器设计方法还包括获得miRNA向导序列的反向互补序列(全部或部分)的步骤。

miRNA传感器设计方法还包括向先前步骤的序列的5′端添加8个以上的碱基的步骤。

miRNA传感器设计方法还包括自先前步骤中得到的序列开始，使用图9中所示的模式生成假想的传感器双链体的步骤。

miRNA传感器设计方法还包括使用Nupack或类似的二级结构预测代码来计算以下项目的步骤：(i)来自先前步骤的假想双链体的热力学稳定性。理想情况下，在1nM链浓度时，Nupack应预测＞90％或＞95％的成分链(component strand)应形成假想的传感器双链体。(ii)如果传感器双链体不稳定或二级结构不正确，则确定是否可以更改或修改传感器链5′端的8个末端碱基，或链A或链B的长度，以优化热力学稳定性。

miRNA传感器设计方法还包括根据以下参数在NCBI BLAST中筛选传感器链中热力学稳定的双链体的步骤：(i)使用“稍有相似”的搜索选项，(ii)对于传感器序列，在传感器5′端添加的8个碱基除了想要的miRNA以外不应增加转录物的互补性。如果增加，则调整序列/顺序并从4重新开始。

设计针对治疗性靶分子的向导链序列的方法

根据某些实施方式，如下所述，设计针对治疗性靶基因或RNA分子(例如，mRNA或miRNA)的向导链序列的方法包括几个步骤。

在某些实施方式中，设计针对治疗靶标的向导链序列的方法(“向导链设计方法”)包括使用以下至少一种方法获得一个或多个预期的向导链序列的步骤：(i)针对意图标靶找到公开的向导链序列；(ii)在靶基因上找到已知的miRNA靶位点，或(iii)使用本领域已知的公开算法或设计工具[17，18]。

向导链设计方法还包括检查向导序列的步骤，以确保5′域(domain)(图10)处的6个碱基比3′域(图10)处的6个碱基包含更多的AU。这将提高正确的链负载的概率[19]。理想情况下，3′域应富含CG，并以CG碱基对终止。

向导链设计方法还包括将四个末端碱基添加至向导链的5′端以使双链体完整的步骤。他们应富含CG以提高热力学稳定性。

向导链设计方法还包括构建如图10所示的假想的RNAi靶向双链体的步骤。

向导链设计方法还包括以下步骤：使用Nupack或类似的标准二级结构计算工具，检查向导链所具有的弱内部二级结构以及最小的与其自身结合的趋势(在1nM链浓度时不超过10％)。根据需要调整在3中添加的碱基。

设计核心链序列并检查用以向导的成对传感器的兼容性的方法

根据某些实施方式，设计核心链序列并检查用于向导的配对传感器的兼容性的方法包括几个步骤，如下所述。

在某些实施方式中，设计针对治疗靶标的向导链序列的方法(“核心链设计方法”)包括选择传感器和向导链的合适组合的步骤，上文和工作实施例中讨论了根据本文所述的实施方式设计那些链的方法。

核心链设计方法还包括通过构建形式为5′-B-C3-P-C3 A-3′的链来构建核心链的步骤，其中A和B是来自假想的传感器双链体(图6或9)的互补链B的序列，P是来自假想的RNAi双链体(图10)的乘客链的序列，C3是C3接头。

核心链设计方法还包括使用Nupack或类似的标准二级结构计算工具检查向导链和核心链碱基配对具有以下性质的步骤：(i)1nM链浓度时，＞95％的链在正确的双链体中碱基配对，(ii)向导链双链体具有正确的构象(conformation)，具有～23个碱基对双链体，两个碱基3′向导链突出端，和10-12个碱基5′和3′核心突出端，且具有最少的二级结构，以及(iii)如果不满足上述标准，则选择新的传感器或向导配对。

用于治疗心肌肥大的条件性siRNA复合物

本文公开了一种治疗策略，其以心肌肥大(通常在心肌梗塞后产生)所涉及的分子途径作为靶向，具有最小的脱靶效果。心肌梗塞(MI)是一种心脏病发作。当血块阻塞冠状动脉而阻断血液流向心脏(一种称作心脏缺血的病症)时，可能发生MI。

处于阻塞的下游的心肌失去氧，导致肌肉细胞受伤和死亡。MI后，缺氧和组织损伤诱发左心室重构(图35A，37)。心脏再灌注导致炎症和氧化损伤。MI期间心肌细胞的损伤会引起一系列生物信号事件，导致心肌细胞体积增加并以损害心脏功能的特定方式经历增殖。这种肥大反应是由包括适应不良的再生基因程序在内的因素综合作用而引起的。在适应不良的再生期间，心脏经历变化，对患者诱发不利的病症(图35B)。受影响的心室体积增大，但心室壁变薄，并且心脏泵血的能力随时间而降低。这可能导致多种严重问题，包括心力衰竭，二次心脏病发作，或猝死。因此，该过程称为适应不良性肥大(与适应性肥大相对，适应性肥大增强心脏对诸如运动等刺激的反应)。

例如，可通过抑制钙调磷酸酶和组蛋白脱乙酰化酶2(HDAC2)的药物来缓解适应不良的心肌肥大。但是，这些药物会在非心脏组织中引起严重的副作用。因此，必须要有一种限制药物对心脏的活性的方法。

本文所述的条件性小干扰RNA(cond-siRNA)的特异性和多功能性通过劫持RNA干扰(RNAi)途径，为多种疾病和癌症提供了一类新的疗法。尽管目前针对MI后心肌肥大的治疗选择可以减轻病症的严重程度，但必须要以驱动肥大性反应的内部适应不良基因程序作为靶向。特别地，由于空间位阻，cond-siRNA(图4)的序列带有信号和标靶链，仅在存在适当的心肌肥大信号时才会激活-因此仅通过由支点介导的链置换来将疾病细胞作为靶向。

本文所述的Cond-siRNA可通过使用MI的心脏RNA生物标志物作为激活信号以针对钙调磷酸酶或HDAC2开启RNAi沉默(silencing)来实现此目的。使用这种方法，靶基因的RNAi沉默限于表达MI相关的RNA生物标志物的心肌细胞。这意味着在靶标的抑制会导致严重副作用的其他器官和组织中，RNAi活性将不会开启。一方面，本文公开了一种链置换操作的，可编程的条件性siRNA复合物，其可被肥大心肌中表达的特定mRNA和miRNA转录物激活，以通过RNAi敲除来将不相关的促-肥大性(pro-hypertrophic)途径作为靶向。

为了设计用于治疗心脏肥大的有效Cond-siRNA，可根据本文所述的实施方式使用用于测量相关基因表达的体内和/或体外筛选方法。

某些基因在病理性心肌肥大条件下被上调，其可以是候选的病理性生物标志物，以将Cond-siRNA分子向导至靶细胞群，并且可以用于置换Cond-siRNA的传感器链。例如，某些信号级联在肥大刺激条件下被激活(见图11)。例如，针对在野生型(wt)小鼠以及在多种肥大条件下的差异基因表达，筛选了在病理性心肌肥大中上调的基因和miRNA，以确定哪些基因是用作设计传感器链的靶标的合适候选物。参见以下工作实施例。

体外筛选方法可包括使用在低氧条件下培养或用苯肾上腺素处理的心肌细胞系(例如新生大鼠心室肌细胞(NRVM)，人心肌细胞(HCM))。图12A。也可使用体内方法，包括但不限于，用于缺血性心力衰竭(HF)的大鼠模型(例如，缺血/再灌注模型)，或用于非缺血性HF的大鼠模型(例如，胸主动脉收缩(TAC)模型)。参见图12B。

选择用于激活Cond-siRNA的RNA病理性生物标志物(输入信号)是设计本文所述的Cond-siRNA复合物的重要过程。使用对心肌肥大病症具有特异性的病理性RNA生物标志物进行条件性RNAi活化是为了确保RNAi活动仅在心脏组织中具有活性。理想情况下，这些生物标志物应在受MI影响的心脏组织中高度过表达，而在身体其他组织中不表达。通过比较从NRVM细胞培养物和小鼠模型(具有已知的被测mRNA和miRNA的全生物表达模式)的体外和体内实验收集的数据(参见以下工作示例)，确定至少三个mRNA和三个miRNA符合标准，包括编码心房利钠肽(ANP)，B型利钠肽(BNP)，和肌球蛋白重链β(MHCβ)的mRNA，以及编码mir-23a-3p，mir-125-5p，和mir-199b-5p的miRNA。

因此，根据本文所述的实施方式，可用于激活条件性siRNA复合物的治疗性生物标志物包括但不限于，针对受MI影响的心肌细胞的mRNA生物标志物，例如下文所述的那些。

在某些实施方式中，用于治疗心肌肥大的Cond-siRNA包括被设计成将存在于心脏细胞(例如，心肌细胞)中和/或在心脏细胞中上调的生物标志物作为靶向的传感器链。此类生物标志物可包括但不限于心房利钠肽(ANP)，B型利钠肽B(BNP)，肌球蛋白重链β(MHCβ)，mir-23a-3p，mir-125-5p，和mir-199b-5p。在一些方面中，传感器链检测编码生物标志物的mRNA或miRNA序列。并且，在某些方面，传感器链通过结合至mRNA的3′UTR来检测编码生物标志物的mRNA序列。下面讨论有关示例性生物标志物的其他信息。

ANP(nppa)信号传感器链。nppa(心房利钠肽)编码在肥大条件下过度表达的ANP蛋白，因此适合作为针对肥大的生物标志物。

BNP(nppb)信号传感器线。nppb(B型利钠肽)编码BNP蛋白，其作为心脏激素起作用，并调节钠尿(natruiresis)，利尿，血管舒张和心血管体内稳态。健康个体血流中天然存在的BNP水平低；在心室中为高水平。血流中高浓度的BNP表示心力衰竭，是肥大的生物标志物。因此，在诱发的心肌肥大病症中BNP的显著上调指示有效的传感器链基因选择。

在一些实施方式中，设计了NPPB RH SSS v2.0传感器，其中基于AU富集度，发夹(hairpin)，聚G部分(tract)和8bp支点区域在整个3′UTR中通过筛选智人mRNA来手动检查31bp序列窗口。发现了三个区域；针对与其他mRNA的匹配情况以及结合的收率％的NCBIBlast检查减少了对选传感器的选项(参见NPPB传感器结构，图13)。

MHCβ(myh7)信号传感器链。MYH7(肌球蛋白重链7)编码心脏肌球蛋白的β-重链亚基。编码的蛋白质的变化量与心肌纤维的收缩速度相关。myh7主要在心室和I型肌纤维中表达。基因突变与肥大型心肌病有关，mybh7在病理性心肌肥大中上调。在诱发的心肌肥大病症中，观察到myh7明显上调，表明myh7是另一潜在的传感器链基因选择。

在一些实施方式中，设计了myh7 RH SSS v2.0传感器，其中通过筛选整个智人mRNA，手动检查了31bp序列窗口。因为mRNA的3′UTR短且有许多聚G部分(tract)，所以筛选进入了编码区；但是它们包含二级结构。仅找到并选择了1个区域；检查了NCBI Blast是否与其他mRNA匹配(例如，参见myh7传感器结构，图14)。

在一些实施方式中，传感器链与上述任何生物标志物完全互补(即100％互补)。在一些实施方式中，传感器链与上述任何生物标志物部分互补。例如，传感器链可以与生物标志物至少70％互补，与生物标志物至少70％互补，与生物标志物至少75％互补，与生物标志物至少80％互补，与生物标志物至少85％互补，与生物标志物至少90％互补，与生物标志物至少95％互补，与生物标志物至少96％互补，与生物标志物至少97％互补，与生物标志物至少98％互补，或与生物标志物至少99％互补。

此外，传感器链与生物标志物的互补性可以与编码ANP(nppa)，BNP(nppb)，或MHCβ(myh7)的mRNA序列的任何变体的任何19-40个碱基片段匹配。

在其他实施方式中，传感器链包括下表1中的序列之一：

在某些实施方式中，用于治疗心脏肥大的Cond-siRNA包括设计成将治疗性RNAi靶标作为靶向的向导链，该治疗性RNAi靶标存在于心脏细胞(例如，心肌细胞)中和/或在心脏细胞中上调，并且在本领域中已知会改善MI后的适应不良的肥大，但其全身抑制或表达可能会导致不希望的副作用。在某些实施方式中，可用于设计Cond-siRNA的向导链的治疗性靶标包括但不限于钙调磷酸酶[7-10](或其亚基，例如，PPP3Ca，PPP3CB，PPP3CC，PPP3R1，PPP3R2)，以及HDAC2[11，12]或HDAC2[11，12]。在一些方面中，向导链与编码治疗性靶标的mRNA或miRNA序列结合。

HDAC2向导链。HDAC2(组蛋白脱乙酰化酶2)通过修饰染色质结构，在转录调控，细胞周期进程和发育途径中起着中央调节器的作用。HDAC2抑制通过涉及GSK3β的途径抑制了适应不良的再生程序，从而抑制了肥大反应。HDAC2充当关键的心脏肥大调节器和潜在的治疗性靶标。

在一些实施方式中，设计了HDAC2 RH TGS v2.1向导链，其中基于HDAC2靶向的siRNA的过往研究，从HDAC2智人mRNA中获得23个碱基对序列。在3′端增加了两个U碱基对。为了防止潜在的不适当的Dicer切开和RISC复合物负载并入，故意改变了5′端的四个碱基对以使其不与mRNA匹配。还进行了NCBI Blast检查，以检查是否与其他mRNA匹配。参见HDAC2向导链结构，图15。

钙调磷酸酶向导链。钙调磷酸酶是心肌肥大的主要促成因子(propoter)，并且已发现抑制钙调磷酸酶可减少肥大。并且，由于钙调磷酸酶一直存在于缺血细胞中，因此钙调磷酸酶是本发明的良好治疗性靶标。

在一些方面中，向导链的RNAi靶向区段(即，自3′末端起的碱基1-21)与以上讨论的任何治疗性靶标完全互补(即，100％互补)。在一些方面，向导链的RNAi靶向片段(即，自3′末端起的碱基1-21)与以上讨论的任何治疗靶标部分互补。例如，传感器链可以与生物标志物至少70％互补，与生物标志物至少70％互补，与生物标志物至少75％互补，与生物标志物至少80％互补，与生物标志物至少85％互补，与生物标志物至少90％互补，与生物标志物至少95％互补，与生物标志物至少96％互补，与生物标志物至少97％互补，与生物标志物至少98％互补，或与以上讨论的任何治疗靶标至少99％互补。在其他实施方式中，自3′末端(向导链的推定种子区域(putative seed region))起的碱基14-20与编码钙调磷酸酶(例如PPP3Ca，PPP3CB，PPP3CC，PPP3R1，PPP3R2)的亚基或HDAC2的至少一部分的mRNA序列的3′UTR具有至少90％的互补性。

在某些实施方式中，抑制适应不良的肥大的Cond-siRNA是检测下表2中的来自列表A的任何生物标志物并将列表B中的任何成员作为靶向的Cond-siRNA。

表2

因此，根据一些实施方式，本文所述的Cond-siRNA可以具有与对应于A中列出的生物标志物的RNA转录物的序列大部分或完全互补的传感器链，以及以上文描述的方式将列表B的成员作为靶向的向导链。

在其他实施方式中，传感器链包括下表3中的序列之一：

在其他实施方式中，用于治疗心脏肥大的Cond-siRNA包括核心链，该核心链被设计为根据上述方法将传感器连接至向导链。在某些方面，核心链包括下表4中的序列之一：

在一些实施方式中，以上核心链包括C3间隔子(spacer)接头，但也可以使用任何合适的接头。

在某些实施方式中，用于治疗心肌肥大的Cond-siRNA是一种构建体，其包括如下表5中所示的向导链，核心链，和传感器链(也参见图16-17)。

在其他实施方式中，条件性siRNA复合物可包含分别选自表1，3，和4的一条传感器链，一条向导链，和一条核心链的任何组合。显示完整复合物的条件性siRNA复合物的其他实施方式可以在附录A中找到，其随附于此。

此外，如以下示例中所述，在体内和体外的不同促(pro)-肥大条件下筛选了几种mRNA和miRNA转录物，以帮助设计cond-siRNA复合物链。

治疗方法

上述的cond-siRNA复合物可以用于治疗心肌肥大的方法。因此，在一些实施方式中，本文公开了用于治疗心肌肥大的方法，其中该方法包括向受试者施用治疗有效量的上述一种或多种与心肌肥大相关的cond-siRNA的步骤。如本文所公开，受试者可以是患有MI后心肌肥大或任何其他类型的心肌肥大的任何人或其他动物。

病症的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可指预防病症，减慢(slow)病症的发作或发展速度，降低病症发展的风险，预防或延迟(delay)与病症相关的症状的发展，减轻或终止与病症相关的症状，发生病症的完全或部分消退(regression)，或其某种组合。

用于治疗心肌肥大的方法，包括施用治疗有效量的治疗性组合物。“有效量”，“治疗有效量”或“有效剂量”是在受试者中产生希望的治疗效果的组合物(例如治疗性组合物或药剂)的量，例如预防或治疗目标病症或缓解(alleviate)与病症相关的症状。精确的治疗有效量是就给定受试者的治疗功效而言将产生最有效结果的组合物的量。该量将取决于多种因素而变化，包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性，药代动力学，药效学，和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，一般身体状况，对给定剂量的反应性，和药物类型)，制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质，以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对施用化合物的反应并相应地调整剂量。有关其他指引，请参阅《雷明顿：药学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)》第21版，费域科学研究院(USIP)，Lippincott Williams&Wilkins，费域，宾夕法尼亚州，2005年。

在一些实施方式中，一种或多种cond-siRNA可以单独使用或作为治疗心肌肥大的药物组合物的一部分使用。因此，在一些实施方式中，公开了包含上述任何一种或多种与心肌肥大相关的Cond-siRNA的药物组合物。治疗性组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指参与将感兴趣的化合物从一个组织，器官，或身体的一部分携带或运输至另一组织，器官，或身体的一部分的药学上可接受的材料，组合物，或载剂。例如，载体可以是液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂，或封装材料，或其某种组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它也必须适合与它可能遇到的任何组织，器官，或身体的一部分接触，这意味着它一定不能携带毒性，刺激性，过敏性反应，免疫原性，或任何其他远远超过其治疗性益处的并发症的风险。

本文所述的治疗性组合物可以通过任何合适的施用途径来施用。施用途径可以指本领域已知的任何给药途径，包括但不限于气雾剂，肠，鼻，眼，口，肠胃外，直肠，透皮(例如局部乳膏或软膏，贴剂)，或阴道。可以使用局部乳膏或软膏或通过透皮贴剂来完成“透皮”给药。“肠胃外”是指通常与注射有关的施用途径，包括眶下，输注，动脉内，囊内，心内，真皮内，肌内，腹膜内，肺内，脊髓内，胸骨内，鞘内，子宫内，静脉内，蛛网膜下腔，囊内，皮下，经粘膜，或经气管。在一个实施方式中，通过心内注射来施用心肌肥大相关的cond-siRNA或其治疗性组合物(图18)以确保局部递送至心脏组织。

已经参考实施方式和说明性示例描述了本发明，本领域技术人员可以理解，如所描述和示出的对本发明的修改不脱离说明书中所公开的本发明的精神和范围。给出实施方式以帮助理解本发明，但无意于并且不应解释为以任何方式限制其范围。示例不包括常规方法的详细描述。这样的方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且在许多出版物中都有描述。此外，以上引用的所有参考文献和以下实施方式中的所有参考文献均通过引用全文并入本文，如同在本文中已充分阐述。随附提交的所有附录A-E构成完整公开的一部分。

实施例

实施例1：促肥大基因和miRNA表达筛选用于选择治疗心肌肥大的传感器候选物

筛选在病理性心脏肥大条件下被上调的基因和miRNA在多种条件下的小鼠和NRVM中的差异表达，以确定哪些分子是适合用作设计传感器链的生物标志物靶标的候选物。

体内稳态中的野生型小鼠组织中的差异基因表达。与其他组织相比，合适的病理性生物标志物候选物应在心脏中差异表达，以最大程度地减少脱靶效应。在wt小鼠的正常心脏，肝脏，肺，肾脏，骨骼肌，和大脑中测量了几种在病理性心肌肥大中被上调的基因(DDiT4L，MYH7，ANP，BNP)，以及控制其表达的转录因子(MEF2C，心肌素)。图19。还测量了几种miRNA，如图38所示。

低氧条件下NRVM中的差异基因和miRNA表达。如图20-21所示.于低氧条件下在NRVM中筛选合适的病理性生物标志物候选物(ANP，BNP，MYH7，MEF2C，心肌素，DDiT4L，和miRNA)以进行差异表达。

该实验模拟心肌梗塞(MI)期间的氧剥夺(低氧)。使用本领域技术人员已知的技术，在标准培养皿底物上培养准备了NRVM细胞[1，2]。然后将培养的NRVM细胞于37℃暴露至低氧条件(0.2％O₂气氛)24小时。随后在常氧条件(95％环境空气/5％CO₂)下培育12小时。

培育后，使用本领域的标准方案和试剂盒收获NRVM细胞并提取全部RNA[3]。通过定量RT-PCR并使用适合于mRNAs4和miRNA的标准方法对信使RNAs ANP，BNP，Myh7，MEF2C，心肌素，DD汀4L，和microRNAs mir-23a-3p，mir-125b-5p，mir-199b-5p，mir-208和mir-195进行了定量[5]。

结果显示在图20-21中，作为与在常氧条件下培育36小时的情况相比的暴露于低氧的NRVM细胞中存在的mRNA或miRNA的拷贝数的倍数变化。

该实验的结果表明，在低氧条件下，ANP，BNP，DDiT4L，mir-23a-3p，和mir-199b-5p被过量表达了4倍以上。

苯肾上腺素处理后NRVM中的差异基因和miRNA表达。与未处理的NRVM相比，苯肾上腺素(PE)处理后测得了miRNA的表达，以及ANP，BNP，MYH7，MEF2C，心肌素，DDiT4L的表达。

苯肾上腺素刺激是研究心肌细胞肥大的标准方法[6，7]。在该实验中，通过标准方案准备了NRVM细胞。然后将苯肾上腺素以50μM的浓度添加到培养基中24小时。24小时后，如上所述收获细胞用于RNA分离和分析。

实验结果表明，PE刺激后，ANP，BNP，Myh7，心肌蛋白mRNA过表达超过10倍(图22)，并且在PE刺激后，miRNA，mir-23a-3p，mir-125b-5p，和mir-199b-5p过表达超过4倍(图23)。

心力衰竭小鼠模型中的差异基因表达。在胸主动脉收缩(TAC)模型中的非缺血性心力衰竭小鼠和缺血/再灌注(I/R)缺血性心力衰竭的小鼠心脏组织中测量ANP，BNP，MYH7，MEF2C，心肌素，DDiT4L的表达，与假治疗小鼠进行比较。

在与局部缺血/再灌注(I/R)模型有关的实验中，小鼠经历了模拟局部缺血(剥夺血流)心力衰竭的程序。在第0天，通过外科手术将冠状动脉夹紧20分钟，然后再灌注，使小鼠遭受缺血性心力衰竭。28天后，处死实验小鼠。收获心脏组织，并使用如上所述的标准方案分离RNA。如上所述，使用RT-PCR对mRNA和miRNA进行定量。将处理过的小鼠中的mRNA和miRNA与对照小鼠中发现的mRNA和miRNA进行了比较，所述对照小鼠接受了不涉及夹紧冠状动脉以诱发局部缺血/再灌注的假手术(sham procedure)。

结果显示，在患有缺血性HF的小鼠中，所有测试的mRNA均过表达超过10倍(图24)。ANP和myh7的过表达超过1000倍(图24)。对于miRNA，只有mir-23a-3p显著过表达了～15倍(图25)。

在与非缺血性HF模型(TAC)有关的实验中，小鼠经历胸主动脉收缩(TAC)程序以诱发非缺血性心力衰竭。简而言之，小鼠的上胸部收缩以减少通过主动脉的血流28天。这诱发了非缺血性心力衰竭。28天后，处死动物并收获心脏组织。如上所述，使用标准方案分离RNA。如上所述，使用RT-PCR对mRNA和miRNA进行定量。将治疗过的小鼠中的mRNA和miRNA与对照小鼠中发现的mRNA和miRNA进行了比较，对照小鼠均接受了不涉及主动脉收缩的假手术。

结果显示，在收缩的小鼠中，所有测试的mRNA都过表达超过20倍(图24)。ANP和myh7过表达超过1000倍(图24)。对于miRNA，所有测试的miRNA均过表达超过10倍(图25)。而且，mir-23a-3p过表达了～80倍(图25)。

实施例2：ANP的设计：钙调磷酸酶Cond-siRNA

信使RNA的5′UTR和编码序列经常被mRNA结合蛋白或转运核糖体占据。在哺乳动物中，miRNA通常在3′UTR位点结合以调节mRNA。因此，3′UTR中的结合位点可能比5′UTR中的位点和mRNA区域的编码序列更易接近(accessible)。

当设计用于检测mRNA的传感器时，希望的是从3′UTR中的位点开始。如果找不到此类位点或有其他原因(例如需要在编码区或5′UTR中检测特定的重要序列)，则可以针对这些位点设计传感器。

ANP 3’UTR测序结果。鼠模型用于测试ANP的能力：钙调磷酸酶Cond-siRNAs抑制苯肾上腺素诱发的心肌细胞肥大的能力。因此，将ANP传感器设计为将大鼠ANP作为靶向。

为了设计ANP传感器，对新生大鼠心室心肌细胞中发现的ANP mRNA的3′UTR进行测序，其中使用标准程序提取RNA，通过RT-PCR扩增3′UTR，并提交扩增的DNA以通过麻省总医院的DNA测序核心进行测序。

测序的DNA如下(N表示未确定的碱基)

来自CCIB DNA核心的(MGH)ANP 3’UTR测序结果＞293387-293389_D10_1_074nppa_3_UTR_Ane.seq

＞此为正向序列：

TCAGCCANNNNNNNNNGAGCAGATCGCAAAAGATCCCAAGGCCTTGCGGTGTGTCACACAGCTTGGTCGCATTGCCACTGAGAGGTGGTGAATACCCTCCTGGAGCTGCAGCTTCCTGTCTTCATCTATCACGATCGATGTTAAGTGTAGATGAGTGGTTTAGTGAGGCCTTACCTCTCCCACTCTGCATATTAAGGTAGATCCTCACCCNNNNANNANNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO：27)

使用NCBI BLAST，确定了中心序列

与褐家鼠nppa mRNA 3’UTR同源性为99％，与小家鼠nppa mRNA 3’UTR同源性为92％。

生成传感器候选物：

为了产生候选传感器链，确定了上述序列的反向互补。

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNTNNTNNNNGGGTGAGGATCTACCTTAATATGCAGAGTGGGAGAGGTAAGGCCTCACTAAACCACTCATCTACACTTAACATCGATCGTGATAGATGAAGACAGGAAGCTGCAGCTCCAGGAGGGTATTCACCACCTCTCAGTGGCAATGCGACCAAGCTGTGTGACACACCGCAAGGCCTTGGGATCTTTTGCGATCTGCTCNNNNNNNNNTGGCTGA(SEQ ID NO：29)

然后，使用Python脚本生成中央粗体序列(rat nppa 3prime utr sensor.xlsx)的所有可能的连续31nt片段(支点8nt，加双链体区域23nt)。这些是该区域的初始可能的传感器序列(T需要转换为U)。Python脚本作为附录B随附于此。

所生成的Python编码是在对每个传感器序列进行分析之后执行的：(i)针对三个或更多连续Gs(例如：GGG，GGGG，GGGGG)的每次出现添加一个扣分；(ii)针对四个或更多连续A/T(例如ATAT，AAAA，TTTT，TTAT等)的每次出现添加一个扣分；(iii)计算由G或C组成的序列的百分比；(iv)计算最多的三个碱基(例如，在A，G，C，T中，如果A，G和T在序列中最多，则碱基中A，G或T的百分比为多少)占序列的百分比。

然后，按照重要程度，通过以下标准对可能的传感器列表进行排序：(i)扣分数量最少，优选0′(ii)最高3个字母；以及(iii)最高的GC含量(例如，参见图41-42)。

针对两项质量逐一筛选排序列表上的序列：(i)根据标准RNA二级结构预测编码，假想的传感器双链体具有高稳定性和准确性；(ii)除了大鼠和小鼠中的从支点区域(3′处的8个碱基)延伸入超过50％的双链体区域(从3′起的碱基9至31′)的nppa mRNA以外，传感器链与RNA转录物几乎没有明显匹配。

确定以下传感器序列是有利的：

ATTCACCACCTCTCAGTGGCAATGCGACCAA(SEQ ID NO：30)

为了进一步提高传感器的热力学稳定性，将第一个碱基在5′处从A更改为C。这形成了以下传感器序列：

传感器(突变碱基有下划线)：CUUCACCACCU CUCAGUGGCAAUGCGACCAA(SEQ ID NO：31)

在nupack上，由该序列构造的假想传感器双链体显示出8的热力学稳定性，平衡浓度为0.97nM。另请参见图26。

使用“稍有相似”设置的传感器序列的NCBI BLAST显示除了与小鼠和大鼠ANP(nppa)mRNA之外，没有明显的序列匹配。

钙调磷酸酶是由三种催化同工酶(PPP3CA，PPP3CB，PPP3CC)之一和两个调节亚基(PPP3R1和PPP3R2)之一组成的异二聚体。为了将钙调磷酸酶作为靶向，识别了针对钙调磷酸酶的PPP3CA亚基的向导序列，其将人，大鼠，和小鼠中存在的广泛保有的靶位点：UGUUGUUUGGCUU UUCCUG UU(SEQ ID NO：32)作为靶向。

然后将片段CGAG添加至5′端以产生23nt向导链，接着根据前述规则生成核心链。这些序列如下所示：

向导：CG AG UGUUGU UUGGC UU UUCCUG UU(SEQ ID NO：11)

传感器(突变碱基有下划线)：CUUCACCACCU CUCAGUGGCAAU GCGACCAA(SEQ ID NO：33)

核心：AGGUGGUGAAG-接头-CAGGAAAAGCCAAACAACACUCG-接头-AUUGCCACUGAG(SEQID NO：19)

如Nupack所预测，向导链加上核心链显示出良好的热力学稳定性(图27)。

然后，根据此前在美国专利号9,725,715中公开的方案添加化学修饰，其主题通过引用并入本文。最终序列如下所示：

传感器：

/5Sp9/mC*+T*mU*mC*+A*mC*mC*+A*mC*+C*mU*mC*mU*+C*mA*mG*+T*mG*+G*mC*mA*+A*mU*mG*mC*+G*mA*mC*mC*+A*mA*/3AmMO/(SEQ ID NO：34)

向导：/5AmMC6/+C*+G rArG rUrGrUrUrGrU rUrUrGrGrC rUrU rUrUrCrCrUrGrUrU(SEQ ID NO：35)

核心：mArGmGrUrGrGrUrGrArArG/iSpC3/mC*+A*

mGrGrArArArArGrCrCrArArArCrArArCrArCrUrC*mG/iSpC3/

rArUrUrGrCrCrArCrUrGrAmG(SEQ ID NO：36)

核苷酸和修饰如下所示：(1)+A，+T，+C，+G为LNA；(2)mA，mU，mC，mG为2’-O-甲基；(3)rA，rU，rC，rG为RNA；(3)*表示硫代磷酸酯骨架连接；(4)/5Sp9/为三乙二醇接头；(5)/iSpC3/为内部C3间隔子；(6)/5AmMC6/为C6接头上的5’伯胺修饰；(7)/3AmMO/为3’伯胺修饰。

实施例3：mir-23a-3p的设计：钙调磷酸酶Cond-siRNA

mir-23a-3p传感器如下设计。miRbase的mir-23a条目可在以下URL中找到：http：//www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl？acc＝MI0000079

mir-23a-3P序列的序列，5’-3’为：

＞hsa-miR-23a-3p MIMAT0000078

AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC(SEQ ID NO：37)

mir-23a-3p的反向互补序列为GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU(SEQ ID NO：38)

感测microRNA输入的Cond-siRNA传感器是microRNA向导链通常仅为21nt长，而Cond-siRNA传感器的双链体区域通常为23个核苷酸长，且支点通常为5至8个核苷酸长。这意味着microRNA向导链的长度不足以完全将传感器链从核心链上置换出来。

通过配置传感器链使向导链将传感器从与核心链的3′突出端和核心链的5′突出端的5′末端处的最后几个碱基配对置换出来，从而解决了该问题。

这样，核心链的3′突出端变得不受保护并降解。5′突出端的5′末端也变得不受保护并经历降解，最终导致整个5′突出端降解。然后，这使得传感器链从RNAi区域完全解离。

因此，假定一条21nt miRNA向导链，从3′端开始的传感器链的一些可能的几何结构，示于下表6：

在表6中，方案A给出了23bp的传感器双链体，并允许miRNA置换5′核心链片段的多达4个末端碱基，方案B，23bp传感器，置换了3个末端碱基，方案C，23bp传感器，置换了4个末端碱基，方案D，23bp传感器，置换了5个末端碱基，方案E，22bp传感器，置换了5个末端碱基，以及方案F，22bp传感器，置换了3个末端碱基。

钙调磷酸酶传感器设计：

来自表6的方案F用于设计以下钙调磷酸酶传感器：5’CGAAGAACGGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU3’(SEQ ID NO：39)

序列：CGAAGAAC(SEQ ID NO：40)被添加至传感器的5’。设计此序列以提高传感器双链体的热力学稳定性，最小化传感器链中的二级结构，以及最小化与非-mir23a-3p转录物的重叠。

根据NCBI BLAST，传感器与人RNA转录物没有明显的非意图匹配，并且与小鼠RNA转录物仅有少量的明显的非意图匹配。

使用上述针对ANP：钙调磷酸酶构建体识别的同一钙调磷酸酶PPP3CAsiRNA向导，并且使用本文所述的算法生成核心链序列。

核心：UCCGUUCUUCG-接头-CAGGAAAAGCCAAACAACACUCG-接头-UGCCAGGGAUU(SEQ IDNO：41)

如假想的传感器双链体(图29)那样，向导链和核心链显示出良好的热力学稳定性，如Nupack所预测(图28)。

因此，最终的完全修饰序列如下：

钙调磷酸酶向导：C6胺+C*+G rArG rUrGrUrUrGrU rUrUrGrGrC rUrU rUrUrCrCrUrG rUrU(SEQ ID NO：42)

Mir-23a-3p传感器，使用22bp传感器双链体并具有LNA模式：

/5Sp9/mC*+G*mA*+A*mG*mA+A*mC*+G*mG*mA*

+A*mA*mU*mC*mC*+C*mU*mG*+G*mC*mA*+A*mU*mG*+T*mG*+A*+T*/3AmMO/(SEQ IDNO：43)

核心链：mUrCrCrGrUrUrCrUrUrCrG/iSpC3/

mC*+A*mGrGrArArArArGrCrCrArArArCrArArCrArCrUrC*mG/iSpC3/

rUrGrCrCrArGrGrG mA rU mU(SEQ ID NO：44)

核苷酸和修饰如下：(1)+A，+T，+C，+G为LNA；(2)mA，mU，mC，mG为2’-O-甲基；(3)rA，rU，rC，rG为RNA；(3)*表示硫代磷酸酯骨架连接；(4)/5Sp9/是三乙二醇接头；(5)/iSpC3/为内部C3间隔子；(6)/5AmMC6/为C6接头上的5’伯胺修饰；(7)/3AmMO/为3’伯胺修饰。

实施例4：Cond-siRNA构建体的合成和测试

为了证明Cond-siRNA在抑制心肌细胞肥大中的用途，设计并合成了Cond-siRNA以检测鼠ANP或mir-23a-3p并抑制钙调磷酸酶。该构建体示于图16和17。所有的链均购自市售寡核苷酸供应商(Exiqon Inc，现为Qiagen的一部分)。

组装和纯化。传感器，核心，和向导链在50nM至1uM链浓度下以1.0：1.1：1.0的比例混合，并在1x PBS缓冲液中进行热退火(80℃30秒，然后于50℃至60℃恒温培育～1小时，接着冷却至室温)。

当需要纯化时，将构建体以500nM退火，每孔装载20uL，在10％非变性PAGE中。在120V的1xTBE缓冲液中运行90分钟。正确的带被切除。然后使用标准RNA分离试剂盒通过粉碎和浸泡方法提取Cond-siRNA构建体。

图30显示了其中的Cond-siRNA被组装和纯化的示例性凝胶。

mir-23a-3p：钙调磷酸酶Cond-siRNA的双重荧光素酶测定(图31)。对于该测定，评估了上述Cond-siRNA在没有正确的生物标志物的情况下保持RNAi无(OFF)活性并在存在携带mir-23a-3p序列的RNA转录物的情况下将RNAi切换为有(ON)的能力。对于该测试，将未纯化的mir-23a-3p：钙调磷酸酶Cond-siRNA以指定的浓度沿着活化剂和双重荧光素酶质粒共转染到人Hek293细胞中。

活化剂质粒表达无效的转录物，具有不正确的活化剂的转录物，21碱基的mir-23a-3p序列，或与整个传感器链互补的更长的序列。

双重萤光素酶质粒编码的萤火虫萤光素酶作为对照，并以在3′UTR中具有钙调磷酸酶靶位点的海肾萤光素酶作为RNAi的靶标。

结果表明，当表达mir-23a-3p序列或完全匹配的序列时，该Cond-siRNA具有明显增加的针对钙调磷酸酶靶标的RNAi活性。图31。因此，在mir-23a-3p存在的情况下，该构建体应能够激活针对钙调磷酸酶的RNAi活性。

PE刺激下NRVM细胞中纯化的ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA的体外实验。在此实验中，测试了鼠ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA是否可以检测苯肾上腺素(PE)刺激时ANP的过表达，并激活针对钙调磷酸酶的RNAi敲除。

测试了ANP：钙调磷酸酶对鼠生物标志物和靶标的生物学作用，因为没有合适的人类模型可以测试。这种面向鼠的Cond-siRNA的生物学作用应代表针对人类配置的Cond-siRNA会具有的生物学作用。

对于该实验，在正常条件下(95％空气，5％CO₂，37℃)使用标准方案培育NRVM细胞。使用RNAiMax将纯化的ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA以20nM浓度转染到NRVM细胞中。将转染的细胞培育24小时。然后将PE添加到培养基中，使最终浓度达到50uM。再过48小时后，收获细胞并染色或加工以分离RNA。

钙调磷酸酶mRNA的RT-PCR定量结果显示在图32中。对于每个群组(未处理和PE处理的细胞)，在具有加扰的siRNA转染的细胞(阴性对照)中观察到的钙调磷酸酶mRNA水平被标准化为1.0。在未经处理的群组中，用ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA转染的细胞没有可检测的钙调磷酸酶的敲除。这意味着，正如所意图的，Cond-siRNA在正常细胞中的RNAi活性极低。

在用PE处理的细胞中，Cond-siRNA激活了RNAi，而钙调磷酸酶mRNA的水平与用加扰的siRNA对照转染的细胞中观察到的水平相比降低了～50％。这表明ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA可以检测ANP mRNA的过表达，并按意图随钙调磷酸酶的RNAi抑制作出反应。

处理过的和未处理过的细胞的荧光显微镜成像的结果显示在图33中。结果显示，用纯化的ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA处理的细胞经历的肥大程度少于用加扰的siRNA处理的细胞。此外，Cond-siRNA的治疗效果与阳性对照(市售，非条件性钙调磷酸酶siRNA)类似。

使用荧光显微镜进行细胞大小定量的结果显示在图34中所示。结果显示，PE刺激导致用阴性对照加扰siRNA处理的细胞中平均细胞大小从～750μm2增加到～1300μm2。但是，在用Cond-siRNA处理的细胞中，平均细胞大小从～750μm2增加到～900μm2，并且在统计学上不显著。该结果类似于非条件性的市售钙调磷酸酶siRNA。

以上结果表明，ANP：钙调磷酸酶Cond-siRNA具有低背景RNAi活性，可以检测并响应NRVM细胞的PE刺激，并且对减少NRVM细胞的肥大具有显著的生物学作用。

实施例5：示例性向导和传感器链序列

下面是从向导链和传感器链序列自动生成核心链序列的示例。它们具有23bp的双链体，具有8个碱基支点。

实施例5a，与随机选择的人NPPA传感器配对的随机选择的人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：

GGAGAGGCGAGGAAGUCACCAUCAAACCACU

核心为：CUCGCCUCUCC UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGGAUGGUGACUUC

实施例5b，与随机选择的NPPB传感器配对的上述人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：

GGAAUCAGAAGCAGGUGUCUGCAGCCAGGAC

核心为：CUUCUGAUUCC UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGUGCAGACACCUG

实施例5c，与随机选择的人Myh7传感器配对的上述人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：

CCAAGGAGCUGUUACACAGGCUCCAGCAUGG

核心为：CAGCUCCUUGG UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGGAGCCUGUGUAA

实施例5d，与来自实施例1的人NPPA传感器配对的随机选择的人/大鼠HDAC2 mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：

GGAGAGGCGAGGAAGUCACCAUCAAACCACU

核心为：CUCGCCUCUCC GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGGAUGGUGACUUC

实施例5e，与来自实施例2的人NPPB传感器配对的上述随机选择的人/大鼠HDAC2mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：

GGAAUCAGAAGCAGGUGUCUGCAGCCAGGAC

核心为：CUUCUGAUUCC GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGUGCAGACACCUG

实施例5f，与来自实施例3的人Myh7传感器配对的上述随机选择的人/大鼠HDAC2mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：

CCAAGGAGCUGUUACACAGGCUCCAGCAUGG

核心为：CAGCUCCUUGG GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGGAGCCUGUGUAA

在下一个实施例中，我们再次使用实施例1-6中的向导，但选择miRNA传感器。传感器配置为22bp的双链体，具有7个碱基的突出端和对称的11个碱基的核心链突出端。

实施例5g，与mir-23a-3p传感器配对的随机选择的人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：CGAAGAAC GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU

核心为：UCCGUUCUUCG UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGUGCCAGGGAUU

实施例5h，与mir-125b-5p传感器配对的上述人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：CGACAGU UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA

核心为：GUGAACUGUCG UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGGACCCUAACUU

实施例5i，与mir-195b-5p配对的上述人/大鼠PPP3CA mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUUACCAGCAUCUCAGUCAUU

Cond-siRNA传感器：CCUGAA GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG

核心为：UGUUCUUCAGG UGACUGAGAUGCUGGUAAAGUGGUUUAGACUAUC

实施例5j，与mir-23a-3p传感器配对的随机选择的人/大鼠HDAC2 mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：CGAAGAAC GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU

核心为：AACAGCUCCUUGG GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGGGAGCCUGUGU

实施例5k，与mir-125b-5p配对的上述随机选择的人/大鼠HDAC2 mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：CGACAGU UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA

核心为：UCCGUUCUUCG GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGUGCCAGGGAUU

实施例51，与mir-195b-5p传感器配对的上述随机选择的人/大鼠HDAC2mRNA向导

Cond-siRNA向导：CCAC UUCAUCACAAGCUAUCCGCUU

Cond-siRNA传感器：CCUGAA GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG

核心为：UGUUCUUCAGG GCGGAUAGCUUGUGAUGAAGUGGUUUAGACUAUC

实施例6：由商业siRNA自动化设计网站设计的示例性siRNA

来自http：//dharmacon.horizondiscovery.com/design-center/

对于以下每个类别，设计工具的任务是设计将人和大鼠mRNA这两者的蛋白质编码区作为靶向的siRNA。示出了前三名的候选。通过在反义链的5′端添加4G/C富集的碱基来制备Cond-siRNA向导。

将人(NM_000944)和大鼠(NM_017041)PPP3CA mRNA这两者作为靶向的候选siRNA向导链序列(反义，antisense)和相应的靶标位点(正义，sense)

正义：5′G.A.A.C.A.A.G.A.U.C.C.G.A.G.C.A.A.U.A.U.U 3′

反义：5′U.A.U.U.G.C.U.C.G.G.A.U.C.U.U.G.U.U.C.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CGAC

U.A.U.U.G.C.U.C.G.G.A.U.C.U.U.G.U.U.C.U.U 3′

正义：5′U.G.A.C.U.G.A.G.A.U.G.C.U.G.G.U.A.A.A.U.U3′

反义：5′U.U.U.A.C.C.A.G.C.A.U.C.U.C.A.G.U.C.A.U.U3′

Cond-siRNA向导：5′CGAC

U.U.U.A.C.C.A.G.C.A.U.C.U.C.A.G.U.C.A.U.U3′

正义：5′G.G.U.C.A.G.A.A.G.A.A.G.A.U.G.G.A.U.U.U.U3′

反义：5′A.A.U.C.C.A.U.C.U.U.C.U.U.C.U.G.A.C.C.U.U3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC

A.A.U.C.C.A.U.C.U.U.C.U.U.C.U.G.A.C.C.U.U3′

将人(NM_001142353)和大鼠(NM_017042)PPP3CB mRNA这两者作为靶向的候选siRNA向导链序列(反义)和相应的靶位点(正义)

正义：5′G.C.U.A.U.A.G.A.A.U.G.U.A.C.A.G.A.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.U.C.U.G.U.A.C.A.U.U.C.U.A.U.A.G.C.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CGAC

U.U.U.C.U.G.U.A.C.A.U.U.C.U.A.U.A.G.C.U.U

正义：5′C.C.U.U.U.A.A.G.C.A.G.G.A.A.U.G.U.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.A.C.A.U.U.C.C.U.G.C.U.U.A.A.A.G.G.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′GGAC

U.U.A.C.A.U.U.C.C.U.G.C.U.U.A.A.A.G.G.U.U

正义：5′G.C.A.A.U.U.G.G.C.A.A.G.A.U.G.G.C.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.G.C.C.A.U.C.U.U.G.C.C.A.A.U.U.G.C.U.U 3′

Cond-向导：5′CCAC

U.U.G.C.C.A.U.C.U.U.G.C.C.A.A.U.U.G.C.U.U

将人(NM_001243974)和大鼠(NM_134367)PPP3CB mRNA这两者作为靶向的候选siRNA向导链序列(反义)和相应的靶标位点(正义)

正义：5′G.U.A.U.A.G.A.G.U.G.U.G.U.G.C.U.G.U.A.U.U3′

反义：5′U.A.C.A.G.C.A.C.A.C.A.C.U.C.U.A.U.A.C.U.U3’

Cond-siRNA向导：5′CCAC

U.A.C.A.G.C.A.C.A.C.A.C.U.C.U.A.U.A.C.U.U 3’

正义：5′A.G.U.A.U.U.U.G.A.G.A.A.U.G.G.G.A.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.U.C.C.C.A.U.U.C.U.C.A.A.A.U.A.C.U.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC

U.U.U.C.C.C.A.U.U.C.U.C.A.A.A.U.A.C.U.U.U 3′

正义：5′C.U.A.U.G.U.G.G.ACA.G.A.G.GC.U.A.U.U.U. 3′

反义：5′A.U.A.G.C.C.U.C.U.G.U.C.C.A.C.A.U.A.G.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC

A.U.A.G.C.C.U.C.U.G.U.C.C.A.C.A.U.A.G.U.U 3′

将人(NM_001527)和大鼠(NM_053447)HDAC2 mRNA这两者作为靶向的候选siRNA向导链序列(反义)和相应的靶向位点(正义)

正义：5′G.C.G.G.A.U.A.G.C.U.U.G.U.G.A.U.G.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.C.A.U.C.A.C.A.A.G.C.U.A.U.C.C.G.C.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC

U.U.C.A.U.C.A.C.A.A.G.C.U.A.U.C.C.G.C.U.U 3′

正义：5′G.G.A.U.A.U.U.G.G.U.G.C.U.G.G.A.A.A.A.U.U 3′

反义：5′U.U.U.U.C.C.A.G.C.A.C.C.A.A.U.A.U.C.C.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC

U.U.U.U.C.C.A.G.C.A.C.C.A.A.U.A.U.C.C.U.U 3′

正义：5′A.A.G.C.A.G.A.U.G.C.A.G.A.G.A.U.U.U.A.U.U 3′

反义：5′U.A.A.A.U.C.U.C.U.G.C.A.U.C.U.G.C.U.U.U.U 3′

Cond-siRNA向导：5′CCAC U.A.A.A.U.C.U.C.U.G.C.A.U.C.U.G.C.U.U.U.U 3′

实施例7：miRNA传感器链的示例性设计

miRNA传感器链的示例性设计如下所示。

miRNA在哺乳动物物种中具有高度保有(conserve)的序列。因此，我们可为包括人在内的所有测试动物设计一个单一的miRNA传感器。

对于每个序列，我们首先取向导序列的反向互补，然后添加8个碱基以创建29nt传感器。

＞hsa-miR-23a-3p MIMAT0000078

AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

＞反向互补

GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU

＞传感器，添加8个碱基以产生29mer

CGAAGAAC GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU

Nupack显示最小的二级结构并且不接受自我碱基配对

＞hsa-miR-125b-5p MIMAT0000423

UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

＞反向互补

UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA

＞传感器，添加7个碱基以产生29mer，

CGACAGU UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA

使用二级结构预测编码确保二级结构相对开放。如果不是，则改变所添加的碱基并重试。

＞hsa-miR-199b-5p MIMAT0000263

CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC

＞反向互补

GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG

＞传感器，添加6个碱基以产生29mer，

CCUGAA GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG

可接受的低二级结构

实施例8：miRNAs

其他miRNA如下所示：

＞rno-miR-23a-3p MIMAT0000792

AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

＞hsa-miR-23a-3p MIMAT0000078

AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

＞rno-miR-23a-3p MIMAT0000792

AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

＞mmu-miR-125b-5p MIMAT0000136

UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

＞hsa-miR-125b-5p MIMAT0000423

UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

＞rno-miR-125b-5p MIMAT0000830

UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

＞hsa-miR-199b-5p MIMAT0000263

CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC

＞mmu-miR-199b-5p MIMAT0000672

CCCAGUGUUUAGACUACCUGUUC

参考资料

1 Au-Graham，E.L.，Au-Balla，C.，Au-Franchino，H.，Au-Melman，Y.，Au-delMonte，F.&Au-Das，S.成年小鼠心肌细胞的分离，培养和功能性表征(Isolation，Culture，and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes).JoVE，e50289，doi：doi：10.3791/50289(2013).

2 Paradis，A.N.，Gay，M.S.，Wilson，C.G.&Zhang，L.新生儿缺氧/缺氧抑制发育中的心脏的心肌细胞增殖并减少心肌细胞先天能力：内皮素-1的作用(Newborn HyPoxia/Anoxia Inhibits Cardiomyocyte Proliferation and Decreases CardiomyocyteEndowment in the Developing Heart：Role of Endothelin-1).PLOS ONE 10，e0116600，doi：10.1371/期刊.pone.0116600(2015).

3 Xiao，J.，Liu，H.，Cretoiu，D.，Toader，D.O.，Suciu，N.，Shi，J.，Shen，S.，Bei，Y.，Sluijter，J.P.G.，Das，S.，Kong，X.&Li，X.miR-31a-5p通过靶向RhoBTB1促进产后心肌细胞增殖(miR-31a-5p promotes postnatal cardiomyocyte proliferation bytargeting RhoBTB1).Experimental&Amp；Molecular Medicine 49，e386，doi：10.1038/emm.2017.150(2017).

4 Nolan，T.，Hands，R.E.&Bustin，S.A.使用实时RT-PCR对mRNA进行定量(Quantification of mRNA using real-time RT-PCR).Nature Protocols 1，1559，doi：10.1038/nprot.2006.236(2006).

5 Fiedler，S.D.，Carletti，M.Z.&Christenson，L.K.RT-PCR方案：第二版(NicolaKing编)(in RT-PCR Protocols：Second Edition(ed Nicola King))49-64(HumanaPress，2010).

6 Hartmann，H.A.，Mazzocca，N.J.，Kleiman，R.B.&Houser，S.R.苯肾上腺素对猫心室肌细胞钙电流和收缩力的影响(Effects of phenylephrine on calcium currentand contractility of feline ventricular myocytes).American Journal ofPhysiology-Heart and Circulatory Physiology 255，H1173-H1180，doi：10.1152/ajpheart.1988.255.5.H1173(1988).

7 Katanosaka，Y.，Iwata，Y.，Kobayashi，Y.，Shibasaki，F.，Wakabayashi，S.&Shigekawa，M.钙调磷酸酶抑制苯肾上腺素治疗的肥大性心肌细胞中Na+/Ca2+交换(Calcineurin Inhibits Na+/Ca2+Exchange in Phenylephrine-treated HyPertrophicCardiomyocytes).Journal of Biological Chemistry 280，5764-5772，doi：10.1074/jbc.M410240200(2005).

8 Sussman，M.A.，Lim，H.W.，Gude，N.，Taigen，T.，O1son，E.N.，Robbins，J.，Colbert，M.C.，Gualberto，A.，Wieczorek，D.F.&Molkentin，J.D.通过钙调磷酸酶抑制来预防小鼠心脏肥大(Prevention of Cardiac HyPertrophy in Mice by CalcineurinInhibition).Science 281，1690-1693，doi：10.1126/science.281.5383.1690(1998).

9 Tham，Y.K.，Bernardo，B.C.，Ooi，J.Y.Y.，Weeks，K.L.&McMullen，J.R.心脏肥大和心力衰竭的病理生理学：信号通路和新型治疗靶标(Pathophysiology of cardiachypertrophy and heart failure：signaling pathways and novel therapeutictargets).Archives of Toxicology 89，1401-1438，doi：10.1007/s00204-015-1477-x(2015).

10 Molkentin，J.D.，Lu，J.-R.，Antos，C.L.，Markham，B.，Richardson，J.，Robbins，J.，Grant，S.R.&Olson，E.N.依赖钙调磷酸酶的心肌肥大转录途径(ACalcineurin-Dependent Transcriptional Pathway for Cardiac Hypertrophy).Cell93，215-228，doi：https：//doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81573-1(1998).

11 Cao，D.J.，Wang，Z.V.，Battiprolu，P.K.，Jiang，N.，Morales，C.R.，Kong，Y.，Rothermel，B.A.，Gillette，T.G.&Hill，J.A.组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂通过抑制自噬来减轻心肌肥大(Histone deacetylase(HDAC)inhibitors attenuate cardiachypertrophy by suppressing autophagy).Proceedings of the National Academy ofSciences 108，4123-4128，doi：10.1073/pnas.1015081108(2011).

12 Trivedi，C.M.，Luo，Y.，Yin，Z.，Zhang，M.，Zhu，W.，Wang，T.，Floss，T.，Goettlicher，M.，Noppinger，P.R.，Wurst，W.，Ferrari，V.A.，Abrams，C.S.，Gruber，P.J.&Epstein，J.A.Hdac2通过调节Gsk3β活性来调节心脏肥大反应(Hdac2regulates thecardiac hyPertrophic response by modulating Gsk3β activity).Nature Medicine13，324.doi：10.1038/nm1552

https：//www.hature.com/articles/nm1 552#supplementary-information(2007).

13 Liu，X.，Xiao，J.，Zhu，H.，Wei，X.，Platt，C.，Damilano，F.，Xiao，C.，Bezzerides，V.，

，P.，Che，L.，Zhang，C.，Spiegelman，Bruce M.&Rosenzweig，A.miR-222是运动诱导的心脏生长所必需的，并且防止病理性心脏重塑(miR-222IsNecessary for Exercise-Induced Cardiac Growth and Protects againstPathological Cardiac Remodeling).Cell Metabolism 21，584-595，doi：https：//doi.org/10.1016/j.cmet.2015.02.014(2015).

14 Han，S.-P.，Goddard III，W.A.，Scherer，L.&Rossi，J.J.信号可激活的构建体和相关组分的组成方法和系统(Signal activatable constructs and relatedcomponents compositions methods and systems).USA专利US9725715B2(2015).

15 Zadeh，J.N.，Steenberg，C.D.，Bois，J.S.，Wolfe，B.R.，Pierce，M.B.，Khan，A.R.，Dirks，R.M.&Pierce，N.A.NUPACK：核酸系统的分析和设计(NUPACK：Analysis anddesign of nucleic acid systems).期刊of Computational Chemistry 32，170-173，doi：10.1002/jcc.21596(2011).

16 Jaramillo-Botero，A.，Nielsen，R.，Abrol，R.，Su，J.，Pascal，T.，Mueller，J.&Goddard，W.Vol.307当前化学主题(Topics in Current Chemistry)(eds BarbaraKirchner&Jadran Vrabec)1-42(Springer Berlin/Heidelberg，2012).

17 Naito，Y.&Ui-Tei，K.siRNA设计：方法和方案(in siRNA Design：Methods andProtocols)(ed Debra J.Taxman)57-68(Humana Press，2013).

18 Boudreau，R.L.，Spengler，R.M.&Davidson，B.L.治疗性siRNA的合理设计：最大程度地降低脱靶潜能，以提高针对亨延顿氏病的RNAi疗法的安全性(Rational Designof Therapeutic siRNAs：Minimizing Off-targeting Potential to Improve theSafety of RNAi Therapy for Huntington′s Disease).MolTher，doi：http：//www.nature.com/mt/journal/vaop/ncurrent/suppinfo/mt2011185s1.html(2011).

19 Sano，M.，Sierant，M.，Miyagishi，M.，Nakanishi，M.，Takagi，Y.&Sutou，S.短RNA双链体的不对称末端结构对RNA干扰活性和链选择的影响(Effect of asymmetricterminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activityand strand selection).Nucleic Acids Research 36，5812-5821，doi：10.1093/Bar/gkn584(2008).

1.Kohstam MA，Kramer DG，Patel AR，Maron MS，Udelson JE.心力衰竭中的左心室重塑：当前的临床意义和评估概念(Left ventricular remodeling in heart failure：current concepts in clinical significance and assessment).JACC CardiovascImaging.2011；4(1)：98-108.doi：10.1016/j.jcmg.2010.10.008.

2.Rij RPV.病毒遇到RNAi。RNA干扰的抗病毒应用研讨会(Virus meetsRNAi.Symposium on Antiviral Applications of RNA Interference).EMBOReports.2008；9(8)：725-729.doi：10.1038/embor.2008.133.

3.J.N.Zadeh，C.D.Steenberg，J.S.Bois，B.R.Wolfe，M.B.Pierce，A.R.Khan，R.M.Dirks，N.A.Pierce.NUPACK：核酸系统的分析和设计(NUPACK：analysis and designofnucleic acid systems).J Comput Chem.32：170-173，2011.

4.Jessup M，Brozena S.心力衰竭(Heart Failure).New England Journal ofMedicine.2003；348：2007-2018.doi：10.1056/NEJMra021498.

附录A

具有钙调磷酸酶和HDAC2靶标的传感器链miR-23a-3p的设计综述

传感器miR-23a-3p基因序列

5′aucac auugc caggg auuucc 3′

21 碱基

钙调磷酸酶向导与核心

·钙调磷酸酶是一种蛋白磷酸酶，由两个亚基组成：PPP3CA(催化)和PPP3R1(调节)。Thermo Fisher有一个针对此蛋白(PPP3CA)的siRNA，始于碱基对1549。

·https：//www.thermofisher.com/order/genome-database/browse/sima/keyword/s72075

·向导(19bp的钙调磷酸酶靶标)：

1549：5’CGAG UGUUG UUUGG CUUUU CCUG UU 3’(自C变为G)

·核心链：

NuPack分析

·核心

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167393？token＝ShVxxDxhch&str and_id＝0

NuPack分析

·向导

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/167395？token＝16HdwHxzTn&stra nd_id＝0

NuPack分析

·具有两个小的核心突出端的传感器：97％

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167390？temperature＝37.0&token＝nJoY73JxjY&permutation_id＝2&complex_id＝14

NuPack分析

·具有核心的钙调磷酸酶向导：100％

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167392？temperature＝37.0&token＝mInaB5VvSR&permutation_id＝1&complex_id＝4

钙调磷酸酶向导链与人构建体的NCBI检查：

·主要关注的匹配

智人聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)家族成员14(PARP14)，转录物变体X2，mRNA(20/21增/减匹配)

智人未知功能LOC105374732(LOC105374732)，ncRNA(15bp增/减匹配)

智人含FYVE域锌指蛋白16(ZFYVE16)，转录物变体X19，mRNA(15bp增/减匹配)

智人富含GC启动子结合蛋白1(GPBP1)，转录物变体X11，misc_RNA(15bp增/减匹配)

HDAC2向导与核心链

·来自SI00434959的HDAC2向导

https：//www.qiagen.com/us/shop/rnai/flexitube-sima/？catno＝SI00434952#orderinginfbrmation

·向导链：5’GC ACUUA GAUUG AAACAACCCA GUU 3’(25bp)

·具有HDAC2靶标的核心：

粗体是短突出端

Nupack分析

·核心：

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167401？token＝Lpfhlxf ZJE&strand_id＝0

Nupack分析

·向导：

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167399？token＝wwbTxc1M2n&strand_id＝0

Nupack分析

·核心与向导：100％

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1168982？temperature＝37.0&token＝0B6YynDpIv&permutation_id＝1&complex_id＝4

Nupack分析

·传感器与核心突出端：97％

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167403？temperature＝37.0&token＝CCVfDSecYt&permutation_id＝2&complex_id＝14

向导与人转录物的NCBI检查

·主要关注的匹配：

智人溶质载体蛋白家族35成员F5(SLC35F5)，转录物变体X6，mRNA(15bp增/减匹配)

预测的：智人水通道蛋白12B(AQP12B)，转录物变体X16，misc_RNA(14bp增/减匹配)

HDAC2靶向的条件性siRNA构建体的设计综述

*信号”BNP，MYH7*

HDAC2靶标向导序列

1)使用HDAC2 siRNA的公开的文献-自Qiagen公司

·http：//www.nature.com/cddis/journal/v8/n3/extref/cddis201749x1.docx

·具有NCBI的HDAC2 mRNA序列的检查序列

·https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001527.3

·给定DNA序列—＞变为RNA序列—＞取向导链的反向互补

·始于HDAC2 mRNA的bp 518

·

·

·向导靶标HDAC2：

·

·5’向导的4bp有意地不匹配

·

向导与NCBI人转录物

BNP候选物#1

NPPB：HDAC2 RH1 V2.0

BNP mRNA序列

·序列始于BNP mRNA的3’UTR

·

·粗体-31bp序列用于传感器链的参考

·mRNA序列的来源：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/83700236

BNP传感器

·序列，5’-＞3’

·取先前BNP mRNA玻片的粗体31bp的反向互补

·

·#511BP

·下划线-8bp支点

·Nupack评估

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1166536？token＝PcTqQE aZRt&strand_id＝0

所有序列集合

具有突出端的传感器

·http：//www.nupack.org/partition/show/1166567？time_refresh＝1.0&token＝TGH

具有核心的向导

·注解：修改后的向导链，其5’端的前4个bp带有CGAG，以在不正确的Dicer切开和RISC复合物负载的情况下提供不匹配

·修饰w/2U突出端：

·

·修饰核心：

·

http：//www.nupack.org/partition/show/1167524？token＝002PMIkq4b

BNP候选物#2

NPPB：HDAC2 RH2 V2.0

BNP mRNA序列

·序列始于BNP mRNA的3’UTR

·粗体-31bp序列用于传感器链的参考

·mRNA序列的来源：

·https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/83700236

BNP传感器

·序列，5’-＞3’

·取先前BNP mRNA玻片的粗体31bp的反向互补

·

·#519BP

·下划线-8bp支点

·Nupack评估

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1166628？token＝wqLsVGJ XbN&strand_id＝0

所有序列集合

具有突出端的传感器

·http：//www.nupack.org/partition/show/1166634？time_refresh＝1.0&token＝hidzFsLfs4

具有核心的向导

http：//www.nupack.org/partition/histogram-detail/1168283？temperature＝37.0&tokeh＝DmPJ US5fy6&permutation_id＝1&complex_id＝4

BNP候选物#3

BNP mRNA序列

·序列始于BNP mRNA的3’UTR

·

·粗体-31bp序列用于传感器链的参考

·mRNA序列的来源：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/83700236

BNP传感器

·序列，5’-＞3’

·取先前BNP mRNA玻片的粗体31bp的反向互补

·

·#551BP

·下划线-8bp支点

·Nupack评估

·http：//www.nupack.org/partition/histogram-detail/1166638？token＝wZSopNP dBt&strand_id＝0

全序列集合

具有突出端的传感器

·http：//www.nupack.org/partition/show/1166634？time_refresh＝1.0&token＝hidzFs Lfs4

具有核心的向导

·http：//www.nupack.org/partition/show/1168284？token＝2ebgXKAxXb

MYH7信号

·MYH7：肌球蛋白重链7

·编码心脏肌球蛋白的重链亚基-心肌的收缩速度

·背景：肌球蛋白-2重链，2碱轻链，2调节轻链

·正常人心室，1型(慢缩)肌纤维

·突变导致肥大性心肌病、肌球蛋白贮积性肌病，和许多其他心脏疾病

·来源：http：//www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝MYH7

唯一MYH7候选物

MYH7 mRNA序列

·序列始于MYH7 mRNA的3’UTR

·

·粗体-31bp序列用于传感器链的参考

·mRNA序列的来源：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000257.3

MYH7传感器

·序列，5’-＞3’

·取先前MYH7 mRNA玻片的粗体31bp的反向互补

·

·#6030BP

·下划线-8bp支点

·Nupack评估

·http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1167009？token＝OyD14ywh0J&strand_id＝0

所有序列

具有突出端的传感器

·http：//www.nupack.org/partition/show/1167024？token＝2leoRi1CIS

具有核心的向导

http：//www.nupack.org/partition/show/1168285？time_refresh＝1.0&token＝dDbKge Fett

设计综述：心脏缺血中的条件性siRNAs：

NPPA，NPPB，MYH7，HDAC2，钙调磷酸酶

By：Sahil Sagar

07-06-2017

NPPA背景

·传感器

·AKA：ANP，ANF，ANH，CDD

·如果在心脏细胞中过表达，可抑制适应不良的心脏肥大。

NPPB背景

·传感器

·AKA：BNP

·高水平的BNP可作为缺血性心力衰竭患者的生物标志物

MYH7背景

·传感器

·AKA：CMD1S，CMH1，MPD1，MYHCB，SPMD，SPMM

·MYH7基因的过表达或突变可导致细胞过早死亡并增加心肌纤维化

靶标：

·HDAC2

·抑制可减少心肌肥大

·https：//www.nature.com/nm/joumal/v13/n3/full/nm1552.html

·钙调磷酸酶

·抑制可减少心肌肥大

·http：//circres.ahajoumals.org/content/84/6/623

NPPA HDAC2设计

构建体#1：(最佳)

http：//www.nupack.org/partition/histogram_detail/1157307？temperature＝37.0&token＝gYZW v2FATz&permutation_id＝2&complex_id＝23

核心：

传感器：

向导

NPPA HDAC2设计

构建体#3：

http：//www.nupack.org/partition/show/1169058？time-refresh＝1.0&token＝OXLbgX6bBo

核心：

传感器：

向导：

NPPA钙调磷酸酶设计

构建体#1：(最佳)

http：//www.nupack.org/partition/show/1169063？time-refresh＝1.0&token＝RnEIROmvsz

核心：

传感器：

修饰的传感器：CA+ACA+AG+ATG+AC+ACA+AA+TGC+AGC+AG+AGA+C+C+C

s1-s1：28s1：24DNA ^TM：87RNA ^TM：92

向导：

附录B

#产生人myh73’utr的31nt传感器候选物

hmyh7＝

′gctttgccacatcttgatctgctcagccctggaggtgccagcaaagccccatgctggagcctgtgtaacagctccttgggaggaagca

gaataaagcaattttccttgaagccgag′

chmyh7＝reverse_complement_RNA(hmyh7)

print(chmyh7)

print(′\n′)

check_sequence(chmyh7，31，′myh7 human.tsv′)

#产生人nppa 3’utr的31nt传感器候选物

hnppa＝′″agata acagccaggg aggacaagca gggctgggcc tagggacaga ctgcaagaggctcctgtccc

ctggggtctc

tgctgcattt gtgtcatctt gttgccatgg agttgtgatc atcccatcta agctgcagcttcctgtcaac acttctcaca tcttatgcta

actgtagata aagtggtttg atggtgactt cctcgcctct cccaccccat gcattaaattttaaggtaga acctcacctg

ttactgaaag tggtttgaaa gtgaataaac ttcagcacca tggacagaag ac′″

chnppa＝reverse_complement_RNA(hnppa)

print(chnppa)

print(′\n′)

check_sequence(chnppa，31，′nppa human.tsv′)

#产生人nppb 3’utr的31nt传感器候选物

hnppb＝″′gag gaagtcctgg ctgcagacac ctgcttctga ttccacaagg ggctttttcctcaaccctgt ggccgccttt

gaagtgactc atttttttaa tgtatttatg

tatttatttg attgttttat ataagatggt ttcttacctt tgagcacaaa atttccacggtgaaataaag tcaacattat aagcttt′″

chnppb＝reverse_complement_RNA(hnppb)

print(chnppb)

print(′\n′)

check_sequence(chnppb，31，′nppb human.tsv′)

#产生大鼠myh73’utr的31nt传感器候选物

rmyh7＝′″atct

tgtgctaccc aaccctaagg atgcctgtga agccctgaga cctggagcct ttgaaacagc

accttaggca gaaacacaat aaagcaattt tccttcaagc c′″

crmyh7＝reverse_complement_RNA(rmyh7)

print(crmyh7)

print(′\n′)

check_sequence(crmyh7，31，′myh7 rat.tsv′)

#产生大鼠nppa 3’utr的31nt传感器候选物

rnppa＝′″cagcc

aaatctgctc gagcagatcg caaaagatcc caagcccttg cggtgtgtca cacagcttgg

tcgcattgcc actgagaggt ggtgaatacc ctcctggagc tgcagcttcc tgtcttcatc

tatcacgatc gatgttaagt gtagatgagt ggtttagtga ggccttacct ctcccactct

gcatattaag gtagatcctc acccctttca gaaagcagtt ggaaaaaaat aaatccgaat

aaacttcagc accacggaca gacgctgagg cctg′″

cmppa＝reverse_complement_RNA(mppa)

print(crnppa)

print(′\n′)

check_sequence(crnppa，31，′nppa rat.tsv′)

#产生大鼠nppa 3’utr的31nt传感器候选物

rnppb＝′″gaagacc tcctggctgc agactccggc ttctgactct gcctgcggctcttctttccc

cagctctggg accacctctc aagtgatcct gtttatttat ttgtttattt atttattttt

atgttgctga ttttctacaa gactgtttct tatcttccag cacaaacttg ccacagtgta

ataaacatag cctatttctt gcttttgg′″

cmppb＝reverse_complement_RNA(mppb)

print(crnppb)

print(′\n′)

check_sequence(crnppa，31，′nppb rat.tsv′)

附录C

智人肌球蛋白重链7(MYH7)，mRNA

NCBI参考序列：NM_000257.3

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_000257 6069bp mRNA 线型的 PRI 17-JUN-2018

定义智人肌球蛋白重链7(MYH7)，mRNA.

编号 NM_000257XM_005267696

版本 NM_000257.3

关键词 RefSeq.

来源智人(人)

生物智人

真核生物；后生动物；脊索动物；有头动物；脊椎动物门；骨脊椎动物；

哺乳动物；真兽亚纲；灵长总目；灵长类；简鼻亚目；

狭鼻猴亚目；人科；人属。

参考文献1(碱基1至6069)

作者 Feng X，He T，Wang JG和Zhao P.

题目肥大型心肌病家族中β-肌球蛋白重链的Asn391Thr突变

期刊 Int Heart J 59(3)，596-600(2018)

PUBMED 29743414

评论 GeneRIF：MYH7的Asn391Thr突变是肥大型心肌病的恶性突变，该突变携带者应得到有效的治疗以防止猝死

参考文献2(碱基1至6069)

作者 Viswanathan SK，Sanders HK，McNamara JW，Jagadeesan A，Jahangir A，Tajik AJ和Sadayappan S.

题目肥大型心肌病的临床表型与基因突变和突变剂量无关

期刊 PLoS ONE 12(11)，e0187948(2017)

PURMED 29121657

评论 GeneRIF：数据提供了证据，证明MYH7突变占肥大型心肌病(HCM)病例的24.4％MYBPC3突变，MYBPC3构成了HCM的主要病因，并且这两个突变在表型上无法区分。

出版状态：只供在线

参考文献3(碱基1至6069)

作者 Wang B，Guo R，Zuo L，Shao H，Liu Y，Wang Y，Ju Y，Sun C，Wang L，Zhang Y和Liu L.

题目 [肥大型心肌病患者汉族谱系MYH7-V878A突变的基因型和表型相关性分析]

期刊 Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 34(4)，514-518(2017)

PUBMED 28777849

评论 GeneRIF：MYH7-V878A是汉族中外显率高的一个热点。

参考文献4(碱基1至6069)

作者 Oldfors A.

题目遗传性肌球蛋白肌病

期刊 Neuromuscul.Disord.17(5)，355-367(2007)

PUBMED 17434305

评论综述文章

参考文献5(碱基1至6069)

作者 Cirino，A.L.和Ho，C.

题目肥大性心肌病概述

期刊 (in)Adam MP，Ardinger HH，Pagon RA，Wallace SE，Bean LJH，Stephens K和Amemiya A(Eds.)；GENEREVIEWS((R))；(1993)

PUBMED 20301725

参考文献6(碱基1至6069)

作者 Lamont，P.和Laing，N.G.

题目远侧肌病

PUBMED 20301606

参考文献7(碱基1至6069)

作者 Hershberger，R.E.和Morales，A.

题目扩张型心肌病概述

PUBMED 20301486

参考文献8(碱基1至6069)

作者 DeChene，E.T.，Kang，P.B.和Beggs，A.H.

题目先天性纤维比例失调

PUBMED 20301436

参考文献9(碱基1至6069)

作者 Warlick CA，Ramachandra S，Mishra S和Donis-Keller H.

题目人心脏β-肌球蛋白重链基因(HMSYHCO1)位点的二核苷酸重复多态性

期刊 Hum.Mol.Genet.1(2)，136(1992)

PUBMED 1301151

参考文献10(碱基1至6069)

作者 Fougerousse F，Dufour C，Roudaut C和Beckmann JS.

题目心脏β-肌球蛋白重链(MYH6)的人基因处的二核苷酸重复多态性

期刊 Hum.Mol.Genet.1(1)，64(1992)

PUBMED 1301139

评论被评述REFSEQ：该记录已由NCBI工作人员整理。参考序列源自BF834726.1，EU747717.1，M58018.1和BC11173.1。2014年6月20日当天或之前，此序列版本替换了XM_005267696.1.NM_000257.2。

概述：肌肉肌球蛋白是含有2个重链亚基，2个碱轻链亚基，以及2个调节轻链亚基的六聚体蛋白。该基因编码心脏肌球蛋白的β(或慢)重链亚基。它主要在正常人的心室中表达。它还在富含慢肌I型肌纤维的骨骼肌组织中表达。该蛋白和心肌肌球蛋白的α(或快)重亚基的相对丰度变化与心肌的收缩速度有关。在甲状腺激素耗竭和血流动力学超负荷期间，其表达也会改变。该基因的突变与家族性肥大型心肌病，肌球蛋白贮积性肌病，扩张型心肌病，和莱因早发性远端肌病有关。[由RefSeq提供，2008年7月]。

出版说明：该RefSeq记录包括可用于该基因的出版物的子集。请查看基因记录以访问其他出版物。

附录D

智人利钠肽A(NPPA)，mRNA

NCBI参考序列：NM_006172.3

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_006172 858bp mRNA 线型的 PRI 29-JUL-2018

定义智人利钠肽A(NPPA)，mRNA.

编号 NM_006172

版本 NM_006172.3

关键词 RefSeq.

来源智人(人)

生物智人

哺乳动物；真兽亚纲；灵长总目；灵长类；简鼻亚目；

狭鼻猴亚目；人科；人属。

参考文献1(碱基1至858)

作者 Cannone V，Scott CG，Decker PA，Larson NB，Palmas W，Taylor KD，WangTJ，Gupta DK.Bielinski SJ和Bumett JC Jr.

题目非裔美国人遗传变体rs5068的G等位基因与良好的心脏代谢曲线相关：动脉粥样硬化的多种族研究(MESA)

期刊 PLoS ONE 12(12)，e0189858(2017)

PUBMED 29253899

评论 GeneRIF：非裔美国人遗传变体rs5068的G等位基因与代谢综合征的较低患病率和较低甘油三酸酯值相关

出版状态：只供在线

参考文献2(碱基1至858)

作者 Salo，P.P.，Havulinna，A.S.，Tukiainen，T.，Raitakari，O.，Lehtimaki，T.，Kahonen，M.，Kettunen，J.，Mannikko，M.，Eriksson，J.G.，Jula，A.，Blankenberg，S.，Zeller，T.，Salomaa，V.，Kristiansson，K.和Perola，M.

题目全基因组关联分析表明，在一般人群的血压调节中，心房利钠肽比B型利钠肽更重要

期刊 Circ Cardiovasc Genet 10(6)(2017)

PUBMED 29237677

评论 GeneRIF：数据表明在一般人群中心房利钠肽的降血压作用。

参考文献3(碱基1至858)

作者 Wakula P，Neumann B，Kienemund J，Thon-Gutschi E，Stojakovic T，Manninger M，Scherr D，Scharnagl H，Kapl M，Pieske B和Heinzel FR.

题目用于鉴定患有心房高频事件和阵发性房颤的患者的CHA2DS2-VASc评分和血液生物标记物

期刊 Europace 19(4)，544-551(2017)

PUBMED 28431065

评论 GeneRIF：TIMP-4，NT-proANP，NT-proBNP与PAF和AHRE最相关。通过添加选定的生物标记物，CHADS2-VASc对PAF的识别性能得以提高。

参考文献4(碱基1至858)

作者 Bartus K，Podolec J，Lee RJ，Kapelak B，Sadowski J，Bartus M，Oles K，Ceranowicz P，Trabka R和Litwinowicz R.

题目使用LARIAT装置进行经心外膜经皮左心耳缝合结扎后心房利钠肽和脑钠肽的变化。

期刊 J.Physiol.Pharmacol.68(1)，117-123(2017)

PUBMED 28456775

评论 GeneRIF：总之，术后3个月使用LARIAT装置进行经皮心外膜左心耳缝合结扎后，ANP和BNP水平无显著差异。

参考文献5(碱基1至858)

作者 Suga S，Nakao K，Hosoda K，Mukoyama M，Ogawa Y，Shirakami G，Arai H，Saito Y，Kambayashi Y，Inouye K等

题目利钠肽家族，心房利钠肽，脑钠肽，和C型利钠肽的受体选择性

期刊Endocrinology 130(1)，229-239(1992)

PUBMED 1309330

参考文献6(碱基1至858)

作者 Bennett BD，Bennett GL，Vitangcol RV，Jewett JR，Burnier J，Henzel和Lowe DG.

题目三种人利钠肽受体的胞外域-IgG融合蛋白。激素药理学及其在合成肽抗血清固相筛选中的应用

期刊 J.Biol.Chem.266(34)，23060-23067(1991)

PUBMED 1660465

参考文献7(碱基1至858)

作者 Koller KJ，Lowe DG，Bennett GL，Minamino N，Kangawa K，Matsuo H和Goeddel DV.

题目 C型利钠肽(CNP)选择性激活B型利钠肽受体

期刊 Science 252(5002)，120-123(1991)

PUBMED 1672777

参考文献8(碱基1至858)

作者 Yang-Feng，T.L.，Floyd-Smith，G.，Nemer，M.，Drouin，J.和Francke，U.

题目 pronatriodilatin基因位于人1号染色体的远端短臂和小鼠4号染色体上

期刊 Am.J.Hum.Genet.37(6)，1117-1128(1985)

PUBMED 2934979

参考文献9(碱基1至858)

作者 Zivin，R.A.，Condra，J.H.，Dixon，R.A.，Seidah，N.G.，Chretien，M.，Nemer，M.，Chamberland，M.和Drouin，J.

题目编码大鼠和人心房利钠肽的DNA序列的分子克隆和表征

期刊 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(20)，6325-6329(1984)

PUBMED 6238331

参考文献10(碱基1至858)

作者 Oikawa，S.，Imai，M.，Ueno，A.，Tanaka，S.，Noguchi，T.，Nakazato，H.，Kangawa，K.，Fukuda，A.和Matsuo.H.

题目编码人心房利钠肽前体的cDNA的克隆和序列分析

期刊 Nature 309(5970)，724-726(1984)

PUBMED 6203042

评论被评述REFSEQ：该记录已由NCBI工作人员整理。参考序列源自BC005893.1和AA779538.1。该序列是RefSeqGene项目中的参考标准。2009年6月13日，此序列版本替换了NM_006172.2。

概述：该基因编码的蛋白质属于利钠肽家族。利钠肽与细胞外液量和电解质体内稳态的控制有关。该蛋白被合成为大的前体(包含信号肽)，经过加工后从N端释放出一种肽，与血管活性肽，心扩张素相似，而从C端释放出另一种具有排尿-利尿活性的肽。该基因的突变与6型家族性心房颤动相关。该基因位于1号染色体上的利钠肽家族另一成员的附近。[由RefSeq提供，2015年10月]。

附录E

智人利钠肽B(NPPB)，mRNA

NCBI参考序列：NM_002521.2

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_002521 708bp mRNA 线型的 PRI 22-JUL-2018

定义智人利钠肽B(NPPB)，mRNA.

编号 NM_002521

版本 NM_002521.2

关键词 RefSeq.

来源智人(人)

生物智人

哺乳动物；真兽亚纲；灵长总目；灵长类；简鼻亚目；

狭鼻猴亚目；人科；人属。

参考文献1(碱基1至708)

作者 Hex C，Smeets M，Penders J，Van Hoof V，Verbakel J，Buntinx F和VaesB.

题目用于初级保健中NT-proBNP的Cobas h232即时检验的准确性，用户友好性和实用性

期刊 J.Clin.Pathol.71(6)，539-545(2018)

PUBMED 29263170

评论 GeneRIF：报告NT-proBNP即时检验在诊断心力衰竭的初级保健中的实用性。

参考文献2(碱基1至708)

作者 Drozdz T，Kwinta P，Kordon Z，Sztefko K，Rudzinski A，Zachwieja K，Miklaszewska M，Czamecka D和Drozdz D.

题目 [B型利钠肽作为慢性肾脏病患儿心脏功能障碍的标志物]

期刊 Pol.Merkur.Lekarski 44(262)，171-176(2018)

PURMFD 29775443

REMARK GeneRIF：对于患有慢性肾脏疾病的儿童，BNP是心力衰竭的指标，与肾功能参数和左心室质量指数相关。

参考文献3(碱基1至708)

作者 Fernandez-Susavila H，Rodriguez-Yanez M，Dopico-Lopez A，Arias S，Santamaria M，Avila-Gomez P，Doval-Garcia JM，Sobrino T，Iglesias-Rey R，CastilloJ和Campos F.

题目利钠肽的头和尾：脑利钠肽的神经保护作用。

期刊 J Am Heart Assoc 6(12)，e007329(2017)

PUBMED 29203579

评论 GeneRIF：提示BNP作为抗脑缺血的保护性内源性因子的潜在作用。

出版状态：只供在线

参考文献4(碱基1至708)

作者 Legaz-Arrese A，Carranza-Garcia LE，Navarro-Orocio R，Valadez-LiraA，Mayolas-Pi C，Munguia-Izquierdo D，Reverter-Masia J和George K.

题目成年及青少年男性和女性耐力运动后心脏生物标志物释放

期刊 J.Pediatr.191，96-102(2017)

PUBMED 29173327

评论 GeneRIF：运动相关的hs-cTnT和NT-proBNP的增加是对60分钟最大游泳测试的反应，该测试独立于青春期状态/青春期对成年人。本数据还表明，男性的基线和运动后hs-cTnT值高于女性，而NT-proBNP值无性别差异。

参考文献5(碱基1至708)

作者 Krause A，Liepke C，Meyer M，Adermann K，Forssmann WG和Maronde E.

题目人利钠肽表现出抗菌活性

期刊 Eur.J.Med.Res.6(5)，215-218(2001)

PUBMED 11410403

评论 GeneRIF：脑型利钠肽(hBNP-32)是对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和酵母具有活性的抗菌肽。

参考文献6(碱基1至708)

作者 Arden KC，Viars CS，Weiss S，Argentin S和Nemer M.

题目人B型利钠肽前体(NPPB)基因在1p36染色体上的定位

期刊 Genomics 26(2)，385-389(1995)

PUBMED 7601467

参考文献7(碱基1至708)

题目利钠肽家族，心房利钠肽，脑利钠肽，和C型利尿钠肽的受体选择性

期刊 Endocrinology 130(1)，229-239(1992)

PUBMED 1309330

参考文献8(碱基1至708)

作者 Bennett BD，Bennett GL，Vitangcol RV，Jewett JR，Burnier J，Henzel W和Lowe DG.

期刊 J.Biol.Chem.266(34)，23060-23067(1991)

PUBMED 1660465

参考文献9(碱基1至708)

题目 C型利钠肽(CNP)选择性激活B型利钠肽受体

期刊 Science 252(5002)，120-123(1991)

PUBMED 1672777

参考文献10(碱基1至708)

作者 Sudoh T，Maekawa K，Kojima M，Minamino N，Kangawa K和Matsuo H.

题目编码人脑利钠肽前体的cDNA的克隆和序列分析

期刊 Biochem.Biophys.Res.Commun.159(3)，1427-1434(1989)

PUBMED 2522777

评论被评述REFSEQ：该记录已由NCBI工作人员整理。参考序列源自AJ708502.1，M25296.1和BC025785.1。2005年12月16，此序列版本替换了NM_002521.1。

概述：该基因是利钠肽家族的成员，并编码一种起心脏激素作用的分泌蛋白。该蛋白质经历了两次裂解过程，一次在细胞内，第二次在分泌入血液后。该蛋白质的生物学作用包括利尿，排尿，血管舒张，抑制肾素和醛固酮的分泌，以及在心血管体内稳态中的关键作用。该蛋白质在血流中的高浓度指示心力衰竭。该蛋白质还充当具有抗菌和抗真菌活性的抗菌肽。该基因的突变与绝经后骨质疏松症有关。[由RefSeq提供，2014年11月]。

附录F

褐家鼠肌球蛋白重链7(Myh7)，mRNA

NCBI参考序列：NM_017240.2

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_017240 5923bp mRNA 线型的 ROD 31-MAY-2018

定义 Rattus norvegicus myosin heavy chain 7(Myh7)，mRNA.

编号 NM_017240

版本 NM_017240.2

关键词 RefSeq.

来源褐家鼠(挪威鼠)

生物褐家鼠

哺乳动物；真兽亚纲；灵长总目；啮齿动物；啮齿目；鼠形亚目；

鼠总科；鼠科；鼠亚科；鼠属。

参考文献1(碱基1至5923)

作者 Tomita-Mitchell A，Stamm KD，Mahnke DK，Kim MS，Hidestrand PM，LiangHL，Goetsch MA，Hidestrand M，Simpson P，Pelech AN，Tweddell，Benson DW，Lough JW和Mitchell ME.

题目 MYH6变体对左心发育不全综合征的影响

期刊 Physiol.Genomics 48(12)，912-921(2016)

PUBMED 27789736

参考文献2(碱基1至5923)

作者 Chandra V，Gollapudi SK和Chandra M.

题目大鼠心脏肌钙蛋白T突变(F72L)介导的对细丝协同性的影响受α-和β-肌球蛋白重链同工型的调节

期刊 Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.309(8)，H1260-H1270(2015)

PUBMFD 26342069

评论 GeneRIF：TnT突变F72L导致在MYH6存在时与扩张型心肌病和在MYH7存在时肥大型心肌病相关的收缩性变化。

参考文献3(碱基1至5923)

作者 Kralova E，Doka G，Pivackova L，Srankova J，Kuracinova K，Janega P，Babal P，Klimas J和Krenek P.

题目 1-精氨酸减弱心脏功能障碍，但进一步下调异丙肾上腺素诱导的心肌病中的α-肌球蛋白重链表达。

期刊 Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.117(4)，251-260(2015)

PUBMED 25865156

参考文献4(碱基1至5923)

作者 Taylor KC，Buvoli M，Korkmaz EN，Buvoli A，Zheng Y，Heinze NT，Cui Q，Leinwand LA和Rayment I.

题目残留物调节肌球蛋白棒的结构特性并向导粗纤维组件

期刊 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112(29)，E3806-E3815(2015)

PUBMED 26150528

参考文献5(碱基1至5923)

作者 Zhang P，Shan T，Liang X，Deng C和Kuang S.

题目雷帕霉素的哺乳动物靶标对于鼠心肌细胞存活和心脏发育至关重要

期刊 Biochem.Biophys.Res.Commun.452(1)，53-59(2014)

PUBMED 25139234

参考文献6(碱基1至5923)

作者 O′Neill L，Holbrook NJ，Fargnoli J和Lakatta EG.

题目大鼠心脏肌球蛋白重链基因mRNA从年轻到衰老的逐渐变化

期刊 Cardioscience 2(1)，1-5(1991)

PUBMED 1888877

参考文献7(碱基1至5923)

作者 Schuyler GT和Yarbrough LR.

题目心肌肥大和甲状腺功能减退时肌球蛋白和肌酸激酶mRNA水平的变化

期刊 Basic Res.Cardiol.85(5)，481-494(1990)

PUBMED 1703406

参考文献8(碱基1至5923)

作者 McNally EM，Kraft R，Bravo-Zehnder M，Taylor DA和Leinwand LA.

题目全长大鼠α和β心脏肌球蛋白重链序列。比较表明功能差异的分子基础

期刊 J.Mol.Biol.210(3)，665-671(1989)

PUBMED 2614840

参考文献9(碱基1至5923)

作者 Kraft R，Bravo-Zehnder M，Taylor DA和Leinwand LA.

题目大鼠β心脏肌球蛋白重链全长cDNA的完整核苷酸序列

期刊 Nucleic Acids Res.17(18)，7529-7530(1989)

PUBMED 2798112

参考文献10(碱基1至5923)

作者 Izumo，S.，Lompre，A.M.，Matsuoka，R.，Koren，G.，Schwartz，K.，Nadal-Ginard，B.和Mahdavi，V.

题目心肌肥大过程中的肌球蛋白重链信使RNA和蛋白质同工型转变。血流动力学与甲状腺激素诱导的信号之间的相互作用

期刊 J.Clin.Invest.79(3)，970-977(1987)

PUBMED 2950137

评论临时REFSEQ：该记录尚未接受NCBI的最终审查。参考序列源自X15939.1。

2013年2月21日，此序列版本替换了NM_017240.1。

概述：肌球蛋白重链；参与肌肉收缩 [RGD，2006年2月].

附录G

褐家鼠利钠肽A(Nppa)，mRNA

NCBI参考序列：NM_012612.2

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_012612 831bp mRNA 线型的ROD 10-JUN-2018

定义褐家鼠利钠肽A(Nppa)，mRNA.

编号 NM_012612

版本 NM_012612.2

关键词 RefSeq.

来源褐家鼠(挪威鼠)

生物褐家鼠

鼠总科；鼠科；鼠亚科；鼠属。

参考文献1(碱基1至831)

作者 Barallobre-Barreiro J，Gupta SK，Zoccarato A，Kitazume-Taneike R，Fava M，Yin X，Werner T，Hirt MN，Zampetaki A，Viviano A，Chong M，Bern M，Kourliouros A，Domenech N，Willeit P，Shah AM，Jahangiri M，Schaefer L，Fischer JW，IoZZo RV，Viner R，Thum T，Heineke J，Kichler A，Otsu K和Mayr M.

题目糖蛋白质组学揭示在人心房颤动中具有抗肌生长抑制素活性的饰胶蛋白聚糖肽

期刊 Circulation 134(11)，817-832(2016)

PUBMED 27559042

参考文献2(碱基1至831)

作者 Yuan K，Park BM，Choi YT，Kim JH，Cho KW和Kim SH.

题目内皮素家族对ANP分泌的影响

期刊 Peptides 82，12-19(2016)

PUBMED 27208702

评论 GeneRIF：提示ET家族对ANP分泌的促分泌作用顺序为ET-1＞/＝ET-2＞＞ET-3＞s6C，而ET-1诱导的心房利钠肽分泌负调节ET-1的升压作用。

参考文献3(碱基1至831)

作者 Lee CH，Ha GW，Kim JH和Kim SH.

题目大鼠实验性结肠炎中利钠肽系统的调节

期刊 Dig.Dis.Sci.61(4)，1060-1068(2016)

PUBMED 26660905

评论 GeneRIF：实验性结肠炎中ANP增强对基础运动的抑制作用可能是由于结肠利钠肽受体A mRNA的表达增加

参考文献4(碱基1至831)

作者 Bugrova，M.L.

题目 [大鼠心肌细胞灌注后心房和脑利钠肽的变化]

期刊 Tsitologiia 58(2)，129-134(2016)

PUBMED 27228659

评论 GeneRIF：这是由于以下事实：ANP是利钠肽系统的主要激素，参与正常情况下的血压调节，而BNP是心血管病理中压力的主要调节剂

参考文献5(碱基1至831)

作者 Pang A，Hu Y，Zhou P，Long G，Tian X，Men L，Shen Y，Liu Y和Cui Y.

题目在糖尿病性心肌病中，丝氨酸蛋白酶被下调并通过激活心房利钠肽途径发挥心脏保护作用

期刊 Cardiovasc Diabetol14，134(2015)

PUBMED 26446774

评论 GeneRIF：在糖尿病性心肌病中，ANP mRNA和蛋白降低。

出版状态：只供在线

参考文献6(碱基1至831)

期刊 J.Biol.Chem.266(34)，23060-23067(1991)

PUBMFD 1660465

参考文献7(碱基1至831)

作者 Levin ER和Frank HJ.

题目利钠肽抑制大鼠星形胶质细胞增生：由C受体介导

期刊 Am.J.Physiol.261(2Pt 2)，R453-R457(1991)

PUBMED 1652217

参考文献8(碱基1至831)

题目 C型利钠肽(CNP)选择性激活B型利钠肽受体

期刊 Science 252(5002)，120-123(1991)

PUBMED 1672777

参考文献9(碱基1至831)

作者 Mukoyama，M.，Nakao，K.，Saito，Y.，Ogawa，Y.，Hosoda，K.，Suga，S.，Shirakami，G.，Jougasaki，M.和Imura，H.

题目充血性心力衰竭时人脑利钠肽增加

期刊 N.Engl.J.Med.323(11)，757-758(1990)

PUBMED 2143809

参考文献10(碱基1至831)

作者 Jin H，Yang RH，Chen YF，Jackson RM和Oparil S.

题目心房利钠肽可减轻慢性缺氧大鼠肺动脉高压的发展

期刊 J.Clin.Invest.85(1)，115-120(1990)

PUBMED 2136863

评论经验证的REFSEQ：该记录已经过验证或初步审核。参考序列源自CB724799.1，X00665.1和AI602287.1。2007年10月17日，此序列版本替换了NM_012612.1。

概述：肽参与控制体液量和血管功能[RGD，2006年2月].

附录H

褐家鼠利钠肽B(Nppb)，mRNA

NCBI参考序列：NM_031545.1

FASTA图形

转至：

轨迹 NM_031545 628bp mRNA 线型的ROD 21-JUL-2018

定义褐家鼠利钠肽B(Nppb)，mRNA.

编号 NM_031545

版本 NM_031545.1

关键词 RefSeq.

来源褐家鼠(挪威鼠)

生物褐家鼠

鼠总科；鼠科；鼠亚科；鼠属。

参考文献1(碱基1至628)

作者 Saklani R，Gupta SK，Mohanty IR，Kumar B，Srivastava S和Mathur R.

题目芦丁通过改变TNF-α，CRP和BNP水平及抗氧化作用对stz诱导的糖尿病大鼠产生心脏保护作用

期刊 Mol.Cell.Biochem.420(1-2)，65-72(2016)

PUBMED 27443845

评论 GeneRIF：芦丁通过改变TNF-α，CRP和BNP水平及抗氧化作用对stz诱导的糖尿病大鼠产生心脏保护作用。

参考文献2(碱基1至628)

作者 Holditch SJ，Schreiber CA，Burnett JC和Ikeda Y.

题目 B型利钠肽敲除雌性的动脉重塑

期刊 Sci Rep 6，25623(2016)

PUBMED 27162120

评论GeneRIF：数据显示，大约60％的B型利尿钠前体(Nppb)/雌性在她们的一生中出现肠系膜结节性多动脉炎(PAN)样血管炎，有些早在4个月大的时候。

出版状态：只供在线

参考文献3(碱基1至628)

作者 Terse PS，Joshi PS，Bordelon NR，Brys AM，Patton KM，Amdt TP和SutulaTP.

题目 2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)诱导的大鼠心脏毒性：NT-proBNP和BNP作为潜在的早期心脏安全生物标志物

期刊 Int.J.Toxicol.35(3)，284-293(2016)

PUBMED 26838190

评论 GeneRIF：NT-proBNP和BNP是2-DG诱导的心脏毒性的潜在早期生物标志物，可用于临床试验中监测2-DG治疗。

参考文献4(碱基1至628)

作者 Bugrova，M.L.

题目 [大鼠心肌细胞灌注后心房和脑利钠肽的变化]

期刊 Tsitologiia 58(2)，129-134(2016)

PUBMED 27228659

REMARK GeneRIF：这是由于以下事实：ANP是利钠肽系统的主要激素，参与正常情况下的血压调节，而BNP是心血管病理中压力的主要调节剂。

参考文献5(碱基1至628)

作者 Dogan H，Sarikaya S，Neijmann ST，Uysal E，Yucel N，Ozucelik DN，Okuturlar Y，Solak S，SeverN和Ayan C.

题目 N端前B型利钠尿肽作为创伤中钝性心脏挫伤的标志物

期刊 Int J Clin Exp Pathol8(6)，6786-6792(2015)

PUBMED 26261563

REMARK GeneRIF：钝性胸部外伤5小时后，血清NT-proBNP水平显著增加。

出版状态：只供在线

参考文献6(碱基1至628)

期刊 J.Biol.Chem.266(34)，23060-23067(1991)

PUBMED 1660465

参考文献7(碱基1至628)

作者 Dagnino L，Drouin J和Nemer M.

题目心脏和心外组织中利钠肽基因的差异表达

期刊 Mol.Endocrinol.5(9)，1292-1300(1991)

PUBMED 1837590

参考文献8(碱基1至628)

作者 Levin ER和Frank HJ.

题目利钠肽抑制大鼠星形胶质细胞增生：由C受体介导

期刊 Am.J.Physiol.261(2Pt 2)，R453-R457(1991)

PUBMED 1652217

参考文献9(碱基1至628)

作者 Hoffman A，Grossman E和Keiser HR.

题目充血性心力衰竭大鼠血浆水平升高和脑钠肽的钝化作用

期刊 Am.J.Hypertens.4(7Pt 1)，597-601(1991)

PUBMED 1831369

参考文献10(碱基1至628)

题目 C型利钠肽(CNP)选择性激活B型利钠肽受体

期刊 Science252(5002)，120-123(1991)

PUBMED 1672777

评论临时REFSEQ：该记录尚未接受NCBI的最终审查。参考序列源自M25297.1。

概述：主要由心脏的心房和心室产生的激素[RGD，2006年2月].

Claims

1.一种条件性RNA-传感器复合物，包括：

包含至少一个支点片段的传感器链，其中，该支点片段与靶细胞中存在或过表达的病理性生物标志物结合；

一个双链pro-RNA分子，包括

向导链，包含一个与靶细胞中的治疗性靶分子结合的RNA分子；以及

一个核心链，包括

一个第一部分，包含与所述向导链完全或部分互补并与该向导链结合的乘客链；

一个第二部分，包含与所述传感器链完全或部分互补并与该传感器链结合的第一保护片段；和

一个第一接头，其将所述乘客链的第一端与所述第一保护片段连接。

2.如权利要求1所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述核心链还包含一个与所述传感器链完全或部分互补的第二保护片段，以及一个将所述乘客链的第二端与所述第二保护片段连接的第二接头。

3.如权利要求1或2所述的条件性RNA-传感器复合物，其中所述支点片段是适配子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，当所述病理性生物标志物与所述支点片段结合时所述传感器链从所述双链pro-RNA分子上被置换下，且所得的双链pro-RNA分子是Dicer的底物。

5.如权利要求1-4中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述靶细胞是心肌细胞。

6.如权利要求5所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述靶细胞是心肌细胞且所述病理性生物标志物是与心肌梗塞或心肌肥大相关的生物标志物。

7.如权利要求6所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述病理性生物标志物包含编码ANP，BNP，MHCβ，mir-23a-3p，mir-125-6p，或mir-199b-5p的至少一部分的分子。

8.如权利要求1-7中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述编码ANP，BNP，MHCβ，mir-23a-3p，mir-125-6p，或mir-199b-5p的至少一部分的分子是mRNA分子或miRNA分子。

9.如权利要求8所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述RNA分子包含选自SEQ IDNOS：1-10的序列。

10.如权利要求9所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链还包含对RNA序列的一个或多个化学修饰，其中，所述一个或多个化学修饰选自锁核酸(LNA)修饰，肽核酸(PNA)修饰，2′-O-甲基修饰，吗啉代修饰，硫代磷酸酯修饰，末端修饰，或接头修饰。

11.如权利要求5-10中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述双链pro-RNA分子是RNA干扰(RNAi)分子，且所述治疗性靶分子是编码钙调磷酸酶或组蛋白脱乙酰化酶2(HDAC2)的至少一部分的RNA分子。

12.如权利要求11所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述向导链包含选自SEQ IDNOS：11-16的序列。

13.如权利要求1-12中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述第一接头，所述第二接头，或第一和第二接头这两者均为C3间隔子。

14.如权利要求11所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述向导链还包含对RNA序列的一个或多个化学修饰，其中，所述一个或多个化学修饰选自锁核酸(LNA)修饰，肽核酸(PNA)修饰，2′-O-甲基修饰，吗啉代修饰，硫代磷酸酯修饰，末端修饰，或接头修饰。

15.如权利要求1-14中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述核心链包含

一条乘客链；

一个第一接头，其将乘客链的3’端连接至所述第一保护片段；以及

一个第二接头，其将乘客链的5’端连接至所述第二保护片段。

16.如权利要求15所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述核心链包含选自SEQ IDNOS：17-26的序列。

17.如权利要求15或16所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述核心链还包含对RNA序列的一个或多个化学修饰，其中，所述一个或多个化学修饰选自锁核酸(LNA)修饰，肽核酸(PNA)修饰，2′-O-甲基修饰，吗啉代修饰，硫代磷酸酯修饰，末端修饰，或接头修饰。

18.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：4具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：21具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：15具有至少95％同源性的序列。

19.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：5具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：22具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：15具有至少95％同源性的序列。

20.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：6具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：23具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：15具有至少95％同源性的序列。

21.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：7具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：24具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：15具有至少95％同源性的序列。

22.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：8具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：25具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：16具有至少95％同源性的序列。

23.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：9具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：26具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：16具有至少95％同源性的序列。

24.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：8具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：18具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：11具有至少95％同源性的序列。

25.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：10具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：12具有至少95％同源性的序列。

26.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ ID NO：12具有至少95％同源性的序列。

27.如权利要求1-6中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链包含与SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列，所述核心链包含与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性的序列，且所述向导链包含与SEQ IDNO：12具有至少95％同源性的序列。

28.如权利要求18-27中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物，其中，所述传感器链，所述向导链和/或所述核心链还包括对RNA序列的一个或多个化学修饰，其中，所述一个或多个化学修饰选自锁核酸(LNA)修饰，肽核酸(PNA)修饰，2′-O-甲基修饰，吗啉代修饰，硫代磷酸酯修饰，末端修饰，或接头修饰。

29.一种药学组合物，包含：

一种权利要求1-28中任一项所述的条件性RNA-传感器复合物；以及

一种药学上可接受的载体或赋形剂。

30.一种治疗病理性病症的方法，包括向患有病理性病症的受试者施用治疗有效量的权利要求1-29中任一项的条件性RNA-传感器复合物或权利要求30的药学组合物。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述病理性病症是心肌梗塞(MI)，心肌肥大。

32.如权利要求31所述的方法，其中，施用治疗有效量包括在检测到MI后心肌内注射所述条件性RNA-传感器复合物或所述药学组合物。

33.一种条件性siRNA，包含一个核心链，一个传感器链，和一个siRNA向导链，其中，所述条件性siRNA可由促-肥大性(pro-hypertrophic)RNA序列激活，且其中，所述条件性siRNA以钙调磷酸酶或HDAC-2作为靶向。

34.一种药学组合物，包含权利要求33的条件性siRNA和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

35.一种治疗心肌肥大的方法，包括向患有心肌肥大的受试者施用治疗有效量的权利要求1的条件性siRNA或权利要求34的药学组合物。