CN111629753A - 免疫毒素、其制剂以及它们在药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活的治疗或预防性治疗方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。还提供了治疗具有慢性移植物抗宿主病(cGVHD)或处于发生该疾病的风险中的哺乳动物受试者的方法。还提供了有关的药物组合物。

Description

免疫毒素、其制剂以及它们在药物中的用途
发明领域
本发明涉及治疗领域，包括慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的预防疗法，抗病毒疗法，包括病毒再激活的预防和病毒再激活的控制，以及爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)感染向移植后淋巴增生性障碍(PTLD)的进展和进行性多灶性白质脑病(PML)的发展的预防（在免疫调节疗法例如免疫抑制的背景下）。提供了用于用在这样的疗法中的方法和手段，包括改进的药物组合物。
发明背景
免疫抑制用于治疗某些危及生命的免疫病症，例如与移植相关的排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、急性实体器官排斥和几种严重的自身免疫疾病。
EP 0945139 A1、EP 1 066 058 B1和US 2006/051355描述了一种免疫毒素混合物，其用于治疗同种异体造血干细胞移植(HSCT)以后的免疫相关疾病诸如GVHD。所述免疫毒素混合物包含抗-CD3抗体和抗-CD7抗体，它们各自缀合至蓖麻毒蛋白A，后者靶向成熟的T细胞和天然杀伤(NK)细胞，从而“重置”免疫系统。这些文件报道了一项初步临床研究，其中将免疫毒素混合物施用给患有急性GVHD (aGVHD)的人患者。
WO 98/55150描述了包含与一定量的美洲商陆抗病毒蛋白连接的单克隆抗体TXU-7的免疫毒素，其用于治疗T细胞白血病、淋巴瘤、急性髓性白血病和病毒感染，包括HIV感染。
US 2008/233128描述了用T-细胞耗竭抗体（诸如抗-CD3“OKT3”）治疗病毒感染。其中描述的研究是没有报告实际结果的研究设计。
van Oosterhout等人, Blood, 2000, 第95卷, 第12期, 第3693-3701页, 描述了使用抗-CD3和抗-CD7免疫毒素组合治疗急性GVHD的初步研究。
Keymeulen等人, Blood, 2010, 第115卷, 第6期, 第1145-1155页报道了用抗-CD3抗体(TRX4)治疗I型糖尿病患者与EBV的短暂再激活有关。
van Oosterhout等人, Int. J. Pharm, 2001, 第221卷, 第175-186页描述了抗-CD3和抗-CD7蓖麻毒蛋白A-免疫毒素的免疫毒素混合物的生产，其用于GVHD治疗的初步临床研究。
使用Campath (阿仑珠单抗)的抗体疗法已被用于例如B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的免疫疗法。Campath已被用于治疗对全身和局部类固醇具有抗性的急性肠GVHD(Schnitzler等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2008, 第15卷, 第8期, 第910-919页)。但是，Campath疗法的一种并发症是机会性感染（具体地，人巨细胞病毒(CMV)的再激活）的风险显著增加(Schnitzler等人，同上)。
使用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的抗体疗法已被用于器官移植中的急性排斥的免疫疗法和再生障碍性贫血的疗法。ATG还已经用于治疗GVHD (Bacigalupo等人,Blood, 2001,第98卷, 第10期, 第2942-2947页)。但是，报道了更高的致死性感染风险(Bacigalupo等 人，同上)。已经报道了用ATG的早期治疗会改善具有类固醇抗性aGVHD的患者的存活率(MacMillan等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2002, 第8卷, 第40-46页)。ABX-CBL（一种杂交瘤产生的针对CD147抗原的鼠IgM单克隆抗体）的2/3期多中心随机化临床试验，与用于类固醇抗性aGVHD的ATG相比，发现ABX-CBL在治疗急性类固醇抗性GVHD方面未显示出优于ATG的改善(MacMillan等人,Blood, 2007, 第109卷, 第6期, 第2657-2662页)。
尽管许多疗法已显示出对aGVHD的治疗前景，但迄今为止的研究已经报道了存活的患者在以后的时间点发展出慢性GVHD (cGVHD)的顽固性高发生率。例如，报道的在经aGVHD治疗的存活者中cGVHD的发生率是在44%-80%的范围内(参见：Furlong等人,Bone Marrow Transplant., 2009, 第44卷, 第11期, 第739-748页; Socié等人,Blood, 2017,第129卷, 第5期, 第643-649页; MacMillan等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2002, 第8卷, 第40-46页；和MacMillan等人,Blood, 2007, 第109卷,第6期, 第2657-2662页)。
移植后淋巴增生性障碍(PTLD)是给予由于器官移植后的治疗性免疫抑制而引起的B细胞增殖的名称。该疾病是潜在感染爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的B细胞淋巴细胞的不受控增殖。
先前已知的免疫毒素疗法已经报告了并发症，包括毛细血管渗漏综合征(CLS)。这可以限制可对其使用免疫毒素疗法的患者（例如，在治疗前至少具有一定血清白蛋白水平的患者）。希望提供一种基于免疫毒素的疗法，其使并发症（包括毛细血管渗漏综合征和/或与毛细血管渗漏综合征有关）最小化。
已经发现用于储存和递送组合免疫毒素的已知药物组合物在较长期稳定性方面表现出许多缺点，特别是在较高温度下。具体地，不溶性聚集体的出现可能影响这样的药物组合物的保存期限和/或需要长时间的冷藏。
因此，尽管抗-T-细胞免疫抑制在某些严重免疫障碍的治疗中显示出巨大的希望，但仍然存在未得到满足的对用于这样的免疫受损的患者中的病毒感染和/或病毒再激活的治疗选择（包括预防性治疗）的需求，以及未得到满足的对这样的治疗选择的需求：其降低在aGVHD治疗之后cGVHD的发生率和/或其最小化或避免迄今为止与免疫毒素疗法有关的并发症（诸如严重的毛细血管渗漏综合征）。其它未得到满足的需求包括提供用于治疗上述病症的药物的稳定性增加的制剂。本发明解决了这些和其它需求。
发明内容
广泛地，本发明涉及用于在正在进行免疫调节治疗、特别是针对T细胞的免疫抑制和/或炎性细胞因子抑制的受试者中治疗（包括预防性治疗）病毒感染或病毒再激活的方法和手段。本发明的发明人已经令人惊讶地发现，与用标准免疫抑制对照治疗的患者相比，用T-Guard(RTM)联合疗法（抗-CD3和抗-CD7免疫毒素的混合物）治疗的受试者，例如人移植后患者，表现出降低的病毒感染和/或病毒再激活(例如对于人巨细胞病毒(CMV)和/或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))的发生率。如本文中所述，这反映在T-Guard(RTM)治疗的患者中增加的存活率，特别是在机会性病毒感染尤其成问题时的治疗后早期阶段。在监测其病毒滴度的患者中，在T-Guard(RTM)治疗期间或以后(例如以后不久)观察到了病毒再激活的消退（即病毒滴度在高峰后恢复到较低水平）。
因此，在第一方面，本发明提供了一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活或者病毒感染或病毒再激活向PTLD或PML的进展的治疗或预防性治疗的方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。
本发明的第一方面还提供了特异性地识别CD3的第一抗体分子，并且该第一抗体分子与毒性部分连接，用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活或病毒感染或病毒再激活向PTLD或PML的进展的治疗或预防性治疗的方法中，其中所述第一抗体分子与特异性地识别CD7的第二抗体分子同时、分别或序贯施用，所述第二抗体分子连接至毒性部分。
本发明的第一方面还提供了特异性地识别CD7的抗体分子(“第二抗体分子”)，并且该抗体分子连接至毒性部分，用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活或病毒感染或病毒再激活向PTLD或PML的进展的治疗或预防性治疗的方法中，其中所述第二抗体分子用于与特异性地识别CD3的另一种抗体分子(“第一抗体分子”)同时、分别或序贯施用，所述第一抗体分子连接至毒性部分。
根据本发明的该方面，所述组合物可以以抗-CD3和抗-CD7抗体分子的混合物或混合液的形式提供，或者可以以部件试剂盒的形式提供，所述部件试剂盒包括包含抗-CD3抗体分子的第一组合物和包含抗-CD7抗体分子的第二组合物，其例如被包装或包含在单独的容器中。所述部件试剂盒可以用于在施用给受试者之前组合，或者可以用于同时、分别或序贯施用，其中第一和第二组合物各自施用给相同的受试者。
在某些情况下，所述第一和第二抗体分子以组合物（例如混合物或混合液）的形式提供，并通过施用一剂或多剂的所述组合物而施用给受试者。所述组合物可以例如是各自具有其各自毒性部分的第一和第二抗体分子的混合物，其中所述第一和第二抗体分子的摩尔比是在100:1至1:100的范围内，通常10:1至1:10，且在某些情况下2:1至1:2，诸如大约1:1。
在某些情况下，病毒感染或再激活的病毒可能不是HIV。在某些情况下，病毒感染或病毒再激活可能是疱疹病毒目（Herpesvirales）的病毒。具体地，病毒感染可以选自人巨细胞病毒(CMV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)。在某些情况下，病毒感染或病毒再激活可伴随多瘤病毒科（Polyomaviridae）的JC病毒(也被称作John Cunningham病毒)。
在某些情况下，免疫调节治疗是免疫抑制治疗。具体地，免疫调节治疗可以是针对T细胞的免疫抑制。在某些情况下，免疫调节治疗包括移植物抗宿主病(GvHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗。具体地，自身免疫疾病可以是具有异常T细胞活性作为组分的疾病。
在某些情况下，所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物。也就是说可以将一剂或多剂组合物(例如T-Guard(RTM))或用于同时、分别或序贯施用的它的组分抗体分子施用或用于施用给受试者以实现双重作用或双重目的。即，需要免疫抑制的T细胞介导的病症的治疗以及病毒感染或病毒再激活或向PTLD或PML的进展的治疗或预防性治疗。
在某些情况下，所述第一抗体分子和/或所述第二抗体分子是鼠抗体。
在某些情况下，所述第一抗体分子是选择性地结合人CD3的IgG2b同种型单克隆抗体。具体地，所述第一抗体分子可以是在EP 0945139 A1和Spits等人,Hybridoma,1983, 第2卷, 第423页(其整个内容明确地通过引用并入本文)中公开为“SPV-T3a”的抗体。
在某些情况下，所述第二抗体分子是IgG2a同种型单克隆抗体。具体地，所述第二抗体分子可以是在EP 0945139 A1和Tax等人, Monoclonal antibodies against humanthymocytes and T lymphocytes. Protides of the biological fluids, 第29届讨论会, 1981, Peeters H编, Pergamon Press, Oxford and New York, 1982, 和Tax等人, Clin. Exp. Immunol., 1984, 第55卷, 第427页(其整个内容明确地通过引用并入本文)中公开为“WT1”的抗体。
在某些情况下，所述第一抗体和所述第二抗体缀合至选自以下的毒性部分：蓖麻毒蛋白、去糖基化的蓖麻毒蛋白A (dgRTA)和未糖基化的重组蓖麻毒蛋白A。使用任意合适的缀合或接头化学，可以将所述抗体缀合至毒性部分，例如蓖麻毒蛋白A。具体地，所述缀合可以采用N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP; Pharmacia)或4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)。毒素(例如蓖麻毒蛋白A)与抗体分子的缀合比可以是在0.5:1至5:1的范围内。具体地，毒素(例如蓖麻毒蛋白A)与抗体分子的缀合比可以是在0.8:1至1.2:1的范围内。
抗体的制备以及与毒素（例如蓖麻毒蛋白A）的缀合可以如以下所述：EP 0945139A1 (参见第8页，其段落[0063]至[0065])，其整个内容明确地通过引用并入本文。本文特别考虑的是完全重组的免疫毒素（例如通过可切割的肽接头连接至重组核糖体抑制蛋白的Fab、scFv或SC mAb）。额外地或备选地，可以将所述第一和第二抗体分子作为单一双特异性的(抗-CD3/抗-CD7)抗体提供，从而提供双特异性的免疫毒素诸如抗-CD3/CD7-rRTA。
在某些情况下，将以下至少一种去免疫化：
所述第一抗体；
所述第二抗体；
所述第一抗体的毒性部分；和
所述第二抗体的毒性部分。
可以通过Epibase(RTM)或Epibase IV(RTM) (Lonza Group AG)或EpiMatrix T细胞表位作图系统(EpiVax, Inc.)进行去免疫化策略。
在某些情况下，已经确定该受试者具有EBV和/或CMV病毒感染或处于该病毒感染风险中。例如，在供体-接受者移植组合的情况下，其中供体具有或被怀疑具有EBV和/或CMV感染史，与其组合的是EBV/CMV阴性接受者。另一个例子是已经用抗-T细胞疗法“调理”的移植接受者。具体地，所述受试者可能表现出高于1000个病毒DNA拷贝/ ml血液的EBV和/或CMV病毒滴度。具体地，在免疫调节疗法的第一剂之前7天开始并在免疫调节疗法的最后一剂结束的时期期间的任何时点，受试者可能表现出升高的和/或正在升高的EBV和/或CMV病毒滴度。例如，受试者可能在免疫调节治疗的第一剂当天或者之前一天或多天呈现升高的EBV和/或CMV血浆病毒滴度。备选地或额外地，受试者可能表现出正在升高的EBV和/或CMV血浆病毒滴度(即与第一次测量相比在第二次或后续测量时更高的滴度)，从而指示病毒感染或再激活控制差。表现出升高的和/或正在升高的EBV和/或CMV病毒滴度的受试者，包括免疫受损的人患者，可能特别适合于用本发明的组合物诸如T-Guard(RTM)治疗。
在某些实施方案中，所述组合物提供了临床益处，如在施用本发明的第一方面的组合物后180天通过病毒滴度的降低（例如，小于1000个病毒DNA拷贝/ml血液的EBV和/或CMV病毒滴度）所评估的。
在某些情况下，所述组合物抑制和/或杀死CD3+和/或CD7+ T-细胞。
在某些情况下，相对于CD3+和/或CD7+ T-细胞，所述组合物赦免了CD8+ 抗病毒T-细胞。具体地，所述组合物可以靶向CD3+和CD7+ T-细胞，而相对赦免抗病毒T-细胞，诸如靶向CMV和/或EBV的CTL。
在某些情况下，所述组合物可以用于PTLD的治疗（包括预防性治疗）方法中。在某些情况下，所述组合物可以用于进行性多灶性白质脑病(PML)的治疗（包括预防性治疗）方法中。
PML是一种罕见的并且经常致命的病毒性疾病，其特征是脑白质在多个部位的进行性损伤或炎症。它由JC病毒引起，该病毒通常存在并保持在免疫系统控制下。JC病毒通常是无害的，除非免疫系统减弱的情况下。一般而言，PML在前几个月具有30-50％的死亡率，幸存者可能会遭受不同程度的神经障碍。PML几乎仅在具有严重免疫缺陷的患者中发生，最常见于具有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者中，但使用长期免疫抑制药物（包括化学疗法）的人也处于增加的PML风险中，例如具有移植物、霍奇金淋巴瘤、多发性硬化症、银屑病和其它自身免疫疾病的患者。
在某些情况下，监测受试者的病毒感染和/或再激活，例如关于CMV或EBV，作为治疗方法的一部分。也就是说，可以分析受试者，或更通常地，分析样品诸如从受试者获得的血液或血浆样品，以便测量病毒滴度或病毒感染、病毒增殖或病毒再激活的征象。备选地或额外地，可以监测受试者的病毒感染或再激活的间接征象，例如病毒感染的征状。这种监测可以在治疗之前、期间和/或之后进行。在特定情况下，可以在治疗过程中定期进行监测，例如每天或每周测定病毒滴度。在某些情况下，监测受试者的病毒感染和/或再激活包括在免疫调节治疗之前、期间和/或之后测量病毒滴度至少一次。在某些情况下，监测包括通过实时定量PCR测量血浆病毒滴度。
在某些情况下，正在或已经用预防性抗病毒药物治疗受试者。例如，受试者可能已经接受阿昔洛韦(RTM)的治疗过程。
在第二方面，本发明提供了一种治疗具有病毒感染或病毒再激活或者处于病毒感染或病毒再激活风险中的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
向需要所述治疗的受试者同时、分别或序贯施用治疗有效量的特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，
并且其中所述受试者正在进行免疫调节治疗。在某些情况下，所述第一和第二抗体分子以组合物(例如混合物或混合液)的形式提供，并通过施用一剂或多剂所述组合物而施用给受试者。所述组合物可以例如是各自具有它们各自的毒性部分的第一和第二抗体分子的混合物，其中所述第一和第二抗体分子的摩尔比是在100:1至1:100的范围内，通常10:1至1:10，且在某些情况下2:1至1:2，诸如大约1:1。
在某些实施方案中，所述治疗方法提供了临床益处，如在施用所述第一和第二抗体后180天通过病毒滴度的降低（例如，小于1000个病毒DNA拷贝/ml血液的EBV和/或CMV病毒滴度）所评估的。
本发明的第一方面的组合物、选择和其它特征同样适用于本发明的第二方面。
在第三方面，本发明提供了包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活的治疗或预防性治疗方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。所述第一和第二抗体可以作为组合物(例如混合物或混合液)提供，以通过施用一剂或多剂所述组合物而施用给受试者。备选地，所述第一和第二抗体可以以部件试剂盒的形式提供，所述部件试剂盒包括包含抗-CD3抗体分子的第一组合物和包含抗-CD7抗体分子的第二组合物，其例如被包装或包含在单独的容器中。所述部件试剂盒可以用于在施用给受试者之前组合，或者可以用于同时、分别或序贯施用，其中第一和第二组合物各自施用给相同的受试者。
本发明的第一方面的组合物、选择和其它特征同样适用于本发明的第三方面。
在第四方面，本发明提供了一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的治疗或预防性治疗方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。
在某些实施方案中，所述组合物可以用于用在cGVHD的预防性治疗中以提供临床益处，如通过在所述免疫调节治疗后180天cGVHD的发生率所测量的。
在某些实施方案中，所述免疫调节治疗包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)的治疗。例如，已经接受同种异体干细胞移植并且已经发展出aGVHD、特别是类固醇难治性aGVHD的患者可以用所述组合物例如T-Guard(RTM)治疗，以便为aGVHD提供治疗益处，并以降低的发展cGVHD的可能性的形式提供临床益处（例如，如在用所述组合物例如T-Guard(RTM)治疗后180天测量的）。
在某些实施方案中，所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物，因此所述组合物为了双重目的而施用。即，aGVHD的治疗和cGVHD的预防性治疗。
关于本发明的第四方面，所述第一和第二抗体分子可以如根据本发明的第一方面所定义。
在第五方面，本发明提供了一种治疗具有慢性移植物抗宿主病(cGVHD)或处于发生该疾病的风险中的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
向需要所述治疗的受试者同时、分别或序贯施用治疗有效量的特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，
并且其中所述受试者正在进行免疫调节治疗。在某些情况下，所述第一和第二抗体分子以组合物(例如混合物或混合液)的形式提供，并通过施用一剂或多剂所述组合物而施用给受试者。所述组合物可以例如是各自具有它们各自的毒性部分的第一和第二抗体分子的混合物，其中所述第一和第二抗体分子的摩尔比是在100:1至1:100的范围内，通常10:1至1:10，且在某些情况下2:1至1:2，诸如大约1:1。
本发明的第一方面的组合物、选择和其它特征同样适用于本发明的第五方面。
在某些实施方案中，所述免疫调节治疗包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)的治疗。例如，已经接受同种异体干细胞移植并且已经发展出aGVHD、特别是类固醇难治性aGVHD的患者可以用所述组合物例如T-Guard(RTM)治疗，以便为aGVHD提供治疗益处，并以降低的发展cGVHD的可能性的形式提供临床益处（例如，如在用所述组合物例如T-Guard(RTM)治疗后180天测量的）。
在某些实施方案中，所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物，因此所述组合物为了双重目的而施用。即，aGVHD的治疗和cGVHD的预防性治疗。
在第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含：
(i) 0.05-0.5 mg/mL、任选地0.2 mg/mL的单克隆抗体分子，其特异性地识别CD3并且其缀合至至少一种蓖麻毒蛋白毒素A (RTA)，和/或
0.05-0.5 mg/mL、任选地0.2 mg/mL的单克隆抗体分子，其特异性地识别CD7并且其缀合至至少一种RTA；
(ii) 5-20 mM、任选地10 mM的柠檬酸盐缓冲液；
(iii) 50-300 mM、任选地75-200 mM或125 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐；
(vi) 0.01-0.1%(w/v)、任选地0.05%(w/v)的聚山梨酯，
其中所述组合物是在水中并且具有在6-7.5范围内的pH，任选地6.5的pH。
在某些实施方案中，所述特异性地识别CD3的抗体分子是选择性地结合人CD3的鼠IgG2b同种型单克隆抗体。具体地，所述抗体可以是SPV-T3a。
在某些实施方案中，所述特异性地识别CD7的抗体分子是选择性地结合人CD7的鼠IgG2a同种型单克隆抗体。具体地，所述抗体可以是WT1。
在某些实施方案中，SPV-T3a和WT1都存在于所述组合物中。在某些情况下，每种抗体缀合至平均每个抗体分子1-2个RTA (例如去糖基化的RTA (dgRTA))分子。在某些情况下，所述缀合经由4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯交联剂进行。
在某些实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲液包含与柠檬酸形成盐的药学上可接受的碱，例如柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸钾、柠檬酸镁或柠檬酸铵。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲液包含柠檬酸钠。
在某些实施方案中，所述L-精氨酸盐是L-精氨酸.HCl。
在某些实施方案中，所述聚山梨酯是吐温(RTM) 20。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种选自以下的试剂：
120-160 mM麦芽糖；
100-150 mM、任选地125 mM海藻糖；
25-75 mM、任选地50 mM甘氨酸；和
80-120 mM、任选地100 mM甘露醇。
具体地，所述组合物可以包含130-150 mM、任选地140 mM麦芽糖一水合物。
在某些实施方案中，所述组合物包含：
(i) 0.2 mg/mL的SPV-T3a-dgRTA和0.2 mg/ml的WT1-dgRTA；
(ii) 10 mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液；
(iii) 125 mM L-精氨酸.HCl；
(iv) 0.05%(w/v)吐温(RTM) 20；
(v) 140 mM麦芽糖一水合物
其中所述组合物是在注射用水中且具有6.5的pH。
在某些实施方案中，所述组合物是无菌的。在某些实施方案中，所述组合物适合用于注射。
在第七方面，本发明提供了一种冻干的组合物，其是本发明的第六方面的组合物的冷冻干燥形式。所述冻干的组合物可以适于用于重构，例如，用水或水溶液重构，以形成本发明的第六方面的组合物。
在第八方面，本发明提供了本发明的第六或第七方面的药物组合物，其用于用在本发明的第二方面的治疗方法中和/或用于用在本发明的第五方面的治疗方法中。
在第九方面，本发明提供了本发明的第六或第七方面的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于用在本发明的第二方面的治疗方法中和/或用于用在本发明的第五方面的治疗方法中。
在第十方面，本发明提供了一种制品，其包含：
容器或壳体；
所述容器或壳体在其中具有本发明的第六或第七方面的组合物；和
标签或插页，其具有关于在本发明的第二方面的治疗方法中和/或在本发明的第五方面的治疗方法中使用所述组合物的说明书。在某些情况下，所述容器或壳体保持无菌性，例如，借助于密封件和/或气密性封闭。
在第十一方面，本发明提供了用于用在药物中的本发明的第六或第七方面的组合物。
在第十二方面，本发明提供了用于用在治疗哺乳动物受试者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的方法中的本发明的第六或第七方面的组合物。
在第十三方面，本发明提供了一种治疗哺乳动物受试者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本发明的第六或第七方面的组合物。
在第十四方面，本发明提供了本发明的第六或第七方面的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物受试者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤。
在第十五方面，本发明提供了一种制品，其包含：
容器或壳体；
所述容器或壳体在其中具有本发明的第六或第七方面的组合物；和
标签或插页，其具有关于在治疗哺乳动物受试者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的方法中使用所述组合物的说明书。在某些情况下，所述容器或壳体保持无菌性，例如，借助于密封件和/或气密性封闭。
在第十六方面，本发明提供了包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，所述组合物用于用在人患者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗方法中，其中所述患者具有小于30 g/L的血清白蛋白水平，如在施用所述组合物之前测量的。
在某些实施方案中，组合物所述患者具有在10 g/L至30 g/L之间、任选地在15 g/L至25 g/L之间的血清白蛋白水平。在某些实施方案中，所述组合物用于用在提供临床益处的方法中，如通过施用所述组合物后3级或更高的毛细血管渗漏综合征(CLS)的发生率所测量的。在某些实施方案中，所述第一和第二抗体分子如关于本发明的第一方面所定义。在某些实施方案中，所述组合物如关于本发明的第六方面所定义。
在第十七方面，本发明提供了一种治疗人患者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者同时、分别或序贯施用治疗有效量的特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，且其中所述患者具有小于30 g/L的血清白蛋白水平，如在施用所述组合物之前测量的。在某些实施方案中，所述患者具有在10 g/L至30 g/L之间、任选地在15 g/L至25 g/L之间的血清白蛋白水平。在某些实施方案中，所述方法提供临床益处，如通过所述施用后3级或更高的毛细血管渗漏综合征(CLS)的发生率所测量的。在某些实施方案中，所述第一和第二抗体分子如关于本发明的第一方面所定义。在某些实施方案中，所述组合物如关于本发明的第六方面所定义。
在第十八方面，本发明提供了包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物在药物制备中的用途，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，所述药物用于治疗人患者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤，其中所述患者具有小于30 g/L的血清白蛋白水平，如在施用所述组合物之前测量的。在某些实施方案中，所述患者具有在10 g/L至30 g/L之间、任选地在15 g/L至25 g/L之间的血清白蛋白水平。在某些实施方案中，所述药物用于提供临床益处，如通过所述施用后3级或更高的毛细血管渗漏综合征(CLS)的发生率所测量的。在某些实施方案中，所述第一和第二抗体分子如关于本发明的第一方面所定义。在某些实施方案中，所述组合物如关于本发明的第六方面所定义。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或声明明确地避免这样的组合时。在下面更详细地并且参考附随实施例和附图描述本发明的这些和其它方面和实施方案。
附图说明
图1显示了对照组(n=21) (条1和3)和T-Guard(RTM)治疗组(n=6) (条2和4)的第28天应答率(条1和2)和6个月总存活率(条3和4)，其表示为研究群体的百分比。T-Guard(RTM)治疗组的应答率和存活率均较高。
图2显示了用对照（机构护理标准）治疗的患者的存活率曲线（在y轴上的存活率相对于在x轴上的GvHD后按月计的时间绘制）。<6个月的初始阶段表现出与难治性GvHD和感染相关的存活率的迅速下降；>6个月的稍后阶段表现出与潜在疾病复发相关的存活率的更慢下降。
图3显示了用对照(机构护理标准) (n=20)和T-Guard(RTM) (n=6)治疗直到6个月的患者的两条存活率曲线（在y轴上的存活率相对于在x轴上的GvHD后按月计的时间绘制）。T-Guard(RTM)治疗的患者表现出高于对照组的存活率。
图4显示了用T-Guard(RTM)治疗的患者的EBV (圆圈)和CMV(三角形)滴度相对于在治疗开始以后按天计的时间绘制的图（如箭头所示，以48小时间隔进行四次输注）。显然，在T-Guard(RTM)治疗和随后的冲洗后，已达到250000 DNA拷贝/ml的测量水平的EBV滴度在随后的几天中显示出显著下降。
图5显示了用T-Guard(RTM)治疗的患者(与在图4中治疗的患者不同的患者)的EBV(圆圈)和CMV(三角形)滴度相对于在治疗开始以后按天计的时间绘制的图（如箭头所示，以48小时间隔进行四次输注）。显然，在T-Guard(RTM)治疗后，CMV滴度下降。此外，在T-Guard(RTM)治疗和随后的冲洗后，在治疗开始后14天，看到EBV滴度的显著下降。
图6显示了从用T-Guard(RTM)治疗的患者获得的FACS细胞分选结果的来自一名患者的例子。左侧小图显示了相对于CD8 FITC绘制的CD3 cy7。右侧小图显示了相对于CMVAPC绘制的CMV PE。用四聚体对患者02-02的循环T细胞的分析揭示了在治疗开始后3周内在CD8阳性T细胞级分中的大分数(17.38%)的CMV-反应性细胞。
图7显示了用T-Guard(RTM)治疗的患者和用历史对照治疗的患者在第28天的总临床应答(ORR)和在6个月的总存活率(OS)。T-Guard(RTM)治疗结果(n=20)显示在条2和4中；历史对照(n=42; Nijmegen, NL (n=21): 伊诺莫单抗(inolimomab)/依那西普; Münster,DE (n=21): 英夫利昔单抗(infliximab))显示在条1和3中。CR = 完全应答（条1和2的较深色阴影中的下部条部分）。PR = 部分应答（较浅色阴影中的上部条部分）。y轴显示了研究群体的百分比。T-Guard(RTM)治疗的患者中的CR和OS高于历史对照。
图8显示了用T-Guard(RTM)（n=20；橙色；从约1个月开始的上部曲线）和历史对照（n=42；灰色；从约1个月开始的下部曲线）治疗的患者的总存活率(OS)的Kaplan Meijer曲线。y轴是OS（％）；x轴是第二线治疗后随访的时间（月）。T-Guard(RTM)治疗组的六个月OS为60％，而历史对照为29％。Cox回归分析得出P = 0.02。
图9显示了制备和纯化抗体-毒素缀合物以获得药学上可接受的产品组合物的逐步过程的流程图描述(“过程A”)。在pH 7.5的25 mM磷酸盐缓冲液中进行在中心水平线上方的缀合和纯化步骤；在pH 6.5的10 mM柠檬酸盐缓冲液中进行在水平线下方的步骤。
图10显示了制备和纯化抗体-毒素缀合物以获得药学上可接受的产品组合物的备选逐步过程的流程图描述(“过程B”)。与过程A的差别在于，向10 mM柠檬酸盐缓冲液的变换发生在上部水平线所示的点的更上游。在pH 6.5的10 mM柠檬酸盐缓冲液中进行该上部水平线以下的步骤。
图11显示了，T-Guard(RTM)治疗诱导具有多种T细胞库的快速免疫重建。(A)显示了21名患者在T-Guard(RTM)疗法之前（筛选）和以后1个月(M1)、3个月(M3)和6个月(M6)通过独特CDR3序列的总数测量的独特T-细胞克隆的数目(Wilcoxon配对符号秩检验)。在T-Guard(RTM)疗法后的前6个月内存在独特T细胞克隆的显著增加，突出了在T细胞内的多样扩增。在T-Guard(RTM)疗法之前(C)、疗法之后1个月(D)、3个月(E)和6个月(F)，单个患者的血液T细胞库。
图12显示了描绘本发明的免疫毒素组合的可能作用机理模式的图示，如通过T-Guard(RTM)施用所举例说明的。据信涉及毒素诱导的细胞凋亡(抗-CD3和抗-CD7指导)和同种异体激活的抑制。
图13：与历史对照相比，在用CD3/CD7-IT治疗后第28天的应答率（上）和6个月的总存活率（下）的概述。接受CD3/CD7-IT和历史对照的患者之间的差异是统计上显著的，具有完全缓解率(p=0.012)和6个月存活率(p= 0.021)两方面的改善。
图14：CD3/CD7-IT诱导了具有多种T细胞库的快速免疫重建。(A-C)所有患者的中位T-细胞计数(A)、中位NK- 细胞计数(B)和中位B-细胞计数(C)的时程。在每个图中，蓝线代表中位值，下部灰色虚线和上部灰色虚线分别代表第25个和第75个百分位。(D)在施用CD3/CD7-IT之前(Pre)以及治疗后1、3和6个月，独特T-细胞克隆的绝对数目的概要。使用独特CDR3序列的总数来测量独特T-细胞克隆的数目。p-值基于Wilcoxon配对符号秩检验。在CD3/CD7-IT治疗后6个月独特T-细胞克隆的显著增加反映了扩增的T细胞的多样性的增加。(E-H)显示在治疗前(E)和CD3/CD7-IT治疗后1 (F)、3 (G)和6 (H)个月在单个患者中的T细胞库的代表性直方图。
图15 CD3/CD7-IT不影响抗病毒EBV-和CMV-相关的T细胞克隆的分数。
(A&C)在治疗后检测为病毒感染阳性的患者中的抗-EBV (A)和抗-CMV (C) T-细胞的绝对数目的概要。在每个患者组中，在治疗之前和之后测量与病毒相关的T细胞的数目。
(B&D)显示了独特抗-EBV (B)和抗-CMV (D) T-细胞克隆的差异丰度分析的图。显示了两名在治疗前测试为各自病毒感染阳性的患者的代表性图。将筛选样品与用CD3/CD7-IT治疗后1个月和3个月采集的样品进行对比。这种逐对对比证实，大多数相应的CMV-和EBV-相关的克隆均未由于治疗而扩增或收缩。在每个图中，灰色对角实线指示两个样品中相等的克隆数目（无变化）。位于灰色虚线和相应X轴或Y轴之间的克隆在其它样品中不存在，例如在治疗前存在，但在治疗后不存在。
具体实施方式
在描述本发明时，将采用以下术语，并且意图其如下所示定义。
抗体分子
如本文参考本发明的所有方面所使用的，术语“抗体”或“抗体分子”包括任何免疫球蛋白，无论是天然的还是部分地或完全地合成产生的。术语“抗体”或“抗体分子”包括单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(包括多克隆抗血清)。抗体可以是完整的或衍生自完整抗体的片段（参见下文）。抗体可以是人抗体、人源化抗体或非人源抗体。“单克隆抗体”是针对靶分子的单个抗原性位点或“决定簇”的均质的、高特异性的抗体群体。“多克隆抗体”包括针对靶分子的不同抗原决定簇的异质抗体群体。术语“抗血清(“antiserum”或"antisera")”表示含有从经免疫动物获得的抗体的血清。
已经表明，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。因此，本文对抗体的提及以及对本发明的方法、阵列和试剂盒的提及涵盖了完整抗体，还涵盖了包含抗体结合片段的任何多肽或蛋白质。结合片段的例子是（i）由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；（ii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iii）由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；（iv）由VH结构域组成的dAb片段；（v）分离的CDR区域；（vi）F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；（vii）单链Fv分子（scFv），其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该肽接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点；（viii）双特异性的单链Fv二聚体（WO 93/11161）和（ix）“双体(diabody)”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段（WO94/13804; 58）。通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键，可以稳定Fv、scFv或双体分子。也可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微体(minibody)。
本文中使用的抗体分子和免疫毒素意图分别包括重组抗体和重组免疫毒素（例如，通过可切割的肽接头连接至重组核糖体抑制蛋白的Fab、scFv或SC mAb）。额外地或备选地，所述第一和第二抗体分子可以作为单个双特异性(抗-CD3/抗-CD7)抗体提供，从而提供双特异性的免疫毒素诸如抗-CD3/CD7-rRTA。
关于抗体分子，术语“选择性地结合”在本文中可用于表示这样的情况，其中特异性结合对的一个成员将不表现出与除其特异性结合配偶体外的分子的任何显著结合。在例如抗原结合位点对由许多抗原携带的特定表位具有特异性的情况下该术语也适用，在这种情况下，携带抗原结合位点的特异性结合成员将能够结合携带所述表位的各种抗原。
在某些情况下，选择性地结合CD3的抗体可以包含抗体SPV-T3a的互补性决定区(CDR)。根据IMGT编号系统(Lefranc, M.-P. 等人,Nucleic Acids Research, 1999, 第27卷, 第209-212页, 通过引用并入本文)，SPV-T3a的CDR是：CDRH1-H3: SEQ ID NO: 5-7;CDRL1-L3: SEQ ID NO: 8-10。在某些情况下，选择性地结合CD3的抗体可以包含SPV-T3a的VH (SEQ ID NO: 3)和/或SPV-T3a的VL (SEQ ID NO: 4)。在某些实施方案中，选择性地结合CD3的抗体可以是具有SEQ ID NO: 1的重链和SEQ ID NO: 2的轻链的SPV-T3a抗体。
在某些情况下，选择性地结合CD7的抗体可以包含抗体WT1的互补性决定区(CDR)。根据IMGT编号系统(Lefranc, M.-P. 等人,Nucleic Acids Research, 1999, 第27卷, 第209-212页, 通过引用并入本文)，WT1的CDR是: CDRH1-H3: SEQ ID NO: 15-17; CDRL1-L3: SEQ ID NO: 18-20。在某些情况下，选择性地结合CD7的抗体可以包含WT1的VH(SEQ IDNO: 13)和/或WT1的VL (SEQ ID NO: 14)。在某些实施方案中，选择性地结合CD7的抗体可以是具有SEQ ID NO: 11的重链和SEQ ID NO: 12的轻链的WT1抗体。
SPV-T3a
SPV-T3a是选择性地结合人CD3的鼠IgG2b单克隆抗体，所述人CD3是由1个CD3γ链(UniProt: P09693)、1个CD3δ链(UniProt: P04234)和2个CD3ε链(UniProt: P07766)组成的T细胞表面糖蛋白。SPV-T3a的产生和表征描述于Spits等人,Hybridoma,1983, 第2卷,第423-437页，其整个内容明确地通过引用并入本文。如本文所述，使用4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α- 甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(“SMPT”)交联剂，SVP-T3a抗体可以缀合至蓖麻毒蛋白毒素A (RTA)，例如去糖基化的蓖麻毒蛋白毒素A。据信与每个SPV-T3a抗体缀合的去糖基化的蓖麻毒蛋白毒素A分子的平均数目是大约1.5。该抗体缀合物在本文中可以称为SPV-T3a-RTA。可以通过图9所示的过程或图10所示的过程进行缀合和纯化。
通过从杂交瘤细胞沉淀物提取mRNA，进行RT-PCR并在ABI3130x1 GeneticAnalyzer上进行DNA测序，来确定SPV-T3a轻链和重链的氨基酸序列。预测了氨基酸序列，并通过质谱分析得到了证实。根据IMGT编号系统(Lefranc, M.-P. 等人,Nucleic Acids Research, 1999, 第27卷, 第209-212页, 通过引用并入本文)确定互补性决定区(CDR)。
SPV-T3a重链和轻链的氨基酸序列分别如下所示。
SPV-T3a重链：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
VH结构域标有下划线；CDRH1-H3以粗体显示并具有下划波浪线。
SPV-T3a轻链：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
VL结构域标有下划线；CDRL1-L3以粗体显示并具有下划波浪线。
SPV-T3a-VH：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
SPV-T3a-VL：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
SPV-T3a-CDRH1：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
SPV-T3a-CDRH2：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
SPV-T3a-CDRH3：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
SPV-T3a-CDRL1：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
SPV-T3a-CDRL2：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
SPV-T3a-CDRL3：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
。
WT1
WT1是选择性地结合人CD7 (UniProt: P09564)的鼠IgG2a单克隆抗体，所述人CD7是作为免疫球蛋白超家族的一个成员的跨膜蛋白，并在胸腺细胞和成熟的T细胞上发现。WT1的产生和表征描述在Tax等人,Hamatol Bluttransfus, 1983, 第28卷, 第139-141页和Tax等人,Clin Exp Immunol, 1984, 第55卷, 第427-436页，它们二者的内容明确地通过引用并入本文。如本文中所述，使用SMPT交联剂，WT1抗体可以缀合至蓖麻毒蛋白毒素A (RTA)，例如去糖基化的蓖麻毒蛋白毒素A。据信与每个WT1抗体缀合的去糖基化的蓖麻毒蛋白毒素A分子的平均数目是大约1.5。该抗体缀合物在本文中可以称为WT1-RTA。可以通过图9所示的过程或图10所示的过程进行缀合和纯化。WT1是商购可得的。例如，抗-CD7抗体(克隆WT1)由LifeSpan BioSciences, Inc. 在目录号: LS-C122885-1000 (1000µl在PBS, 0.1%叠氮化钠中)下销售用于研究用途，例如，免疫荧光和免疫组织化学。
通过从杂交瘤细胞沉淀物提取mRNA，进行RT-PCR并在ABI3130x1 GeneticAnalyzer上进行DNA测序，来确定WT1轻链和重链的氨基酸序列。预测了氨基酸序列，并通过质谱分析得到了证实。根据IMGT编号系统(Lefranc, M.-P. 等人,Nucleic Acids Research, 1999, 第27卷, 第209-212页, 通过引用并入本文)确定互补性决定区(CDR)。
WT1重链和轻链的氨基酸序列分别如下所示。
WT1重链：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
VH结构域标有下划线；CDRH1-H3以粗体显示并具有下划波浪线。
WT1轻链：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
VL结构域标有下划线；CDRL1-L3以粗体显示并具有下划波浪线。
WT1-VH：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
WT1-VL：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
WT1-CDRH1：
Figure DEST_PATH_IMAGE030
WT1-CDRH2：
Figure DEST_PATH_IMAGE032
WT1-CDRH3：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
WT1-CDRL1：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
WT1-CDRL2：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
WT1-CDRL3：
Figure DEST_PATH_IMAGE040
。
移植物抗宿主病(GVHD) - 急性和慢性
GVHD是在从遗传上不同的人接收移植组织后产生的医学并发症。GVHD通常与干细胞移植（骨髓移植）相关，但该术语也适用于其它形式的组织移植。捐赠组织（移植物）中的免疫细胞将接受者（宿主）识别为外源（非自身）。移植的免疫细胞然后攻击宿主的身体细胞。传统上，在移植后前100天内发生的GVHD被武断地分类为急性，而在较晚阶段仍存在或发展的GVHD被称为慢性GVHD。目前的观点是，慢性GVHD不仅仅是急性GVHD的延续(Toubai等人2008, Flowers等人 2011)。尽管在急性和慢性GVHD牵涉的器官之间存在明显的重叠，在慢性GVHD中受影响的器官的分布是宽得多的，也包括眼、肺、唾液腺和食管。基于组织学征象，急性GVHD以细胞凋亡和坏死为主，而慢性GVHD则代表炎症性和纤维化过程，类似于在某些自身免疫障碍中所见(Higman等人 2004, Filipovich等人 2005)。尽管急性GVHD与随后的慢性GVDH高度相关，但大约20-30%的具有急性GVHD的人在以后不会发展慢性GVHD。此外，25-35%的慢性GVHD是‘重新的’，没有任何先前的急性表现（Lee 2005）。
本文中使用的“提供临床益处，如通过3级或更高的毛细血管渗漏综合征（CLS）的发生率来测量的”是指避免在施用本发明的组合物的患者中发生3级或更高的毛细血管渗漏综合征或血管渗漏综合征(VLS)，例如如在施用所述组合物以后1-100天之间（例如1-10天之间）所评估的。CLS/VLS分级可以按照Sausville等人,Blood, 1995, 第85卷, 第12期,第3457-3465页的定义，其内容明确地通过引用并入本文。具体地，使用了NCI CommonToxicity标准。血管渗漏具体如下分级：I级，最小踝关节压凹性水肿；2级，踝关节压凹性水肿和重量增加，但是总重量增加小于10磅；3级，外周性水肿，伴有大于10磅的重量增加或胸腔积液，无肺功能缺陷记录；4级，全身性水肿、胸腔积液或腹水，伴有肺功能缺陷或肺水肿；和5级，在肺水肿的情况下需要机械通气的呼吸衰竭，或需要加压支持的低血压。
药物组合物及其施用
本发明的组合物可以配制为药物组合物，其可呈固体或液体组合物的形式。这样的组合物通常将包含某种载体，例如固体载体或液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液或二醇类诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。这样的组合物和制剂通常包含至少0.1重量%的化合物。
对于静脉内、皮肤或皮下注射或在患处的注射，活性成分可以呈胃肠外可接受的水溶液或液体的形式，其不含热原并且具有合适的pH、张度和稳定性。本领域相关技术人员非常能够使用例如化合物或其衍生物的溶液制备合适的溶液，例如在生理盐水、用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散体中。
除了一种或多种化合物(任选地与其它活性成分组合)外，所述组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、张度调节剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员众所周知的其它材料。这样的材料应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其它材料的精确性质可以取决于施用途径，例如，静脉内注射。
优选地，将药物组合物以预防有效量或治疗有效量（视情况而定，尽管预防可以视作治疗）施用给个体，这足以显示出对个体的益处。通常，这将造成治疗上有用的活性，从而给个体提供益处。所施用的化合物的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的病症的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量的决定等，在一般从业人员和其他医生的责任内，并且通常考虑要治疗的疾病、个别患者的状况、递送部位、施用方法和从业人员已知的其它因素。上面提到的技术和协议的例子可以参见：Handbook of Pharmaceutical Additives,第2版(M. Ash和I. Ash编), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott,New York, USA); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000,Lippincott, Williams & Wilkins出版；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,第2版, 1994。作为例子，优选地以约0.01至100 mg活性化合物/千克体重之间和更优选地约0.5至10mg/kg体重之间的剂量将组合物施用给患者。
在特定情况下，本发明的药物组合物可以以大约4 mg/m2体表面积（BSA）的剂量施用或用于施用。本发明的药物组合物可以有利地作为多次输注施用或用于施用，例如以48小时间隔给予的四次4小时输注。
以下作为示例给出，并且不应解释为对权利要求范围的限制。
实施例
实施例1–在用T-Guard(RTM)免疫毒素混合物治疗以后移植物抗宿主病患者的延长存 活.
研究产品是名为T-Guard(RTM)的免疫毒素组合，其由等量（w/w）的两种鼠抗体(mAb)SVP-T3a (抗-CD3, IgG2b)和WT1 (抗-CD7, IgG2a)组成，每种鼠抗体缀合至重组蓖麻毒蛋白毒素A-链(RTA): SPV-T3a-RTA和WT1-RTA。将T-Guard作为以48小时间隔给予的四次4-小时输注静脉内地施用给人GvHD患者。每个剂量由4 mg/m2体表面积(BSA)组成。通常，估计的BSA将位于1.4至2.5 m2 (小人至大人)之间某处。如果患者的BSA超过2.5 m2，则剂量计算应使用2.5 m2。
在要用T-Guard(RTM)治疗的组中的7名GvHD患者中，在即将开始T-Guard(RTM)治疗之前，一名为CMV阳性，一名为EBV阳性。开始T-Guard(RTM)治疗后，没有看到新的EBV或CMV再激活。在用由伊诺莫单抗(商品名Leucotac, 抗-CD25)和依那西普(商品名Enbrel,抗-TNF)的组合组成的机构护理标准(SoC)治疗的21名患者中，2名患者发生了可能的侵袭性霉菌病，2名患者发生了CMV感染（一名进展为CMV结肠炎），2名患者发生了腺病毒感染，3名患者发生了EBV感染。如在图1中所示，与对照相比，T-Guard(RTM)治疗组的第28天应答率和6个月存活率均更好。图2显示了使用机构SoC治疗的患者的存活率曲线。显著的早期死亡率阶段（<6个月）是明显的。此早期死亡率阶段与难治性GvHD以及病毒感染或再激活有关(也参见van Groningen等人,Biol. Blood Marrow Transplant, 2016, 第22卷, 第170-182页)。图3显示了直至6个月时间点的T-Guard(RTM)治疗的患者相对于机构SoC的存活率曲线。显然，在T-Guard(RTM)治疗的患者中累积存活率更高。
实施例2–在用T-Guard(RTM)免疫毒素混合物治疗的移植物抗宿主病患者中病毒 再激活的自发消退.
进行了另一个研究，其中用T-Guard(RTM)（与上面实施例1中所述相同的剂量和间隔）治疗表现出阳性病毒滴度的GvHD患者，并随时间监测CMV和EBV病毒滴度。
通过实时定量PCR测量CMV滴度，基本上如在Kalpoe等人,J. Clin. Microbiol.,2004, 第42卷, 第4期, 第1498-1504页中所述，其整个内容明确地通过引用并入本文。
通过实时定量PCR测量EBV滴度，基本上如在Niesters等人,J. Clin. Microbiol., 2000, 第38卷, 第712-715页中所述，其整个内容明确地通过引用并入本文。
尽管用阿昔洛韦(RTM)预防，但两名GvHD患者在筛查时仍显示出阳性病毒滴度。第一名患者为EBV阳性，第二名患者为EBV和CMV阳性。特别是第一名患者在T-Guard(RTM)治疗开始后的第一周显示EBV滴度的大幅增加，总计250000 DNA拷贝/ml (参见图4)。令人惊奇地，EBV滴度随后在接下来的两周内消退，而无需以利妥昔单抗或治疗性CTL的形式进一步干预。尽管滴度较低，但在第二名患者中看到EBV和CMV的相似应答(参见图5)。
对第二名患者的第21天血液样品的四聚体分析表明，他的CD8阳性细胞包括17％的CMV定向的T-细胞(参见图6)。不希望受任何特定理论约束，本发明的发明人相信，被T-Guard(RTM)治疗相对赦免的抗-CMV T-细胞能够使患者的CMV滴度保持低。进一步预期将用HLA匹配的EBV四聚体进行染色。治疗开始后第二周EBV再激活的消退明显表明，也必须存在EBV定向的T-细胞(参见图5)。
本实施例证实了患者在接受T-Guard(RTM)治疗后2-3周内从类固醇抗性急性GvHD恢复并成功战胜了(既存)感染。这些患者都是“稳定的”GvHD应答者的事实表明，与抗病毒T细胞相比，T-Guard(RTM)优先消除同种异体反应性的T-细胞。目前认为，观察到的是抗病毒细胞的相对赦免，所述细胞然后可能会在T-Guard(RTM)被冲洗掉以后（在最后一次输注后1-2天内）通过淋巴细胞减少诱导的稳态增殖而扩增。这个结论的进一步支持来自图11中所示的扩增T细胞库。
实施例3 – 关于用于治疗类固醇难治性急性GVHD的抗-CD3/CD7免疫毒素组合(T- Guard(RTM))的I/II期研究
背景
迫切需要针对类固醇难治性急性移植物抗宿主病(SR-aGVHD)的更有效疗法。由于血液学恶性肿瘤的感染和复发会导致总存活率(OS)差，因此在获得缓解后限制免疫抑制的持续时间的疗法可能是优选的。免疫毒素(IT)组合(T-Guard(RTM))由两种靶向活化的T淋巴细胞上的CD3和CD7的抗体-药物缀合物(即蓖麻毒蛋白A)组成，并且已经显示出作为SR-aGVHD的三线疗法的功效，同时允许快速免疫重建。因此，T-Guard(RTM)是根据本发明的各个方面的组合物。
目的
我们针对T-Guard(RTM)用于治疗SR-aGVHD的安全性和有效性进行了一项前瞻性I/II期多中心试验(NCT02027805)。
方法
患有II-IV级SR-aGVHD的成年患者有资格被纳入。排除标准由以下组成：不受控感染的存在、慢性GVHD的征象、严重肾病损和严重低白蛋白血症。T-Guard(RTM)作为每48小时的4-小时静脉内输注来施用，共4剂各4 mg/m2。主要功效终点定义为在第28天的总临床应答(ORR)。主要次要终点是6个月OS以及安全性和耐受性。
结果
在2014年6月至2016年9月之间，计划中的20名成年患者被纳入了两个欧洲中心。中位年龄为53岁（范围18-74）的11名女性和9名男性患者都已经接受了同种异体干细胞移植来治疗髓样和淋巴样恶性肿瘤。除了两个人以外的所有人都完成了计划的8天T-Guard(RTM)治疗。SR-aGVHD在3名患者（15％）中为II级，在11名患者（55％）中为III级，在7名患者（35％）中为IV级。在大多数患者中累及2个器官(16/20, 80%)，其中胃肠道（GI）和肝脏受累分别为18例和5例。基线白蛋白水平为中值23克/L（范围：16-34；N 35-50克/L），并基于2-生物标志物模型(ST2和REG3α)，没有患者被归类为低危(< 0.08)，50％被归类为高危(≥0.32)。在WO 2013/066369中进一步描述了2-生物标志物模型，其整个内容明确地通过引用并入本文。
在第28天，12名患者已经达到了临床应答(ORR: 12/20, 60%)，其中10名（50％）获得了完全缓解（CR），图7。在那些具有高危生物标志物特征的患者中，在50％中达到了CR。至少随访6个月，12名患者活着(6个月OS 60%), 图7。其他8名患者的死因是难治性aGVHD (N=4)、难治性GVHD和感染(N=3)和假膜性结肠炎(N=1)。在那些接受计划治疗的患者中，ORR、CR率和6个月OS分别为60%、50%和60%。与接受英夫利昔单抗(N=21)或伊诺莫单抗/依那西普(N=21)的历史对照有利地比较的结果是：ORR为52％，6个月OS为29%(图7和8)。
没有记录到明显的输注反应，尽管两名患者在其第一次输注时经历寒战，并且在输注前引入氯马斯汀以后没有看到输注反应。如预期的，总感染和不利事件的比率高。但是，存在有限数目的发生在超过一名患者中的潜在可归因的不利事件，其由以下组成：低白蛋白血症、微血管病和血小板减少症。毛细血管渗漏综合征发生于仅一名患者中，伴有需要利尿剂治疗的水肿（2级）。分别在3名患者中记录了早期(< 3个月) EBV和CMV感染，但未发生CMV疾病或PTLD。虽然仅40％接受了霉菌活性抗真菌预防，但未见到侵袭性真菌病（IFD）。与其它RTA免疫毒素相比，观察到的副作用的低数目和轻严重程度被认为是不寻常的。这表明该剂量能够在使副作用最小化的同时产生治疗效果。
虽然一周的疗程与T细胞和NK细胞的立即耗竭有关，但T-Guard(RTM) IT-组合的短半衰期（约9小时）允许伴有多样T细胞受体库的快速免疫重建，并对抗病毒的EBV和CMV-特异性克隆的分数没有负面影响，如通过深度测序所评估的。与治疗后的第一个月相比，在6个月内存在独特T细胞克隆的显著增加(p=0.03) (参见图11)。
特别值得注意的是，在该1/2期研究中，在T-Guard(RTM)治疗后6个月(180天)，12名患者中的仅1名被诊断出cGVHD征状；这意味着180天的cGVHD发生率仅为8.3％。而且，该cGVHD事件被评估为仅“有限的”(参见表1)。
表1: 慢性GVHD事件
Figure DEST_PATH_IMAGE042
* 在招募前报告了cGVHD的征象和征状(嘴和皮肤).
** 患者已确认在医疗史中报告的cGVHD。
CR=完全应答者; PR=部分应答者; A=存活; D=死亡。
在6个月(180天)时存活者的cGVHD率仅为8.3％，而不是文献报道的典型> 40％发生率。具体地，以前已经报告了以下cGVHD：
Furlong等人,Bone Marrow Transplant., 2009, 第44卷, 第11期, 第739-748页:在100天后MMF为73.3%（仅存活者）。
Socié等人,Blood, 2017, 第129卷, 第5期, 第643-649页: 在1年后伊诺莫单抗为75.4%且ATG为80.2%(仅存活者)；所有事件被评估为严重的。
MacMillan等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2002, 第8卷, 第40-46页: 在1年后ATG为50.6%(仅存活者)。
MacMillan等人,Blood, 2007, 第109卷, 第6期, 第2657-2662页: 相对于开始治疗的患者，ABX-CBL为44%，且ATG为46%。
结论
用短期T-Guard(RTM)治疗SR-aGVHD被证实是安全的且耐受良好的，并导致高CR率和60％的有前途的6个月OS，特别是考虑到高危背景（90％的GI受累，50％的高危生物标志物特征）。
此外，研究结果令人惊讶地表明，根据本发明的各个方面的组合物T-Guard(RTM)能够预防性地治疗cGVHD，如通过针对SR-aGVHD的二线治疗(即T-Guard(RTM)施用)后180天cGVHD的发生率所评估的。因此，这些结果指示，在进行aGVHD（包括SR-aGVHD）的免疫调节治疗的患者组中，T-Guard(RTM)可能在cGVHD的预防性治疗中具有第二应用。
严重RTA相关毒性的缺乏
与基于RTA的免疫毒素的治疗用途相关的主要安全担忧之一是毛细血管渗漏综合征(CLS)，其次是伴有CK水平升高的肌痛(Vitetta等人 1991, Amlot等人 1993, Conry等人1995, Sausville等人 1995, Stone等人 1996, Engert等人 1997, Frankel等人 1997,Schnell等人 1998, Messmann等人 2000, Schnell等人 2000, Schindler等人 2001,Schnell等人 2002, Schnell等人 2003, Schindler等人 2011)。Vitetta教授的研究组对于可比较免疫毒素描述了等于或高于1µg/ml (约0.5 x 10-8 M)的血清浓度通常与严重的RTA相关副作用的发生有关，所述副作用主要由CLS组成(Amlot等人 1993, Sausville等人1995, Stone等人 1996)。此外，基于在五项临床试验中患者的回顾性分析，Schindler等人得出的结论是，先前的放射疗法会加剧基于RTA的免疫毒素的毒性(Schindler等人 2001)。Stone等人, 2001和Sausville等人 1995报道称，免疫毒素Cmax与CLS/VLS严重程度正相关(参见，例如，Sausville等人, 1995的图2)。
令人感兴趣的是，如本文中所述，T-Guard(RTM)治疗迄今未在任何接受治疗的患者中诱发任何严重的CLS或肌痛。既没有在1/2期试验中，也没有在研究人员发起的剂量递增研究中，而所有各位患者均已接受先前的化学和放射治疗，并且所有患者的Cmax值均达到或超过1µg/ml。尽管2期研究中的八名患者被诊断出具有一些有限的与CLS有关的征状，这些患者中的7名根本不需要治疗（轻度CLS；1级），且仅1名用利尿剂治疗水肿（中度CLS；2级）。迄今为止，在任何用T-Guard(RTM)治疗的32名患者（包括研究人员发起的剂量递增研究和“指定的患者”）中尚未报道严重的CLS病例。在1/2期研究中也没有观察到CK升高或治疗有关的肌痛（在研究人员发起的剂量递增研究中，仅1名患者表现出血浆CK水平的1级增加）。
不希望受任何特定理论约束，本发明的发明人假定，T-Guard(RTM)的有利安全性特征的原因可能是RTA毒素在SPV-T3a和WT1上的分配（各半剂量），由于等电点的差异，所述mAb可能具有不同的全身分布特征（并由此造成非特异性毒性的稀释）。与SPV-T3a-RTA和WT1-RTA对T细胞的假定协同消除以及SPV-T3a通过抑制同种异体激活而提供的累加免疫抑制一起，这可能解释了T-Guard(RTM)的迄今为止观察到的有前途的治疗窗。
相比之下，地尼白介素2 (Ontak(RTM))在皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)中的应用具有以下标签警告：“延迟Ontak的施用直到血清白蛋白水平为至少3.0 g/dL”(参见2008年10月修订的ONTAK(RTM)美国标签)。据报道，在32.5%(76/234)的Ontak(RTM)治疗的患者中发生了毛细血管渗漏综合征。标签警告：“对于小于3.0 g/dL的血清白蛋白水平，停止Ontak”。此外，Olsen等人,J. Clin. Oncol., 2001, 第19卷, 第2期, 第376-388页描述了地尼白介素2 (denileukin difitox)用于治疗CTCL的III期试验，将CLS（或他们所说的血管渗漏综合征“VLS”）定义为“以下至少两种同时发生，无论严重程度如何：水肿、低白蛋白血症(2.8g/dL)和/或低血压”。通过该定义，25%（71名患者中的18名）的患者经历了VLS。Olsen等人2001进一步指出：“在重新攻击时经历第二次VLS发作的四名患者在发生第二次发作的过程开始时具有小于2.8 g/dL的白蛋白水平。小于3.0 g/dL的血清白蛋白水平似乎预测该综合征并可能使患者易患该综合征。既往水肿也是该综合征发展的风险因素。”
值得注意的是，T-Guard(RTM) 1/2期研究的患者在治疗开始时具有23 g/L (范围16-34 g/L) (即2.3 g/dL (范围1.6-3.4 g/dL))的中位血清白蛋白水平。这令人惊讶地表明，尽管T-Guard(RTM)是基于免疫毒素的疗法，但似乎仍适用于这样的患者亚组：其血清白蛋白水平低于另一种基于免疫毒素的疗法(Ontak(RTM))认为安全的水平。不希望受任何特定理论约束，本发明的发明人相信，这有利地为医学从业人员及其患者开辟了进一步的治疗选择。
在实施例3中引用的另外参考文献.
Amlot, P. L., M. J. Stone, D. Cunningham, J. Fay, J. Newman, R. Collins,R. May, M. McCarthy, J. Richardson, V. Ghetie等人(1993). “A phase I study ofan anti-CD22-deglycosylated ricin A chain immunotoxin in the treatment of B-cell lymphomas resistant to conventional therapy.”Blood82(9): 2624-2633.
Conry, R. M., M. B. Khazaeli, M. N. Saleh, V. Ghetie, E. S. Vitetta, T.Liu和A. F. LoBuglio (1995). “Phase I trial of an anti-CD19 deglycosylatedricin A chain immunotoxin in non-Hodgkin's lymphoma: effect of an intensiveschedule of administration.”J Immunother Emphasis Tumor Immunol18(4): 231-241.
Engert, A., V. Diehl, R. Schnell, A. Radszuhn, M. T. Hatwig, S. Drillich,G. Schon, H. Bohlen, H. Tesch, M. L. Hansmann, S. Barth, J. Schindler, V.Ghetie, J. Uhr和E. Vitetta (1997). “A phase-I study of an anti-CD25 ricin A-chain immunotoxin (RFT5-SMPT-dgA) in patients with refractory Hodgkin'slymphoma.”Blood89(2): 403-410.
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Messmann, R. A., E. S. Vitetta, D. Headlee, A. M. Senderowicz, W. D.Figg, J. Schindler, D. F. Michiel, S. Creekmore, S. M. Steinberg, D. Kohler,E. S. Jaffe, M. Stetler-Stevenson, H. Chen, V. Ghetie和E. A. Sausville(2000). “A phase I study of combination therapy with immunotoxins IgG-HD37-deglycosylated ricin A chain (dgA) and IgG-RFB4-dgA (Combotox) in patientswith refractory CD19(+), CD22(+) B cell lymphoma.”Clin Cancer Res6(4): 1302-1313.
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实施例4 - 改进的免疫毒素制剂的开发
正在开发用于治疗GVHD的T-Guard(RTM)。T-Guard(RTM)是由两种抗体(SPV-T3a和WT1)组成的组合产品。单克隆抗体SPV-T3a靶向CD-3，而WT-1靶向CD-7蛋白。两者都分别偶联至蓖麻毒蛋白毒素A链(RTA)，其在结合靶细胞后充当毒性负载。可以将抗体药物缀合物(ADC)配制为单独输注浓缩物(SPV-T3a-RTA和WT1-RTA)以在即将施用前混合。例如，可以将4 mL每种制剂(1/1比例)一起在1瓶中用稀释剂稀释直到100 mL。
两种抗体(SPV-T3a和WT1)在制剂缓冲液(13 mM磷酸钠缓冲液pH 7.5, 140 mMNaCl和0.05%(v/v)吐温-20)中均显示出物理稳定性问题。此制剂缓冲液对应于补充了吐温-20的PBS缓冲液。SPV-T3a-RTA在该制剂缓冲液中在2-8℃可稳定2.5年，但是在冷冻/融化应激时显示聚集体形成。WT1-RTA在该制剂缓冲液中在5-8℃是不稳定的，并在-20℃保持稳定2.5年。储存3年后，该产品不满足关于生物活性和颗粒形成的规范，如用DLS检测的。
本发明的发明人希望获得一种制剂，其将增加两种单克隆抗体（MAb）的物理稳定性用于更长的贮存期限。
方法
蛋白质含量分析
分光光度法的一种常见应用是测量光谱中UV区域的光吸收，以量化样品中的蛋白质浓度。在蛋白质中通常存在的几种氨基酸（诸如色氨酸和酪氨酸）吸收在280 nm范围内的光。蛋白质溶液的吸收取决于氨基酸序列的内容物和蛋白质浓度。根据Lambert-Beer定律，使用蛋白质的质量消光系数（ε），可以从其吸光度（A）计算溶液中的浓度：
A = ε*c*l，其中：
A= 吸光度
ε= 质量消光系数，以cm-1*(mg/mL)-1计
c = 浓度，以mg/mL计
l = 路径长度，以cm计
由于缓冲液组分和盐也可能吸收在该波长的光，因此分光光度计应始终用制剂缓冲液作为空白。制剂缓冲液还应当用于样品的稀释。使用一次用弃的比色皿在UV-1800分光光度计(Shimadzu)上进行测量。
SDS-PAGE
SDS-PAGE根据其电泳迁移率在聚丙烯酰胺基质中分离蛋白质。SDS的结合会掩蔽蛋白质的固有电荷，并导致电荷均匀分布到质量单位。因此，在凝胶电泳过程中，经SDS处理的蛋白质将根据其近似大小而迁移。此外，现有的非共价聚集体将在SDS存在下解离。
根据应用，可以在非还原或还原条件下运行样品。还原剂（例如二硫苏糖醇（DTT））的添加会破坏蛋白质中的内部二硫键，并可以用于区分具有完整蛋白质骨架的蛋白质和通过这些二硫键保持在一起的带切口蛋白质。
在Novex 4-12% Bis/Tris凝胶上分析样品。如果在还原条件下进行电泳，则将NuPage还原剂添加到样品中，并将抗氧化剂（Invitrogen）添加到电泳缓冲液中。为了防止谱带高度或谱带增宽的差异，加载了等体积的样品。用MOPS-SDS运行缓冲液进行电泳。在固定溶液中温育后，将蛋白质用CBBR250 -溶液染色并脱色。使用专有扫描软件（ImageQuant，GE）扫描凝胶。
SE-UPLC分析
SE-UPLC允许确定分子尺寸分布以及完整单体抗体和潜在（蛋白质相关）杂质和变体的相对量。SE-UPLC的主要目标是检测不可逆的可溶性蛋白质寡聚和聚集以及由蛋白质水解产生的较小蛋白质片段。在方法开发过程中，选择柱和流动相，其使蛋白质与固相的相互作用最小，以防止蛋白质或其多聚体形式“粘附”在柱上，同时获得良好的回收率。组分应仅通过其MW来分离。通过在280 nm处的UV吸光度检测蛋白质，并通过将其峰的表面积除以总表面积来计算特定蛋白质杂质的相对量（表示为相对表面积（％））。
在UPLC H-Class生物仪器(Waters)上进行实验，在220 nm或280 nm检测。该系统配备了专门用于生物分子的生物惰性的不锈钢流道。
颗粒尺寸分析(DLS)
当光束穿过胶体分散体时，颗粒或微滴会在所有方向散射一些光。当颗粒与光的波长相比非常小时，散射光的强度在所有方向上都是均匀的（瑞利散射）；对于较大的颗粒（超过大约250 nm直径），强度是角度依赖性的（米氏散射）。
使用相干激光，可能使用光电倍增管检测器观察散射强度的时间依赖性波动。这些波动由以下事实引起：颗粒足够小以经历随机的热（布朗）运动，因此它们之间的距离不断变化。因此，对强度波动的时间依赖性的分析可以得出颗粒的扩散系数，在已知介质的粘度的情况下通过Stokes Einstein方程式可以从所述扩散系数计算出颗粒的流体动力学半径或直径。
在Zetasizer NanoZS (Malvern)上在一次性的低容积UV比色皿（PlastiBrand）中进行DLS测量。在70 μL中在25℃下进行典型的测量，其中在实际测量前3分钟期间将样品平衡至该温度。仪器根据样品的散射信号自动选择测量持续时间和激光强度。使用Zetasiser软件（7.02版）分析所有测量。
缓冲液更换
为了快速筛选多种缓冲液，用2 mL Zeba Spin脱盐柱(MWCO = 7 kDa, Pierce)进行缓冲液更换。这些柱含有尺寸排阻树脂，并可用于稀释的或浓缩的样品，从而实现良好的蛋白质回收率。所述柱始终与700 μL材料的样品大小一起使用。
PEG筛选
使用基于PEG-6000的筛选进行初步制剂筛选。由于已知ADC易于聚集，溶解度是主要的稳定性参数之一。缓冲液类型和pH会影响溶解度，因此制备了12种不同的缓冲液以筛选MAb的最佳溶解度。
测试的条件是：
Figure DEST_PATH_IMAGE043
组氨酸缓冲液pH 5.5、6.0和6.5
Figure 57263DEST_PATH_IMAGE043
磷酸盐缓冲液pH 7.0、7.5和7.5
Figure 974403DEST_PATH_IMAGE043
柠檬酸盐缓冲液pH 5.5、6.0和6.5
Figure 488561DEST_PATH_IMAGE043
乙酸盐缓冲液pH 4.0、4.5和5.0
Figure 883770DEST_PATH_IMAGE043
D-PBS (作为参照)
从每种缓冲液以及含有40%(w/v) PEG-6000的缓冲溶液制备50 mM溶液。后者如下制得：称量12 g PEG-6000并添加浓缩的缓冲溶液和MQ水直到30 mL，以获得含有40%(w/v)PEG-6000的50 mM溶液。将储备溶液用缓冲液或蛋白质进一步稀释至4-20%(w/v) PEG-6000的终浓度。
使用浓缩器(Amicon ultra 15, 10 kDa MWCO)将原始材料浓缩至0.40 mg/mL的大约浓度。使用UV吸光度测量来确定浓度。将材料在平板中以100 μL的总体积稀释2倍，并在5℃温育1天后测量平板。在具有405 nm OD滤光片的Envision (Perkin Elmer)上进行读出。
结果汇总
在不同的实验中，进行了以下概述（表2和表3），给出了不同实验的概述。两个概述均表明，与磷酸盐缓冲液pH 7.5相比，柠檬酸盐缓冲液pH 6.5是优选的。与柠檬酸盐缓冲液相比，磷酸盐缓冲液引起更多的聚集事件。SE-UPLC、SDS-PAGE和DLS确认了这一点。对柠檬酸盐缓冲液观察到赋形剂的差异。在这种情况下，对作为赋形剂的精氨酸观察到更高的回收率和更好的稳定性。该赋形剂在直到25℃的温度显示出对冷冻/融化应激的抵抗和更少量的高分子量(HMW)变体。在40℃也观察到大量的聚集体。对两种抗体都可以得出相同的结论，并通过SDS-PAGE确认结果。
表2: 来自冷冻/融化分析和短期储存研究的WT1-RTA的不同结果的概述。给出了不同的缓冲液（磷酸盐和柠檬酸盐）以及赋形剂，并将结果评价为良好（++）、中间（+）或不优选（-）。SE-UPLC结果作为HMW和agg (曲线下面积)给出。“F/T”= 冷冻/融化；“Stab”= 稳定性；“HMW”= 高分子量变体；“Agg”= 聚集体。
Figure DEST_PATH_IMAGE045
表3: 来自冷冻/融化分析和短期储存研究的SPV-T3a-RTA的不同结果的概述。给出了不同的缓冲液（磷酸盐和柠檬酸盐）以及赋形剂，并将结果评价为良好（++）、中间（+）或不优选（-）。SE-UPLC结果作为HMW和agg (曲线下面积)给出。“F/T”= 冷冻/融化；“Stab”=稳定性；“HMW”= 高分子量变体；“Agg”= 聚集体。
Figure DEST_PATH_IMAGE047
基于以上结果针对WT1-RTA和SPV-T3a-RTA选择的制剂是：10 mM柠檬酸盐(pH6.5), 155 mM L-精氨酸.HCl和0.05%(w/v)吐温-20。此制剂的配方如下：
组分量
柠檬酸* 0.11 g
柠檬酸钠* 2.79 g
L-精氨酸.HCl 32.70 g
吐温-20 0.5 g
H2O补至1000 mL
* 使用NaOH溶液校正pH至6.5。
实施例5 – 更进一步改进的免疫毒素制剂的开发
本发明的发明人试图更进一步改善T-Guard(RTM)制剂的稳定性。在上述制剂(10 mM柠檬酸盐(pH 6.5), 155mM L-精氨酸.HCl和0.05 (w/v)吐温-20)中，发现SPV-T3a-RTA和WT1-RTA均在-60℃、-20℃和5℃稳定多达9个月。但是，由于聚集体的形成，发现在25℃的稳定性欠佳。当前描述的研究的目的是基于加速稳定性研究来开发更稳定的制剂。
热应激研究
为了表征两种化合物(WTl-RTA和SPV-T3a-RTA)，使用了6种不同的分析技术：
Figure 88355DEST_PATH_IMAGE043
SEC
Figure 910818DEST_PATH_IMAGE043
SDS-PAGE
Figure 177851DEST_PATH_IMAGE043
聚集点
Figure 376751DEST_PATH_IMAGE043
DLS
Figure 734046DEST_PATH_IMAGE043
pH
Figure 727409DEST_PATH_IMAGE043
渗透压
表4: 热应激研究的概述
Figure DEST_PATH_IMAGE049
由于尚无可得的关于抗体聚集机制的信息，因此对于筛选考虑了多种赋形剂：还原剂、增溶剂、抗氧化剂、氨基酸和糖。
在下面为每种抗体总结了赋形剂的每种组合的影响。
表5: 赋形剂对SPV-T3a-RTA影响
试剂 影响
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,2 mM N-乙酰半胱氨酸 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺) -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺)；0,25 mg/ml EDTA二钠盐 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺)；10 mM苯甲酸钠 =
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,2 mM单硫代甘油 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,25 mg/ml的维生素E TPGS -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 1mM 2-2'-二硫二吡啶 --
10 mM柠檬酸盐; 100 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0.5%甘油 -
10 mM柠檬酸盐; 50 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 12 mM谷氨酸盐 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 1 mM甲硫氨酸 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甜菜碱 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 20 mM山梨醇 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 20 mM海藻糖 -
表6:赋形剂对WT1-RTA的影响
试剂 影响
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,2 mM N-乙酰半胱氨酸 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺) -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺)；0,25 mg/ml EDTA二钠盐 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,5 mg/ml聚(亚乙基亚胺)；10 mM苯甲酸钠 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,2 mM单硫代甘油 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0,25 mg/ml的维生素E TPGS -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 1mM 2-2'-二硫二吡啶 --
10 mM柠檬酸盐; 100 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 0.5%甘油 -
10 mM柠檬酸盐; 50 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 12 mM谷氨酸盐 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 1 mM甲硫氨酸 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甜菜碱 -
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 20 mM山梨醇 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 20 mM海藻糖 +
12 mM谷氨酸盐和50 mM甘氨酸的添加对SPV-T3aRTA的稳定性具有积极影响，而50 mM甘氨酸、20 mM山梨醇和20 mM海藻糖的添加对WTl-RTA的稳定性具有积极影响。
进行了新制剂研究，以：
•确认用甘氨酸、山梨醇和海藻糖观察到的积极影响
•测试现有赋形剂的其它组合（例如更高的甘氨酸浓度）
•新的赋形剂（例如其它糖）
制剂缓冲液的渗透压的目标为300-450 mOsm/kg。
因此，使用在上述研究中对两种化合物均具有积极影响的制剂缓冲液、与已测试的赋形剂的新组合、具有更高赋形剂浓度的制剂缓冲液和含有其它糖的制剂缓冲液，构建了另一个赋形剂筛选。
根据以下概述进行了加速稳定性测试。
表7：加速稳定性研究的概述
温育温度 时间点2天 时间点2个月
-20℃ 5℃ T=0
5℃ 40℃ T=2天
25℃ 40℃ T=4天
37℃ 5℃ T=0
表8:赋形剂对SPV-T3a-RTA的稳定性的影响
试剂 影响
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸 =
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 12 mM谷氨酸盐 =
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 75 mM甘氨酸, 50 mM谷氨酸盐 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 100 mM甘氨酸 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸; 50 mM山梨醇 +
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 125 mM海藻糖; 50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 125 mM麦芽糖; 50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 120 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 100 mM甘露醇；50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 140 mM麦芽糖 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 40 mM麦芽糖; 100 mM甘氨酸 --
表9:赋形剂对WT1-RTA的稳定性的影响
试剂 影响
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸 +
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 100 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 150 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 50 mM甘氨酸; 50 mM山梨醇 +
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 125 mM海藻糖; 50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 125 mM麦芽糖; 50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 120 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 100 mM甘露醇；50 mM甘氨酸 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 140 mM麦芽糖 ++
10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0,05%吐温20; 40 mM麦芽糖; 100 mM甘氨酸 --
测试的制剂中的4种对两种化合物(SPV-T3a-RTA和WT1-RTA)的稳定性都有积极影响：
1. 10 mM柠檬酸盐, 125 mM L-精氨酸; 0.05%吐温20; 125 mM海藻糖; 50 mM甘氨酸
2. 10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0.05%吐温20; 125 mM麦芽糖; 50 mM甘氨酸
3. 10 mM柠檬酸盐; 120 mM L-精氨酸; 0.05%吐温20; 100 mM甘露醇；50 mM甘氨酸
4. 10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸; 0.05%吐温20; 140 mM麦芽糖
然后对以下制剂进行进一步的稳定性测试：10 mM柠檬酸盐; 125 mM L-精氨酸;0.05%吐温20; 140 mM麦芽糖(用37% HCl调至pH 6.5)。
与在先前制剂缓冲液中的温育相比，在40℃在新制剂缓冲液中温育2天导致SPV-T3a-RTA单体增加了约23％和WTl-RTA单体增加了约13％。还观察到不溶性聚集体的减少(参见表10和11)。
表10：在40℃ 2天后在先前和新的制剂缓冲液中的WT1-RTA蛋白分布
制剂 单体(%) 可溶性聚集体(%) 不溶性聚集体(%)
10mM柠檬酸盐, 150mM L-Arg.HCl, 0.05%(w/v)吐温-20 (pH 6.5) 61.5 24.9 13.7
10mM柠檬酸盐, 125mM L-Arg.HCl, 0.05%(w/v)吐温-20, 140mM麦芽糖(pH 6.5) 74.0 22.9 3.1
表11: 在40℃ 2天后在先前和新的制剂缓冲液中的SPV-T3a-RTA蛋白分布
制剂 单体(%) 可溶性聚集体(%) 不溶性聚集体(%)
10mM柠檬酸盐, 150mM L-Arg.HCl, 0.05%(w/v)吐温-20 (pH 6.5) 44.9 15.9 39.1
10mM柠檬酸盐, 125mM L-Arg.HCl, 0.05%(w/v)吐温-20, 140mM麦芽糖(pH 6.5) 67.9 28.1 4.0
聚集点分析表明，与先前的制剂缓冲液（SPV-T3a-RTA和WTl-RTA的Tagg分别为42℃和45℃）相比，在新制剂缓冲液中的SPV-T3a-RTA (Tagg= 51℃)和WTl-RTA (Tagg= 52℃)是更稳定的。
实施例6 - 单克隆抗体-RTA缀合过程的改进
上述研究（实施例4和5）产生了支持两种缀合物的非常好稳定性特征的制剂。因此，开发工作继续探索可在生产和纯化过程中多远的上游使用该优选制剂缓冲液。
发明人旨在减少沉淀和导致的产物损失。Blue Sepharose柱步骤（除去未缀合的游离抗体）的产率较差，回收的部分遭受聚集。很大一部分沉淀在柱上并丢失。
发明人还旨在改善Blue Sepharose亲和色谱的上样和洗脱条件，以实现mAb和mAb-RTA缀合物的稳健完全分离。
最后，发明人试图在更上游直至且包括缀合步骤采用有利的制剂缓冲液，以也在该更早阶段防止沉淀。
生产过程中的变化如图9和10所示。图9显示了过程A，其中在pH 7.5的25 mM磷酸盐缓冲液中进行在中心水平线以上的缀合和纯化步骤；在pH 6.5的10 mM柠檬酸盐缓冲液中进行在水平线以下的步骤。图10显示了过程B，其与过程A的不同之处在于，向10 mM柠檬酸盐缓冲液的变换发生在上部水平线所示的点的更上游。在pH 6.5的10 mM柠檬酸盐缓冲液中进行该上部水平线以下的步骤。在pH 6.5的10 mM柠檬酸盐缓冲液中进行该上部水平线以下的步骤。
转到流程B后，发现：
• 抗体缀合反应是稳健的且与制剂缓冲液(10mM柠檬酸盐, 125mM L-Arg.HCl, 0.05%(w/v)吐温-20, 140mM麦芽糖(pH 6.5))相容。
• 通过更改G25上的运行缓冲液，实现是简单的
• 通过改变L-精氨酸浓度，可以巧妙地改变Blue Sepharose结合。通过增加L-精氨酸浓度可以实现洗脱。
• 在125 mM L-精氨酸中，没有未缀合的mAb结合，仅小部分的mAb-RTA1在流通中未结合。可以在75-125 mM（诸如100-125 mM）L-精氨酸的范围内确定用于平衡、结合和洗涤的最佳选择性条件。
• 洗脱步骤表明，可以分离mAb-RTA1、mAb-RTA2和mAb-RTA3。缀合程度越高，结合越强。
• 过程B可以进行优化以平衡产率和纯度。还可以选择性地富集药物-抗体变体。
• 发现在Blue Sepharose后的洗脱合并物具有减小的浊度或沉淀。
实施例7–抗-CD3/CD7免疫毒素的组合用于类固醇难治性急性移植物抗宿主病的 I/II期试验
介绍
急性移植物抗宿主病(aGvHD)是在同种异体造血干细胞移植(HSCT)后可发生的主要并发症。在发生aGvHD的患者中预后较差，尤其是在具有胃肠道（GI）和/或肝脏受累的严重类固醇难治性aGvHD (SR-aGvHD)的情况下1,2。目前，尚无标准的二线疗法被批准用于SR-aGvHD，并且没有可用的治疗选择似乎能提供令人信服的优异结果，平均只有30％的完全应答者1, 3, 4。六个月存活率接近50％，但是在五分之一的患者中实现了长期存活2。
移植物抗宿主免疫反应的根本核心是响应于宿主抗原呈递细胞的同种异体反应性供体T细胞的增殖和分化，宿主抗原呈递细胞诱导组织损伤和效应期期间炎症的传播5-7。因此，许多当前使用的疗法由引起T细胞耗竭的抗体或旨在抑制T细胞功能的生物制剂或小分子抑制剂组成1,3,6,8。此类方法的明显挑战在于，诱导的免疫抑制应尽可能地是选择性的和简短的，以避免感染性并发症和潜在的血液学恶性肿瘤的复发，否则它们会抵消控制急性GvHD反应的直接益处9-12。
作为实现该目的的新方法，我们开发了两种抗-T-细胞免疫毒素的组合，旨在诱导T细胞的协同体内耗竭和抑制，同时允许免疫系统在治疗后快速重建13,14。该组合产品由两种针对CD3和CD7的鼠单克隆抗体的1:1混合物组成(T-GuardTM)，它们各自分别缀合至重组蓖麻毒蛋白毒素A链15，以下缩写为CD3/CD7-IT16,17。临床前研究表明，CD3/CD7-IT通过抑制蛋白质合成诱导两种T细胞（特别是活化的T-细胞和NK-细胞）的细胞凋亡，并通过阻断和调节TCR/CD3复合物来减少T-细胞活化（图12）17。在剂量递增研究中，7位具有SR-aGvHD的患者中的5位对作为三线疗法的CD3/CD7-IT有应答17。该研究的有前途结果导致了这里报道的CD3/CD7-IT用于治疗SR-aGVHD的I/II期研究。
方法
这项前瞻性单臂I/II期研究得到了Radboud University Medical Center Nijmegen(荷兰)和University Medical Center Muenster (德国)的伦理委员会和机构审查委员会的批准。从所有患者获得了知情同意书。
基于剂量递增研究的结果选择I/II期研究的4 mg/m2 T-Guard开始剂量17。应用了Bryant-Day 2阶段设计18，对8位患者进行了预先安排的中期分析，以保护患者免于向无效或有毒治疗的不必要暴露。如果在前8名患者以后，观察到2个或更少（≤25％）第28天应答者和/或4个或更多（≥50%）剂量限制毒性（3级或更高级别的不利药物反应）（I期），该试验将因无效和/或毒性而终止。否则，试验应扩大到共20名患者（II期）（样品大小估计：S2）。
在HSCT以后或在移植后供体淋巴细胞输注以后发展为II至IV级aGvHD的成年（≥18岁）患者获得参加资格；根据Harris等人建立的标准定义aGvHD等级20。经组织活检证实aGvHD的诊断。将SR-aGvHD定义为服用全身性皮质类固醇(≥2mg/kg/天的泼尼松龙或等同物) 3天后进展或7天后没有改善的aGvHD 3, 4。已接受SR-aGvHD的额外治疗的患者被排除，还排除了表现中度或重度慢性GvHD（cGvHD）、严重器官功能障碍、不受控的感染、>266µmol/L (1.87mg/dL)的血清肌酸酐水平和/或≤1.5g/dL的血清白蛋白水平的患者。
CD3/CD7-IT (S3)的治疗方案由以48小时间隔施用的4mg/m2的4次4小时静脉内（i.v.）输注组成。在CD3/CD7-IT治疗期间继续GvHD预防，其主要由单独的或与麦考酚酸莫酯组合的环孢菌素-A组成。全身性皮质类固醇在对T-Guard有应答的患者中的推荐递减为以3-5天间隔的10％（相对于开始剂量）。在研究第28天之后，类固醇递减的速率由当地方案决定。感染的抗微生物预防、预防性和/或经验性治疗、以及氯马斯汀预处理（静脉内2 mg）的使用由医师和建立的当地方案决定。
如果患者接受了至少一剂的CD3/CD7-IT，则被纳入关于毒性和功效的分析。主要终点为第28天的总应答率（ORR，定义为PR和CR率之和）以及在用CD3/CD7-IT治疗后长达6个月的可能药物相关AE的发生。次要终点是第28天的CR率、6个月总存活率(OS)和cGvHD的发生率。将ORR、第28天的CR和6个月OS与我们机构的接受伊诺莫单抗-依那西普(N=21)或英夫利昔单抗(N=21)的历史对照所得到的结果进行了对比21。将CR定义为与aGvHD相关的所有征象和征状的消退。将PR定义为在所有初始GvHD靶器官中GvHD阶段的改善，而在任何新器官中都没有GvHD的完全消退或出现。将无应答（NR）定义为在第28天之前没有变化、混合应答、进行性疾病或需要补救疗法22。将2014年NIH诊断标准用于评估cGvHD并对其评分23。基于AE通用术语标准(Common Terminology Criteria for AE，CTCAE 4.0)对血液学和非血液学AE（包括细胞因子释放综合征（CRS））分级。使用较早定义的标准将毛细血管渗漏综合征(CLS)如下分级24:1级，无症状，不需要治疗；2级，有症状，但不需要流体支持；3级，呼吸受损或需要流体；4级，危及生命，需要使用血管加压剂支持和/或机械通气。在3级AE的情况下，只有根据研究人员的判断，如果会改善患者的毒性参数或当判断符合患者的利益时，才施用CD3/CD7-IT的后续剂量。根据建立的指南定义侵袭性真菌疾病(IFD)、EBV-和CMV感染25-27。
CD3/CD7-IT的制备
CD3/CD7-IT由鼠单克隆抗体SPV-T3a (抗-CD3)和WT1 (抗-CD7)组成，它们各自缀合至重组RTA。如以前所述使用良好生产规范制备CD3/CD7-IT15，并增加了一个步骤以用半胱氨酸封闭残余接头和用重组RTA代替去糖基化的植物衍生的RTA17, 28。在等渗缓冲溶液pH6.5中以0.2mg/ml的浓度配制免疫毒素，并冷冻保存（在-20℃或更低）。
体外实验室分析
在治疗之前和之后收集外周血样品以分析预测的GvHD生物标志物、细胞因子水平、免疫重建、药代动力学和人抗药物抗体(ADA)的发展。
在Icahn School of Medicine (Mount Sinai, New York)，测量了生物标志物ST2 (致肿瘤性抑制2)和Reg3α(再生胰岛衍生蛋白3-α)的水平。基于经验证的算法29为每位患者确定概率得分p̂，所述算法用于预测aGvHD患者的治疗失败风险和非复发死亡率。当在用全身性皮质类固醇治疗的1周±3天以后p̂>0.291时，患者处于高危中。
使用定量多重免疫测定法在Myriad RBM (Austin, TX)测量血清细胞因子水平。
使用流式细胞术通过免疫分型分析淋巴细胞。在CD45+和侧向散射低细胞上门控淋巴细胞，并为每微升血液每种表型记录辅助性T-细胞(CD5+和CD4+)、细胞毒性T-细胞(CD5+和CD8+)、NK细胞(CD56+和CD5-)和B细胞(CD19+)的计数。由于CD3/CD7-IT处理的潜在CD3调节，使用CD5代替CD3来鉴定和定量T细胞。对于TCR测序，从收集在PAXgene试管中的全血分离DNA。然后使用ImmunoSEQ (Adaptive Biotechnologies, Seattle)对TCRβ CDR3区域进行扩增和测序。将偏置控制的V和J基因引物用于扩增重排的V(D)J区段，用于以大约20倍的覆盖率进行高通量测序(HTS)分析30。在使用分簇算法校正测序误差后，使用International ImMunoGeneTics信息系统对CDR3区段进行注释，从而鉴别哪些V、D和J基因对每个重排有贡献31。通过将患者的TCRβ数据与据报道对EBV和CMV抗原具有特异性的TCRβ序列进行对比，确定了EBV-相关的和CMV-相关的T-细胞的绝对数目32。
使用经验证的生物发光测定法，在Celonic AG（瑞士巴塞尔）测量了SPV-T3a-RTA和WT1-RTA的血清浓度，以及针对这些免疫毒素中的任一种的ADA的存在。如前所述进行药代动力学分析17。
统计分析
使用描述统计学分析患者特征。给出了估计的aGvHD应答率以及95% Clopper-Pearson精确置信区间（CI）。通过将具有≥2的CTCAE等级的AE和/或感染的发生率制表，分析毒性。将Kaplan-Meier曲线用于分析总存活率。使用卡方检验将因CD3/CD7-IT导致的第28天的ORR以及完全和部分缓解率与从接受伊诺莫单抗-依那西普(N=21)或英夫利昔单抗(N=21)的机构历史对照获得的相应结果进行了对比21。使用时序检验对比了6个月OS率。
关于免疫重建，使用Wilcoxon配对符号秩检验分析了在治疗前、1个月、3个月和6个月样品之间的患者内差异。<0.05的双侧p-值被认为是统计上显著的。使用DeWitt等人描述的差别丰度分析来鉴定扩增的和富集的T细胞克隆33。基于其在每个库中的比例或时间点，在两个样品中确定给定的克隆明显扩增或收缩，并使用Fisher氏精确检验和在5%水平进行的Benjamini-Hochberg校正进行分析。
结果
患者和GvHD特征
从2014年6月到2016年9月，招募了20名患者参加研究。表1列出了患者、供体和GvHD特征。在招募时，3名患者（15％）具有II级aGvHD，17名具有III级或IV级aGvHD (85%)。在16名患者（80％）中累及两个器官；在18个（90％）和5个（25％）病例中分别累及胃肠道和肝脏。基线白蛋白水平低，尤其是在GI-GvHD患者中（中位值：2.3g/dL；范围：1.6-3.4g/dL；正常范围:3.5-5.0g/dL）。使用ST2和Reg3α的血清浓度的经验证的算法证实了所有患者的显著风险，具有0.345的平均p̂；大多数患者（11/20）被归类为治疗失败和NRM的高风险29。在最初的皮质类固醇治疗后8天的中位区间（范围：5-16天）之后和移植后中位48天（范围：26-308天）之后，开始CD3/CD7-IT治疗。
GvHD应答和患者结果
CD3/CD7-IT治疗后的中位随访期为292天（范围：3-889天）。在完成治疗计划之前，两名患者因进行性SR-aGvHD死亡。其余18名患者（90％）以48小时间隔接受所有四个计划剂量。在第28天，ORR为60％（12/20患者），95% CI为36-81％；10名患者(50%; 95% CI:27-73%)达到了CR（图13）。在12名有应答且存活的患者中，可根据方案逐渐减少皮质类固醇。具有高危生物标志物特征的患者中，ORR为55％（6/11）。在6个月时间点，12名患者在对CD3/CD7-IT组合应答后存活，对应的OS率为60%(95% CI:36-78%) (图13)；对于具有高危生物标志物特征的患者，存活率为64％（7/11）。在试验中死亡的8名患者的死因是难治性aGvHD（4名患者）、具有感染的难治性GvHD (3名患者)和假膜性结肠炎(1名患者)。与关于在紧邻试验开始就入选的42名患者的队列所报告的结果相比，用CD3/CD7-IT获得的结果是有利的。具体而言，CR率分别为50%相对于19%(p=0.012)，6个月OS率分别为60%相对于29%(p=0.021)。关于预测第28天应答或6个月存活率的基线特征，没有发现明显差异。为了补偿在治疗开始时aGVHD严重程度的差异，在对总体aGVHD分级进行调整后，重复上述分析。在针对aGVHD等级调整后20，CR和OS率仍然是显著的（分别为p=0.032和0.034）。在治疗开始后24个月，与该历史对照组相比，研究患者仍然表现出几乎翻一番的总存活率（从16.7％到35％，分别p=0.47和0.09）。存活至6个月时间点的12名患者中的3名（25％）发生了cGVHD；对两名患者报道的严重程度为轻度，一名患者为严重。
三名AML患者出现复发，但所有患者均为具有不良风险AML的患者。
安全性
数据和安全监测委员会（Data and Safety Monitoring Board，DSMB）审查了对前8名患者的预先计划的中期分析，他们在此基础上得出结论，没有出现重大安全担忧，并且观察到的风险-收益平衡值得继续研究。一般而言，CD3/CD7-IT被良好耐受，并被发现是安全的，没有报道与研究药物相关的SUSAR（疑似意外的严重不良反应）或SAE（严重AE）。尽管未记录到临床上显著的输注相关的反应，但是两名未接受预处理的患者经历了寒战，其在氯马斯汀治疗后迅速消退（2级AE）。大多数患者具有升高的巨噬细胞活化/募集标志物(MCP-1和MIP-1β)水平，并且该增加在首次输注后最明显；但是，仅上述两名经历过寒战的患者也具有IL-6水平的增加34, 35。其余患者不具有IL-6、IL-8、IL-10或IFN-γ浓度的增加，他们也未形成与CRS对应的临床征象。
20名患者中的几名出现了有限数目的可能治疗相关的AE，包括低白蛋白血症、微血管病和/或血小板减少症(表2)。低白蛋白血症在基线时出现在所有20名患者中（在80％的患者中为2级或3级），并且由于CD3/CD7-IT治疗，可能在8名患者中恶化。这8名患者出现了轻度外周性水肿，除一个病例外的所有病例可容易使用利尿剂控制。一名患者需要用白蛋白输注和利尿剂治疗全身性水肿和显著的体重增加；因此该患者被归类为具有2级CLS。15名患者（75％）具有既存的低血小板计数（在25％的病例中为3或4级），血小板减少症在14名患者（70％）中发生或恶化。尽管各种其它原因可能促进血小板减少症的发展，时程至少暗示了在9名患者中与CD3/CD7-IT的可能关联。尽管如此，血小板减少症是短暂的，没有导致出血事件，很少需要血小板输注。分别在3名患者中观察到早期EBV和CMV感染（在3个月内）（其中2名患者为EBV和CMV阳性）；但是，没有EBV或CMV疾病发生。尽管只有40％的患者接受了霉菌活性的抗真菌预防，但在任何患者中均未观察到IFD。尽管如此，正如在这种背景中所预期的，感染和AE的数目是相对高的。两名患者发生了艰难梭菌（Clostridium difficile）感染，其导致其中一名因假膜性结肠炎而死亡。此外，尽管5名患者发生了菌血症（分别在2、2和1名患者中出现肠球菌、葡萄球菌或产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）感染），但该发生率（25％）并未高于历史对照所报道的21。
在用CD3/CD7-IT治疗后，在20名患者中的10名（50％）中检测到针对SPV-T3a-RTA和/或WT1-RTA的ADA；在这10名患者中的4名中，在任何给定点的滴度≥20,000。尽管如此，没有报告血清病的病例。ADA的出现被认为几乎没有临床关联性，因为ADA通常在9-10天后形成，而CD3/CD7-IT目前被开发为仅一周治疗选择，其血清半衰期仅为9小时。
药代动力学
药代动力学分析揭示，CD3/CD7-IT的平均血清半衰期和Cmax (和SD)分别为8.59±3.04h和1231±671µg/L，这与先前公开的数据一致17。
免疫重建和抗病毒免疫
与其预期效果一致，CD3/CD7-IT治疗导致T-细胞和NK-细胞的大量耗竭，早在治疗后第二周就开始快速恢复(图14A-B)。重要的是，在绝对B细胞计数上没有观察到显著影响(图14C)。关于在治疗开始之前和之后由治疗诱导的幼稚、记忆、效应和效应记忆型T-细胞的相对比例的变化，没有观察到明显的模式（CD4:CD8比例也没有降低或逆转）。此外，在CD4群体中调节性T细胞（Tregs）的绝对计数和Tregs的百分比显示正常变化，并在治疗开始后28天或在其余的随访期期间未观察到明显的上升或下降趋势。
在用CD3/CD7-IT治疗之前和在可能的情况下之后1、3和6个月，对PBMC中TCR-β基因的CDR3区域进行HTS。HTS可以确定给定样品中所有T-细胞中的总T-细胞计数、T细胞库的多样性以及TCR CDR3区域的序列。通过在样品中存在的独特T-细胞克隆的数目来表征样品中的T-细胞多样性，所述数目由使用HTS鉴别的独特CDR3序列的数目反映。在CD3/CD7-IT治疗开始之前，患者具有低的T-细胞多样性，其在第一个月之前进一步下降，最可能是由于T细胞的绝对数目的减少。T细胞多样性在治疗后六个月之前稳定反弹，其中多种T细胞库包括几种新的多克隆T-细胞群体(图14D-H)。
接下来，我们检查了CD3/CD7-IT是否影响抗病毒T-细胞克隆。因此，我们分析了用CD3/CD7-IT治疗后患者中EBV-和/或CMV-特异性的T-细胞克隆的发生。通过筛选编码分别识别CMV-和EBV-特异性抗原的受体的164个和854个TCRβ序列的有效清单，鉴定抗病毒T-细胞克隆32。
患者分别在95%和40%中具有EBV和CMV的阳性血清学，且供体在85%和35%中具有。感染仅发生在具有阳性血清学的那些患者中。图15A和C显示了用CD3/CD7-IT治疗后经历EBV和/或CMV感染的四名患者（两名患者仅具有EBV或CMV感染，两名患者具有EBV和CMV感染两者）。所有这些患者表现出感染后EBV-和CMV-相关克隆的数目增加，从而提示，抗病毒T-细胞应答不受CD3/CD7-IT治疗负面影响。
最后，通过在治疗开始之前病毒感染检测为阳性的患者中在即将CD3/CD7-IT治疗前采取的样品与在治疗后1和3个月采取的样品之间进行逐对对比，我们进行了独特抗病毒T-细胞克隆的差示分析。该分析表明，在治疗开始时，就克隆丰度而言，EBV-和CMV-相关的T-细胞克隆在整个T细胞群体中均匀分布。此外，这些克隆没有由于CD3/CD7-IT治疗而扩增或收缩(图15B-D)。当我们分析来自在治疗开始时具有抗病毒T细胞但未发生病毒感染的患者的样品时，获得了类似的结果；我们的数据(未显示)提示，这些患者可能已经从血清阳性供体获得了这些抗病毒克隆。综上所述，这些结果指示，CD3/CD7-IT不会对抗-EBV或抗-CMVT-细胞克隆的比例产生负面影响，从而提示，这种治疗似乎并未将这些患者置于获得这些机会性病毒感染的更高风险中。
讨论
在这里，我们报告了一项多中心I/II期试验的结果，以研究在具有SR-aGvHD的患者中使用CD3/CD7-IT治疗的体内安全性和功效。我们的结果表明，该CD3/CD7-IT具有有前途的功效，在第28天的ORR为60％；具体地，我们的患者中的50％获得了CR，而6个月OS率为60％。与我们的机构历史对照所报告的结果相比，这些结果更好（图13），并考虑到患者的高危特征，这些结果值得注意：85％的患者具有严重的SR-aGvHD，90% GI受累，以及55％的患者具有高危生物标志物特性。对二线疗法的汇总分析显示，只有32％的患者达到了完全缓解，相应的6个月存活率为49％1。此外，我们的II期结果确定地匹配关于目前正在研究的SR-aGVHD的其它药物（包括brentuximab vedotin和鲁索替尼）所报告的结果，这些药物已显示在大约30%的患者中达到CR36。我们的研究存在某些需要确认的限制。首先，样品大小是相对小的，我们没有包括随机的比较组（comparator arm）。此外，研究群体在年龄、调理方案、供体类型和所用GvHD预防方案方面不均一。尽管如此，研究群体代表了在我们机构接受治疗的SR-aGVHD患者，并且主要由具有潜在高危特征的患者组成。
CD3/CD7-IT看起来是安全的。尽管存在抗-CD3 mAb SPV-T3a，但CD3/CD7-IT在两名患者中均引起了轻度输注反应，所述两名患者均未接受输注前氯马斯汀。此外，我们没有观察到与CRS有关的毒性或横纹肌溶解，正如用其它基于RTA的免疫毒素所见37,38。研究人员确实认为低白蛋白血症、微血管病和血小板减少症可能与CD3/CD7-IT有关。但是，这些事件主要由既存病症的恶化组成。研究人员认为这些事件更可能与潜在的SR-GVHD和/或神经钙蛋白抑制剂的伴随使用有关。尽管如此，鉴于免疫毒素的潜在毒性效应，CD3/CD7-IT仍然有可能已经促成这些事件，在将来的研究中将需要注意这种可能性。
正如关于这种临床背景所预期的，感染是相对常见的；但是，感染的发生率与先前的报告或我们的机构对照没有实质差异21,39,40。由GvHD本身的存在和治疗引起的多方面免疫缺陷、由GI-GvHD引起的粘膜屏障破坏和/或生态失调可以解释这些感染中的大多数，尤其是艰难梭菌感染和肠球菌菌血症41。尽管我们的患者中只有一半接受了霉菌活性的抗真菌预防，但我们没有观察到IFD病例。更重要的是，尽管T细胞和NK细胞大量耗竭，但EBV/CMV感染的发生率（15％）似乎相对低21,39，并且在我们的患者中没有发生移植后淋巴增生性障碍或CMV疾病的病例。这可以通过以下事实解释：治疗相对赦免病毒特异性的T-细胞，并且在治疗开始后6个月内发生了免疫重建。在治疗的第二周，T-细胞和NK-细胞计数开始上升，特别是在实现其SR-aGvHD缓解的患者中；在3个月时，这些细胞计数与HSCT后通常见到的细胞计数相似42。细胞数目的这种增加还伴随着T细胞克隆多样性的同时且显著增加。因此，用CD3/CD7-IT的治疗允许患者的免疫系统在实现缓解后恢复，并且与依赖于体内T-细胞耗竭的其它治疗方式（例如抗胸腺细胞球蛋白和阿仑珠单抗）相比，治疗后的免疫重建似乎是有利的43, 44。
在临床上已经评价了用于治疗aGvHD的其它基于免疫毒素的治疗，诸如H65-RTA(抗-CD5, 蓖麻毒蛋白A链)和地尼白介素2 (CD25, 白喉毒素)13,45。CD3/CD7-IT与这些先前疗法相比可以提供优点。首先，该组合靶向相同靶细胞上的多种抗原，该策略倾向于比使用单一免疫毒素更有效46-53。此外，CD3/CD7-IT对最近激活的T细胞以及可能在aGvHD的传出阶段中发挥作用的NK细胞具有明显偏好17。最后，CD3/CD7-IT具有双重作用机制，因为抗-CD3mAb SPV-T3a通过经由不依赖RTA诱导的细胞杀伤的机制与CD3/TCR复合物结合，提供额外的免疫抑制(图12)17。
总而言之，我们报告了I/II期研究的结果，该研究涉及具有高危SR-aGvHD的患者，表明CD3/CD7-IT在治疗后提供高的临床缓解率和快速的免疫重建。基于这些结果，目前正在设计一项III期研究，以检查在SR-aGvHD的治疗中包括CD3/CD7-IT的潜在价值。
表1: 患者特征和HSCT和GvHD特征.
特征 N %
患者的数目 20 100
岁数, 中位值(范围) 53(18-74) NA
性别, M/F 9/11 45/55
诊断
骨髓样恶性肿瘤 15 75
淋巴样恶性肿瘤 5 25
供体
MUD 13 65
MRD 5 25
MMUD 1 5
单倍体 1 5
干细胞来源
PBSC 19 95
BM 1 5
疾病风险指数
低 0 0
中 5 25
高 15 75
调理方案 a
MAC 6 30
RIC 5 25
NMA 9 45
GvHD预防
CyA 5 25
CyA/MTX 1 5
CyA/MMF (CyA后) 13 (1) 65
急性GvHD
HSCT后 19 95
DLI后 1 5
在招募时的aGvHD等级
II 3 15
III 11 55
IV 6 30
累及的器官
皮肤 15 75
肝脏 5 25
肠 18 90
2个累及的器官 16 80
在CD3/CD7-IT开始时的生物标志物评分
高危p > 0.291 11 55
至aGvHD的时间（天）
中位值(范围) 40 (10-308) NA
至CD3/CD7-IT治疗的时间（天）
中位值(范围) b 8 (5-16) NA
a调理方案：NMA调理由Flu-TBI组成；RIC方案是基于Flu-Bus和Flu-Mel的；MAC方案是基于Cyclo-TBI、Flu-Mel-TBI或FLAMSA的。
b相对于最初的皮质类固醇治疗。
注：aGvHD = 急性移植物抗宿主病; BM = 骨髓; CyA = 环孢菌素A; DLI = 供体淋巴细胞输注；单倍体= 单倍同一性的有关供体; MAC = 清髓性调理; MMF = 麦考酚酸莫酯; MMUD = 错配的无关供体; MRD = 匹配的有关供体; MTX = 甲氨蝶呤；MUD = 匹配的无关供体; NA = 不适用; NMA = 非清髓性调理; PhAT = 药理学审计跟踪; PBSC=外周血干细胞; RIC = 降低强度调理。a相对于最初的皮质类固醇治疗。
表2: 可能与治疗有关的不利事件的总结
2级a　　　　　　　　　 　3级　　　　　　　　　　　4级
贫血(1)b　　　　　 　血小板减少症(3)　　　　　血小板减少症(5)
腹部疼痛(1) 　　　 　嗜中性粒细胞减少症(1)
血小板减少症(1) 　 　升高的胆红素(2)
嗜中性粒细胞减少症(1)　　肌病(1)
微血管病(1) 　　　 　　微血管病(1)
寒战(2) 　　　　　　 低白蛋白血症(1)
毛细血管渗漏综合征(1)
低白蛋白血症(1)
a每个AE的分级基于AE通用术语标准的4.0版本，但是毛细血管渗漏综合征除外，其使用Messmann等人描述的系统分级24。
b括弧中的数字是指经历指定不利事件的患者的数目。
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Claims (71)

1.一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的病毒感染或病毒再激活的治疗或预防性治疗的方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。
2.用于根据权利要求1的用途的组合物，其中所述病毒感染或病毒再激活伴随疱疹病毒目或多瘤病毒科的病毒。
3.用于根据权利要求2的用途的组合物，其中所述病毒感染或病毒再激活选自人巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和JC病毒。
4.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述免疫调节治疗包括移植物抗宿主病(GvHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗。
5.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物。
6.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述第一抗体分子和/或所述第二抗体分子是鼠抗体。
7.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述第一抗体分子是选择性地结合人CD3的IgG2b同种型单克隆抗体。
8.用于根据权利要求7的用途的组合物，其中所述第一抗体分子是抗体SPV-T3a。
9.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述第二抗体分子是IgG2a同种型单克隆抗体。
10.用于根据权利要求9的用途的组合物，其中所述第二抗体分子是抗体WT1。
11.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体缀合至选自蓖麻毒蛋白、去糖基化的蓖麻毒蛋白A (dgRTA)和未糖基化的重组蓖麻毒蛋白A的毒性部分。
12.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中将以下至少一种去免疫化：
所述第一抗体；
所述第二抗体；
所述第一抗体的毒性部分；和
所述第二抗体的毒性部分。
13.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述受试者已经被确定具有EBV和/或CMV病毒感染或处于所述感染的风险中。
14.用于根据权利要求13的用途的组合物，其中所述受试者表现出超过1000个病毒DNA拷贝/ml血液的EBV和/或CMV病毒滴度。
15.用于根据权利要求13或权利要求14的用途的组合物，其中在免疫调节疗法的第一剂之前14天开始并在免疫调节疗法的最后一剂结束的时期期间的任何时点，所述受试者表现出升高的和/或正在升高的EBV和/或CMV病毒滴度。
16.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述组合物抑制和/或杀死CD3+和/或CD7+ T-细胞。
17.用于根据权利要求16的用途的组合物，其中所述组合物相对于CD3+和/或CD7+ T-细胞赦免了CD8+ 抗病毒T-细胞。
18.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中：
(i)所述治疗方法包括预防移植后淋巴增生性障碍(PTLD)和/或进行性多灶性白质脑病(PML)；和/或
(ii)监测所述受试者的病毒感染和/或再激活。
19.用于根据权利要求18(ii)的用途的组合物，其中监测所述受试者的病毒感染和/或再激活包括在免疫调节治疗之前、过程中和/或之后测量：
病毒滴度；
病毒培养物；
病毒抗原检测；
病毒血清学；和/或
免疫组织化学
至少一次。
20.用于根据权利要求19的用途的组合物，其中所述监测包括通过实时定量PCR测量血浆病毒滴度。
21.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中正在或已经用预防性抗病毒药物治疗所述受试者。
22.用于根据前述权利要求中的任一项的用途的组合物，其中所述组合物以部件试剂盒的形式提供，所述部件试剂盒包括包含所述第一抗体分子的第一部分和包含所述第二抗体分子的第二部分，其中所述第一和第二部分用于同时、分别或序贯施用给受试者。
23.一种治疗具有病毒感染或病毒再激活或者处于病毒感染或病毒再激活的风险中的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
向需要所述治疗的受试者同时、分别或序贯施用治疗有效量的特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，
并且其中所述受试者正在进行免疫调节治疗。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一和第二抗体分子以一剂或多剂组合物的形式提供，所述组合物包含100:1至1:100之间的摩尔比的所述第一和第二抗体分子。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述病毒感染或病毒再激活伴随疱疹病毒目或多瘤病毒科的病毒。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病毒感染或病毒再激活选自人巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和JC病毒。
27.根据权利要求23-26中的任一项所述的方法，其中所述免疫调节治疗包括移植物抗宿主病(GvHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗。
28.根据权利要求23-27中的任一项所述的方法，其中所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物。
29.根据权利要求23-28中的任一项所述的方法，其中所述第一抗体分子和/或所述第二抗体分子是鼠抗体。
30.根据权利要求23-29中的任一项所述的方法，其中所述第一抗体分子是选择性地结合人CD3的IgG2b同种型单克隆抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一抗体分子是抗体SPV-T3a。
32.根据权利要求23-31中的任一项所述的方法，其中所述第二抗体分子是IgG2a同种型单克隆抗体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二抗体分子是抗体WT1。
34.根据权利要求23-33中的任一项所述的方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体缀合至选自蓖麻毒蛋白、去糖基化的蓖麻毒蛋白A (dgRTA)和未糖基化的重组蓖麻毒蛋白A的毒性部分。
35.根据权利要求23-34中的任一项所述的方法，其中将以下至少一种去免疫化：
所述第一抗体；
所述第二抗体；
所述第一抗体的毒性部分；和
所述第二抗体的毒性部分。
36.根据权利要求23-35中的任一项所述的方法，其中所述受试者已经被确定具有EBV和/或CMV病毒感染或处于所述感染的风险中。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者表现出超过1000个病毒DNA拷贝/ml血液的EBV和/或CMV病毒滴度。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中在免疫调节治疗的第一剂之前14天开始并在免疫调节治疗的最后一剂结束的时期期间的任何时点，所述受试者表现出升高的和/或正在升高的EBV和/或CMV病毒滴度。
39.根据权利要求23-38中的任一项所述的方法，其中所述组合物抑制和/或杀死CD3+和/或CD7+ T-细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述组合物相对于CD3+和/或CD7+ T-细胞赦免了CD8+ 抗病毒T-细胞。
41.根据权利要求23-40中的任一项所述的方法，其中所述治疗方法包括预防移植后淋巴增生性障碍(PTLD)和/或进行性多灶性白质脑病(PML)。
42.根据权利要求23-41中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括监测所述受试者的病毒感染和/或再激活。
43.根据权利要求42所述的方法，其中监测所述受试者的病毒感染和/或再激活包括在免疫调节治疗之前、过程中和/或之后测量：
病毒滴度；
病毒培养物；
病毒抗原检测；
病毒血清学；和/或
免疫组织化学
至少一次。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述监测包括通过实时定量PCR测量血浆病毒滴度。
45.根据权利要求23-44中的任一项所述的方法，其中正在或已经用预防性抗病毒药物治疗所述受试者。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述抗病毒药物包括阿昔洛韦。
47.一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其用于用在进行免疫调节治疗的哺乳动物受试者中的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的治疗或预防性治疗方法中，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分。
48.用于权利要求47的用途的组合物，其中所述组合物用于用在cGVHD的预防性治疗中以提供临床益处，如在所述免疫调节治疗后180天通过cGVHD的发生率所测量的。
49.用于权利要求47或权利要求48的用途的组合物，其中所述组合物用于根据前述权利要求中的任一项的用途，其中所述免疫调节治疗包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)的治疗。
50.用于根据权利要求47-49中的任一项的用途的组合物，其中所述组合物是用于免疫调节治疗的相同组合物。
51.用于根据权利要求47-50中的任一项的用途的组合物，其中所述第一和第二抗体分子如在权利要求6-11中的任一项中所定义。
52.一种治疗具有慢性移植物抗宿主病(cGVHD)或处于发生该疾病的风险中的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
向需要所述治疗的受试者同时、分别或序贯施用治疗有效量的特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，
并且其中所述受试者正在进行免疫调节治疗。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述免疫调节治疗包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)的治疗。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述方法是cGVHD的预防性治疗方法以提供临床益处，如通过在所述免疫调节治疗后180天cGVHD的发生率所测量的。
55.根据权利要求52-54中的任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗体分子如在权利要求6-11中的任一项中所定义。
56.一种药物组合物，其包含：
(i) 0.05-0.5 mg/mL、任选地0.2 mg/mL的单克隆抗体分子，其特异性地识别CD3并且其缀合至至少一种蓖麻毒蛋白毒素A (RTA)，和/或
0.05-0.5 mg/mL、任选地0.2 mg/mL的单克隆抗体分子，其特异性地识别CD7并且其缀合至至少一种RTA；
(ii) 5-20 mM、任选地10 mM的柠檬酸盐缓冲液；
(iii) 50-300 mM、任选地75-200 mM或125 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐；
(vi) 0.01-0.1%(w/v)、任选地0.05%(w/v)的聚山梨酯，
其中所述组合物在水中并且具有在6-7.5范围内的pH，任选地6.5的pH。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中：
(a)所述特异性地识别CD3的抗体分子是选择性地结合人CD3的鼠IgG2b同种型单克隆抗体；和/或
(b)所述特异性地识别CD7的抗体分子是选择性地结合人CD7的鼠IgG2a同种型单克隆抗体。
58.根据权利要求57所述的组合物, 所述特异性地识别CD3的抗体分子是SPV-T3a和/或所述特异性地识别CD7的抗体分子是WT1。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中SPV-T3a和WT1都存在且各自缀合至平均每个抗体分子1-2个去糖基化的RTA (dgRTA)分子，且其中所述缀合经由4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯交联剂进行。
60.根据权利要求56-59中的任一项所述的组合物，其中：
(a)所述柠檬酸盐缓冲液包含柠檬酸钠或柠檬酸钾；
(b)所述L-精氨酸盐是L-精氨酸.HCl；和/或
(c)所述聚山梨酯是吐温(RTM) 20。
61.根据权利要求56-60中的任一项所述的组合物，其进一步包含至少一种选自以下的试剂：
120-160 mM麦芽糖；
100-150 mM、任选地125 mM海藻糖；
25-75 mM、任选地50 mM甘氨酸；和
80-120 mM、任选地100 mM甘露醇。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述至少一种试剂是130-150 mM、任选地140mM麦芽糖一水合物。
63.根据权利要求56-62中的任一项所述的组合物，其包含：
(i) 0.2 mg/mL的SPV-T3a-dgRTA和0.2 mg/ml的WT1-dgRTA；
(ii) 10 mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液；
(iii) 125 mM L-精氨酸.HCl；
(iv) 0.05%(w/v)吐温(RTM) 20；
(v) 140 mM麦芽糖一水合物
其中所述组合物在注射用水中且具有6.5的pH。
64.一种冻干组合物，其呈如在权利要求56-63中的任一项中所定义的组合物的冷冻干燥形式，且其适合用于用水或水溶液重构以形成权利要求56-63中的任一项的组合物。
65.根据权利要求56-64中的任一项所述的组合物，其用于用在权利要求23-46中的任一项和/或权利要求52-55中的任一项的方法中。
66.用于用在药物中的根据权利要求56-64中的任一项的组合物。
67.根据权利要求56-64中的任一项的组合物，其用于用在哺乳动物受试者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗方法中。
68.一种包含特异性地识别CD3的第一抗体分子和特异性地识别CD7的第二抗体分子的组合物，其中所述第一和第二抗体分子各自提供有毒性部分，所述组合物用于用在人患者中的急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物排斥、自身免疫疾病、T-细胞白血病或T-细胞淋巴瘤的治疗方法中，其中所述患者具有小于30 g/L的血清白蛋白水平，如在施用所述组合物之前测量的。
69.用于根据权利要求68的用途的组合物，其中所述患者具有在10 g/L至30 g/L之间、任选地在15 g/L至25 g/L之间的血清白蛋白水平。
70.用于根据权利要求68或权利要求69的用途的组合物，其中所述组合物用于用在方法中以提供临床益处，如通过所述组合物施用后3级或更高的毛细血管渗漏综合征(CLS)的发生率来测量的。
71.用于根据权利要求68-70中的任一项的用途的组合物，其中所述第一和第二抗体分子如在权利要求6-11中的任一项中所定义，或其中所述组合物如在权利要求56-64中的任一项中所定义。
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