CN111629726A - 通过激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体抵抗呼吸抑制的方法 - Google Patents

Abstract

提供了能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物，并且所述化合物可以以类似药物组合物的形式给药。还提供了使用所述化合物治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的的呼吸抑制和用药过量的方法。还提供了诱发受试者镇痛、麻醉或镇静，同时治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量的方法。

Description

通过激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体抵抗呼吸抑制的 方法

发明人：任军；约翰·格里尔

受让人：阿尔伯塔大学理事会

技术领域

本发明涉及使用靶向神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体(neuronal heteromericnicotinic acetylcholine receptors)的化合物治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因引起的受试者呼吸抑制和用药过量的方法，所述其他原因包括非阿片样物质、阻塞性睡眠呼吸暂停、中枢性睡眠呼吸暂停、早产呼吸暂停、低氧、普拉德-威利综合症(Prader-Willi Syndrome)、雷特综合症、庞皮病、潮式(Cheyne-Stokes)呼吸、神经元变性、中风、心力衰竭、脑外伤、帕金森氏病或脊髓损伤。

背景技术

阿片类镇痛药是用于治疗急性、术后和慢性疼痛的被使用最广泛的有效药物(Swarm等人，2001)。然而，阿片剂受体的激活导致对呼吸驱动的抑制(舒克(Shook)等人，1990；格里尔(Greer)等人，1995；格雷(Gray)等人，1999；基维尔(Kivell)等人，2004；洛里耶(Lorier)等人，2010)。呼吸频率降低的一个重要原因是由于阿片样物质与前包钦格复合体(

complex，

)中吸气节律产生神经元上表达的μ-阿片剂受体结合(格雷(Gray)等人，2001；蒙坦东(Montandon)等人，2011)。此外，阿片样物质抑制舌下(XII)运动神经元放电，从而抑制对于维持开放气道至关重要的舌头的颏舌肌的激活(洛里耶(Lorier)等人，2010；哈吉哈(Hajiya)等人，2009)。对阿片样物质诱发的呼吸抑制(opioid-induced respiratory depression,OIRD)的敏感性在个体之间差异显著(德霍希尔(Desrosiers)，2006)。很难预测哪些患者最为敏感；然而，较大的年龄、影响心肺系统的疾病和睡眠呼吸暂停是增加患者受到来自OIRD的伤害的风险的因素(德霍希尔(Desrosiers)，2006；阿格罗(Agro)等人，2004；罗纳斯(Launois)等人，2007)。较长时间的患者自控镇痛是出现OIRD问题(即低氧血症或意外死亡)的另一个领域。在北美和其他地区，羟考酮和芬太尼的使用导致致命性用药过量的发病率的增加也是一个主要问题(加拿大社区药物使用流行病学网络简报(CCENDU Bulletin)，2015；疾病防治中心(CDC)，2017)。

施用阿片样物质受体拮抗剂纳洛酮的现行实践有效抵抗OIRD，但以丧失镇痛作用为代价。因此，临床医生必须在局部镇痛与可控制的呼吸抑制之间找到平衡。临床前数据表明，血清素受体的激活可以克服OIRD(冈瑟(Guenther)等人，2009，2010，2012)。血清素能受体激动剂抵御OIRD在大鼠模型中的功效已经被证实，但以诱发明显的副作用为代价(雷恩(Ren)等人，2015)。临床前数据与评估血清素能受体药剂抵御OIRD的临床试验一致，这些临床试验均显示在剂量低于引起严重副作用的剂量时缺乏疗效(勒琴

等人，2005；厄特尔(Oertel)等人，2007)。抵抗OIRD的另一策略是从药理学上阻断颈动脉体和CNS神经元上的大电导钙激活钾离子通道(BK_Ca-channels)，由此在大鼠和人类中诱发换气过度，从而部分地抵消了与OIRD相关的换气不足(戈尔德(Golder)等人，2013；麦克劳德(McLeod)等人，2014；鲁泽克兰斯(Roozekrans)等人，2015)。但是，该研究计划似乎已经停止，并且还没有充分发展到能确定其临床适用性(http://www.galleonpharma.com)。

在啮齿动物模型中抵抗OIRD的被称为安帕金(ampakines)的药物被发现，该药物正向调控AMPA(氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)受体(格雷(Gray)等人，1999；雷恩(Ren)等人，2006；2009)。同样地，来自IIa阶段试验的数据显示，安帕金对遭受由阿芬太尼诱发的中度呼吸抑制的人具有疗效(厄特尔(Oertel)等人，2010)。但是，在使用引起快速而严重的呼吸抑制的瑞芬太尼团注给药的第二IIa阶段临床试验中安帕金无效(克里斯托(Krystal)等人，2017)。更烈性的安帕金可能更有效，但存在有关刺激CNS的问题(林奇(Lynch)，2006；林奇(Lynch)和加尔(Gall)，2006)。安帕金的溶解度限制导致目前只有口服配方能够用于临床试验，并且它们与安帕金达到血浆治疗水平(>1小时)的延迟相关。因此，快速减少OIRD而不干扰所需的镇痛作用并且不诱发显著副作用的药物治疗仍然是尚未被满足的临床需求。

阿片样物质不是引起呼吸抑制的唯一一类药物。异丙酚、醇、巴比妥酸盐和苯二氮卓类均可通过抑制呼吸节律发生引起呼吸抑制，并驱动颅运动神经元和脊髓运动神经元(雷恩(Ren)和格里尔(Greer)，2006；雷恩(Ren)等人，2012，2013)。这些药剂的作用机制的重要部分是经过位于前包钦格复合体

神经元和呼吸运动神经元上的GABAA受体电导的调节。除阿片样和非阿片样药物之外，呼吸抑制的其他机制或原因还包括阻塞性睡眠呼吸暂停、中枢性睡眠呼吸暂停、早产呼吸暂停、普拉德-威利综合征、雷特综合征、庞皮病、潮式呼吸、神经元变性、中风、心力衰竭、脑外伤、帕金森氏病和脊髓损伤。

烟碱型受体由五个亚基组成，围绕中心孔对称排列(戈蒂(Gotti)等人，2006)。已有在呼吸网络所在的脑干中的和在调节呼吸的颈动脉化学感受器上的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的报道。(瓦达(Wada)等人，1989；邵(Shao)和费尔德曼(Feldman)，2002；尚贝兰(Chamberlin)等人，2002；刘(Liu)等人，2005；叶杜立(Hatori)等人，2006)。这包括α7、α4、α3、β4和β2亚基。

因此，本领域中需要说明上述化合物在抵抗阿片样物质诱发、非阿片样物质诱发或其他原因的呼吸抑制中的相对功效。

发明内容

本发明涉及使用靶向神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的方法。

一方面，本发明包括一种治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的方法，包括对所述受试者给药有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物。

在一种实施方式中，呼吸抑制的其他原因选自非阿片类药物、阻塞性睡眠呼吸暂停、中枢性睡眠呼吸暂停、早产呼吸暂停、低氧、普拉德-威利综合症、雷特综合症、庞皮病、潮式呼吸、神经元变性、中风、心力衰竭、脑外伤、帕金森氏病或脊髓损伤。在一种实施方式中，非阿片类药物选自异丙酚、异氟烷、巴比妥酸盐、苯二氮卓类、挥发性麻醉剂或醇。

在一种实施方式中，通过化合物的口服、鼻孔喷雾、静脉内或肌肉内给药来治疗、预防或改善呼吸抑制和用药过量或其他原因的呼吸抑制。

在一种实施方式中，所述化合物选自正向变构调节剂或烟碱型乙酰胆碱激动剂，所述烟碱乙酰胆碱激动剂选自作用于α4β2 nAChRs的完全激动剂或部分激动剂。在一种实施方式中，所述完全激动剂包括3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(A85380)。在一种实施方式中，所述部分激动剂包括(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺(利万西林(Rivanicline))。在一种实施方式中，所述正向变构调节剂包括3-[3-(3-吡啶基)-1,2,4-恶二唑-5基]苄腈(NS9283)。

在一种实施方式中，所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是含有α4β2和可能的其他类型的β2的烟碱型乙酰胆碱受体。在一种实施方式中，所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是含有β4的烟碱型乙酰胆碱受体。

另一方面，本发明包括激活细胞或有机体中的神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的方法，包括将所述细胞或所述有机体暴露于上述化合物。在一种实施方式中，所述细胞包括神经元细胞。

又一方面，本发明包括一种诱发受试者的镇痛、麻醉或镇静，同时治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量的方法，包括对所述受试者给药有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物。

根据下面的描述，本发明的其他方面和优点将是显而易见的。但是，应当理解，尽管详细描述和具体示例示出了本发明的优选实施方式，但其仅以示意说明的方式给出，因为对于本领域技术人员而言，本发明的精神和范围内的各种变化和修改将从这些详细描述变得显而易见。

附图说明

现将参照所附简化的、概略的、不按比例的图以示例性实施例的方式描述本发明。图中：

图1是用于评估α4β2 nAChR化合物对芬太尼诱发的成年大鼠的呼吸抑制、镇痛和镇静的影响的现有方法(雷恩(Ren)等人，2015)的示意图。

图2A-E是在媒介物(生理盐水)(图2A)、A85380(图2B)、利万西林(图2C)、NS9283(图2D)和PNU282987(图2E)给药后来自全身体积描记器记录的呼吸速率的痕迹。

图2F是示出响应于芬太尼以及随后媒介物(生理盐水)、A85380和利万西林给药的呼吸频率变化的时间进程的群体数据图。

图2G是示出响应于芬太尼以及随后媒介物(HPCD)、NS9283和PNU282987给药的呼吸频率变化的时间进程的群体数据图。

图3A-D是来自第四颈神经的整流和集成放电的记录，其示出了体外制剂中A85380(25nM)、利万西林(0.5μM)、NS9283(15μM)和PNU282987(1-20μM)对脑干-脊髓产生的呼吸节律的影响。

图3E-F是群体数据图。

图3G-J是来自第四颈神经的整流和集成放电的记录，其示出了DAMGO浸浴后A85380、利万西林、NS9283和PNU282987的影响。

图3K-L是群体数据图。

图4A-B是来自髓质切片和

中的舌下神经(XIIn)的整流和集成放电的记录，其示出了A85380(25nM)的影响以及由DHβE(200nM)(图4A)对这种影响的逆转；以及A85380对DAMGO影响的逆转(图4B)。

图4C-D是群体数据的图。

图5是来自第四颈神经的整流和集成放电的记录，其示出了在体外制剂中存在乙醇(50mM)和戊巴比妥(50μM)的情况下A85380(25nM)对脑干-脊髓产生的呼吸节律的影响。

图6A-B是在A85380和异丙酚共同给药后，来自全身体积描记器记录的呼吸活动的痕迹。

图7示出来自舌下神经(XIIn)的整流和集成放电的记录，其示出了在体外制剂中存在低于正常细胞外钾水平(6mM)的情况下，A85380(25nM)对由髓质切片产生的呼吸节律和运动输出的影响。

图8涉及在阻塞性和中枢性呼吸暂停以及早产呼吸暂停中发生的对舌下运动神经元的弱呼吸驱动，并示出来自在C2水平下切开的脑干-脊髓的舌下神经(XIIn)的整流和集成放电的记录：40分钟内初始强烈呼吸活动，随后为缓慢呼吸频率和微弱运动输出(幅度小且爆发持续时间短)，以及在浸浴A85380(25nM)后呼吸频率、幅度和爆发持续时间增加的时期。

图9涉及脊髓损伤，并示出具有C2半切的脑干-脊髓制剂的示意图(左)，以及来自P0大鼠脑干-脊髓制剂的C4记录形成的整流和集成信号，其示出了对侧(A：顶部痕迹)和同侧(B：底部痕迹)至一侧C2半切的呼吸活动。

图10A-D是来自四个出生后第3天幼崽的代表性全身体积描记记录，其示出了沙西替丁-A(sazetidine-A)(0.5mg/kg)和VMY-2-95(1mg/kg)对芬太尼诱发的新生大鼠呼吸抑制的影响。

图10E-G是群体数据的图，其示出了呼吸频率(f_R)、潮气量(V_T)和每分钟通气量(V_E)与芬太尼给药前的对照组的比较：沙西替丁(sazetidine)和VMY-2-95对芬太尼诱发的呼吸抑制的依赖剂量的缓解，这两种影响均被α4β2、α6β2、α4β4拮抗剂DHβE阻断。

图11A-C示出媒介物(HPCD，静脉团注(iv bolus)，芬太尼之后约7分钟)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响(图11A)，沙西替丁-A(1mg/kg，静脉团注，芬太尼之后约7分钟)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响(图11B)，VMY-2-95(1mg/kg，静脉团注)给药逆转了芬太尼诱发的呼吸速率下降(图11C)。

图11D是群体数据图，其示出了沙西替丁-A(0.5-2mg/kg)对芬太尼诱发的呼吸速率降低(相对于芬太尼输注之前的对照组)没有影响。

图11E是群体数据图，其示出了VMY-2-95(1mg/kg)诱发的对芬太尼诱发的呼吸速率降低的缓解(相对于芬太尼输注之前的对照组)。

图12A和12B是来自两只幼崽的代表性全身体积描记记录。图12A示出与生理盐水媒介物共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药，在芬太尼给药后的7分钟内引起呼吸频率的明显抑制和潮气量的轻度抑制，随后的SIB 1553A(40mg/kg)给药分别部分逆转了芬太尼诱发的呼吸速率(f_R)的下降，而对芬太尼诱发的潮气量(V_T)的下降没有明显影响。图12B示出与非选择性烟碱型受体拮抗剂梅坎米胺(mecamylamine,Mec)(6mg/kg)共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药，在芬太尼给药后的7分钟内引起呼吸频率的明显抑制和潮气量的轻度抑制，随后的SIB 1553A(40mg/kg)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响。

图12C是示出在芬太尼给药之前相对于对照组的f_R的群体数据。

图13A和13B是来自两只幼崽的代表性全身体积描记记录。图13A示出与生理盐水媒介物共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药，在芬太尼给药后的7分钟内引起呼吸频率的明显抑制和潮气量的轻度抑制，随后的洛贝林(lobeline)(10mg/kg)给药部分逆转了芬太尼诱发的呼吸速率(f_R)的降低，并且完全逆转了芬太尼诱发的潮气量(V_T)的降低。图13B示出了与非选择性nAChR受体拮抗剂梅坎米胺(6mg/kg)共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药不影响芬太尼诱发的呼吸抑制，并且随后的洛贝林(10mg/kg，芬太尼后7分钟)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制的影响更小。

图13C-E是示出相对于芬太尼给药之前的对照组的f_R、V_T和每分钟通气量(V_E)的群体数据。

图14A和14B示出了芬太尼(30μg/kg，10分钟，静脉输注)给药在来自两只大鼠的全身体积描记记录中引起明显的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)。随后的生理盐水媒介物(静脉注射(iv))给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响(图14A)，并且随后的洛贝林(3mg/kg，静脉团注，芬太尼后约7分钟)给药完全逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制(图14B)。

图14C-E是示出相对于芬太尼输注之前的对照组的呼吸参数(f_R、V_T、V_E)的群体数据。

图14F是显示动脉血氧饱和度(Sao₂)的群体数据。

图15示出了洛贝林对成年大鼠心率的影响。示出的数据点为在生理盐水后2分钟(静脉注射，n＝5)，洛贝林后2分钟(3mg/kg，静脉注射，n＝5)，芬太尼后7分钟(30μg/kg，10分钟，静脉输注)，以及在随后的生理盐水(n＝8)或洛贝林(n＝8)给药后2分钟。

图16A-C示出了芬太尼(12μg/kg，1分钟，静脉输注)与生理盐水媒介物(1分钟静脉输注)的共同给药引起两只大鼠明显的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)和呼吸暂停(图16A-B)，以及芬太尼(12μg/kg，1分钟，静脉输注)与洛贝林(3mg/kg，1分钟，静脉输注)共同给药明显防止了芬太尼诱发的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)以及消除了呼吸暂停(图16C)。

图17A和17B示出洛贝林对进行伤害性行为(舔和举)所花费时间的影响，其中图17A是I阶段(福尔马林注射后0-5分钟)，17B是II阶段(福尔马林注射后20-40分钟)。

图18A-C示出烟碱(600nM)或A85380(25nM)的浸浴应用明显增加了基线呼吸频率(f_R)，而对新生儿脑干-脊髓制剂的呼吸幅度、持续时间和面积没有影响。PNU282987(30μM)轻度增加了基线f_R。

图18D-F示出DAMGO(200nM)抑制f_R和爆发面积，该影响被随后的烟碱(600nM)，A85380(25nM)的应用逆转，而未被PNU282987(30μM)的应用逆转。

图18G示出DAMGO和α4β2拮抗剂DHβE(400nM)的共同给药抑制了f_R和爆发面积；该作用不再受到随后烟碱(600nM)的应用的影响。

图18H-I是示出基线f_R和DAMGO诱发的呼吸抑制(相对于对照组)的群体数据。

图19A示出A85380的浸浴应用增加了基线呼吸频率并且降低了基线呼吸爆发面积。

图19B示出DAMGO(200nM)的浸浴应用抑制了呼吸频率和爆发面积；该影响被随后A85380的应用逆转。

图19C是群体数据。

图20A-F是源自六个产后第3天幼崽的代表性全身体积描记记录。芬太尼给药(35μg/kg，图20A-D)或与DHβE(6mg/kg，图20E-F)的共同给药在芬太尼给药后7分钟内导致呼吸频率的明显抑制以及潮气量轻度抑制。随后的生理盐水给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用(图20A)。烟碱(0.6mg/kg，图20B)和A85380(0.06mg/kg，图20C)而非PNU282987(20mg/kg，图20D)逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制。然而，烟碱(0.6mg/kg，图20E)和A85380(0.06mg/kg，图20F)均对由与DHβE(6mg/kg)共同给药的芬太尼诱发的呼吸抑制不产生任何影响。

图20G-1是示出相对于芬太尼给药前的对照组，呼吸频率(f_R)、潮气量(V_T)和每分钟通气量(V_E)的群体数据。

图21A-D是来自4只成年大鼠的代表性全身体积描记记录。芬太尼(60μg/kg，20分钟以上，静脉输注)给药在输注的7分钟内引起呼吸速率的明显下降。芬太尼诱发的呼吸频率的下降不受后续生理盐水(图21A)或PNU282987(10mg/kg，图21D)给药(静脉注射)的影响，但被烟碱(0.3mg/kg，图21B)和A85380(0.03mg/kg，图21C)减弱。

图21E-G是示出相对于给药之前的对照组，呼吸频率变化的时间进程的群体数据。

图22A和22B是来自2只成年大鼠的代表性全身体积描记记录，其中在生理盐水(颈部皮下给药)后2分钟，芬太尼(20μg/kg，400s，静脉输注)给药引起呼吸频率和每分钟通气量的明显抑制(图22A)，并且在芬太尼给药前2分钟预先给药A85380(0.06mg/kg，皮下)减少了芬太尼诱发的呼吸频率的下降(图22B)。

图22C是示出相对于给药之前的对照组，呼吸频率的群体数据。

图23A和23B是来自2只成年大鼠的代表性全身体积描记记录，其中大剂量的瑞芬太尼(5μg/kg，静脉团注20s，与生理盐水共同给药)引起明显的呼吸暂停并在第一分钟内降低每分钟通气量(V_E)(图23A)，并且A85380(0.06mg/kg，静脉注射)与瑞芬太尼的共同给药明显减少了瑞芬太尼诱发的呼吸暂停和V_E的降低(图23B)。

图23C-D是群体数据。

图24提供实验方案的图形概要。在芬太尼给药(20μg/kg，400s，静脉输注)前2分钟给药A85380(0.06mg/kg，皮下颈部，皮下)或生理盐水。特别地，在一组动物中，在芬太尼给药10分钟后开始翻正反射测试，然后将动物从腔室中移出，在芬太尼给药40分钟后进行热伤害感受测试(图24A)。在另一组动物中，在芬太尼给药后10分钟给药福尔马林(图24B)。

图25A示出在包含或不包含(W/O)随后芬太尼输注的情况下给药A85380或生理盐水之后42分钟时测量的、A85380对响应于热刺激的缩爪潜伏期的影响。

图25B示出在W/O随后芬太尼输注的情况下给药A85380或生理盐水之后32-52分钟时测量的、A85380对福尔马林给药后20-40分钟伤害感受行为(舔和举)所花费的时间的影响。

具体实施方式

在进一步详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，当然，这些实施方式可能会发生变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

应当理解，当提供值的一个范围时，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指出)以及所述范围内的任何其他所述的值或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，同样也包含在本发明内，但以所述范围内的任何明确排除的极限为准。当所述范围包括一个或两个极限时，排除那些所包括的极限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。

除非文中另有明确指明，必须说明的本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了有限数量的示例性方法和材料。

必须注意的是，本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数的指代物，除非上下文另外明确的指出。

本发明涉及使用靶向神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物用于治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的方法。

如本文所使用的，缩写“神经元”是指神经元或神经细胞，其是通过电和化学信号接收、处理和传输信息的电可兴奋细胞。神经元是包括大脑和脊髓的中枢神经系统以及包括自主神经系统和躯体神经系统的周围神经系统的主要组成部分。

如本文所使用的，术语“神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体”(缩写为“神经元nAChR”或“神经元nAChRs”)是指在神经元中发现的具有不同药理和生物物理特性和位置的α(2-10)和β(2-4)亚基的异聚组合的五聚体(戈蒂(Gotti)等人，2006)。β2和β4烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚基在整个中枢神经系统和周围神经系统中表达。这两个β亚基可以与α2、α3、α4或α5亚基中的任意一个形成异源多聚体通道。α4β2在哺乳动物的脑中含量最高，而α3β4主要在周围神经节中。神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体需要不同的亚基装配配偶体(至少一个α亚基加上至少一个β亚基)，包括但不限于α2β4、α3β4、α4β4、α2β2、α3β2、α4β2、α6β2、α7β2、α4α5β2和α4α6β2烟碱型乙酰胆碱受体。

如本文所使用的，术语“化合物”是指靶向神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的物质。在一种实施方式中，所述化合物选自烟碱乙酰胆碱激动剂或正向变构调节剂。

如本文所使用的，术语“激动剂”是指与受体结合并激活受体以产生生物响应的化合物。如本文所用，术语“烟碱型乙酰胆碱激动剂”是指模拟烟碱型乙酰胆碱受体处的乙酰胆碱的作用的化合物。在一种实施方式中，烟碱型乙酰胆碱激动剂包括完全激动剂。如本文所使用的，“完全激动剂”以等同于内源激动剂的功效结合并激活受体。在一种实施方式中，完全激动剂包含3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(缩写为“A85380”，由雅培公司(Abbott Laboratories)开发)。A85380对α4β2或α6β2烟碱型乙酰胆碱受体具有选择性。此外，A85380是一种广谱镇痛药，其剂量(0.02-0.06mg/kg)不会诱发明显的行为影响(沙利文(Sullivan)等人，1996；柯曾(Curzon)等人，1998；鲁特(Rueter)等人，2000；鲁特(Rueter)等人，2003；鲁特(Rueter)等人，2006)。放射标记形式的A85380对人类是安全的(鲁特(Rueter)等人，2006)。在一种实施方式中，完全激动剂是2-((2R,6S)-6-((S)-2-羟基-2-苯基乙基)-1-甲基哌啶-2-基)-1-苯基乙酮，其通常被称为作为“洛贝林”。洛贝林是人类α4β4nAChR的完全激动剂、人类α4β2 nAChR的部分激动剂和大鼠α3β4 nAChR的部分激动剂(吴(Wu)等人，2006；卡尼克娃(Kaniakova)等人，2014)。

在一种实施方式中，烟碱型乙酰胆碱激动剂包括部分激动剂。如本文所使用的，“部分激动剂”以比内源激动剂低的效率结合和激活受体。在一种实施方式中，部分激动剂包括(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺或(E)-间烟碱((E)-metanicotine)，其通常被称为“利万西林”(由塔格赛普特(Targacept)和福尔克医药(Falk Pharmaceuticals)共同开发)。利万西林对α4β2、α6β2烟碱型乙酰胆碱受体表现出选择性。此外，利万西林是一种广谱镇痛药，其剂量(3-10mg/kg)不会在啮齿动物中诱发显著的副作用(利普爱罗(Lippiello)等人，1996；达玛(Damaj)等人，1999)。在一种实施方式中，α4β2、α6β2烟碱型乙酰胆碱受体的部分激动剂包含6-[5-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-3-吡啶基]-5-己炔-1-醇，其通常被称为“沙西替丁-A”及其类似物3-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-5-(2-苯基乙炔基)-吡啶，其通常被称为“VMY-2-95”。在一种实施方式中，部分激动剂是(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚，其通常被称为“SIB-1533A”，并且其是α4β2烟碱型乙酰胆碱受体的部分激动剂，但是为含β4的选择性亚型烟碱型乙酰胆碱受体(例如α2β4烟碱型乙酰胆碱受体)的完全激动剂。

如本文所使用的，术语“正向变构调节剂”是指诱发直接激活或失活靶蛋白功能的初级配体作用放大的化合物。本发明的正向变构调节剂是间接增加受体活性的神经元异源烟碱型乙酰胆碱受体的变构调节剂。在一种实施方式中，正向变构调节剂(positiveallosteric modulator,PAM)包含3-[3-(3-吡啶基)-1,2,4-恶二唑-5基]苄腈，其通常被称为“NS9283”(由神经研究公司(Neurosearch Inc.)开发)。NS9283被开发为止痛药(李(Lee)等人，2011；潘迪亚(Pandya)等人，2011；朱(Zhu)等人，2011；罗德(Rode)等人，2012；蒂默曼(Timmermann)等人，2012；格鲁普(Grupe)等人，2013；奥尔森(Olsen)等人，2013年)。NS9283本身对烟碱乙酰胆碱受体没有任何内在活性，而是通过降低失活速率来放大乙酰胆碱结合的作用。NS9283(2.5-30mg/kg)不会在啮齿动物中诱发副作用(李(Lee)等人，2011；朱(Zhu)等人，2011；蒂默曼(Timmermann)等人，2012)。NS9283是(α4)₃(β2)₂nAChR的正向变构调节剂。

可用于本发明的其他烟碱型乙酰胆碱完全激动剂、部分激动剂和PAMS包括但不限于3-溴野靛碱(3-bromcytisine)、3-吡啶-野靛碱(3-pyr-Cytisine)、5-碘代-A-85380、2-甲基-3-{[(2S)-吡咯烷-2-基]甲氧基}吡啶(ABT 089，泊桑尼克(pozanicline))、1-吡啶-3-基吡咯烷-3-胺(ABT202)、ABT418(依班比林(ebanicline))、ABT 594([(R)-5-(2-氮杂环丁烷基甲氧基)-2-氯吡啶]，替班尼克(tebanicline))、(1S，5S)-3-(5,6-二氯-3-吡啶基)-3,6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷(ABT894，索菲尼克林(sofinicline))、2S)-3-乙炔基-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(奥替尼克林(Altinicline)，SIB-1508Y)、AVE 3183、AZD1446(TC6683)、(2S,4E)-5-(5-异丙氧基吡啶-3-基)-N-甲基戊-4-烯-2-胺(AZD-3480，异丙克兰(Ispronicline)，TC-1734)、大麻二酚、CC4、CP-601927、野靛碱、(5aS,8S,10aR)-5a,6,9,10-四氢,7H,11H-8,10a-甲基吡啶并[2',3':5,6]吡喃并[2,3-d]氮杂卓(达尼克林(Dianicline)，SSR-591,813)、地甲酰氟溴(Desformylflustrabromine)(2-[6-溴-2-(2-甲基丁-3-烯-2-基)-1H-吲哚-3-基]-N-甲基乙胺)、二甲基苯基哌嗪鎓(Dimethylphenylpiperazinium，DMPP)、烟碱、RJR 2429、TC 1827、TC 2216、TC 2559、TC2696、TC 6499、TC 8831、TI-10165、UB-165和7,8,9,10-四氢-6,10-甲基-6H-吡嗪并[2,3-h][3]苯并氮杂卓(伐尼克林(Varenicline)、戒必适(Chantix)、畅沛(Champix))。

本发明的某些实施方式涉及用于治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的靶向神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的方法以及上述化合物的用途。在一种实施方式中，本发明包括一种治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的方法，包括向受试者给药有效量的上述化合物中的一种。在一种实施方式中，本发明包括使用上述化合物的一种治疗、预防或改善受试者的由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量的用途。

在一种实施方式中，本发明包括一种激活细胞或有机体中的神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的方法，包括将所述细胞或所述有机体暴露于上述化合物。在一种实施方式中，所述细胞包括神经元细胞。

在一种实施方式中，本发明包括一种诱发受试者镇痛、麻醉或镇静，同时治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量的方法，包括对所述受试者给药有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包含该化合物的组合物。

如本文所使用的，术语“呼吸抑制”是指以呼吸频率以及对颅运动神经元和脊髓运动神经元的吸气驱动减小为特征的多种病症。具体而言，呼吸抑制是指与呼吸节律产生活动相关的髓神经网络对血液中PCO₂的累积水平(或PO₂的下降水平)无反应，且随后不足以刺激控制肺肌肉的运动神经元的病症。该术语旨在包括与麻醉药(例如，异丙酚、异氟烷)、巴比妥类、苯二氮卓类、醇、早产呼吸暂停，遗传性疾病(例如，雷特综合征、庞皮病)、潮式呼吸以及神经性障碍(例如中风、创伤、影响脑干的退行性疾病)有关的呼吸抑制的其他原因。

如本文所使用的，术语“阿片样物质”意在包括天然或合成的具有镇静、麻醉或其他类似于含有鸦片或其天然或合成衍生物的那些的作用的药物、激素或其他化学或生物物质。阿片样物质的非排他性清单包括阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、贝齐米特、丁丙诺啡、布托啡诺、卡芬太尼、氯尼他秦、可待因、环佐辛、二氢脱氧吗啡、右吗拉胺、地佐辛、地恩丙胺、双氢可待因、二氢埃托啡、二氢吗啡、地美沙朵、地美庚醇、二甲噻丁、吗苯丁酯、地匹哌酮、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、依托尼秦、埃托啡、芬太尼、海洛因、氢可酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左洛啡烷、左啡诺、左芬啡烷、洛芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、美托酮、吗啡、麦罗啡、纳布啡、那碎因、尼可吗啡、去甲左啡诺、去甲美沙酮、纳洛芬、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟考酮、羟吗啡酮、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、非诺啡烷、苯哌利定、匹米诺定、哌腈米特、丙庚嗪(propheptazine)、二甲哌替啶、丙哌利定、丙吡兰、丙氧芬、舒芬太尼、曲马多、替利定。该定义包括任何来源的所有阿片样物质，包括天然来源的化合物、合成化合物和半合成化合物。该定义还包括所有的同分异构体、立体异构体、酯类、醚类、盐以及这些同分异构体、立体异构体、酯类、醚类的盐，无论何时，在特定的化学名称内都可能存在此类同分异构体、立体异构体、酯和醚。在一种实施方式中，阿片样物质是芬太尼。

如本文所使用的，术语“受试者”是指动物界的任何成员。在一种实施方式中，受试者是人类患者。在一种实施方式中，受试者是成年患者。在一种实施方式中，儿科患者是18岁以下的患者，而成年患者是18岁或年龄更大的患者。

可以配制本发明的化合物用于治疗用途。组合物或药物组合物可以包含本发明的化合物与一种或多种药学可接受的载体的组合。如本文所使用的，术语“载体”是指生物可相容的和药学可接受的合适的媒介物，包括例如适用于给药的液体稀释剂。如本文所使用的，术语“生物可相容的”是指对于预期的用途不产生明显的不希望的宿主反应。最优选地，生物可相容的材料对于预期的用途是无毒的。因此，对于人类用途，生物可相容的最优选地对人类或人类组织是无毒的或者对人体或人类组织没有损害。本领域技术人员熟悉在这方面有用的任何药学可接受的载体，因此将不详细讨论制备根据本发明的药物组合物的方法。如本文所使用的，术语“药学可接受的”是指不显著干扰化合物的功效并且对于其给药的宿主具有可接受的毒性特征的物质。

适当地，可以在各种实施方式中将包含本发明化合物的药物组合物配制成肠胃外给药的剂量单位制剂，所述剂量单位制剂包含常规无毒的药学可接受的载体、佐剂和媒介物。本文所用术语“肠胃外”包括皮下注射、鼻孔喷雾、真皮内、静脉内、肌肉内、血管内、胸骨内、鞘内注射或输注技术。在一个实施方案中，本发明的化合物肌肉内给药。

药物组合物可以是无菌注射水性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏(Ringer’s)溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌固定油可用作溶剂或悬浮介质。可选地，助剂，例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂，也可以包含在注射溶液或悬浮液中。

本发明化合物的有用剂量取决于本领域技术人员众所周知的许多因素，例如，化合物的类型和药效特性；受试者的年龄、体重和总体健康状况；症状的性质和程度；任何同时进行的治疗；治疗的频率和所需的效果。

如本文所使用的，术语“有效量”是指经施用可用于治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的本发明化合物的制剂的任意量。如临床医生或其他获得资格的观察者所指出的，有效量的组合物可提供症状主观上的缓解或客观上可辨认的改善。如本文所使用的，术语“治疗”、“预防”和“改善”是指旨在减轻与疾病、障碍或病症相关的症状，预防其发展或改变其病理所执行的干预。因此，在各种实施方式中，该术语可以包括在各个阶段的疾病、障碍或病症的预防(防止)、缓和、减轻或治愈。因此，在各种实施方式中，需要治疗/防治的人可以包括已经患有该疾病、障碍或病症的人和/或容易患该疾病、障碍或病症或具有患上该疾病、障碍或病症的风险的人和/或有待预防疾病、障碍或病症的人。

在本发明的开发过程中，发现在一种实施方式中，使用特定靶向烟碱型乙酰胆碱受体的α4β2亚型的化合物是一种克服阿片样物质诱发的呼吸抑制的强有力的、有效的方法。尽管这些化合物中许多已在涉及α4β2 nAChR的非呼吸相关功能的临床前和临床试验中进行了检测(例如，镇痛、认知、戒烟)，但这些化合物用于抵抗阿片样物质诱发的呼吸抑制的相对功效尚未被发现。这些化合物容易穿过血脑屏障，并特异性地作用于α4β2烟碱型乙酰胆碱受体。此外，化合物在大鼠血浆/大脑中的半衰期约为1-2小时(鲁特(Rueter)等人，2006；本谢里夫(Bencherif)等人，1997；蒂默曼(Timmermann)等人，2012)。

下列实施例中提供的数据显示，通过调节神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体(例如含有α4β2或β4的烟碱型乙酰胆碱受体)活性的化合物，阿片样物质诱发的呼吸抑制被明显而强劲地逆转，而靶向呼吸神经元表达的α7烟碱型乙酰胆碱受体的化合物则无法做到这一点。该化合物可在临床上使用，而无明显副作用。相反地，靶向α3β4烟碱型胆碱受体的化合物具有胃肠道副作用，靶向α7烟碱型乙酰胆碱受体的化合物可能引起烟碱诱发的癫痫发作，以及一些癌症中的细胞增生和血管生成(然(Jain)，2004；达玛(Damaj)等人，1999；伊波(Iha)等人，2017；艾格里顿(Egleton)等人，2008；帕里瑞(Paleari)等人，2009；图尼耶(Tournier)等人，2011)。

不受任何理论的束缚，本领域的技术人员将理解，这些发现可以扩展到与麻醉药(例如，异丙酚、异氟烷)、巴比妥酸盐类、苯二氮卓类、醇、早产呼吸暂停、遗传性障碍(例如，雷特综合症、庞皮病)、潮式呼吸和神经性障碍(例如，中风、创伤、影响脑干的退行性疾病)相关的呼吸抑制的其他原因。

通过(直接或间接)导致受体阳性激活的化合物激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体可以克服阿片样物质诱发的呼吸抑制，其中完全激动剂A85380是最有效的。在一种实施方式中，阿片样物质包括芬太尼。芬太尼是一种强效镇痛药，通常用于急性和慢性疼痛，其意外用药过量的情况很普遍。本领域技术人员将认识到，不受任何理论的束缚，芬太尼的发现可以扩展到其他μ-阿片受体药剂，包括但不限于吗啡和羟考酮。

临床意义包括使由于对阿片样物质诱发的呼吸抑制的敏感性而不能接受足够镇痛的患者群体受益。此外，可能出现对抗由阿片样物质(例如，芬太尼)引起的致死性用药过量的其他解毒剂。所述化合物具有作为止痛剂的额外有益特性(马陆比(Marubio)等人，1999；比特内(Bitner)等人，2000；德克尔(Decker)等人，2004；达玛(Damaj)等人，2007)。因此，当与所述化合物共同给药时，可能需要更低剂量的芬太尼以实现所需的镇痛，从而导致较少的包括呼吸抑制和镇静在内的副作用。

在以下实施例中描述了本发明的实施方式，这些实施方式是为了帮助理解本发明而提出的，而不应被解释为以任何方式限制其后的权利要求书中所限定的本发明的范围。

实施例1-使用成年大鼠在体内共同给药芬太尼和靶向α4β2 nAChR的药物的效果

来自成年大鼠的体积描记记录用于检测靶向α4β2 nAChRs的药物(A85380、利万西林、NS9283)与芬太尼的共同给药，以确定是否可以显著降低OIRD水平和减少致死性用药过量。同时监测镇痛水平，以评估靶向nAChR的药物和芬太尼是否有叠加效应。

图1是实验方案的示意图(任(Ren)等人，2015)。简而言之，除测量呼吸参数外，还进行了三种伤害感受测试方法和镇静措施。在阿片样物质给药后6-10分钟开始翻正反射测试，一直持续到动物从芬太尼诱发的镇静作用中苏醒。阿片样物质输注后12分钟开始钳尾，并且每4分钟重复一次。当动物恢复翻正反射时，将其取出进行热或福尔马林测试。每4分钟重复进行一次热测试，直到缩爪潜伏期恢复到对照组水平。在福尔马林注射后0-40分钟进行福尔马林测试。

更详细地，在尾静脉插管过程中，在诱发室内用3％异氟烷将雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠(300-500g)暂时麻醉。将大鼠放置在经过改装可以使尾部外置以进行药物输注的体积描记器中。用压力传感器、信号调节器和模拟数字板(阿克森(Axon))记录压力变化。测量包括频率、呼吸暂停次数以及潮气量的相对变化以及在药物输送前后的每分钟通气量(任(Ren)等人，2015)。脉搏血氧仪放置在尾巴上，以监测动脉血氧饱和水平和心率。体温用直肠探针测量。

将芬太尼输注到一条尾静脉中(静脉注射)，并将大剂量的α4β2 nAChR靶向药物注入另一尾静脉中。放置在体积描记器室中后大约5分钟开始芬太尼输注。任(Ren)等人(2006)和任(Ren)等人(2009)中描述了用于诱发不同水平的芬太尼诱发的RD和致死率的合适方法。具体地，20μg/kg给药输送20分钟抑制呼吸频率小于对照组的50％。在相同的持续时间内60μg/kg芬太尼给药抑制呼吸频率大于对照组的50％。快速输注80μg/kg芬太尼(在1分钟内输送)通常会导致致命的呼吸暂停。

导致强劲的受体激活剂量的α4β2 nAChR靶向剂与各种剂量的芬太尼共同给药：A85380(团注0.01、0.03mg/kg)(沙利文(Sullivan)等人，1996；柯曾(Curzon)等人，1998；鲁特(Rueter)等人，2000；鲁特(Rueter)等人，2003；鲁特(Rueter)等人，2006)；利万西林(团注，3、10mg/kg)(里皮罗(Lippiello)等人，1996；达玛(Damaj)等人，1999)；和NS9283(团注10、30mg/kg)(马陆比(Marubio)等人，1999；蒂默曼(Timmermann)等人，2012；毛雷尔(Maurer)等人，2017)。使用α7AChR激动剂PNU282987的实验表明，α7亚型的激活不能明显缓解芬太尼诱发的RD；因此，对该受体没有进一步研究。给药受体拮抗剂二氢-β-刺桐定(DHβE；溶于生理盐水；团注6mg/kg)(达玛(Damaj)等人，1995)以测试α4β2 nAChR内源激活的阻断作用。所有nAChR靶向药物均购自托克雷斯(Tocris)。对动物进行如下测试：3(芬太尼剂量)×9(共同给药)×10-20每组。

图2-11中的数据表示为平均值±SEM；图12-25中的数据表示为平均值±SD(Sigmaplot)。使用随机方法根据实验条件分配单元。使用盲法测试，其中一个人服用药物而第二个人在不知情药物给药的情况下分析数据。对于通过正态检验(夏皮罗-威尔克(Shapiro-Wilk))和等方差检验(布朗-福赛斯(Brown-Forsythe))的数据，对两组用t检验进行参数统计，或者对多组用ANOVA进行参数统计，然后进行多次比较。对于未通过正态检验或等方差检验的数据，应用非参数统计。p<0.05被认为是显著差异。

除呼吸参数外，通过在芬太尼和α4β2 nAChR靶向剂共同给药之后应用疼痛评估的多种方法，即(热、机械和化学的)伤害感受测试，检查各种条件下的镇痛水平，以确定这种药剂(A85380、利万西林、NS9283)能否降低伤害感受敏感性并增强阿片样物质诱发的镇痛。

热板测试通过使用足底测试装置来测量热伤害感受，该足底测试装置由位于后爪正下方、腔室底部下方20mm的红外热源组成(任(Ren)等人，2006；2009；2015)。当大鼠感觉到疼痛并收回爪子时，该仪器会自动检测到精确至0.1秒的缩回潜伏期。

机械测试包括用镊子(具有恒定压力)钳尾。下列参数的至少两个的明显变化表明对钳尾有正响应：呼吸变化(通过体积描记法)、心率(通过脉搏血氧测定)、氧饱和度(通过脉搏血氧测定)和身体运动(目测)(任(Ren)等人，2015)。

福尔马林测试通过在右后爪的足底区域(intraplantar region)内注射福尔马林稀溶液(50μl，生理盐水稀释的1.5％福尔马林)来检测伤害感受响应，然后对试验的第一阶段(0-5分钟；反映伤害感受器的直接激活)和第二阶段(20-40分钟；反映炎症)在5分钟间隔内记下进行伤害感受行为(舔/提起/缩回被注射的爪)所花费的时间(杜比松(Dubuisson)等人，1977)。

先前的研究表明，20μg/kg和60μg/kg的芬太尼给药输送20分钟后诱发的镇痛分别在芬太尼输注结束后约30分钟和100分钟时消失。因此，比较添加和不添加各种浓度的α4β2nAChR靶向药剂的镇痛持续时间，以评估药剂的组合是否可以增强镇痛作用。

还监测了镇静的变化和异常行为的迹象。除了呼吸抑制之外，意外的镇静是阿片样物质诱发的导致患者发病率和住院时间增加的另一严重不良事件(嘉泽那(Jarzyna)等人，2011；姜葵(Jungquist)等人，2013；凯斯勒(Kessler)等人，2013)。尽管尚不清楚其潜在机制，但阿片样物质诱发的镇静作用被认为与阿片样物质的抗胆碱能的活性有关(本亚明(Benyamin)等人，2008)。因此，确定了α4β2的激活是否可以缓解镇痛性阿片样物质诱发的镇静作用，从而为α4β2R靶向剂提供了抵抗阿片样物质诱发的呼吸抑制的另一项优势。镇静作用(失去翻正反射)被定义为，大鼠在被置于仰卧后无法将自己调整到俯卧姿势。

报道α4β2 nAChR靶向剂的最小副作用的先前研究没有与阿片剂共同给药来进行。任(Ren)等(2015)描述了如何确定为减少呼吸抑制而施用的血清素能受体激动剂是否还会产生明显的不需要的行为变化(例如，痛觉过敏、强力呼吸、异常的身体动作)。在本文所述的关于α4β2 nAChR靶向剂(A85380、利万西林、NS9283)的初步研究中未观察到类似现象。

为了检查单独的α4β2化合物是否影响基线伤害感受敏感性和呼吸参数，测量了热缩爪潜伏期，随后在对照组中进行体积描记法测定30分钟，并在给药α4β2化合物(A853800.01、0.03mg/kg；利万西林3、10mg/kg；NS9283 10、30mg/kg；DHβE 1mg/kg；或媒介物；腹膜内(ip)注射)后重复10分钟。还监测了对福尔马林注射的伤害感受响应。在注射福尔马林前20分钟给药α4β2化合物(腹膜内注射)。动物测试如下：9(治疗)×10每组×2伤害感受测试。

实施例2-α4β2 nAChR靶向药物(A85380、利万西林或NS9283)对芬太尼引起的呼吸抑制的急救功效

进行体内实验以确定是否可以将α4β2 nAChR靶向药物用作对抗严重的芬太尼诱发的呼吸抑制和致死性的急救干预。数据显示，这三种药物均具有一定的积极作用，其中完全激动剂A85380表现出最强的作用。

相对于纳洛酮的优点是维持了镇痛作用。该方案在一条尾静脉内持续芬太尼输注6分钟(60μg/kg，持续20分钟)后达到显著的呼吸抑制，或在快速输注1分钟(80μg/kg，持续1分钟)后达到致死性呼吸暂停。随后向另一尾静脉注射给药大剂量的α4β2靶向药物或媒介物以评估从呼吸抑制中急救的功效。

确定了相比于静脉内给药，经由大腿肌肉的肌肉内给药是否可产生呼吸抑制的正向缓解和相对及时(relative timing)。在紧急情况下，很难放置静脉输液线；因此，类似于Epi-Pen^TM的预包装的肌肉内注射器可能具有明显的优势。芬太尼给药后，输送A85380(0.01、0.03mg/kg)、利万西林(3、10mg/kg)、NS9283(10、30mg/kg)或媒介物(生理盐水，HPCD)(通过静脉内和肌肉内的路径团注)。将急救的效力与纳洛酮(1mg/kg)所达到的效力进行比较。动物测试如下：2(芬太尼剂量)×9(治疗)×2(给药路径)×10每组。

来自成年大鼠小组的初步实验的数据表明，α4β2 nAChRs的激动剂或正向变构调节剂减轻了芬太尼诱发的呼吸抑制。代表性迹线如图2A-D所示。未观察到通过激动剂PNU282987(15mg/kg)激活α7 nAChRs带来的明显逆转(图2E)。人口数据示于图2F-G。α4β2nAChR完全激动剂A85380(0.03mg/kg，静脉团注)给药在芬太尼输注的整个过程中迅速并完全地逆转了芬太尼诱发的呼吸频率下降。α4β2 nAChR部分激动剂利万西林(3mg/kg，静脉团注)在芬太尼输注的整个过程中迅速并部分地逆转了芬太尼诱发的呼吸频率下降。α4β2nAChR正向变构调节剂NS9283(10mg/kg，静脉团注)部分和暂时地逆转芬太尼诱发的呼吸频率下降。这些试剂中任一种给药后均未观察到异常行为。

数据显示芬太尼引起呼吸频率的明显下降，这被α4β2 nAChR药剂逆转。频率是接触阿片样物质的人受影响的主要呼吸参数。数据还显示芬太尼输注后潮气量减少。任(Ren)等人(2006)报道了，潮气量的减少部分是由于对呼吸运动神经元的驱动减少，更多是由于芬太尼诱导的肌肉僵化和胸腔僵化。在大鼠中发生的僵化是有充分记录的现象，其作用机理尚不清楚。芬太尼诱发的僵化也发生在接触芬太尼的一些患者中，但通常不如在大鼠中明显。α4β2 nAChR靶向药物不会减少肌肉僵化，因此没有潮气量的完全逆转。因此，体内模型不能很好地适用于评估药物是否能逆转任何阿片样物质诱发的对运动神经元活性的抑制。为了解决这个问题，使用体外制剂，这可以在阿片样物质和α4β2 nAChR靶向药物给药之前和之后从运动神经元(XII)和运动神经(横膈膜和XII)直接记录(实施例3)。

图2A-E示出，α4β2 nAChR完全激动剂A85380、部分激动剂利万西林和正向变构调节剂NS9283减轻了芬太尼诱发的成年大鼠呼吸速率的降低，但α7 nAChR完全激动剂PNU282987没有减轻芬太尼诱发的成年大鼠呼吸速率的降低。芬太尼给药(60ug/kg，20分钟，静脉输注)引起呼吸速率的明显下降。迹线以全身体积描记器记录连续显示。媒介物(生理盐水)对芬太尼诱发的呼吸速率降低没有影响(图2A)。A85380(0.03mg/kg，静脉团注)非常迅速地逆转芬太尼诱发的呼吸速率的降低(图2B)。这比之前用安帕金(ampakines)时观察到的要快得多。利万西林(3mg/kg，静脉团注)迅速并部分逆转了芬太尼诱发的呼吸速率下降(图2C)。NS9283(10mg/kg，静脉团注)部分且暂时逆转了芬太尼诱发的呼吸速率的降低(图2D)。PNU282987(15mg/kg，静脉团注)对芬太尼诱发的呼吸速率的降低没有影响(图2E)。群体数据示出了响应于芬太尼与随后的生理盐水(n＝7)、A85380(0.03mg/kg，n＝7)和利万西林(3mg/kg，n＝7)给药(图2F)，以及HPCD媒介物(n＝8)、NS9283(10mg/kg，n＝6)或PNU282987(1、2、3、10、15、15mg/kg，合计n＝6)给药(图2G)的呼吸频率变化的时间进程。(相对于媒介物对照，^xp＜0.05、*p＜0.01、^#p＜0.001)。HPCD(2-羟丙基-β-环糊精)是用于稳定和增溶不溶于水的药物的常用赋形剂。使用双向RM ANOVA，随后使用海姆-思达克(Holm-Sidak)法。箭头标出了nAChR激动剂或媒介物的团注注射。A85380(0.03mg/kg，对照组的97.8±3.1％，n＝5)、利万西林(3mg/kg，对照组的98.4±3.6％，n＝5)，NS9283(10mg/kg，对照组的103.3±4.2％，n＝4)以及PNU282987(1、3、5、10、15mg/kg，对照组的102.9±4.1％，n＝5)均对基线每分钟通气量无明显影响，与之前的发现一致(利普爱罗(Lippiello)等人，1996)。

实施例3-μ-阿片制剂和

吸气神经元和XII运动神经元的α4β2 nACh受体激活的相互作用的机理研究

使用来自体外制剂的神经活动的记录和全细胞膜片(patch)记录检测阿片制剂剂和α4β2 nAChR靶向药物对

神经元和XII运动神经元的作用机制。使用在

和XII运动神经元群体中产生强有力的、有节奏的吸气活动的髓质切片制剂(芬克(Funk)，2013)。在特定的首尾水平切开髓质切片，以暴露

和XII运动神经元群体(朗吉蒂沙库(Ruangkittisakul)等人，2006)。红外差动干扰对比显微镜的使用为全细胞膜片电极的靶向提供了神经元的清晰可视化。

从新生的斯普拉格-杜勒大鼠获得脑干-脊髓和髓质切片制剂。用甲氧氟烷麻醉大鼠、切除大脑，并解剖脑干-脊髓(BSSC)和髓质切片(史密斯(Smith)等人，1990；1991)。BSSC不断注入改性的克雷布斯(Krebs)溶液。切开单个有节律的髓质切片(厚500-650μm)，并用浸浴液连续灌注。使用细胞外玻璃电极从髓质切片的BSSC或XII神经根丝的第四腹侧颈神经根记录吸气活动。

全细胞记录靶向神经元位于切片表面约70mm内。用含有140K-葡萄糖酸酯、4NaCl、1 CaCl₂、10 BAPTA、10 HEPES、5 MgATP和0.3 Na₃GTP的内部溶液(以mM计)填充细胞内吸量管(任(Ren)等人，2006)。当Vm响应于超极化电流脉冲而变化时，测量输入电阻。测量微型EPSC(mEPSC)的频率和幅度，并通过比较对照组期和药物应用期之间的平均mEPSC频率和幅度值变化的累积频率直方图来确定每种药物的影响(洛里耶(Lorier)等人，2010)。

记录将集中于

中的节律性吸气神经元和XII核中接收吸气驱动电位的运动神经元，以确定α4β2 nAChR靶向药物(A85380、利万西林、NS9283)是否具有以下效果：1)在存在和不存在河豚毒素(TTX，1μM)的情况下，诱发神经元发生膜去极化，从而响应膜超极化和增加对DAMGO的输入阻力；2)在不存在和存在DAMGO的情况下，调节

吸气神经元的吸气驱动电位；3)减轻阿片样物质诱发的对自发EPSC的抑制；4)在存在TTX(1μM)、士的宁(10μM)和荷包牡丹碱(bicuculline)(10μM)的情况下，通过突触前机制作用，以减轻阿片样物质诱发的对微型EPSC(mEPSC)的抑制。

来自先前的髓质切片研究的数据已经确定，μ-阿片制剂受体激活通过

和XII运动神经元核内的突触前机制抑制递质(transmitter)释放(洛里耶(Lorier)等人，2010；哈吉(Haji)等人，2003；拉利(Lalley)等人，2006；巴兰义(Ballanyi)等人，2010)。μ-阿片制剂激动剂对

神经元也有选择性的突触后作用，所述

神经元被认为主要参与吸气性节律的生成(格雷(Gray)等人，2001；孟坦东(Montandon)等人，2011；竹田(Takeda)等人，2001；洛里耶(Lorier)等人，2008)。烟碱和利万西林激活

吸气神经元会引起与膜噪声增加、自发的兴奋性突触后电流(EPSC)的频率和幅度的增加以及降低的吸气驱动电流幅度有关的补剂内向电流(tonic inward current)，(邵(Shao)等人，2002)。那些突触前/后的调节作用是否能抵抗μ-阿片制剂受体介导的对神经元兴奋性的抑制作用尚不清楚。此外，α4β2 nAChR靶向剂对吸气XII运动神经元的作用尚未被研究。本文应用基于

神经元(Montandon等人，2011)和XII运动神经元(洛里耶(Lorier)等人，2010)相关研究的电生理学方法来确定α4β2受体靶向药物是否可以通过突触前和/或突触后机制来逆转μ-阿片制剂受体介导的对神经元兴奋性的抑制作用。

体外数据表明，α4β2 nAChR靶向药剂(A85380、利万西林、NS9283)缓解了由μ-阿片制剂受体激动剂[D-Ala2,NMe-Phe4,Gly-ol5]-DAMGO引起的呼吸抑制，类似于用芬太尼在成年大鼠体内观察到的情况。DAMGO通常用于本领域的体外实验，而芬太尼用于体内。它们结合到相同的μ-阿片制剂受体。体外分析是通过检测添加到浸浴脑干-脊髓的介质中的药物的作用而开始的，所述分析显示沿神经轴(髓质和脊髓)的吸气节律性放电。

记录来自第四颈神经的整流和积分放电。如图3A-C(代表性的迹线)和图3E-F(群体数据；相对于配对t检验(paired-t-test)或威氏符号秩检测(Wilcoxon signed ranktest)的对照组，^xp<0.05、*p<0.01、^#p<0.001；n＝6-8)所示，α4β2 nAChR完全激动剂A85380、部分激动剂利万西林和正向变构调节剂NS9283在所应用的浓度下，均增加了基线呼吸频率，而对幅度没有显著的影响。激动剂PNU282987(高达20μM，已显示在体外完全激活受体)激活α7AChR会导致呼吸频率非常适度的增加。图3G-J(代表性的迹线)和图3K-L(群体数据；两个比较组之间^xp<0.05、*p<0.01、^#p<0.001，采用单向RM ANOVA，然后采用海姆-思达克方法；每个数据点来自n＝6-8)示出了DAMGO诱发的呼吸抑制(呼吸频率和幅度的降低)通过随后的A85380(25nM)、利万西林(0.5μM)和NS9283(15μM)的浸浴应用明显逆转，而PNU282987(1、3、10、15、15、20μM，合计n＝6)没有带来明显逆转。

整流和积分放电记录来自髓质切片(用红色标记)和

(用蓝色标记)中的舌下神经(XIIn)。含有

和XII运动神经元(在呼吸循环的吸气阶段放电)的髓质切片制剂，用于在

水平更直接地评估药物作用。图4A和图4C示出了A85380(25nM)的浸浴应用在髓质切片中增加了呼吸频率并且降低了的呼吸幅度。随后α4β2 nAChR拮抗剂DHβE(200nM)的浸浴应用逆转了这种影响。图4B示出了DAMGO(300nM)诱发呼吸频率和幅度的抑制，被A85380(25nM)减轻。图4C-D示出了群体数据(^xp<0.05、*p<0.01、^#p<0.001，用单向RMANOVA、随后用海姆-思达克法分析药物前后的显著差异；对于每个数据点，n＝6)。

实施例4-α4β2 nAChR靶向药物(A85380)减轻由GABA_A受体介导的机制诱发的呼吸抑制的功效

如图5的整流和积分C4记录所示，在浸浴新生大鼠脑干-脊髓制剂的培养基中添加乙醇(50mM)和戊巴比妥(50μM)会抑制呼吸节律。在乙醇和戊巴比妥存在的情况下，随后添加A85380(25nM)缓解乙醇和戊巴比妥诱发的呼吸抑制。不受任何理论束缚地，α4β2 nAChRs的靶向作用可能是减轻药物通过GABA_A受体机制体外引起呼吸抑制的作用的有效手段。

在进一步的实验中，将A85380(0.03mg/kg，ip)和异丙酚(30mg/kg，ip)对新生大鼠进行体内共同给药(P3)。在对照组中，向媒介物(生理盐水)与30mg/kg的异丙酚共同给药(图6A)。这导致在异丙酚注射后5分钟内呼吸频率和幅度明显下降，并且持续30分钟。A85380(0.03mg/kg)与异丙酚(30mg/kg)的共同给药显著预防了异丙酚诱发的呼吸抑制(图6B)。不受任何理论束缚地，α4β2 nAChRs的靶向作用可能是减轻药物(例如，异丙酚)通过GABA_A受体机制体内引起呼吸抑制的作用的有效手段。

实施例5-α4β2 nAChR靶向药物(A85380)减轻由弱内源性兴奋性驱动引起的呼吸抑制的功效

使用阿片类药物和GABA_A受体靶向药物的实施例4证明了，由抑制作用对神经元的影响诱发的呼吸抑制。但是，还存在另一种呼吸抑制的一般原因：呼吸抑制是由丧失对

和呼吸运动神经元的正常兴奋性输入而引起的。这种丧失被认为是某些患者阻塞性和中枢性呼吸暂停的原因。兴奋性驱动的丧失是在遗传性疾病(例如庞皮病和普拉德-威利综合症)中XII运动神经元和

神经元受到抑制的一种机制(任(Ren)等人，2003；艾玛拉(ElMallah)等人，2015)。发生阻塞性和中枢性呼吸暂停的另一种情况是早产呼吸暂停中正常兴奋性驱动的丧失(任(Ren)等人，2015)。在某些神经变性疾病和心血管疾病中还发生的另一种情况是，突触到

神经元的神经元功能异常或死亡(例如，中风、心力衰竭、脑外伤、帕金森氏病；程(Cheng)等人的综述，2017；库莱布拉斯(Culebras)和安瓦尔(Anwar)，2018)。

使用对

神经元和呼吸运动神经元的抑制兴奋性驱动的两种模型用以证明α4β2nAChR靶向药物缓解与一般病理学相关的呼吸抑制。第一个模型是新生大鼠髓质切片制剂，将所述制剂浸泡在含有低于正常水平(9mM)的细胞外钾水平(6mM)的溶液中。这导致缺乏正常的激励，从而降低了XII运动神经元的呼吸节律和运动输出(振幅小且爆发持续时间短)。如图7所示，在浸泡介质中添加A85380(25nM)有效地逆转了呼吸驱动和运动输出的丧失。

第二种模型是围产期大鼠脑干脊髓制剂，所述制剂由于缺乏兴奋性驱动而产生不稳定的呼吸节律发生并降低了对XII运动神经元的驱动。由于这种突触驱动的丧失，许多早产儿表现出阻塞性睡眠呼吸暂停和中枢性睡眠呼吸暂停。如图8所示，来自C2处切开的脑干-脊髓的整流和积分XII神经记录示出，在40分钟内开始出现强烈的呼吸活动，随后出现缓慢呼吸频率和微弱运动输出的时期(幅度小、爆发持续时间短)。A85380(25nM)的浸浴应用增加了呼吸频率、幅度和爆发持续时间，从而缓解呼吸节律的减弱和舌下神经(XIIn)运动神经元活性的激活。

存在从美松汀(mespontine)胆碱能神经元到XII运动神经元和呼吸核的胆碱能投射，其在睡眠过程中调制(库宾(Kubin)和菲尼克(Fenik)，2004；贝灵翰姆(Bellingham)和爱尔兰(Ireland)，2002)。总的来说，以上数据提供了以下证据：靶向α4β2 nAChRs可以缓解由

(与中枢性睡眠呼吸暂停有关)和XII运动神经元(与阻塞性睡眠呼吸暂停有关)的刺激降低引起的多种疾病。不受任何理论束缚地，睡眠过程中α4β2 nAChRs的激活可以为呼吸节律性神经元和XII运动神经元提供足够的兴奋性输入，以克服任何与分别导致中枢性睡眠呼吸暂停和阻塞性睡眠呼吸暂停的Ach内源性释放的减少(分别导致)相关的抑制作用。

实施例6-α4β2 nAChR靶向药物(A85380)缓解由脊髓损伤引起的呼吸抑制的功效

与脊髓损伤有关的发病和死亡的主要原因之一是呼吸肌肉组织的正常功能丧失。这是由从呼吸节律产生中心到呼吸脊髓运动神经元的突触驱动减少导致的。使用脊髓损伤的体外新生脑干脊髓大鼠模型(齐默(Zimmer)和果戈翰(Goshgarian)，2005)来测试靶向α4β2 nAChR缓解弱呼吸驱动的功效。图9示出具有C2半切(左)的脑干-脊髓制剂图。整流和积分信号从示出对侧(A：顶部痕迹)和同侧(B：底部痕迹)至一侧C2半切的呼吸活动的P0大鼠脑干-脊髓制剂的两个C4记录中获得。同侧神经半切后神经活动明显减少，但仍然偶尔观察到类似呼吸的活动，并且与对侧神经的呼吸活动相关。A85380(25nM)的浸泡应用导致之前较弱的呼吸运动输出增加(即，增加呼吸频率)，并部分增加了脊髓受损侧的同侧呼吸幅度。

基于这些数据，A85380给药可增强对脊髓损伤后下行驱动丧失之后发生的呼吸和其他运动神经元(例如，姿势、运动)的弱突触驱动。不受任何理论的束缚，与间歇性低氧有关而使用的药物治疗(例如给药A85380以增强呼吸活动)可能会进一步增强呼吸输出(特纳(Turner)等人，2016)。

实施例7-通过选择性烟碱α4β2受体配位体VMY-2-95减轻芬太尼诱发的呼吸抑制

检验了选择性α4β2nAChR部分激动剂、沙西替丁-A及其类似物VMY-2-95克服OIRD的功效。α4β2 nAChR组合成两种不同的化学计量：(α4)₂(β2)₃和(α4)₃(β2)₂，分别称为高灵敏度(HS)和低灵敏度(LS)nAChR(莫瑞尼(Moroni)等人，2006)。高亲和力α4β2 nAChR部分激动剂、沙西替丁-A和VMY-2-95激活或有效脱敏α4β2 nAChRs(肖(Xiao)等人，2006；卡蓬(Carbone)等人，2009；莱文(Levin)等人，2010；元宫达(Yenugonda)等人，2013)。具体而言，沙西替丁-A在(α4)₂(β2)₃受体处表现出完全的激动剂活性，而在(α4)₃(β2)₂受体处几乎没有激动剂活性(泽雅(Zwart)等人，2008；卡蓬(Carbone)等人，2009)。与沙西替丁-A相比(胡斯曼(Hussmann)等人，2012)，VMY-2-95口服给药具有更好的血脑屏障渗透性(宫(Kong)等人，2015)。本研究检验了下述假设：沙西替丁-A和VMY-2-95缓解了芬太尼引起的呼吸抑制而不损害芬太尼引起的镇痛作用。

在第一项研究中，在大鼠幼崽中(出生后3天)体内检验了沙西替丁-A及其类似物VMY-2-95(所有药物通过颈部皮下给药)。沙西替丁-A(0.1-0.5mg/kg)、VMY-2-95(1mg/kg)和α4β2/α4β4 nAChR拮抗剂DHβE(6mg/kg)均未明显改变基线V_E(数据未示出)。与我们先前的研究(任(Ren)等人，2015)一致，芬太尼(35μg/kg)导致f_R显著降低、V_T轻微降低，效果持续约20分钟。结果示于图10。特别地，图10A-D是来自四个产后3天幼崽的代表性全身体积描记记录。所有测试的药物均在后颈区域皮下给药。芬太尼(35μg/kg，图10A-C)给药或与DHβE共同给药(6mg/kg，图10D)在芬太尼给药的7分钟内引起呼吸频率明显下降和潮气量轻度下降。随后的媒介物(HPCD)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响(图10A)。沙西替丁-A(0.5mg/kg，图10B)和VMY-2-95(1mg/kg，图10C)逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制。然而，沙西替丁-A(0.5mg/kg，数据未示出)和VMY-2-95(1mg/kg，图10D)均对芬太尼与DHβE(6mg/kg)共同给药诱发的呼吸抑制没有任何影响。呈现并测量了在芬太尼给药前(左迹线)、芬太尼给药后7分钟(中迹线)和芬太尼给药后12分钟(右迹线)的呼吸变化。示出相对于芬太尼给药前的对照组的呼吸频率(f_R)、潮气量(V_T)和每分钟通气量(V_E)的群体数据示出于图10E-G。*p<0.05、**p<0.01、***P<0.001，显著差异；ns：p>0.05，在各比较组中无显著差异，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝6-7。

总的来说，第一项研究表明在芬太尼给药后约7分钟，随后给药媒介物(图10A)对呼吸抑制没有影响。沙西替丁-A(0.2-0.5mg/kg，图10B)和VMY-2-95(1mg/kg，图10C)缓解了芬太尼诱发的呼吸抑制(f_R、V_T、V_E降低)。DHβE(6mg/kg)与芬太尼的共同应用通过随后施用沙西替丁-A(数据未示出)或VMY-2-95(图10D)给药而妨碍了芬太尼诱发的呼吸抑制的缓解。

在第二项研究中，检验了α4β2配位体沙西替丁-A及其类似物VMY-2-95在成年大鼠体内抵抗芬太尼诱发的呼吸抑制的功效。图11示出了60μg/kg芬太尼静脉输注20分钟期间成年大鼠呼吸的代表性体积描记记录。芬太尼给药(60ug/kg，20分钟，静脉输注)导致两只成年大鼠的呼吸速率显著下降。迹线以全身体积描记器记录连续显示。图11A示出了媒介物给药(HPCD，静脉团注，芬太尼给药后约7分钟)对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用。图11B示出了沙西替丁-A给药(1mg/kg，静脉团注，芬太尼给药后约7分钟)对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用。最后，图11C示出了VMY-2-95给药(1mg/kg，静脉团注)逆转了芬太尼诱发的呼吸速率的降低。图11D是群体数据，示出了沙西替丁-A(0.5-2mg/kg)对芬太尼诱发的呼吸速率的降低(相对于芬太尼输注之前的对照)没有影响。^NSp>0.05，与媒介物(生理盐水)组相比无显著差异，使用ANOVA的双向重复测量(随后用海姆-思达克法)。每个n＝8。图11E是群体数据，示出了VMY(1mg/kg)减缓了芬太尼诱发的呼吸速率的降低(相对于芬太尼输注之前的对照)。

总的来说，第二项研究表明，与以往的研究相似(任(Ren)等人，2015)，该示例在芬太尼给药后7分钟内在大多数大鼠中引起了f_R的显著抑制(＞50％的下降)。随后的媒介物注射(图11A)没有改变芬太尼作用的进程。随后的沙西替丁-A(0.5-2mg/kg，图11B)注射没有改变芬太尼作用的进程。相比而言，随后的VMY-2-95注射(1mg/kg，静脉内，图11C)逆转了芬太尼诱发的f_R降低，并且逆转持续超过芬太尼输注的持续时间。

芬太尼还引起潮气量(V_T)的轻度下降。过去的研究(任(Ren)等人，2006)确定，下降的V_T部分是由于对呼吸运动神经元的驱动下降，而较大的原因是由芬太尼诱发的肌肉僵化和胸腔僵化所致。在大鼠中发生的僵化(即使那些未显示出阿片样物质诱发的f_R显著降低的僵化)是有充分记录的现象，其作用机理尚不清楚。VMY-2-95并未减少肌肉僵化，因此大鼠的V_T没有逆转。注意：VMY-2-95缓解了幼崽中的芬太尼诱发的V_T，在芬太尼给药后通常不显示明显的僵化(图10F-G)。

鉴于第一项研究和第二项研究，进行了以下观察：(1)剂量为0.2-0.5mg/kg的沙西替丁-A逆转了芬太尼诱发的幼崽呼吸抑制(最小的血脑屏障)，但对成年大鼠在0.5-2mg/kg对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用；(2)在幼崽和成年大鼠中，1mg/kg剂量的VMY-2-95在频率上逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制；(3)这两种药物对芬太尼诱发的呼吸抑制的不同疗效，可以用VMY-2-95相对于沙西替丁-A能更好地渗透到血脑屏障中来解释(胡斯曼(Hussmann)等人，2012；宫(Kong)等人，2015)；以及(4)选择性α4β2/α4β4 nAChR拮抗剂DHβE与芬太尼的共同给药阻止了随后的沙西替丁-A或VMY-2-95给药对芬太尼诱发的呼吸抑制的缓解，这表明芬太尼诱发的呼吸抑制的缓解是通过α4β2 nAChR的激活而不是脱敏实现的。

实施例8-SIB 1553A对新生大鼠(出生后3-4天)中芬太尼诱发的呼吸抑制的作用

如前所述，β2和β4烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)亚基在整个中枢神经系统和周围神经系统中表达。这两个β亚基可以与α2、α3、α4或α5亚基中的任何一个形成异源多聚体通道。α4β2在哺乳动物脑中含量最高，而α3β4主要在周围神经节中。在非呼吸相关功能(例如，止痛、认知、戒烟)的临床前和临床试验中已对α4β2 nAChRs进行了检测。以上实施例表明，用完全激动剂、部分激动剂和正向变构调节剂激活α4β2nAChRs会减轻阿片样物质诱发的呼吸抑制，而不会降低阿片样物质的镇痛作用。

还研究并检测了α4β2nAChRs的部分激动剂——化合物SIB-1533A——的抵抗OIRD的能力。发现SIB-1533A是有效的，而通过给药α4β2/α4β4nAChR拮抗剂不能完全阻断其作用，就像A85380等药剂的情况一样。因此，考虑了其他作用机制。进一步的文献检索表明，SIB-1533A也是一种含有β4的nAChR的强效激动剂(蒙扎西(Menzaghi)等人，1998；韦尼耶(Vernier)等人，1999)。β4nAChR参与类似焦虑和抑郁的行为，并有助于烟碱的镇痛作用(西蒙诺娃(Semenova)等人，2012)。分布在大鼠中枢神经系统多个区域的β4亚基是α4亚基的候选装配伴侣(蒂尼里-米勒和帕特里克(Dineley-Miller&Patrick)，1992)。

因此，研究了SIB 1553A对芬太尼诱发的新生(出生后3-4天)大鼠的呼吸抑制的作用。图12A和图12B是来自两只幼崽的代表性全身体积描记记录。所有测试的药物均在颈后区域皮下给药。图12A示出与生理盐水媒介物共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药在芬太尼给药后7分钟内引起呼吸频率的显著降低和潮气量的轻度降低。随后SIB 1553A(40mg/kg)给药部分逆转了芬太尼诱发的呼吸速率(f_R)下降，而对芬太尼诱发的潮气量(V_T)下降无明显影响。图12B示出了与非选择性nAChR受体拮抗剂梅坎米胺(6mg/kg)共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药不影响芬太尼诱发的呼吸抑制。随后的SIB 1553A给药(40mg/kg，芬太尼后7分钟)对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响。呈现并测量了在芬太尼给药前(左迹线)、芬太尼给药后7分钟(中迹线)和芬太尼给药后12分钟(右迹线)的呼吸变化。图12C显示群体数据，示出了相对于芬太尼给药前的对照组的f_R。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，显著差异；^NSp>0.05，各比较组无显著差异，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝5-7。

与先前的研究一致(任(Ren)等人，2015)，芬太尼(35μg/kg)引起f_R的显著降低和V_T的小幅降低，并且影响持续约20分钟。在芬太尼给药后约7分钟，随后给药SIB 1553A(40mg/kg，图12A)缓解了芬太尼诱发的f_R降低，而对V_T没有太大影响。SIB 1553A的影响通过非选择性nAChR拮抗剂梅坎米胺(6mg/kg，颈部皮下注射，与芬太尼共同给药，图12B)的预先给药而消除，但仅被选择性α4β2和α4β4 nAChR拮抗剂DHβE(6mg/kg，与芬太尼共同给药)部分阻断。应当指出的是，DHβE阻断了α4β2、α4β4 nAChR的激活，其中IC50分别为0.37、0.19μM(哈维(Harvey)等人，1996，表1)。

实施例9-烟碱型乙酰胆碱受体激动剂洛贝林缓解芬太尼诱发的呼吸抑制和含β4的nAChR的作用

鉴于SIB-1533A的结果，使用另外的药理探针探查了含β4的nAChR的潜在参与。洛贝林是人类α4β4 nAChR的完全激动剂、人类α4β2 nAChR的部分激动剂、大鼠α3β4 nAChR的部分激动剂(吴(Wu)等人，2006；卡尼卡瓦(Kaniakova)等人，2014)。在剂量是与nAChR相互作用的10倍时，洛贝林还可以充当μ-阿片样物质受体拮抗剂(米勒(Miller)等人，2007)。洛贝林已被广泛用于吸烟疗法中，并且不存在严重的不良影响。洛贝林可以通过对梅坎米胺敏感的nAChR而不通过α4β2在小鼠中诱导镇痛，增强烟碱诱发的镇痛作用(达玛(Damaj)等人，1997)。因此，研究了在不损害芬太尼诱发的镇痛的情况下，洛贝林是否减轻了芬太尼诱导的呼吸抑制。

(i)洛贝林部分地通过激活β4 nAChR对抗新生大鼠中的芬太尼诱发的呼吸抑制

在大鼠幼崽中研究了体内nAChR靶向药剂(所有药物经由颈部皮下给药)。来自两个幼崽的代表性的全身体积描记记录在图13A和13B中示出。所有测试的药物在颈后区域皮下给药。图13A示出了与生理盐水媒介物共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药在芬太尼给药后7分钟内引起呼吸频率的显著降低和潮气量的轻度降低。随后的洛贝林(10mg/kg)给药部分逆转了由芬太尼诱发的呼吸速率(f_R)下降，并完全逆转了芬太尼诱发的潮气量(V_T)下降。图13B示出了与非选择性nAChR受体拮抗剂梅坎米胺(6mg/kg)共同给药的芬太尼(35μg/kg)给药对芬太尼诱发的呼吸抑制没有影响。随后的洛贝林给药(10mg/kg，芬太尼后7分钟)对芬太尼诱发的呼吸抑制作用较小。呈现并测量了在芬太尼给药前(左迹线)、芬太尼给药后7分钟(中迹线)和芬太尼给药后12分钟(右迹线)的呼吸变化。图13C-E所示的群体数据示出了相对于芬太尼给药前的对照组的f_R，V_T和每分钟通气量(V_E)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，显著差异；^NSp>0.05，在各比较组中无显著差异，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝7-8。

与先前的研究(任(Ren)等人，2015)一致，芬太尼(35μg/kg)引起f_R的显著降低和V_T的小幅降低，并且影响持续约20分钟。芬太尼给药后约7分钟，随后给药洛贝林(10mg/kg，图13A)缓解了芬太尼诱发的呼吸抑制(f_R、V_T、V_E降低)。预先给药非选择性nAChR拮抗剂梅坎米胺(6mg/kg，颈部皮下注射，与芬太尼共同给药，图13B)可显著抑制但不完全消除洛贝林对芬太尼诱发的呼吸抑制的作用。选择性α4β4/α4β2 nAChR拮抗剂DHβE(6mg/kg，颈部皮下注射，与芬太尼共同给药)部分抑制了洛贝林在f_R上对芬太尼诱发的呼吸抑制的作用(但不抑制V_T)。群体数据示于图13C-E。应当指出，先前已证明a7 nAChR的激活对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用。这些结果表明：(1)洛贝林在f_R上对芬太尼诱发的呼吸抑制的作用部分地被α4β4(也可以是α4β2)nAChR介导；以及(2)洛贝林对芬太尼诱发的V_T降低的作用被β4(例如α3β4，α4β4/α4β2)nAChR介导。总体而言，β4参与洛贝林对芬太尼诱发的呼吸抑制的作用。

(ii)通过洛贝林抵抗芬太尼诱发的成年大鼠的呼吸抑制

检测了成年大鼠中洛贝林用于体内抵抗芬太尼诱发的呼吸抑制的功效。如图14A和14B所示，在两只大鼠的全身体积描记记录中，芬太尼(30μg/kg，10分钟，静脉输注)给药引起明显的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)。图14A示出随后的生理盐水媒介物给药(静脉注射)对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用。图14B示出了随后的洛贝林给药(3mg/kg，静脉团注，在芬太尼给药后约7分钟)完全逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制。图14C-14E示出了群体数据，所述数据示出了相对于芬太尼输注之前的对照组的呼吸参数(f_R、V_T、V_E)。每个n＝9。图14F示出了群体数据，所述数据示出了动脉血氧饱和度(Sao₂)。每个n＝6。*p<0.01、***p<0.001，两组之间差异显著，使用ANOVA的双向重复测量(Holm-Sidak方法)。

总之，图14示出了在30μg/kg芬太尼静脉输注10分钟期间成年大鼠呼吸的代表性体积描记记录。与之前的研究类似(任(Ren)等人，2009，2015)，该示例在芬太尼给药后7分钟内导致大多数的大鼠出现明显的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E降低)。随后的生理盐水媒介物注射(图14A)没有改变芬太尼作用的进程。相比而言，随后的洛贝林注射(3mg/kg，图14B)在f_R、V_T、V_E和Sao₂上完全逆转了芬太尼诱发的呼吸抑制(群体数据示于图14C-14F)。

应该注意的是，(1)在大多数的大鼠中观察到的芬太尼诱发的强烈肌肉僵化似乎已经被轻度缓解，但是在存在洛贝林的情况下仍然持续存在，以及(2)洛贝林(3mg/kg，静脉注射)单独给药导致V_E的轻度增加(对照组的116.2±8.7％，对比对照组的生理盐水105.2±4.7％，p＝0.038，每个n＝5)，与先前的研究一致(斯隆(Sloan)等人，1988)。洛贝林(6mg/kg，腹腔内，n＝3)单独给药不会影响V_E。3)如图15所示，洛贝林(3mg/kg，静脉注射)单独给药引起轻度心动过缓；与先前的研究一致(斯隆(Sloan)等人，1988)。在图15中，数据点示出了生理盐水给药后2分钟(静脉注射，n＝5)，洛贝林给药后2分钟(3mg/kg，静脉注射，n＝5)，芬太尼给药后7分钟(30μg/kg，静脉输注10分钟)，以及随后给药生理盐水(n＝8)或洛贝林(n＝8)后2分钟。*p<0.05，表明差异显著；^NSp>0.05，无显著差异。T检验用于比较生理盐水处理组和洛贝林处理组；使用克鲁斯卡沃利斯(Kruskal-Wallis)秩单向ANOVA(图基(Tukey)测试)比较芬太尼和随后用生理盐水或洛贝林治疗的组。芬太尼(30μg/kg，静脉输注10分钟)给药引起严重的心动过缓，随后的生理盐水给药不会改变心动过缓的严重程度。有趣的是，随后的洛贝林给药并没有加剧心动过缓，而是明显减缓了芬太尼诱发的心动过缓。

(iii)洛贝林预防芬太尼诱导的成年大鼠呼吸抑制和呼吸暂停

当快速给药时，芬太尼诱发特别强烈的呼吸抑制和呼吸暂停。进一步检测了洛贝林在预防芬太尼快速给药诱发的呼吸抑制和呼吸暂停方面的效力。

图16A和B示出芬太尼(12ug/kg，1分钟静脉输注)与生理盐水(静脉输注1分钟)的共同给药在两只大鼠中引起明显的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)和呼吸暂停。图16C示出芬太尼(12μg/kg，1分钟静脉输注)与洛贝林(3mg/kg，1分钟静脉输注)共同给药可明显预防芬太尼诱导的呼吸抑制(f_R、V_T和V_E)和消除呼吸暂停。

总的来说，芬太尼(12μg/kg，1分钟，静脉注射)和生理盐水(第二尾静脉，静脉注射)的共同给药引起明显的呼吸抑制。在一些动物中，芬太尼逐渐抑制了呼吸的速率和深度，随后出现明显的呼吸暂停(图16A，n＝2)。在其他动物中，芬太尼的快速给药后不久(大约10-30秒)出现呼吸暂停，随后进行浅呼吸(图16B，n＝2)。相比之下，芬太尼(12μg/kg，1分钟静脉注射)和洛贝林(3mg/kg，1分钟，第二条尾静脉，静脉注射，n＝4)的共同给药完全预防了芬太尼诱发的呼吸抑制并阻止了呼吸暂停。

(iv)未被洛贝林影响或增强的芬太尼诱发的成年大鼠镇痛

进行福尔马林测试，对在福尔马林注射后0-5分钟(I阶段)、20-40分钟(II阶段)进行伤害感受行为(舔并举起受伤的爪子)所花费的时间进行计分。在洛贝林或生理盐水后30分钟给药福尔马林。首先，评估了成年大鼠中洛贝林(3mg/kg，静脉注射)对基线伤害感受的影响(图17)。在洛贝林(3mg/kg，尾部静脉注射)或生理盐水W/O芬太尼(10μg/kg，静脉输注10)给药后30分钟，将福尔马林(1.5％，50μl)注入后爪的足底区域。在福尔马林给药之后的I阶段：0-5分钟和II阶段：20-40分钟，检测了洛贝林对进行伤害感受行为(舔和举)所花费的时间的影响。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，显著差异；^NSp>0.05，在各比较组中无显著差异，使用单向ANOVA(海姆-思达克方法)。每个n＝8-9。

相对于生理盐水组，在I阶段中，洛贝林处理的组具有降低的伤害响应(图17A)。洛贝林处理倾向于降低II阶段的伤害响应，但相对于生理盐水组，差异不显著(图17B)。然后，评估了成年大鼠中洛贝林(3mg/kg，芬太尼后7分钟，图17)对芬太尼(30μg/kg，静脉输注10分钟)诱发的镇痛作用的影响。如通过福尔马林测试所检测的，芬太尼给药以及芬太尼后7分钟的随后生理盐水给药诱发了明显的镇痛作用，而随后的洛贝林给药在I阶段中进一步增加了芬太尼诱发的镇痛作用(图17A)。洛贝林在II阶段中倾向于增加芬太尼诱发的镇痛作用，但相对于生理盐水组，差异不明显(图17B)。洛贝林对芬太尼(30μg/kg，静脉输注10分钟)诱发的镇静作用没有影响(翻正反射丧失：22.4±7.3分钟，相对于媒介物：23.8±4.6分钟，p＝0.64)。

总而言之，洛贝林和β4 nAChR的其他潜在激动剂或调节剂可以减少OIRD，因此具有促进疼痛控制和减少阿片样物质引起的呼吸抑制和服药过量的潜力。

实施例10-通过α4β2 nAChR的激活增强基线呼吸节律和减轻DAMGO诱发的体外呼吸抑制。

如之前所报道的，用甲氧氟烷麻醉新生大鼠(出生后1-3天)、切除大脑，并切开脑干-脊髓。用改性的克雷布斯(Krebs)溶液在27°±1℃(5ml/min；腔室容积，3ml)连续灌注神经轴，所述溶液包含128mM NaCl、3.0mM KCl、1.5mM CaCl₂、1.0mM MgCl₂、23.5mM NaHCO₃，0.5mM NaH₂PO₄和30mM d-葡萄糖，并用95％O₂-5％CO₂平衡(pH 7.4)。

然后从灌注有浸泡液的脑干-脊髓制剂中切下包含

和更多尾部网状结构区域的单个横向切片(厚700μm)，所述浸泡液与用于BSSC制剂的浸泡液相同，不同之处在于KCl浓度增加至9mM以促进稳定节律的长期产生。来自脑干脊髓的第四腹侧颈神经根或髓质切片制剂的舌下神经根的记录被放大、校正、低通滤波，并使用模拟-数字转换器(阿克森仪器数码数据(Axon Instruments Digidata)；分子设备，加利福尼亚州桑尼维尔(Sunnyvale,CA))和数据采集软件(阿克森仪器轴镜(Axon Instruments AxoScope))记录到计算机中。

通过检查药物应用对产生自发吸气运动活动的介质浸泡脑干-脊髓制剂的作用开始体外分析(图18)。烟碱(600nM，图18A)是nAChR的非选择性激动剂，在浓度高于200nM时引起基线f_R升高。选择性的α4β2 nAChR激动剂A85380(25nM，图18B)在浓度高于5nM时提高基线f_R，而激动剂PNU282987(30μM，图18C)激活α7 nAChR导致f_R非常适度的提高。μ-阿片制剂受体激动剂、D-Ala2、N-Me-Phe4、Gly5-ol]脑啡肽或DAMGO(200nM)用于体外诱发呼吸抑制。随后应用烟碱(600nM，图18D)或A85380(25nM，图18E)明显逆转DAMGO诱导的呼吸抑制(f_R和爆发面积减少)，但PNU282987(30μM，图18F)则无此逆转效果。烟碱和A85380对基线和DAMGO诱发的呼吸抑制的作用被预先应用的α4β2 nAChR拮抗剂DHβE(400nM，图18G和18H)阻止，但未被α7 nAChR拮抗剂MLA(400nM，图18H)阻止。与先前的研究一致，在存在DHβE(400nM，图18H)或MLA(400nM，图18H)的情况下，f_R较慢，这表明通过α4β2和α7 nAChR的内源性激活能强直性刺激呼吸节律。上述nAChR靶向剂对吸气幅度、持续时间或面积无明显影响(数据未示出)。

接下来，使用包含

和XII运动神经元(在呼吸循环的吸气阶段放电)群组的髓质切片制剂(图19)。这样可以在

水平更直接地评估药物作用。A85380(25nM)的浸泡应用提高了f_R，而PNU282987(30μM，数据未示出)对基线呼吸活动没有影响。DAMGO(200nM)导致对f_R的抑制，该对f_R的抑制被A85380(25nM)缓解、但未被PNU282987(30μM，数据未示出)缓解。

实施例11-通过α4β2 nAChR的激活对抗新生大鼠体内芬太尼诱发的呼吸抑制

然后在与体外所用的大鼠幼崽年龄相近的大鼠幼崽中，体内检测实施例10中的化合物(所有药物经由颈部皮下给药)。烟碱(0.3-0.6mg/kg)、A85380(0.03-0.06mg/kg)、PNU282987(1-20mg/kg)和DHβE(6mg/kg)均未显著改变基线V_E(数据未示出)。与先前的研究一致，芬太尼(35μg/kg)导致f_R显著降低和V_T轻度降低，并且这种作用持续了约20分钟。在芬太尼给药后约7分钟，随后媒介物给药(生理盐水：图20A或HPCD)对呼吸抑制没有影响。烟碱(0.3-0.6mg/kg，图20B)和A85380(0.03-0.06mg/kg，图20C)以依赖剂量的方式缓解了芬太尼诱发的呼吸抑制(f_R、V_T、V_E降低)，而其未被PNU282987(1-20mg/kg，图20D)逆转。DHβE(6mg/kg)与芬太尼的共同应用通过随后的烟碱(图20E)或A85380(图20F)给药阻止了芬太尼诱发的呼吸抑制的缓解。群体数据示于图20G-I，示出了相对于芬太尼给药之前的对照组的呼吸频率(f_R)、潮气量(V_T)和每分钟通气量(V_E)。*p<0.05、**p<0.01，***P<0.001，显著差异；ns：p>0.05，在各比较组中无显著差异，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝6-8。

实施例12-通过α4β2 nAChR激动剂对抗成年大鼠体内芬太尼诱发的呼吸抑制

检测了成年大鼠体内α4β2和α7 nAChR激动剂对抗芬太尼诱发的呼吸抑制的功效。图21示出在60μg/kg芬太尼20分钟静脉输注期间成年大鼠呼吸的代表性体积描记记录。类似于先前的研究，该范例在芬太尼给药后7分钟内在大多数的大鼠中产生了明显的f_R抑制作用(>50％的降低)。随后注射媒介物(图21A)没有改变芬太尼作用的进程。相比而言，随后的烟碱注射(0.1-0.3mg/kg，静脉注射，图21B)逆转了芬太尼诱发的f_R降低，并且逆转持续了5-10分钟。A85380(0.01-0.03mg/kg，静脉注射，图21C)注射依赖剂量地逆转了芬太尼诱发的f_R降低，并且在最高剂量下逆转持续超过芬太尼输注的持续时间。PNU282987(1-10mg/kg，静脉内，图21D)对芬太尼诱发的呼吸抑制没有作用。群体数据示于图21E-G，示出相对于给药之前对照组的呼吸频率变化的时间进程，其中烟碱(图21E)和A85380(图21F)相比于生理盐水，PNU282987(1、2、3、10mg/kg，每剂量n＝2)相比于HPCD(图21G)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，显著差异，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝8。在烟碱、A85380给药之后，芬太尼诱发的氧饱和度的降低得到缓解，但是PNU282987给药后没有得到缓解(图21H)。A85380(0.03mg/kg)对芬太尼诱发的f_R下降逆转迅速(中位起效：11.1s，n＝8)，与纳洛酮(0.3mg/kg，10.1s，n＝4，曼特尼秩和检验(Mann-Whitney Rank Sumtest)，p＝0.68)引起的逆转相当。60μg/kg芬太尼输注20分钟结束时，芬太尼诱发的体温下降与生理盐水(中位值：-1.1℃，n＝6)或A85380(中位值：-1.2℃，n＝6，曼特尼秩和检验，p＝0.59)治疗无明显差异。

在成年大鼠中检测了A85380对预防芬太尼诱发的f_R降低的功效。在芬太尼给药(20μg/kg，400s输注，图22)之前2分钟注射媒介物(生理盐水)或A85380(0.06mg/kg，颈部皮下注射)。它导致大多数媒介物治疗的动物的f_R显著降低。A85380给药降低了芬太尼诱发的呼吸抑制的严重程度。需注意，基于之前对于A85380的大鼠研究，给药剂量0.06mg/kg约为EC₅₀。与那些研究一致，未观察到行为副作用。特别地，图22A示出在生理盐水给药(颈部皮下)后2分钟，芬太尼(20μg/kg，400μs，静脉输注)给药引起呼吸频率和每分钟通气量的显著降低。图22B示出在芬太尼之前的2分钟预先给药A85380(0.06mg/kg，皮下)减少了芬太尼诱发的呼吸频率降低。图22C是群体数据，其示出相对于给药之前的对照组的呼吸频率。**p<0.01，两组之间差异显著，使用双向重复测量ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝16。

芬太尼还引起体内V_T的轻度降低。先前的研究已经确定，潮气量减少的部分原因是对呼吸运动神经元的驱动减少，更大的原因是由于芬太尼诱导的肌肉僵化和胸腔僵化。在大鼠中发生的僵化是一个有充分记录的现象，可能涉及纹状μ-阿片样物质受体。A85380似乎没有降低肌肉僵化，因此成年大鼠的V_T没有逆转。相比而言，在P3幼崽中，如果芬太尼诱发的肌肉僵化程度要轻得多，存在烟碱或A85380之后V_T下降的逆转。

实施例13-α4β2 nAChR激动剂预防在成年大鼠体内瑞芬太尼诱发的呼吸暂停

阿片样药物瑞芬太尼引起短时间内作用特别强烈的呼吸抑制。已经证明，低剂量的纳洛酮或安帕金更难对其进行抵抗(最近的临床试验)。因此，为了进一步评估A85380的效力，对它抵抗瑞芬太尼诱发的呼吸抑制进行测试(图23)。图23A和23B是来自2只成年大鼠的代表性全身体积描记记录。大剂量瑞芬太尼(5μg/kg，20秒，与生理盐水共同给药)在第一分钟引起明显的呼吸暂停和降低的每分钟通气量(V_E)(图23A)。A85380(0.06mg/kg，静脉注射)与瑞芬太尼的共同给药显著减少了瑞芬太尼诱发的呼吸暂停并降低了V_E(图23B)。图23C-D显示群体数据。*p<0.05、***P<0.001，在各比较组中有显著差异，使用单向ANOVA(海姆-思达克方法)。每个n＝8。

已表明，瑞芬太尼(5μg/kg，20秒)和生理盐水共同给药在注射后的第一分钟内诱发明显的呼吸暂停和降低的V_E，其在2分钟后恢复。瑞芬太尼(5μg/kg)和A85380(0.03-0.06mg/kg)共同给药显著降低了通常在瑞芬太尼注射后立即发生的呼吸暂停的发生率，并减少了V_E的抑制。

实施例14-α4β2 nAChR激动剂减轻芬太尼诱导的成年大鼠镇静作用

除了呼吸抑制之外，意外的镇静是阿片样物质诱发的另一严重不良事件，其导致患者发病以及住院时间增加。尽管尚未完全理解其潜在机制，阿片样物质引起的镇静作用被认为与阿片样物质的抗胆碱能活性有关。因此，对A85380(0.06mg/kg，皮下注射)激活α4β2会减少芬太尼(20ug/kg，输注400s)诱发的镇静作用这一假设进行检验。与媒介物治疗组(20.5±1.4分钟，n＝8)相比，A85380的镇静作用(翻正反射丧失)适度地，但明显地时间缩短了(芬太尼后16.2±1.3分钟，n＝8，两次尾部t检验，p＝0.039)。

实施例15-由α4β2 nAChR激动剂增强的成年大鼠中芬太尼诱发的镇痛作用

测试了A85380(0.06mg/kg，皮下(sc))对成年大鼠的基线伤害感受的作用。进行了两项伤害感受测试：1)热板测试(任(Ren)等人，2006；2015)：热伤害感受是通过由红外热源(热量设定在70)组成的足底测试装置(尤格巴西(Ugo Basile)，科梅廖弗吉尼亚州(Comerio VA)，意大利)测量的。红外热源定位在后爪的正下方，比试验箱底部低20mm。当大鼠感觉到疼痛并缩回了爪子时，仪器会自动检测到缩回潜伏期，精确至0.1秒。如果在其开始后20秒内未观察到缩回反应，热刺激自动终止以避免组织损伤。2)福尔马林测试：将福尔马林稀释溶液(50μl，1.5％福尔马林)注入右后爪的足底区域，然后在试验的第二阶段(20-40分钟；反映炎症)评估伤害感受行为(舔/举起/缩回注射的爪子)(杜比松(Dubuisson)和丹尼斯(Dennis)，1977)。舔/举起所花费的时间的简单总和是对福尔马林诱发的伤害感受行为的公认评估(阿尔伯特(Abbott)等人，1995)。

镇静作用(丧失翻正反射)的定义是，在通过重新放置体积描记器腔室将动物仰卧放置后，大鼠无法将自身纠正到俯卧位。在这项研究中测试的动物在开始芬太尼输注后约10分钟时不能仰卧，但在芬太尼给药后30分钟内恢复了翻正反射。未测试翻正反射丧失的开始，因此，本研究中翻正反射丧失的持续时间被专门定义为从开始芬太尼给药到恢复翻正反射的时间间隔。图24提供了实验方案的图形概要。在芬太尼给药之前2分钟(20μg/kg，400s，静脉输注)给药A85380(0.06mg/kg，颈部皮下注射)或生理盐水。在一组动物中，翻正反射测试在芬太尼给药后10分钟开始，然后将动物从腔室中取出，在芬太尼给药之后40分钟进行热伤害感受测试(图24A)。在另一组动物中，在芬太尼给药后10分钟给药福尔马林(图24B)。

在图25A中示出在A85380或生理盐水W/O随后输注芬太尼之后42分钟时测量的A-85380对响应于热刺激的缩爪潜伏期的影响。图25B示出A85380或生理盐水给药(没有随后的芬太尼输注)后32-52分钟时测量的A85380对福尔马林给药后20-40分钟的伤害感受行为(舔和举起)所花费的时间的影响。*p<0.05、**p<0.01、***P<0.001，在各比较组中有显著差异，使用单向ANOVA(海姆-思达克法)。每个n＝8。

在A85380或生理盐水给药之前的和给药之后42分钟的热刺激缩爪潜伏期表明，用A85380治疗后，缩爪潜伏期显著增加；而媒介组组没有变化。福尔马林测试(其对福尔马林注射后20-40分钟进行伤害感受行为(舔并举起受伤的爪子)所花费的时间进行计分)表明，与生理盐水组相比A85380治疗组具有降低的伤害感受响应。在两个测试中，A85380诱导的基础镇痛均与先前的研究一致。A85380(0.06mg/kg，在芬太尼给药之前2分钟)对芬太尼(20μg/kg静脉输注400秒)诱发的成年大鼠镇痛作用的影响表明，芬太尼给药(用生理盐水预处理)诱发明显的镇痛作用，其由热和福尔马林测试测得，而在两个测试中，A85380的预处理均进一步增加了芬太尼诱发的镇痛作用。总的来说，这些数据表明A85380增强了芬太尼诱发的镇痛作用。

然而，对于本领域技术人员而言明显的是，除了那些已经描述的之外，在不脱离本文的发明构思的情况下，还可以进行更多的修改。因此，除了本公开的范围之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释本公开内容时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他性的方式指代元件、组件或步骤，表示所指代的元件、组件或步骤可以存在、使用或与其他未明确指出的元件、组件或步骤结合。

参考文献

所提及的所有出版物均通过引用并入本文(在允许的情况下)，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅是在本申请的提交日期之前公开的。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期不同，实际发布日期可能需要单独确认。

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Claims (28)

1.一种治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量的方法，包括对所述受试者给药有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述呼吸抑制的其他原因选自非阿片类药物、阻塞性睡眠呼吸暂停、中枢性睡眠呼吸暂停、早产呼吸暂停、低氧、普拉德-威利综合症、雷特综合症、庞皮病、潮式呼吸、神经元变性、中风、心力衰竭、脑外伤、帕金森氏病或脊髓损伤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的正向变构调节剂，或者选自完全激动剂或部分激动剂的烟碱型乙酰胆碱激动剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是α4β2烟碱型乙酰胆碱受体。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是α4β4烟碱型乙酰胆碱受体。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是含有β4的烟碱型乙酰胆碱受体。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是α3β4烟碱型乙酰胆碱受体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(A85380)、2-((2R,6S)-6-((S)-2-羟基-2-苯基乙基)-1-甲基哌啶-2-基)-1-苯基乙酮(洛贝林)、(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺(利万西林)、6-[5-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-3-吡啶基]-5-己炔-1-醇(沙西替丁-A)、3-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-5-(2-苯基乙炔基)-吡啶(VMY-2-95)、(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚(SIB-1533A)、3-[3-(3-吡啶基)-1，2，4-恶二唑-5基]苄腈(NS9283)、5-{[(2R)-氮杂环丁烷-2-基]甲氧基}-2-氯吡啶(替班西林、依班比林、ABT-594)、(1S,5S)-3-(5,6-二氯-3-吡啶基)-3,6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷(索菲尼克林、ABT-894、A-422894)、2-甲基-3-{[(2S)-吡咯烷-2-基]甲氧基}吡啶(泊桑尼克，ABT-089)、3-甲基-5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]-1,2-恶唑(ABT 418)以及7,8,9,10-四氢-6,10-甲基-6H-吡嗪并[2,3-h][3]苯并氮杂卓(伐尼克林、戒必适、畅沛)。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(A85380)的完全激动剂。

10.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括2-((2R,6S)-6-((S)-2-羟基-2-苯基乙基)-1-甲基哌啶-2-基)-1-苯基乙酮(洛贝林)的部分激动剂。

11.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺或(E)-间烟碱(利万西林)的部分激动剂。

12.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括6-[5-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-3-吡啶基]-5-己炔-1-醇(沙西替丁-A)的部分激动剂。

13.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括3-[(2S)-2-氮杂环丁烷基甲氧基]-5-(2-苯基乙炔基)-吡啶(VMY-2-95)的部分激动剂。

14.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚(SIB-1533A)的部分激动剂。

15.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物是包括3-[3-(3-吡啶基)-1,2,4-恶二唑-5基]苄腈(NS9283)的正向变构调节剂。

16.根据权利要求5所述的方法，其中所述化合物是包括(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚(SIB-1533A)的完全激动剂。

17.根据权利要求6所述的方法，其中所述化合物是包括2-((2R,6S)-6-((S)-2-羟基-2-苯基乙基)-1-甲基哌啶-2-基)-1-苯基乙酮(洛贝林)的完全激动剂。

18.根据权利要求6所述的方法，其中所述化合物是包括(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚(SIB-1533A)的完全激动剂。

19.根据权利要求7所述的方法，其中所述化合物是包括2-((2R,6S)-6-((S)-2-羟基-2-苯基乙基)-1-甲基哌啶-2-基)-1-苯基乙酮(洛贝林)的部分激动剂。

20.根据权利要求7所述的方法，其中所述化合物是包括(±)-4-[2-(((N-甲基)-2-吡咯烷基)乙基]硫代苯酚(SIB-1533A)的完全激动剂。

21.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述化合物的静脉内或肌肉内给药治疗、预防或改善所述呼吸抑制和用药过量。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述阿片样物质包括芬太尼。

23.有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物的用途，用于治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的受试者呼吸抑制和用药过量。

24.一种诱发受试者镇痛、麻醉或镇静，同时治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量的方法，包括对所述受试者给药有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物。

25.有效量的能够激活神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体的化合物或包括所述化合物的组合物的用途，用于诱发受试者镇痛、麻醉或镇静，同时治疗、预防或改善由阿片样物质或呼吸抑制的其他原因诱发的呼吸抑制和用药过量。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(A85380)，用以缓解由弱内源兴奋性驱动引起的呼吸抑制。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是3-(2(s)-氮杂环丁烷基甲氧基)吡啶(A85380)，用以缓解由脊髓损伤引起的呼吸抑制。

28.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经元异侧烟碱型乙酰胆碱受体是α4β2烟碱型乙酰胆碱受体和α6β2烟碱型乙酰胆碱受体。

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