CN111621465A - 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用 - Google Patents

一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111621465A
CN111621465A CN202010441988.0A CN202010441988A CN111621465A CN 111621465 A CN111621465 A CN 111621465A CN 202010441988 A CN202010441988 A CN 202010441988A CN 111621465 A CN111621465 A CN 111621465A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver
cell
cells
mesenchymal stem
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010441988.0A
Other languages
English (en)
Inventor
周明
欧映廷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liver Biotechnology Shenzhen Co ltd
Original Assignee
Liver Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liver Biotechnology Shenzhen Co ltd filed Critical Liver Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority to CN202010441988.0A priority Critical patent/CN111621465A/zh
Publication of CN111621465A publication Critical patent/CN111621465A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/137—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. Msc from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用，属于类器官的构建技术领域。所述肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0:(0.125‑4)或者4:1:(0.125‑4)、且细胞密度为0.5×105/cm2‑2.5×105/cm2混合均匀后，加入到非组织培养处理过的培养板或者超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/v CO2、37℃的培养箱中，培养24h±2h，即得到肝脏类器官。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性研究、代谢研究和生物人工肝等领域。

Description

一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用，属于类器官的构建技术领域。
背景技术
原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可用于肝脏基础研究、病毒研究、药物研发、肝细胞移植以及肝脏器官3D打印。通常情况下，原代肝细胞的培养与维持是在二维(2D)培养体系下进行，即在培养板上包被I型鼠尾胶原，按照严格的细胞密度，将肝细胞接种胶原包被板上，通过加有DMSO的维持培养基进行肝细胞维持。然而，2D培养条件下的肝细胞，许多重要的细胞或者生理功能在很短的时间内丢失，不利于细胞研究和药物研究。在体内，肝细胞与其它肝非实质细胞和细胞外基质相互接触，存在多种细胞间的交流形式，以实现多种重要的细胞功能。
3D细胞培养是能在细胞培养过程中为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的培养技术，形成具有3D结构的混合细胞组织或者细胞团，广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性和代谢研究等。
目前，构建肝脏类器官的方法相对较多，主要有四种，各有优缺点：
一是基于细胞外基质形成“三明治”结构，即利用I型胶原在不同PH下的溶解度不一样，首先铺底层胶原层，接着铺肝细胞，最后在肝细胞上铺上层胶原，形成“三明治”结构，重现肝细胞在体内与细胞外基质的相互作用，让肝细胞生活在三维结构中，相对于2D培养，能更好维持肝细胞的特性。由于“三明治”结构仅实现肝细胞与细胞外基质的相互作用，是相对低级的3D培养方式。
二是基于3D打印技术的类器官构建方法，细胞可以按照预设程序进行排列，得到结构一致的肝脏类器官。缺点是依赖昂贵的3D打印机，产量有限，不利于肝脏类器官的大规模应用。
三是基于微流控技术的肝脏芯片，利用定制化、具有特殊结构的芯片，将肝细胞、肝非实质细胞接种到特定腔室里，实现肝细胞与肝非实质相互作用，以及培养废物的及时排除。但该技术依赖昂贵的仪器设备，技术要求高、产量有限，不利于肝脏芯片的大规模应用。
四是基于细胞自成团的细胞培养技术，主要是利用可贴壁培养的(冻存)肝细胞特性，在低贴壁的培养板上，经过5-7天的悬浮培养，肝细胞自发组织成团，形成圆球体。此方法优点是成本低，简单易行，是目前3D培养技术主要方式；缺点是仅可贴壁肝细胞才能成团、成团时间长(5-7天)，成功率相对较低(仅65％)。
鉴于此，有必要开发一种成本低、快速、高效的肝脏的类器官快速构建的方法。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种肝脏类器官快速构建的方法。本发明的肝脏类器官快速构建的方法，一是能实现原代肝细胞和肝非实质细胞的快速成团(24h以内)，成功率高(100％)；二是不仅可以实现贴壁原代肝细胞的高效成团，还可以实现非贴壁原代肝细胞的高效成团。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性、代谢研究和生物人工肝等领域。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：
分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0:(0.125-4)或者4:1:(0.125-4)、且细胞密度为0.5×105/cm2-2.5×105/cm2混合均匀后，加入到非组织培养处理的培养板或者超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/vCO2、37℃的培养箱中，培养24h±2h，即得到肝脏类器官。
本发明的原理是：
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，简称MSC)广泛分布于各种组织(如骨髓、脂肪、骨骼肌等组织)，胎盘和脐带组织则含有更丰富的MSC。间充质干细胞具有一定干细胞特性，可分化为多种组织细胞，包括肝细胞、胰岛细胞等，具有组织再生修复作用。同时，间充质干细胞可分泌多种免疫调节因子和细胞生长因子，具有一定免疫调节和对抗衰老的作用。再者，间充质干细胞还有很强的自成团特性，在胰岛细胞成团方面有相关文献报道。但是，由于间充质干细胞在肝脏中的分布较少，且其自成团的机理不清楚，因此目前未见利用关间充质干细胞(MSC)用于肝脏类器官构建的相关报道。
本发明利用间充质干细胞(MSC)作为“胶水”，一是能实现原代肝细胞和/或者肝非实质细胞的快速成团(24h以内)，成功率高(100％)；二是不仅可以实现贴壁原代肝细胞的高效成团，还可以实现非贴壁原代肝细胞的高效成团。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性、代谢研究和生物人工肝等领域。
其中，非组织培养处理的培养板，即非贴壁(非TC处理)培养板，可以市售购买，如购自中国耐思(NEST)公司，货号为703011、712011、702011、748011、701011。以上不同货号对应不同规格，不同规格都可以达到同等效果。
TC全称：Tissue culture treated，TC处理表示该培养板经过组织培养处理。非TC处理表示该培养板未经过组织培养处理。
超低贴壁性能培养板，即Ultra-low Attachment，简写为ULA。可以市售购买，如购自美国Corning公司，货号为3474或者3473。以上不同货号对应不同规格，不同规格都可以达到同等效果。
相对于普通的培养板，采用上述两种培养板，可以防止本发明用到的原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液在构建肝脏类器官时细胞贴壁，能使细胞悬浮培养，自发成团。
本发明的肝脏类器官快速构建的方法的有益效果是：
本发明的肝脏类器官快速构建的方法，一是能实现原代肝细胞和肝非实质细胞的快速成团(24h以内)，成功率高(100％)；二是不仅可以实现贴壁原代肝细胞的高效成团，还可以实现非贴壁原代肝细胞的高效成团。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性研究、代谢研究和生物人工肝等领域。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置30min-45min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。
上述原代肝细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-PHH001；或者购自美国BioIVT公司，货号为MX008001或者X008001-P。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
更进一步，所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白。
采用上述更进一步的有益效果是：MEM培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、地塞米松、青链霉素、胎牛血清和牛血清白蛋白。上述几种组分按照相应的配比进行组合，共同达到高效复苏原代肝细胞的功效。
上述MEM培养基可以市售购买，如购自美国Gibco公司，货号为11090081；或者购自美国Sigma公司，货号为M0769-10×1L；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-MEM001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述ITS通用型培养添加剂，是Insulin,Transferrin,Selenium Solution的缩写，可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为41400045；或者购自美国Sigma公司，货号为I3146-5mL；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-ITS001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述L-谷氨酰胺，英文名称为L-Glutamine，简称L-Gln，是谷氨酸的酰胺。上述L-谷氨酰胺可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为25030081；或者购自美国Sigma公司，货号为G7513；或者购自上海源培生物科技股份有限公司，货号为S210JV。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述表皮生长因子可以市售购买，如购自美国R&DSystems公司，货号为236-EG；或者购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为PHG0311；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-EGF001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述氢化可的松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-N0583；或者购自美国Sigma公司，货号为H0888。以上市售产品成分一样，可以达到同等效果。
上述地塞米松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-14648；或者购自美国Sigma公司，货号为D4902。以上市售产品成分一样，可以达到同等效果。
上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为15140163；或者购自美国Sigma公司，货号为V900929；或者购自以色列BiologicalIndustries公司，货号为03-031-1B。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述牛血清白蛋白可以市售购买，如购自Sigma，货号为A1933-100G。
更进一步，所述铺板培养基是在William′sE培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
采用上述进一步的有益效果是：在William′s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、地塞米松、青链霉素和胎牛血清。上述几种组分按照相应的配比进行组合，共同达到铺板肝细胞的功效。
进一步，所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按4500个活细胞/cm2-5500个活细胞/cm2接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到活性高且一致性好的间充质干细胞单细胞悬液。
上述组织培养处理过的培养板，即贴壁(TC处理)培养板，如购自中国耐思(NEST)公司，货号为703001或者701001。以上不同货号对应不同规格，不同规格都可实现本发明的技术效果。
上述得到的间充质干细胞在实际使用时，可以先利用含10ug/ml丝裂霉素C的培养基孵育细胞2h，去掉旧的含10ug/ml丝裂霉素C的培养基，利用胰酶消化形成单细胞，血清终止胰酶活性，离心去掉上清，利用铺板培养基重选细胞沉淀，得到间充质干细胞单细胞悬液。采用含10ug/ml丝裂霉素C的培养基孵育细胞2h，可以抑制间充质干细胞的增殖，但又可保证间充质干细胞的自成团活性。
上述用到的铺板培养基原代肝细胞单细胞悬液制备时用到的铺板培养基，也是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
更进一步，所述原代间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的任意一种。
采用上述更进一步的有益效果是：在本发明中，人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞都可以用于快速构建肝脏类器官。
上述人脐带间充质干细胞，可以市售购买，如购自赛业生物科技有限公司，货号为HUXUC-01001。
上述人骨髓间充质干细胞，可以市售购买，如购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CP-H166。
上述人脂肪间充质干细胞，可以市售购买，如购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CP-H202。
更进一步，所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素。
上述α－MEM基础培养基可以市售购买，如购自Gibco，货号为12571-063。
上述胎牛血清，英文全称是Fetal Bovine Serum,简称FBS，是血清中的一种，主要是来自剖腹产的胎牛。胎牛血清是在屠宰怀孕母牛的时候，通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛血清采自出生10至14天的小牛。上述胎牛血清可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为10091148；或者购自以色列BiologicalIndustries公司，货号为04-001-1A；或者购自美国Hyclone公司，货号为SH30079.03。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
上述青链霉素，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。青霉素和链霉素可分别作用于革兰阳性和革兰阴性细菌，其配合使用可预防细胞培养物的细菌污染。青霉素最初从青霉属真菌中纯化而来，通过直接干扰细菌细胞壁的周转，间接触发酶的释放，从而进一步改变细胞壁。链霉素最初从链霉菌中纯化而来。链霉素通过与细菌核糖体30S亚基结合，从而抑制蛋白质合成并导致细菌死亡。在本发明中，青链霉素用作抑制或杀死细菌。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Gibico公司，货号为10378016。
更进一步，所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。
采用上述进一步的有效果是：10代以内的间充质干细胞具有更好的细胞活性，以及成团能力。
进一步，所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×105/cm2的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到肝非实质细胞单细胞悬液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到活性高且一致性好的肝非实质细胞单细胞悬液。
上述原代肝非实质细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-NPC001。
上述得到的肝非实质细胞单细胞悬液经过冻存液冻存后，可以长期保存。在实际使用时，再将冻存后的肝非实质细胞单细胞悬液于37℃迅速解冻，离心并去掉冻存液，利用铺板培养基重悬细胞，得到间充质干细胞单细胞悬液。上述冻存液由如下体积百分数的原料制成：45％v/v William′s E培养基、45％v/v FBS和10％v/v DMSO。采用上述冻存液，可以高效保存肝非实质细胞的活性与活力。
更进一步，所述传代培养在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。
采用上述进一步的有效果是：5代以内的肝非实质细胞具有更好的细胞活性，更原始的细胞状态。
本发明的目的之二，是提供一种肝脏类器官。本发明的肝脏类器官由上述构建方法构建得到，该肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性、代谢研究和生物人工肝等领域。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。
本发明的肝脏类器官的有益效果是：
本发明的肝脏类器官由上述构建方法构建得到，该肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性、代谢研究和生物人工肝等领域。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。
采用上述进一步的有益效果是：本发明得到的肝脏类器官包含原代肝细胞、肝非实质细胞、间充质干细胞三种细胞，或者包含原代肝细胞和间充质干细胞两种细胞，上述三种细胞或者两种细胞交错分布，形成实心球体。间充质干细胞以更快的速度、更高的效率促进肝脏细胞成团，降低了细胞失巢凋亡以及原代肝细胞去分化的风险；原代肝细胞与肝非实质细胞充分接触，实现了细胞间的信号交流。
本发明的目的之三，是提供上述构建方法构建得到的肝脏类器官的应用。本发明得到的肝脏类器官，可以用于多种用途，具有广阔的应用空间。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。
本发明的肝脏类器官的应用的有益效果：
上述构建方法构建得到的肝脏类器官，可以用于多种用途，具有广阔的应用空间。
附图说明
图1为本发明的实验例中，在相差显微镜下观察到的肝脏类器官形态图，比例尺为400μm。
图2为本发明的实验例中，在相差显微镜下观察到的贴壁肝细胞在胶原包被的培养孔中形态图，比例尺为400μm。
图3为本发明的实验例中，在相差显微镜下观察到的非贴壁肝细胞在胶原包被的培养孔中形态图，比例尺为400μm。
图4为本发明的实验例中，不同培养条件下白蛋白的分泌图。
图5为本发明的实验例中，不同培养体系下肝细胞特异基因的表达水平图。
图6为本发明的实验例中，肝脏类器官的免疫荧光染色图，比例尺为100μm。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0.125、且细胞密度为0.5×105/cm2混合均匀后，加入到非组织培养处理的培养板中，再置于5％v/vCO2、37℃的培养箱中，培养22h，即得到肝脏类器官。
其中，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置30min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。上述原代肝细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-PHH001。
所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白。上述MEM培养基可以市售购买，如购自美国Gibco公司，货号为11090081。上述ITS通用型培养添加剂可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为41400045。上述L-谷氨酰胺可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为25030081。上述表皮生长因子可以市售购买，如购自美国R&D Systems公司，货号为236-EG。上述氢化可的松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-N0583。上述地塞米松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-14648。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Thermo FisherScientific公司，货号为15140163。上述牛血清白蛋白可以市售购买，如购自Sigma，货号为A1933-100G。
所述铺板培养基是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按4500个活细胞/cm2接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为75％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。所述原代间充质干细胞为人脐带间充质干细胞；上述人脐带间充质干细胞，可以市售购买，如购自赛业生物科技有限公司，货号为HUXUC-01001。上述组织培养处理过的培养板，即贴壁(TC处理)培养板，如购自中国耐思(NEST)公司，货号为703001或者701001。所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素；所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。上述α－MEM基础培养基可以市售购买，如购自Gibco，货号为12571-063。上述胎牛血清可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为10091148。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Gibico公司，货号为10378016。
所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×105/cm2的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％时，胰酶消化在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。上述原代肝非实质细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-NPC001。
一种如上所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。
所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。
上述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。
实施例2
本实施例的肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:1:0.125、且细胞密度为2.0×105/cm2混合均匀后，加入到超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/vCO2、37℃的培养箱中，培养24h，即得到肝脏类器官。
其中，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置40min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。上述原代肝细胞可以市售购买，如购自美国BioIVT公司，货号为MX008001。
所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白。上述MEM培养基可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为M0769-10×1L。上述ITS通用型培养添加剂可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为I3146-5mL。上述L-谷氨酰胺可以市售购买，如购自购自美国Sigma公司，货号为G7513。上述表皮生长因子可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为PHG0311。上述氢化可的松可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为H0888。上述地塞米松可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为D4902。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为V900929。上述牛血清白蛋白可以市售购买，如购自Sigma，货号为A1933-100G。
所述铺板培养基是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按5000个活细胞/cm2接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为80％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。所述原代间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞；上述人骨髓间充质干细胞，可以市售购买，如购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CP-H166。上述组织培养处理过的培养板，即贴壁(TC处理)培养板，如购自中国耐思(NEST)公司，货号为701001。所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素；所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。上述α－MEM基础培养基可以市售购买，如购自Gibco，货号为12571-063。上述胎牛血清可以市售购买，如购自以色列Biological Industries公司，货号为04-001-1A。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Gibico公司，货号为10378016。
所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×105/cm2的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到肝非实质细胞单细胞悬液。上述原代肝非实质细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-NPC001。所述胰酶消化在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。
上述超低贴壁性能培养板，即Ultra-low Attachment，简写为ULA。可以市售购买，如购自美国Corning公司，货号为3474。
一种如上所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。
所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。
上述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。
实施例3
本实施例的肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:1:4、且细胞密度为2.5×105/cm2混合均匀后，加入到超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/v CO2、37℃的培养箱中，培养26h，即得到肝脏类器官。
其中，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置45min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。上述原代肝细胞可以市售购买，如购自美国BioIVT公司，货号为X008001-P。
所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白。上述MEM培养基可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-MEM001。上述ITS通用型培养添加剂，可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-ITS001。上述L-谷氨酰胺可以市售购买，如购自上海源培生物科技股份有限公司，货号为S210JV。上述表皮生长因子可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-EGF001。上述氢化可的松可以市售购买，如购自中国MCE公司。上述地塞米松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-14648。上述青链霉素可以市售购买，如购自以色列BiologicalIndustries公司，货号为03-031-1B。上述牛血清白蛋白可以市售购买，如购自Sigma，货号为A1933-100G。
所述铺板培养基是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按5500个活细胞/cm2接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为85％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。所述原代间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞；上述人脂肪间充质干细胞，可以市售购买，如购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CP-H202。上述组织培养处理过的培养板，即贴壁(TC处理)培养板，如购自中国耐思(NEST)公司，货号为703001。所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素；所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。上述α－MEM基础培养基可以市售购买，如购自Gibco，货号为12571-063。上述胎牛血清可以市售购买，如购自美国Hyclone公司，货号为SH30079.03。上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Gibico公司，货号为10378016。
所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×105/cm2的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到肝非实质细胞单细胞悬液。上述原代肝非实质细胞可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-NPC001。所述胰酶消化在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。
上述超低贴壁性能培养板，即Ultra-low Attachment，简写为ULA。可以市售购买，如购自美国Corning公司，货号为3474。
一种如上所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。
所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。
上述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。
实验例
分别在96孔的超低贴壁性能培养板(ULA培养板)中加入表1所列的不同实验组和不同比例的细胞预混液，每孔细胞密度为2×105/cm2,总细胞为0.64×105/孔。另外，在胶原包被的组织培养处理过的培养板(贴壁培养板)中分别接种同等数量的可贴壁肝细胞和非贴壁肝细胞。所有细胞在5％v/vCO2、37℃的培养箱中培养24h后，利用相差显微镜观察细胞成团情况，统计成团情况(如图1、图2、图3所示)。每48h换液一次，收集上清，用于ELISA检测白蛋白分泌(如图4所示)。每94h收集细胞3孔，抽提RNA，利用qPCR检测肝细胞标记基因(如图5所示)。每94h收集细胞3孔，利用OCT包埋类器官做冷冻切片，利用免疫荧光观察类器官肝细胞细胞中hNTCP蛋白定位(如图6所示)。
表1不同细胞组成、比例的细胞成团情况统计表
组别 细胞组成与相应的活细胞数比 是否成团(24h) 成团效率％<sup>a</sup>
A 肝非实质细胞：贴壁肝细胞：MSC＝1:4:4 是 98.8±1.2
A 肝非实质细胞：贴壁肝细胞：MSC＝1:4:1 是 98.4±1.5
A 肝非实质细胞：贴壁肝细胞：MSC＝1:4:0.25 是 90.4±3.7
A 肝非实质细胞：贴壁肝细胞：MSC＝1:4:0.125 是 70.4±3.7
A 肝非实质细胞：贴壁肝细胞＝1:4 否 0.0
B 肝非实质细胞：非贴壁肝细胞：MSC＝1:4:4 是 97.8±1.8
B 肝非实质细胞：非贴壁肝细胞：MSC＝1:4:1 是 96.9±1.9
B 肝非实质细胞：非贴壁肝细胞：MSC＝1:4:0.25 是 87.4±3.5
B 肝非实质细胞：非贴壁肝细胞：MSC＝1:4:0.125 是 69.5±3.8
B 肝非实质细胞：非贴壁肝细胞＝1:4 否 0.0
C 贴壁肝细胞：MSC＝4:4 是 98.4±0.7
C 贴壁肝细胞：MSC＝4:1 是 96.4±1.9
C 贴壁肝细胞：MSC＝4:0.25 是 85.3±2.2
C 非贴壁肝细胞：MSC＝4:0.125 是 71.7±3.8
C 贴壁肝细胞 否 0.0
D 非贴壁肝细胞：MSC＝4:4 是 97.2±1.2
D 非贴壁肝细胞：MSC＝4:1 是 96.5±2.1
D 非贴壁肝细胞：MSC＝4:0.25 是 87.2±3.3
D 非贴壁肝细胞：MSC＝4:0.125 是 68.5±4.1
D 非贴壁肝细胞 否 0.0
a成团效率＝(铺板细胞总数-未成团细胞单细胞)/铺板细胞总数，所得数据为三次独立重复试验平均值±标准差。
图1显示：在超低贴壁性能培养板(ULA培养板)中，间充质干细胞(MSC)可促进肝细胞的高效成团，形成的肝脏类器官具有以下两个特征：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度。
图2显示：贴壁肝细胞在胶原包被的培养孔中呈现贴壁和分化形态。
图3显示：非贴壁肝细胞在胶原包被的培养孔中呈现悬浮游离形态。
图4显示：3维培养体系下(即类器官)，白蛋白分泌水平显著高于2维细胞培养(即肝细胞贴壁于胶原包被上)，说明类器官中的肝细胞具有更强的白蛋白分泌功能，暗示肝细胞的状态更佳。
图5显示：3维培养体系下(即类器官)，钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)、白蛋白(albumin)、细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)的转录水平，与肝组织抽提物(RNA)水平相当，且显著高于2维培养体系(即肝细胞贴壁于胶原包被上)，说明类器官具有很好的原代肝细胞的分化状态。
图6显示：形成的肝脏类器官具有以下四个特征：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能，包括钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)表达。
综上，结果显示：
第一点，间充质干细胞(MSC)可在24h内促使贴壁肝细胞与肝非实质细胞成团。当间充质与肝细胞的活细胞数比小于0.25:4时，成团效率大于90％，成功率高(100％)。
第二点，间充质干细胞(MSC)可在24h内促使非贴壁肝细胞与肝非实质细胞成团。当间充质干细胞与肝细胞的活细胞数比不小于0.25:4时，成团效率大于85％，成功率高(100％)。
第三点，间充质干细胞(MSC)可在24h内促使贴壁肝细胞成团，间充质干细胞与肝细胞的活细胞数比不小于0.25:4时，成团效率大于85％，成功率高(100％)。
第四点，间充质干细胞(MSC)可在24h内促使非贴壁肝细胞成团，间充质干细胞与肝细胞的活细胞数比不小于0.25:4时，成团效率大于85％，成功率高(100％)。
第五点，肝脏类器官相较于传统2维培养，细胞状态维持更好，分化状态更高。
上述涉及到的具体方法：
1、ELISA检测培养上清中白蛋(ELISA试剂盒购买自美国Bethyl Laboratories)的含量的具体方法为：
(1)分别设空白孔、标准孔和待测样品孔，空白孔加入新鲜培养液50μl，余孔分别加入标准品或待测样品，每个标准品或待测样品重复3孔。
(2)轻轻摇匀，酶标板覆膜后37℃反应45min。
(3)弃去液体，试剂盒提供的洗涤液洗涤5次，拍干。
(4)每孔分别加入HRP标记的抗甲肽蛋白与HRP标记的抗白蛋白抗体工作液100μl，37℃孵育1h。
(5)弃去孔内液体，拍干，洗板5次，拍干。
(6)每孔加入显色液100μl，37℃避光显色15min。
(7)每孔加入终止液100μl，用酶标仪在405nm波长下测量各孔。
2、RNA抽提、反转录及Realtime PCR
(1)细胞用Trizol reagent裂解保存(用量为1ml每孔六孔板)，保存于-80℃不超过1个月。
(2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，静置2min后，4℃条件下12000×g离心15min。
(3)将上层水相转移至新的无RNase的EP管，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，静置10min后，4℃条件下12000×g离心10min。
(4)此时可见白色沉淀，弃上清，加入1ml无RNaes的75％乙醇(可保持于-20℃至少1年)剧烈震荡后，4℃条件下7500×g离心5min。
(5)弃上清，常温干燥5-10min。
(6)加入20μl无RNaes水，55-60℃干热10-15min，以使RNA溶解充分。
(7)将RNA放于冰上，用分光光度计测定RNA浓度。
(8)利用Takara的反转录试剂盒进行样品的反转录，合成cDNA。
(9)利用TOYOBO的SYBR green配制反应体系，短暂离心收集到管底；体系如下：
2×SYBR green master mix，10μl；10μmol/L的Primers F，1μl；10μ mol/L的Primers R，1μl；ddH2O，6μl；样品，2μl；总体积20μl。
在荧光定量PCR仪上进行RNA的定量检测，程序如下：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火，20s，72℃延伸，30s，共40个循环。
检测引物如表2所示：
表2引物名称、序列及其退火温度
引物名称 序列(5’→3’) 退火温度/℃
albumin-F(SEQ ID NO.1) actatctatccgtggtcctga 60
albumin-R(SEQ ID NO.2) tcttgatttgtctctccttct 60
HNF4α-F(SEQ ID NO.3) ggccaagtacatcccagctt 60
HNF4α-R(SEQ ID NO.4) tcattgcctaggagcagcac 60
CYP3A4-F(SEQ ID NO.5) tccattcctcatcccaattcttga 60
CYP3A4-R(SEQ ID NO.6) tccactcggtgcttttgtgt 60
ASGPR-F(SEQ ID NO.7) tgctgcttgtggttgtct 60
ASGPR-R(SEQ ID NO.8) cttcatctttcttcccacatt 60
NTCP-F(SEQ ID NO.9) ctcaaatccaaacggccacaatac 60
NTCP-R(SEQ ID NO.10) cacactgcacaagagaatgatgatc 60
HNF4α-F(SEQ ID NO.11) ggccaagtacatcccagctt 60
HNF4α-R(SEQ ID NO.12) tcattgcctaggagcagcac 60
β-actin-F(SEQ ID NO.13) atcgtgcgtgacattaaggag 60
β-actin-R(SEQ ID NO.14) ggaaggaaggctggaagagt 60
3、免疫荧光
将肝脏类器官通过自然沉降下来，4℃在4％(w/v)多聚甲醛固定24h，然后脱水，4℃在10％(w/v)蔗糖中放置2h-3h，4℃在20％(w/v)蔗糖中过夜，4℃在30％(w/v)蔗糖中过夜，得到最终脱水的细胞。在最终脱水的细胞中加入OCT(TissueTek，Sakura，Japan)，储存在-80℃。用冷冻切片(Thermo)切割厚度为5μm的切片。
为了进行免疫染色，将切片在室温下干燥，用冷丙酮固定20min，然后用PBS洗涤2次，每次15min。随后，将切片在室温下用3％(w/v)BSA封闭30min，在4℃分别与兔抗人白蛋白(美国sigma)一起孵育(稀释度1:500)过夜。PBS洗涤3次(每次洗涤5min)后，将切片与Alexa Fluor488偶联的山羊抗兔二抗(稀释度1：1000)(美国Thermo)在室温下孵育1h。用PBS洗涤3次(每次洗涤5min)后，用DAPI(罗氏，巴塞尔，瑞士)将细胞核染色6min，然后用PBS洗涤5min。最后，使用荧光显微镜(Leica)记录染色的切片，并使用Adobe Photoshop CS4的软件对照片进行处理和合并。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 立沃生物科技（深圳）有限公司
<120> 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actatctatc cgtggtcctg a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttgatttg tctctccttc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccaagtac atcccagctt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcattgccta ggagcagcac 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccattcctc atcccaattc ttga 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccactcggt gcttttgtgt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgctgcttgt ggttgtct 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttcatcttt cttcccacat t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcaaatcca aacggccaca atac 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacactgcac aagagaatga tgatc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccaagtac atcccagctt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcattgccta ggagcagcac 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcgtgcgtg acattaagga g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaaggaagg ctggaagagt 20

Claims (10)

1.一种肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0:(0.125-4)或者4:1:(0.125-4)、且细胞密度为0.5×105/cm2-2.5×105/cm2混合均匀后，加入到非组织培养处理的培养板或者超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/v CO2、37℃的培养箱中，培养24h±2h，即得到肝脏类器官。
2.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置30min-45min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白；所述铺板培养基是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。
4.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按4500个活细胞/cm2-5500个活细胞/cm2接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。
5.根据权利要求4所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述原代间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的任意一种；所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素；所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。
6.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×105/cm2的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到肝非实质细胞单细胞悬液。
7.根据权利要求6所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述胰酶消化在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。
9.根据权利要求8所述的肝脏类器官，其特征在于，所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。
10.一种如权利要求8所述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。
CN202010441988.0A 2020-05-22 2020-05-22 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用 Withdrawn CN111621465A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010441988.0A CN111621465A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010441988.0A CN111621465A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111621465A true CN111621465A (zh) 2020-09-04

Family

ID=72269427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010441988.0A Withdrawn CN111621465A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111621465A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112430568A (zh) * 2020-11-25 2021-03-02 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法
CN113717925A (zh) * 2021-08-19 2021-11-30 清华大学 一种人工肝脏类器官及其制备方法和应用
CN115044533A (zh) * 2021-03-09 2022-09-13 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 基于人源化肝细胞共培养细胞组合的体外代谢活化系统及其应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112430568A (zh) * 2020-11-25 2021-03-02 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法
CN115044533A (zh) * 2021-03-09 2022-09-13 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 基于人源化肝细胞共培养细胞组合的体外代谢活化系统及其应用
CN113717925A (zh) * 2021-08-19 2021-11-30 清华大学 一种人工肝脏类器官及其制备方法和应用
CN113717925B (zh) * 2021-08-19 2024-03-12 清华大学 一种人工肝脏类器官及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111621465A (zh) 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用
US11980641B2 (en) Methods for generation of podocytes from pluripotent stem cells and cells produced by the same
CA2701907A1 (en) Optimized and defined method for isolation and preservation of precursor cells from human umbilical cord
US11624055B2 (en) Isolation of cells from hatched reptile eggs for use in production of bioartificial skin and leather
US20200299649A1 (en) Compositions and methods for using small mobile stem cells
CN113423816A (zh) 一种用于干细胞大规模制备的三维培养方法
Miranda et al. Increasing of blastocyst rate and gene expression in co-culture of bovine embryos with adult adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
Zhang et al. Urothelial cell culture
US11834673B2 (en) Method for generating human multipotent mammary stem cells from normal primary breast luminal cells
KR101204894B1 (ko) 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법
KR20220162201A (ko) 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
KR101738715B1 (ko) 식물 줄기세포 또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
Apte Isolation of quiescent pancreatic stellate cells from rat and human pancreas
Jian et al. The isolation of fibroblasts by volumetric regulation cycles
Motta et al. 3D culture of mesenchymal stem cells from the yolk sac to generate intestinal organoid
US20220305175A1 (en) Minimal processing method for decellularization of tissues
KR100883581B1 (ko) 안면피하 지방조직 또는 탯줄조직 유래 성체 줄기세포를이용한 간세포 분화방법 및 그에 사용되는 간세포분화배양액
Singh et al. Isolation and culture of porcine mesenchymal stem cells from adipose tissue
Tomlinson et al. Development of sustainable primary equine hepatocyte culture systems
Frolova et al. Preparation of a Single-Cell Suspension from Tumor Biopsy Samples for Single-Cell RNA Sequencing
Gvazava et al. Cells of mouse submandibular salivary gland in culture in vitro
Polstyanoy et al. Isolation of germ-cell precursors from human ovary tissue
Savchenkova et al. Human subcutaneous adipose tissue subjected to cold shock as source of viable cell population with characteristics of multipotent mesenchymal stromal cells
KINARROY et al. THE EFFECTS OF BIRD’S NEST AS A CRYOPROTECTIVE AGENT ON HUMAN ADIPOSE DERIVED STEM CELLS
KR100818216B1 (ko) Ｃｒｉｐｔｏ－１ 및 Ｏｃｔ４를 동시 발현하는 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 및 그 확인방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200904