CN111610246B - 用于质谱检测的羧基衍生化试剂组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于质谱检测的羧基衍生化试剂组合物及其用途。具体涉及式I化合物与酰胺缩合剂的组合物及其作为羧基衍生化试剂的用途。所述式I化合物在酰胺缩合剂存在下,能与羧基化合物中的羧基发生衍生化反应,将羧基化合物中的羧基酰胺化。所述衍生化试剂羧基衍生化效率高,产物质谱响应好,可以实现在质谱中同时检测脂肪酸和磷脂和MALDI质谱中脂肪酸和磷脂的同时成像。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种用于质谱检测的羧基衍生化试剂 组合物及其用途。
背景技术
脂肪酸(fatty acids)和磷脂作为重要的小分子代谢物,对调节生物体内各项 生理和生物功能起着重要作用。随着生命科学技术的发展,脂肪酸和磷脂的定 性、定量研究为医学基础科研和临床检验提供了重要的依据。
质谱成像作为一种灵敏的原位分析技术,可同时检测组织中分布的多种代 谢物。而其中基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱成像技术作为一种发展最 成熟,待测物分析范围最广的一种成像技术,可用于分析蛋白,多肽,脂质, 以及小分子代谢物。但MALDI质谱成像技术对于同时检测和成像脂肪酸和磷脂 类化合物还存在难点。首先是由于MALDI质谱成像技术灵敏度有限,对于组织 中化合物分子的成像只能成功应用于相对丰度高的物质,另外这些高丰度的物 质还会对丰度低的物质存在离子抑制效应。因此对于丰度低,离子化效率低的 物质像是脂肪酸这类物质的成像仍然存在挑战。另外脂肪酸的分析需要在负离子模式下检测,而磷脂则需要在正离子模式下检测所以没法同时对组织中的脂 肪酸和磷脂类化合物进行检测和成像。虽然最近几年也不断有一些新的基质开 发出来用于常规的MALDI分析脂肪酸。但是没有常规的MALDI分析脂肪酸基 质可以同时用来对脂肪酸和磷脂进行质谱成像。这些新型基质要么不能在 MALDI成像中在真空条件下稳定存在,要么就是在专一测定脂肪酸时损失磷 脂的相关峰。
因此筛选出合适的衍生化试剂,使脂肪酸和磷脂能同时在质谱中检测是非 常必要的。
发明内容
本发明提供了一种羧基衍生化效率高,产物质谱响应好的衍生化试剂组合 物和利用所述衍生化试剂组合物在质谱中同时检测脂肪酸和磷脂的方法。
本发明第一方面,提供了一种用于质谱检测的羧基衍生化试剂组合物,所 述组合物包括:
(i)式I化合物,
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C1-6烯基或C1-6炔基;
X-为卤素负离子或酸根离子;和
(ii)酰胺缩合剂。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为C1-4烷基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为甲基、乙基、丙基或异丙基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为甲基或乙基。
在另一优选例中,所述卤素负离子为Cl-、Br-或I-,较佳地,I-。
在另一优选例中,所述酸根离子为NO3 -或HSO4 -,较佳地,NO3 -。
在另一优选例中,所述式I化合物为N1,N1-二甲基哌嗪碘盐或N1,N1-甲基 乙基哌嗪碘盐。
在另一优选例中,所述酰胺缩合剂选自:O-(7-氮杂苯并三唑-1- 基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六 氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯 并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基 脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟 硼酸季铵盐(TNTU),或其组合,较佳地,HATU。
在另一优选例中,所述组合物为N1,N1-二甲基哌嗪碘盐或N1,N1-甲基乙基哌 嗪碘盐与O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的组 合。
在另一优选例中,所述酰胺缩合剂与化合物I摩尔比为0.1-5∶1,较佳地,0.5-3∶1,更佳地,1-2∶1。
在另一优选例中,所述组合物为溶液形式。
在另一优选例中,所述溶液的溶剂选自:甲醇、乙醇、乙腈、水,或其组 合。
在另一优选例中,所述溶剂中水的体积比小于50%,较佳的,10-30%,更 佳地,10-20%。
在另一优选例中,所述溶液的溶剂为乙腈与水体积比为1-20∶1的混合溶液, 较佳地,2-10∶1,更佳地,5-10∶1。
在另一优选例中,所述溶液具有一个或多个下述特征:
(a)所述式I化合物浓度为0.01-100mg/mL,较佳地,0.05-10mg/mL,更佳地, 0.1-5mg/mL,最佳地,0.5-2.5mg/mL。
(b)所述酰胺缩合剂与化合物I摩尔比为0.1-5∶1,较佳地,0.5-3∶1,更佳地, 1-2∶1。
本发明第二方面,还提供了一种如本发明第一方面的式I化合物作为羧基 衍生化试剂的用途,
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基;和
X-为卤素负离子或酸根离子;
所述化合物在酰胺缩合剂存在下,能与羧基化合物中的羧基发生衍生化反 应,将羧基化合物中的羧基酰胺化。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为C1-4烷基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为甲基、乙基、丙基或异丙基。
在另一优选例中,所述R、R1各自独立地为甲基或乙基。
在另一优选例中,所述卤素负离子为Cl-、Br-或I-,较佳地,I-。
在另一优选例中,所述酸根离子为NO3 -或HSO4 -,较佳地,NO3 -。
在另一优选例中,所述酰胺缩合剂选自:O-(7-氮杂苯并三唑-1- 基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六 氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯 并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基 脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟 硼酸季铵盐(TNTU),较佳地,HATU。
在另一优选例中,所述羧基化合物的分子量<10000Da,较佳地,<5000Da, 更佳地,<2000Da,最佳地,<1800Da。
在另一优选例中,所述羧基化合物选自:脂肪酸、芳香酸、氨基酸、肽, 或其组合。
在另一优选例中,羧基化合物选自:脂肪酸、芳香酸、氨基酸,或其组合。
在另一优选例中,所述脂肪酸为C1-24饱和或不饱和脂肪酸,较佳地,C6-22, 更佳地,C12-22,最佳地,C16-22。
在另一优选例中,所述脂肪酸具有0-8个不饱和度,较佳地,0-6。
在另一优选例中,所述脂肪酸为月桂酸、十四酸、软脂酸、棕榈油酸、硬 脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、芥酸、脱落酸,或其组合。
在另一优选例中,所述肽含有2-20个氨基酸,较佳地,2-12,更佳地,2-10。
在另一优选例中,所述衍生化反应的反应式为:
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C1-6烯基或C1-6炔基;
X-为卤素负离子或酸根离子;
R2-COOH为所述羧基化合物。
在另一优选例中,所述衍生化试剂将羧基化合物衍生化并用于质谱检测。
本发明第三方面,提供了一种同时检测待测样品中脂肪酸和磷脂的质谱检 测方法,包括步骤:
(1)样品预处理:所述的预处理包括加入如本发明第一方面所述的衍生化试 剂组合物与样品进行衍生化反应,得到经衍生化的样品液;
(2)对所述经衍生化的样品液在正离子模式下进行质谱分析,得到质谱的谱 图及谱峰数据。
在另一优选例中,所述质谱分析所使用的质谱为基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱时,在步骤(2)之前,所述方法还包括步骤:
(2-1)用所述的经衍生化的样品液加入基质得到进样液,然后用所述进样 液进行步骤(2)。
在另一优选例中,所述基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。
在另一优选例中,所述进样液中所述基质浓度为1-100mg/mL,较佳地10-50 mg/mL,更佳地,20-30mg/mL。
在另一优选例中,所述衍生化反应的反应温度为-10-50℃,较佳地,10-40 ℃,更佳地,20-30℃
在另一优选例中,所述衍生化反应的反应时间为5-25min,较佳地,8-20min, 更佳地,10-15min。
在另一优选例中,所述脂肪酸为C1-24脂肪酸,较佳地,C4-22脂肪酸,更佳 地,C12-22脂肪酸,最佳地,C16-22脂肪酸。
在另一优选例中,所述脂肪酸具有0-8个不饱和度,较佳地,0-6。
在另一优选例中,所述脂肪酸为月桂酸(C12:0)、十四酸(C14:0)、软脂 酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚 麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、芥酸(C22:1)、C20:4、C22:4、C22:6、脱落酸, 或其组合。
在另一优选例中,所述脂肪酸为月桂酸(C12:0)、十四酸(C14:0)、软脂 酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚 麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、芥酸(C22:1)、脱落酸,或其组合。
在另一优选例中,所述磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑 磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂)、磷脂酰肌醇, 或其组合。
在另一优选例中,所述磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑 磷脂),或其组合。
本发明第四方面,还提供一种生物组织中脂肪酸和磷脂的基质辅助激光解 吸离子化(MALDI)质谱成像方法,包括步骤:
(1)样品预处理:提供生物组织切片,干燥,将包含如本发明第一方面所述 的衍生化试剂组合物的衍生化试剂溶液喷涂到所述生物组织切片上,干燥,得 到经衍生化的生物组织切片;
(2)将所述经衍生化的生物组织切片,喷涂基质液,干燥,得待进样生物组 织切片;及
(3)将生物组织样本贴附在导电玻片上,正离子模式下进行MALDI质谱分 析,得到质谱的谱图及谱峰数据;用于成像。
在另一优选例再,所述生物组织切片厚度为10-30μm,较佳地,为15-25μm。
在另一优选例中,所述衍生化试剂溶液的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、水, 或其组合,且所述溶剂中水的体积比小于50%,较佳的,10-30%,更佳的, 20-30%。
在另一优选例中,所述衍生化试剂溶液具有一个或多个下述特征:
(a)所述式I化合物浓度为0.01-100mg/mL,较佳地,0.05-10mg/mL,更佳地, 0.1-5mg/mL,最佳地,0.5-2.5mg/mL。
(b)所述酰胺缩合剂与化合物I摩尔比为0.1-5∶1,较佳地,0.5-3∶1,更佳地, 1-2∶1。
在另一优选例中,步骤(1)中,所述衍生化试剂溶液的喷涂具有一个或多个 下述特征:
喷涂的流速为3-10μl/min,较佳地,4-8μl/min,更佳地,5-6μl/min。
喷涂的时间为5-25min,较佳地,8-20min,更佳地,10-15min。
在另一优选例中,所述基质液中所述基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。
在另一优选例中,所述基质液中所述基质浓度为10-50mg/mL,较佳地, 15-40mg/mL,更佳地,20-30mg/mL。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述基质液的喷涂具有一个或多个下述特征:
喷涂的流速为3-10μl/min,较佳地,4-8μl/min,更佳地,5-6μl/min。
喷涂的时间为10-60min,较佳地,20-40min,更佳地,25-35min。
在另一优选例中,所述MALDI质谱分析成像空间分辨率为100-200μm。
在另一优选例中,所述脂肪酸为C1-24脂肪酸,较佳地,C4-22脂肪酸,更佳 地,C12-22脂肪酸,最佳地,C16-22脂肪酸。
在另一优选例中,所述脂肪酸具有0-8个不饱和度,较佳地,0-6。
在另一优选例中,所述脂肪酸为月桂酸(C12:0)、十四酸(C14:0)、软脂 酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚 麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、芥酸(C22:1)、C20:4、C22:4、C22:6、脱落酸, 或其组合。
在另一优选例中,所述脂肪酸为C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、 C18:3、C20:0、C20:4、C22:4、C22:6,或其组合。
在另一优选例中,所述磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑 磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂)、磷脂酰肌醇, 或其组合。
在另一优选例中,所述磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑 磷脂),或其组合。
本发明第五方面,还提供了一种衍生化法质谱检测试剂盒,包括:
(1)第一容器,以及位于第一容器内的本发明第一方面所述的组合物;
(2)标签或说明书。
在另一优选例中,所述试剂盒中还包括:第二容器,以及位于第二容器中 的基质。
在另一优选例中,所述基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例2脂肪酸混合标准溶液的衍生化得到的质谱图。
图2为本发明实施例2天然脱落酸的衍生化得到的质谱图。
图3为本发明实施例3多肽的标准品的衍生化得到的质谱图。
图4为本发明实施例4油酸标准品的衍生化得到的质谱图。
图5为本发明实施例5得到的小鼠脑组织衍生化后得到的脂肪酸的质谱成 像图。
图6为本发明实施例5得到的小鼠脑组织衍生化后得到的磷脂的质谱成像 图。
图7为本发明实施例6得到的小鼠心肌组织衍生化后得到的脂肪酸的质谱 成像图。
图8为本发明实施例7得到的人甲状腺组织上衍生化后质谱成像得到的平 均质谱图。
图9为本发明实施例7得到的人甲状腺组织衍生化后得到的脂肪酸和磷脂 的质谱成像图。
图10为C18:3梯度稀释后用不同试剂处理后的质谱图:(a)C18:3梯度稀释后 与衍生化试剂反应15min后的MALDI-MS质谱图;(b)C18:3梯度稀释后用9-氨基 吖啶(9-AA)在负离子模式下检测得到的质谱图;(c)C18:3梯度稀释后用1,8-双二 甲氨基萘(DMAN)在负离子模式下检测得到的质谱图。
图11为用2-氨甲基吡啶衍生化后的亚油酸的衍生化产物在不同浓度下的质 谱图。
图12为用DMPI吡啶衍生化后的亚油酸的衍生化产物在不同浓度下的质谱 图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选和测试,首次将式I所示 的化合物作为羧基衍生化试剂,在酰胺缩合剂存在下,该试剂衍对含羧基的小 分子化合物和多肽等具有很好的衍生化效率,且本发明衍生化法在检测脂肪酸 时的质谱检测限比已知方法检测降低1-4个数量级,有效的提高了质谱对低浓 度样品的检测能力。本发明的衍生化试剂将原本需要在负离子模式下检测的脂 肪酸类物质转化为在正离子模式下响应高的衍生化产物,意外地实现了质谱同 时检测样品中的脂肪酸和磷脂,实现了MALDI质谱中脂肪酸和磷脂的同时成 像。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发 明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,术语“烷基”包括直链或支链的烷基。例如C1-6烷基表示具有 1-6个碳原子的直链或支链的烷基,例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异 丁基、叔丁基等。
如本文所用,术语“烯基”包括直链或支链的烯基。例如C2-6烯基指具有2-6 个碳原子的直链或支链的烯基,例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、 1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。
如本文所用,术语“炔基”包括直链或支链的炔基。例如C2-6炔基是指具有 2-6个碳原子的直链或支链的炔基,例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、或类似基团。
如本文所用,术语“脂肪酸”包括支链或支链脂肪酸,例如C1-24饱和或不 饱和脂肪酸指具有1-24个碳原子的直链或支链的脂肪酸,且所述脂肪酸可具有 0-8个不饱和度,例如丁酸、己酸、辛酸、十一酸、月桂酸、十四酸、软脂酸、 棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、芥酸和脱落酸等。
如本文所用,术语“羧基化合物”“含羧基的化合物”可互换使用,指含 有一个或多个羧基的化合物及其盐,例如,饱和或不饱和脂肪酸类,如丁酸、 己酸、辛酸、十一酸、月桂酸、十四酸、软脂酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、 亚油酸、亚麻酸、花生酸、芥酸和脱落酸等;芳香酸类,如苯甲酸、邻苯二甲 酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、水杨酸、银杏酸(包括C13:0、C15:1、C15:0、 C17:0、C17:1、C17:2等)等;氨基酸类,如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸 等,以及肽,优选含2-20个氨基酸的肽,如血管紧张素I、血管紧张素II、寡肽 -1、寡肽-3、寡肽-5、寡肽-6等。
羧基衍生化试剂组合物
本发明提供了一种用于质谱检测的羧基衍生化试剂组合物,所述组合物包 括:
(i)式I化合物,
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C1-6烯基或C1-6炔基;
X-为卤素负离子或酸根离子;
(ii)酰胺缩合剂。
在另一优选例中,所述酰胺缩合剂选自:O-(7-氮杂苯并三唑-1- 基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六 氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯 并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基 脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟 硼酸季铵盐(TNTU),或其组合,较佳地,HATU。
在另一优选例中,所述酰胺缩合剂与化合物I摩尔比为0.1-5∶1,较佳地, 0.5-3∶1,更佳地,1-2∶1。
在另一优选例中,所述组合物为溶液形式。
本领域技术人员应该理解,所述组合物可以分别给予或以混合物形式给 予。
当分别给予时,两种组分各自独立地以固体和/或溶液形式存在,在使用时 以一定比例使其相互接触,并与样品进行衍生化反应。当以混合物形式给予时, 可以为固体混合物形式,使用时进行溶解,或以一定浓度的混合溶液形式给予。
所述组合物在溶液中的浓度可根据所需检测的样品种类、样品量、检测仪 器等因素进行浓缩或稀释,以得到合适的浓度。
式I化合物的用途
本发明提供了式I化合物作为羧基衍生化试剂的用途,
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基;和
X-为卤素负离子或酸根离子;
所述化合物在酰胺缩合剂存在下,能与羧基化合物中的羧基发生衍生化反 应,将羧基化合物中的羧基酰胺化。
在另一优选例中,所述衍生化反应的反应式为:
其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C1-6烯基或C1-6炔基;
X-为卤素负离子或酸根离子;
R2-COOH为所述羧基化合物。
在另一优选例中,所述衍生化试剂将羧基化合物衍生化并用于质谱检测。
同时检测待测样品中脂肪酸和磷脂的质谱检测方法
本发明的同时检测待测样品中脂肪酸和磷脂的质谱检测方法,包括步骤:
(1)样品预处理:所述的预处理包括加入如上述的衍生化试剂组合物与样品 进行衍生化反应,得到经衍生化的样品液;
(2)对所述经衍生化的样品液在正离子模式下进行质谱分析,得到质谱的谱 图及谱峰数据。
在另一优选例中,所述质谱分析所使用的质谱为基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱时,在步骤(2)之前,所述方法还包括步骤:
(2-1)用所述的经衍生化的样品液加入基质得到进样液,然后用所述进样 液进行步骤(2)。
在另一优选例中,所述基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。
MALDI质谱成像
还提供一种生物组织中脂肪酸和磷脂的基质辅助激光解吸离子化(MALDI) 质谱成像方法,包括步骤:
(1)样品预处理:提供生物组织切片,干燥,将包含如上述的衍生化试剂组 合物的衍生化试剂溶液喷涂到所述生物组织切片上,干燥,得到经衍生化的生 物组织切片;
(2)将所述经衍生化的生物组织切片,喷涂基质液,干燥,得待进样生物组 织切片;及
(3)将生物组织样本贴附在导电玻片上,正离子模式下进行MALDI质谱分 析,得到质谱的谱图及谱峰数据;用于成像。
在另一优选例再,所述生物组织切片厚度为10-30μm,较佳地,为15-25μm。
本发明的主要优点包括:
1.本发明首次将式I化合物作为羧基衍生化试剂用于在质谱中检测羧基化 合物,该试剂衍对含羧基的小分子化合物和多肽等具有很好的衍生化效率,且 本发明衍生化法在检测脂肪酸时的质谱检测限比已知方法检测降低1-4个数量 级,有效的提高了质谱对低浓度样品的检测能力,提高了灵敏度,有利于保证 方法的准确性。
2.本发明的衍生化试剂的氨基能与羧基化合物的羧基形成酰胺,而其季铵 盐端带正电,将原本需要在负离子模式下检测的脂肪酸类物质转化为在正离子 模式下响应高的衍生化产物,使得同时检测样品中的脂肪酸和磷脂成可能。
3.利用本发明的衍生化试剂在MALDI质谱中同时检测脂肪酸和磷脂,可 以实现对脂肪酸和磷脂的同时成像。
4.利用本发明的衍生化试剂在同时检测脂肪酸和磷脂,节省了操作时间, 降低了操作难度和检测成本。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则 百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 N1,N1-二甲基哌嗪碘盐的制备及溶液配置
N1,N1-二甲基哌嗪碘盐(DMPI)的制备:将碘甲烷与N-甲基哌嗪以摩尔比 1∶1.5混合在乙醚中室温下搅拌两小时,待固体析出后,用乙醚洗涤过滤干燥。
DMPI质谱高分辨数据:HR MALDI-MS,[M+H]+,m/z,计算值,115.19, 测量值:115.1230.
DMPI串联质谱数据:MALDI-MS/MS,碎片离子:m/z,15.12,28.13,42.16, 58.15,72.21.
DMPI衍生化试剂溶液的配置:将合成的DMPI 2mg与2mg的O-(7-氮杂苯 并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)溶于1ml体积比为8∶2的乙 腈与水的混合溶液中配置成DMPI衍生化试剂溶液2mg/ml。
DHB储备溶液的配置:基质采用2,5-二羟基苯甲酸(DHB),纯度为98%,用 甲醇∶水∶三氟乙酸(80∶20∶0.1,v/v/v)溶解配置成30mg/ml的DHB储备溶液。
实施例2 衍生化试剂DMPI用于含羧基的小分子化合物的衍生化
称量各个脂肪酸(月桂酸(C12:0)、十四酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)、棕榈 油酸(C16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花 生酸(C20:0)、芥酸(C22:1))的标准品各1mg,用甲醇配置成每个脂肪酸浓度为 1mg/ml的混合储备液,然后稀释至每个脂肪酸浓度为50ng/μL的待测溶液。将 前述每个脂肪酸浓度为50ng/μL的待测溶液和50ng/μL天然脱落酸的水溶液分别 与DMPI衍生化试剂溶液1∶1体积比混合,室温下反应10min后与DHB基质1∶10 混合后取1μL点到MALDI靶板上,待干燥以后送入质谱中进行分析。所使用的 仪器为日本电子Spiral TOF-3000。分析采用高分辨正离子模式。
图1为得到的脂肪酸混合标准溶液的衍生化得到的质谱图。
图2为得到的天然脱落酸的衍生化得到的质谱图。
实施例3 衍生化试剂DMPI用于多肽的衍生化
与实施例1基本相同,不同之处在于待测样品为多肽溶液(1mg/ml血管紧张 素II标准溶液,购自sigma adrich,稀释至10ng/μL),基质采用CHCA溶液(6mg/ml 的甲醇与水的混合溶液)。
图3为得到的多肽的标准品的衍生化得到的质谱图。
实施例4 衍生化试剂N1,N1-甲基乙基哌嗪碘盐用于脂肪酸的衍生化
将碘乙烷与N-甲基哌嗪以1∶1.5的比例混合在乙醚中室温下搅拌两小时, 待固体析出后,用乙醚洗涤过滤干燥。将合成的N1,N1-甲基乙基哌嗪碘盐2mg 与2mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)溶 于1ml体积比为8∶2的乙腈与水的混合溶液中配置成N1,N1-甲基乙基哌嗪碘盐 衍生化试剂溶液2mg/ml。基质采用2,5-二羟基苯甲酸(DHB)纯度为98%,用甲 醇∶水∶三氟乙酸(80∶20∶0.1)溶解配置成30mg/ml的储备溶液。将50ng/μL的 油酸的标准溶液衍生化试剂1∶1体积比混合,室温下反应10min后与DHB基 质1∶10混合后取1μL点到MALDI靶板上,待干燥以后送入质谱中进行分析。 所使用的仪器为日本电子Spiral TOF-3000。分析采用高分辨正离子模式。
图4为得到的油酸标准品的衍生化得到的质谱图。
综上,从图1-4可以看出均得到了衍生化产物的相关峰,且方法的信噪比、 灵敏度很高,说明本发明的衍生化试剂反应快速且可适于不同的含羧基的化合 物。
实施例5 衍生化试剂用于小鼠脑组织的组织上衍生化后质谱成像
本实施例中使用的衍生化试剂为实施例1中配制的DMPI衍生化试剂溶 液,基质为实施例1中配制的DHB储备溶液。
小鼠脑组织用冷冻切片机切得厚度为20μm的组织切片。然后真空干燥 20min。对于衍生化试剂的喷涂采用电喷雾基质喷涂装置,喷针距离ITO载玻 片6cm,喷针所使用电压为5000V,辅助气的流速为20psi。衍生化试剂的流速 5μl/min,喷涂时间是15min。真空冷冻干燥10min后用于后续基质的喷涂。基 质喷涂采用DHB作为基质,基质浓度为30mg/ml基质喷涂时间为30min,基 质的喷涂流速为5μl/min。待干燥后进行质谱分析。MALDI质谱成像日本电子 Spiral TOF-3000.,使用正离子模式进行成像。质量校正使用外标法,成像空间 分辨率采用100μm。使用MALDIVision软件成像。
图5为小鼠脑组织衍生化后得到的脂肪酸质谱成像图。
图6为小鼠脑组织衍生化后得到的磷脂质谱成像图。
实施例6 衍生化试剂用于小鼠心肌组织的组织上衍生化后质谱成像
本实施例中使用的衍生化试剂为实施例1中配制的DMPI衍生化试剂溶 液,基质为实施例1中配制的DHB储备溶液。
小鼠心肌组织用冷冻切片机切得厚度为20μm的组织切片。对于衍生化试 剂的喷涂采用电喷雾基质喷涂装置,喷针距离ITO载玻片6cm,喷针使用电压 为5000V,辅助气的流速为20psi。衍生化试剂的流速5μl/min,喷涂时间是 10min。真空冷冻干燥15min后用于后续基质的喷涂。基质喷涂采用DHB作为 基质,基质浓度为30mg/ml基质喷涂时间为30min,基质的喷涂流速为5μl/min。 待干燥后进行质谱分析。MALDI质谱成像日本电子Spiral TOF-3000.,使用正 离子模式进行成像。质量校正使用外标法,成像空间分辨率采用100μm。
图7为小鼠心肌组织衍生化后得到的脂肪酸和质谱成像图。
实施例7 衍生化试剂用于甲状腺组织的组织上衍生化后质谱成像
本实施例中使用的衍生化试剂为实施例1中配制的DMPI衍生化试剂溶 液,基质为实施例1中配制的DHB储备溶液。
人甲状腺组织(包含甲状腺癌组织)用冷冻切片机切得厚度为20μm的组 织切片。然后真空干燥20min。对于衍生化试剂的喷涂采用电喷雾基质喷涂装 置,喷针距离ITO载玻片6cm,喷针所使用电压为5000V,辅助气的流速为20psi。 衍生化试剂的流速5μl/min,喷涂时间是10min。真空冷冻干燥15min后用于后 续基质的喷涂。基质喷涂采用DHB作为基质,基质浓度为30mg/ml基质喷涂 时间为30min,基质的喷涂流速为5μl/min。待干燥后进行质谱分析。MALDI 质谱成像日本电子Spiral TOF-3000.,使用正离子模式进行成像。质量校正使用 外标法,成像空间分辨率采用200μm。
图8为人甲状腺组织衍生化后质谱成像得到的平均质谱图。
图9为人甲状腺组织衍生化后得到的脂肪酸和磷脂的质谱成像图。
从图9可以看出,脂肪酸和磷脂在癌组织(白色区域线内)和癌旁组织中 的含量差异明显,成像清晰。
综上,使用本发明的衍生化试剂实现了MOLDI质谱对各种生物组织中的 脂肪酸和磷酸同时成像。
对比例1 DMPI衍生化法与传统基质下检测脂肪酸的对比试验
本实施例中使用的衍生化试剂为实施例1中配制的DMPI衍生化试剂溶 液。
为体现衍生化方法与使用传统基质9-氨基吖啶(9-AA)及1,8-双二甲氨基萘(DMAN)在负离子模式下对于脂肪酸的检测的优势。实验中将从C18:3的脂肪 酸的标准溶液从1μg/μL以10倍的稀释比依次稀释,然后取等比例稀释的标准 溶液分别用9-AA和DMAN两种脂肪酸检测的传统基质在负离子模式下进行检 测,两种基质浓度为10mg/mL。另取一份溶液与DMPI衍生化试剂以3μL∶1 μL的比例混合反应10min后,用DHB作为基质进行检测,基质浓度为 10mg/mL。
得到的相应的谱图如图10所示:从图中可以看出,使用衍生化方法的最 低检测限比使用DMAN基质的最低检测限低2个数量级,而比9-AA基质的最 低检测限低4个数量级。这说明衍生化的方法相比与传统基质在负离子模式下 对于脂肪酸的检测的优势明显,也说明该方法具有应用于组织上脂肪酸质谱成 像的潜力。另外除了衍生化方法的检测限更低以外,DMAN基质由于在真空中 不稳定,很难用于脂肪酸的质谱成像,也难以得到高空间分辨的成像数据。所 以使用衍生化的方法比用传统基质进行脂肪酸的检测优势明显。
对比例2 2-氨甲基吡啶和DMPI两种衍生化试剂的比较
实验中将从亚油酸C18:2的标准溶液从1μg/μL以10倍的稀释比依次稀释, 然后取等比例稀释的标准溶液10μL分别与20μL浓度均为1mg/ml 2-氨甲基 吡啶和DMPI两种衍生化试剂混合10s后立即取1μL与3μL DHB基质溶液 混合后在正离子模式下进行检测,得到的对比图如附图11和12所示。用DMPI 衍生化方法的最低检测限比使用2-氨甲基吡啶衍生化法最低检测限低1个数量 级。
综上,本发明的衍生化试剂将含羧基的化合物衍生化后,极大程度的提高 了羧基化合物在质谱检测中的灵敏度,降低检测限(比已知方法降低了1-4个 数量级),提高了质谱对低浓度样品的检测能力,有利于保证检测的准确度, 且本发明的衍生化试剂在生物样品的质谱检测中,与脂肪酸衍生化后形成的衍 生化产物,在正离子模式下质谱响应好,从而使得能用质谱一次进样中同时检 测脂肪酸和磷酸,节省了操作时间,降低了操作难度和检测成本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
1.一种用于质谱检测的羧基衍生化试剂组合物,其特征在于,所述组合物包括:
(i)式I化合物,其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C1-6烯基或C1-6炔基;
X-为卤素负离子或酸根离子;和
(ii)酰胺缩合剂。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述R、R1各自独立地为甲基、乙基、丙基或异丙基。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述卤素负离子为Cl-、Br-或I-。
4.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述式I化合物为N1,N1-二甲基哌嗪碘盐或N1,N1-甲基乙基哌嗪碘盐。
5.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述酰胺缩合剂选自:O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐(TNTU),或其组合。
6. 如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述酰胺缩合剂与化合物I摩尔比为0.1-5:1。
7.式I化合物作为羧基衍生化试剂的用途,其中,所述R、R1各自独立地为C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基;和
X-为卤素负离子或酸根离子;
所述化合物在酰胺缩合剂存在下,能与羧基化合物中的羧基发生衍生化反应,将羧基化合物中的羧基酰胺化。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述酰胺缩合剂选自:O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐(TNTU)。
9.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述羧基化合物的分子量<10000Da。
10.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述羧基化合物选自:脂肪酸、芳香酸、氨基酸、肽,或其组合。
11.一种同时检测待测样品中脂肪酸和磷脂的质谱检测方法,其特征在于,包括步骤:
(1)样品预处理:所述的预处理包括加入如权利要求1所述的衍生化试剂组合物与样品进行衍生化反应,得到经衍生化的样品液;
(2)对所述经衍生化的样品液在正离子模式下进行质谱分析,得到质谱的谱图及谱峰数据。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述衍生化反应具有一个或多个下述特征:
所述反应的反应温度为-10-50℃;
所述反应的反应时间为5-25min。
13.一种生物组织中脂肪酸和磷脂的基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱成像方法,其特征在于,包括步骤:
(1)样品预处理:提供生物组织切片,干燥,将包含如权利要求1所述的衍生化试剂组合物的衍生化试剂溶液喷涂到所述生物组织切片上,干燥,得到经衍生化的生物组织切片;
(2)将所述经衍生化的生物组织切片,喷涂基质液,干燥,得待进样生物组织切片;及
(3)将生物组织样本贴附在导电玻片上,正离子模式下进行MALDI质谱分析,得到质谱的谱图及谱峰数据;用于成像。
14.一种用于羧基化合物的衍生化法质谱检测试剂盒,包括:
(1)第一容器,以及位于第一容器内的如权利要求1所述的组合物;
(2)标签或说明书。
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