CN111603553A - 一种靶向免疫系统治疗肿瘤的dna药物及其应用 - Google Patents

一种靶向免疫系统治疗肿瘤的dna药物及其应用 Download PDF

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曾蓁
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Abstract

本发明公开了一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物及其应用，涉及生物医药技术领域，有效成分包括表达载体和装载在表达载体上的人源免疫活性因子基因片段，所述表达载体为非复制型基因载体，应用于不同组织类型的肿瘤治疗时其所载有的组织特异性启动子不同；所述人源免疫活性因子为人源T细胞共激活因子，异位表达于肿瘤细胞表面，靶向系统免疫反应。本发明公开的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，肿瘤内注射给药后，在不同组织特异性启动子调控下，实现T细胞共激活因子异位高表达于不同组织类型肿瘤细胞膜上，与T细胞表面的配体/受体相互作用，激活T细胞对肿瘤的系统免疫反应。

Description

一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向免疫系统治疗肿瘤的 DNA药物及其应用。
背景技术
癌症严重威胁人类健康。近年来DNA疫苗在免疫治疗肿瘤研发方面非常活跃。 抗肿瘤DNA疫苗也被称为核酸疫苗，是利用基因重组技术直接将编码肿瘤特异性 抗原或肿瘤相关抗原的基因结合在表达载体上，导入生物体内，在宿主细胞内表 达，诱导宿主产生对该肿瘤相关抗原的免疫应答，达到预防和治疗肿瘤的目的。
虽然目前抗肿瘤DNA疫苗在临床试验中有较好应用前景，但其想要在肿瘤免 疫治疗领域中成为一种强有力的治疗手段仍面临许多挑战。最大的挑战是抗肿瘤 DNA疫苗在较大动物和人类中的低免疫原性和有限的抗原表达量，往往不足以刺 激人体的免疫反应，因此抗肿瘤DNA疫苗的应用受到了一定限制。
启动子决定着基因的组织特异性表达，选择不同的启动子，可以控制基因表 达的程度。组织特异性启动子是高效表达外源基因的关键。传统的抗肿瘤DNA 疫苗没有根据不同肿瘤组织类型选择不同启动子，导致外源基因表达效果不理想， 从而限制了抗原在APC的表达。因此，实现外源基因在特定组织细胞中进行高表 达是提高抗肿瘤免疫应答的重要障碍。
T细胞的完全活化有赖于双信号，双信号共刺激，对于T细胞增殖，分化和 存活是必需的。已有大量研究表明，有效双信号共刺激的存在对于免疫系统清除 肿瘤至关重要。将T细胞共激活因子用于肿瘤治疗的临床实验也证实，T细胞共 激活因子激动剂(抗体)能够有效的抑制肿瘤生长。传统的抗肿瘤DNA疫苗为单 信号肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，缺少免疫系统激活所必须的双信号，不能有效激 活免疫系统。近几年，科学家们将DNA疫苗和免疫因子调节剂联合应用的结果表 明，有效双信号共刺激对于提高DNA疫苗的免疫原性大有可为。但是目前DNA 疫苗和免疫因子调节剂的联合应用一般都是将肿瘤抗原和免疫因子分别置于在 两个DNA质粒中，混合这两个DNA后进行注射给药。混合DNA疫苗不能有效地将 两种信号集合地呈现给免疫细胞，因此诱导对特异性抗原的免疫反应作用较低。
传统抗肿瘤DNA疫苗采用静脉或肌肉注射的方式给药，最终安全到达组织细 胞中的有效DNA质粒数量十分有限。例如，静脉给药后，DNA与血液成分相互作 用，进而可能强烈影响其细胞结合特性，导致组织细胞中DNA数量明显降低，因 此抗原表达量明显不足，不能有效激活免疫系统。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药 物，该DNA药物将人源免疫活性因子基因分别装载在非复制型基因载体上，避 免了复制型基因载体(病毒载体)可能存在的病毒致病性和耐药性缺陷。
本发明还公开了一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物的应用，其采用肿 瘤内注射给药，在不同组织特异性启动子调控下，实现T细胞共激活因子异位 高表达于不同组织类型肿瘤细胞膜上，与T细胞表面的配体/受体相互作用，激 活T细胞对肿瘤的系统免疫反应，用于多种不同组织类型癌症免疫治疗或手术 前治疗。
为实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，包括表达载体和装载在表达载体 上的人源免疫活性因子基因片段，所述表达载体为非复制型基因载体，所述人源 免疫活性因子为人源T细胞共激活因子。
上述技术方案中，所述DNA药物采用非复制型基因载体作为表达载体，解 决了复制型基因载体所存在的一系列弊端。现有的DNA疫苗通常采用复制性基 因载体作为病毒的表达载体；而由于病毒存在传染性和致病性(毒性)，因此采 用复制型基因载体作为表达载体其安全性有待考量。同时，病毒感染组织细胞具 有专一性，因此复制型载体具有一定的组织感染局限性，其应用范围受限。此外， 目前所广泛应用的病毒载体多为腺病毒和疱疹病毒，而大概80％的中国人有5 型腺病毒抗体阳性，意味着多数人已经预存对腺病毒的免疫力，当腺病毒再次进 入体内，身体内的腺病毒抗体会攻击病毒载体而非它所携带的外源抗原，从而令 疫苗失效，这称为载体阻碍效应，例如2015年已经批准上市的T-VEC，由于有60％的人群预先存在对疱疹病毒载体的免疫力，所以其疗效仅16％。这种对病毒 载体预先存在的免疫力所导致的耐药性，是复制型载体最大的应用弊端。本申请 以非复制型载体以DNA质粒为基因载体，无病毒致病性和传染性，并且DNA 作为疫苗和治疗在临床已有近30年的应用历史，总体安全性得到证明，同时非 复制型载体也避免了病毒载体可能预先存在的免疫力所导致的耐药性问题，其应 用疗效可期。
在上述技术方案中，所述DNA药物表达载体为装载有组织特异性启动子的 DNA质粒载体，根据应用的肿瘤类型不同，其所装载的组织特异性启动子不同。
进一步地，所述组织特异性启动子表达载体的启动调控，实现人源免疫活性 因子在特定组织类型肿瘤细胞膜上高表达。
进一步地，所述人源免疫活性因子基因片段在B细胞或抗原呈递细胞内表达 为人源T细胞共激活因子。
进一步地，所述人源T细胞共激活因子可特异激活不同类型的T细胞亚群； 所述T细胞共激活因子包括CD80、CD86、ICOSL、OX40L、CD40、4-1BBL、 CD70、CD30L、CD48中的任一种。
进一步地，所述T细胞亚群包括CD4细胞、CD8细胞、NK细胞、细胞毒 性T细胞、淋巴因子T细胞、诱导性T细胞、辅助性T细胞中的任一种。
进一步地，所述人源T细胞共激活因子在细胞内表达为一个或多个活化T 细胞因子的同源或异源融合分子。
进一步地，所述人源T细胞共激活因子为有功能活性的蛋白质或经过剪接 修饰或突变的蛋白多肽。
进一步地，所述人源T细胞共激活因子的功能活性对于激活T细胞提供了 必须的第二信号，并增强对肿瘤的特异免疫反应。
本发明公开了上述DNA药物的应用方法，该DNA药物为DNA生物大分子 结构，以DNA质粒形式肿瘤内注射给药，用于肿瘤的免疫治疗和手术前治疗。
通过肿瘤内注射给药，让DNA药物直接进入肿瘤细胞中表达；在不同组织 特异性启动子调控下，实现T细胞共激活因子异位高表达于特定组织类型的肿 瘤细胞膜上，与T细胞表面的配体/受体相互作用，提供了免疫系统所必须的双 信号，特异性激活T细胞对该种肿瘤的系统免疫应答，用于肿瘤的免疫治疗。
优选地，由于不同免疫活性因子在免疫反应中发挥作用时间不同，所述 DNA药物可通过搭载不同人源免疫活性因子制定在一个治疗疗程组里，最大化 的激活免疫系统。
在上述技术方案中，所述DNA药物可作为一种靶向免疫系统的新型核酸技 术平台，同样适用于多种不同组织类型的癌症手术前免疫治疗，给药2周后进 行手术治疗，术后不易复发、转移，治疗彻底；也适用于与其他肿瘤药联合应 用提高疗效。
本发明公开的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物作为一种靶向免疫系统的 新型核酸技术平台，可通过选用不同的组织特异性启动子的表达载体搭载不同人 源免疫活性因子，实现T细胞共激活因子异位高表达于特定组织类型肿瘤细胞膜 上，适用于多种不同组织类型肿瘤免疫治疗。
附图说明
图1是DNA药物在细胞中表达T细胞共刺激因子示意图(免疫活性因子表 达)；
图2是DNA药物小鼠肿瘤模型药效示意图；
图3是DNA药物小鼠肿瘤模型药效实验中肿瘤体积对比示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
人源T细胞和/或B细胞表面抗原分子的表达部位和功能如下表1所示：
Figure BDA0002520181570000041
Figure BDA0002520181570000051
表1人源T细胞/B细胞表面抗原分子表达部位和功能
下述实施例中，采用CMV(真核基因表达启动子，广泛应用于构建高效真 核表达载体)作为启动子，表达人源T细胞共激活因子的外源基因片段通过常 规的基因工程方法插入DNA质粒载体中。其插入方法可选：PCR合成人源或鼠 源T细胞共激活因子的基因片段，将这些基因片段分别连接于相同酶切割的 DNA质粒上，紧随在DNA质粒的启动子后。将重组载体转化至大肠杆菌感受态 细胞中，筛选阳性克隆后，对筛选出的阳性克隆进行酶切鉴定并测序，并用免疫 荧光法检测插入的外源基因在转染细胞中的表达，如图1所示。
靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物在小鼠肿瘤模型药效实验：
将表达人源T细胞共激活因子的不同外源基因片段基因：鼠源B7基因片段 a、鼠源OX40-L基因片段b分别插入DNA质粒中，并分别制备成：Mc86溶液、 Mox4-L溶液。
选用4-6周龄的健康雌性小鼠(C57)进行动物药效实验，在小鼠的双侧背侧 皮下接种肺癌LL2细胞，建立了小鼠肺癌双侧同源肿瘤模型。接种细胞约7天 后，观察小鼠肿瘤生长约80mm3时(约7-12天)，进行动物药效实验：
将接种肺癌LL2细胞的小鼠随机分为3组，分别于右侧肿瘤瘤内注射给药。
实验组A:注射30ugDNA溶液，含Mc86(携带有鼠源B7基因片段a)；
实验组B:注射30ugDNA溶液，含Mox4-L(携带鼠源OX40-L基因片段b)；
对照组:注射30ugDNA溶液，为未插入任何外源基因的表达载体。
给药10天后观察小鼠，得到以下实验结果：
(1)给药结束后，与对照组相比，实验组A和实验组B小鼠左右两侧肿 瘤明显较小，如图2所示。
(2)给药结束时，测量小鼠肿瘤终体积。对照组小鼠右侧肿瘤平均体积：700.23mm3，左侧肿瘤平均体积：614.16mm3；与对照组相对，携带有鼠源B7 基因片段a、鼠源OX40-L基因片段b的实验组，其左右侧肿瘤体积均明显小于 对照组，如图3所示。
小鼠肺癌(LL2)的免疫治疗结论：
携带有外源基因片段(B7基因片段a)的DNA药物抑制了肺癌肿瘤生长(实 验组A)；
携带有外源基因片段(OX40-L基因片段b)的DNA药物抑制了肺癌肿瘤生 长(实验组B)。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披 露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的 组合。
序列表
<110> 四川安可康生物医药有限公司
<120> 一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 329
<212> PRT
<213> 人源CD86 (Homo sapiens)
<400> 1
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<211> 193
<212> PRT
<213> 人源CD70 (Homo sapiens)
<400> 6
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165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 7
<211> 234
<212> PRT
<213> 人源CD30L (Homo sapiens)
<400> 7
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50 55 60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85 90 95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130 135 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210 215 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 8
<211> 243
<212> PRT
<213> 人源CD48 (Homo sapiens)
<400> 8
Met Cys Ser Arg Gly Trp Asp Ser Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly His Leu Val His
20 25 30
Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser
35 40 45
Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln
50 55 60
Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile
85 90 95
Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Met Arg Val Leu
100 105 110
Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys Leu Gln Val Leu
115 120 125
Asp Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile Glu Lys Ile Glu Asp Met
130 135 140
Asp Asp Asn Cys Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Val Ile Pro Gly Glu Ser
145 150 155 160
Val Asn Tyr Thr Trp Tyr Gly Asp Lys Arg Pro Phe Pro Lys Glu Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Val Leu Glu Thr Thr Leu Met Pro His Asn Tyr Ser Arg
180 185 190
Cys Tyr Thr Cys Gln Val Ser Asn Ser Val Ser Ser Lys Asn Gly Thr
195 200 205
Val Cys Leu Ser Pro Pro Cys Thr Leu Ala Arg Ser Phe Gly Val Glu
210 215 220
Trp Ile Ala Ser Trp Leu Val Val Thr Val Pro Thr Ile Leu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Leu Thr

Claims (10)

1.一种靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：包括表达载体和装载在表达载体上的人源免疫活性因子基因片段，所述表达载体为非复制型基因载体；所述人源免疫活性因子为人源T细胞共激活因子。
2.根据权利要求1所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述人源T细胞共激活因子均在B细胞或抗原呈递细胞内表达为T细胞激活必须的第二信号。
3.根据权利要求1所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述人源T细胞共激活因子包括但不限于CD80、CD86、ICOSL、OX40L、CD40、4-1BBL、CD70、CD30L、CD48中的任一种。
4.根据权利要求3所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述T细胞共激活因子可特异激活不同类型的T细胞亚群；所述T细胞亚群包括CD4细胞、CD8细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、淋巴因子T细胞、诱导性T细胞、辅助性T细胞中的任一种。
5.根据权利要求2～4任一种所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述人源T细胞共激活因子在肿瘤细胞内表达为一个或多个活化T细胞因子的同源或异源融合分子。
6.根据权利要求5所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述人源免疫活性因子基因片段在细胞表达为有功能活性的蛋白质或蛋白多肽。
7.根据权利要求6所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述蛋白多肽经过剪接修饰或突变的活性蛋白多肽。
8.根据权利要求1所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述非复制型基因载体为载有组织特异性启动子的DNA质粒载体。
9.根据权利要求8所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物，其特征在于：所述DNA质粒应用于不同组织类型的肿瘤治疗时其所载有的组织特异性启动子不同。
10.权利要求1～4、6～9任一项所述的靶向免疫系统治疗肿瘤的DNA药物以DNA质粒形式肿瘤内注射给药，在不同组织特异性启动子调控下，实现T细胞共激活因子异位高表达于不同组织类型肿瘤细胞膜上，与T细胞表面的配体/受体相互作用，激活T细胞对肿瘤的系统免疫反应，用于多种不同组织类型癌症免疫治疗或手术前治疗。
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