CN111602055B - 作为癌症生物标志物的挥发性有机化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物标志物，并且涉及用于诊断例如癌症的多种病症的新颖生物标志物。特别地，本发明涉及这些化合物在用于检测癌症(诸如胰腺癌和/或结直肠癌)的测定中作为诊断和预后标志物的用途，以及对应的检测方法。本发明还涉及确定用治疗剂治疗这些疾病的功效的方法，以及用于进行所述测定和方法的设备。所述测定是定性和/或定量的，并且适用于大规模筛选和临床试验。

Description

作为癌症生物标志物的挥发性有机化合物
本发明涉及生物标志物，并且特别地但是非排他地涉及用于诊断多种病症(诸如癌症)的新颖生物标志物。特别地，本发明涉及这些化合物在用于检测癌症(诸如胰腺癌和/或结直肠癌)的测定中作为诊断和预后标志物的用途，以及对应的检测方法。本发明还涉及确定用治疗剂治疗这些疾病的功效的方法，以及用于进行所述测定和方法的设备。该测定是定性和/或定量的，并且适用于大规模筛选和临床试验。
胰腺癌据估计在美国每年导致超过40,000人死亡，并且据估计是2017年总癌症死亡人数的第四大贡献者[1]。在诊断时只有15-20％的患者的疾病潜在地可治愈[2,3]。从基层医疗机构进行转诊以检查疑似胰腺癌取决于症状识别。大型基层医疗数据库研究和患者调查表明，胰腺癌患者在诊断前的几个月和几年中频繁地到他们的全科医生那里就诊[4]。然而，在英国仍有将近一半的患者因急诊入院而被诊断出[5]。目前，英国国家卫生与临床优化研究所(National Institute for Health and Care Excellence,NICE)用于评定胰腺癌的转诊指南包括60岁及以上且具有体重减轻和其他症状的人[6]。早期症状是间歇性的，并与其他常见的良性病症重叠。症状识别的困难性由于缺乏可在一般实践中采用的有效客观诊断方法而加剧。绝大多数生物标志物研究针对高风险群体，例如遗传性胰腺炎、家族性胰腺癌和导管内乳头状黏液瘤。迄今为止，由于多种原因而未能将生物标志物转化为临床用途，所述多种原因包括未包括适当的对照(例如慢性胰腺炎)和无法解释混杂因素(例如胆道阻塞和糖尿病)[7,8]。
在结直肠癌(colorectal cancer,CRCa)在最早期时被诊断出时，超过十分之九的CRCa患者将带病存活五年或更长时间，相比之下当在疾病的最晚期诊断出的时不到十分之一的人将带病存活五年或更长时间[1]。利用肠道症状作为CRCa的主要诊断依据已显示具有非常差的阳性预测值[2]。有症状患者的CRCa风险可以通过不同的检查进行评定。可屈性乙状结肠镜检查是金标准检查，但其大规模应用具有资源牵连并且其成本效益取决于不同症状的预测值。愈创木脂粪便潜血测试在CRCa检测中具有87-98％的良好灵敏度，但是高度可变并且往往特异性不尽人意(13-79％)，需要对多个粪便样品重复进行测试。迄今为止，既不建议也不可将粪便潜血测试用作中间测试[3-6]。粪便免疫化学测试需要单次粪便采样。四个系统是完全自动化的，并且提供了血红蛋白的定量度量，从而允许选择阳性阈值来匹配特定情况。因此，关于CRCa的灵敏度和特异性的可用研究数据是基于少量的癌症。数据表明，根据所选的阳性阈值，对CRCa的灵敏度在35％与86％之间变化，并且特异性在85％与95％之间变化[5,6]。然而，尚无有关早期癌症的较新定量测试的灵敏度的数据。多靶粪便DNA测试当与大型多中心研究中的粪便免疫化学测试相比时，表现出更好的特异性(92％对比73％)，但更低的灵敏度(90％对比96％)[7]。
基于粪便的测试的一种替代方法是呼出气测试，该测试由于该测试的性质而具有高依从性的潜力以及用于测试具有不同VOC识别标志的多于一种疾病的可能性[8,9]。研究人员已经使用气相色谱质谱仪(GC-MS)提出存在特异于CRCa的呼吸气(breath)挥发性有机化合物(VOC)谱[10]。GC-MS是一种用于VOC鉴定的良好技术，但是其是性质上半定量的，并且因此被不同研究小组发现在研究结果重现性方面的能力有限。此外，每个样品都要大量分析时间，这自然不适用于高通量分析。选定的离子流动管质谱仪(SIFT-MS)具有定量并且允许实时分析的优点[11,12]。只有一项先前研究评估了结直肠癌根治性手术切除后患者的呼吸气谱[13]。该研究利用GC-MS并且提出在去除CRCa后呼出气的VOC谱发生了变化，这进一步突出了肿瘤代谢与VOC产生之间的潜在关联。作者还假设这些结果可为在手术后患者随访中使用呼吸气分析和监测无病存活期提供依据[13]。然而，该研究未检查有CRCa复发迹象的患者。先前的研究均未在外部验证初始发现结果。
需要一种可靠的非侵入性标志物来鉴定患有癌症(例如胰腺癌和/或结直肠癌)的患者。一种鉴定患有胰腺癌和/或结直肠癌的患者的诊断方法将对患者具有极大的益处，并将提高早期治疗和改善预后的可能性。
发明人现在已经确定了指示胰腺癌和/或结直肠癌的几种生物标志物或所谓的标志化合物(signature compound)。
发明人首先将注意力转移到胰腺癌的诊断上。如实施例1中所述，将患者招募至两个独立的队列，即初始开发研究和第二验证队列。癌症组包括患有局部和转移癌的患者，而对照组包括具有良性胰腺疾病或正常胰腺的患者。用于比较的对照测试是使用腹部计算机断层扫描进行放射学成像、超声扫描，或用组织病理学检查确认的内镜超声(如果适用的话)。如实施例中描述并且在图1中示出的，用铝袋收集来自开发队列的呼吸气，并使用ReCIVA系统收集来自验证队列的呼吸气。使用气相色谱质谱法执行分析。68名患者被招募到开发队列中(25名癌症，43名非癌症)，并且64名患者被招募到验证队列中(32名癌症，32名非癌症)。在开发队列内的单变量分析时，在鉴定的66种标志挥发性有机化合物(VOC)中，有13种在各组之间显著不同。使用显著挥发物和验证队列的观测者操作特性分析产生了在区分癌症与非癌症方面的曲线下面积为0.767(灵敏度为81.3％，特异性为71.9％)并且在区分腺癌与非癌症方面的曲线下面积为0.828(灵敏度为77.8％，特异性为75％)。
因此，在第一方面中，提供了一种用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患胰腺癌的个体中该标志化合物的浓度参照进行比较，其中与参照相比(i)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，表明该受试者患有胰腺癌，或有患胰腺癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
在第二方面中，提供了一种确定用治疗剂或专门饮食治疗患有胰腺癌的受试者的功效的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患胰腺癌的个体中该标志化合物的浓度参照进行比较，其中(i)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，或者(ii)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是有效的，或者其中(i)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者(ii)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是无效的。
在第三方面中，提供了一种用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的设备，所述设备包括：-
(i)用于确定来自测试受试者的样品中的标志化合物的浓度的装置(means)；以及
(ii)来自未患胰腺癌的个体的样品中标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：与参照相比(i)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，从而表明该受试者患有胰腺癌，或有患胰腺癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
在第四方面中，本发明提供了一种用于确定用治疗剂或专门饮食治疗患有胰腺癌的受试者的功效的设备，所述设备包括：-
(a)用于确定来自测试受试者的样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(b)来自未患胰腺癌的个体的样品中标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：
(i)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，或者与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，从而表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是有效的；或者
(ii)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，从而表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是无效的。
第一方面和第二方面的方法可包括向受试者施用或已经向受试者施用治疗剂或使受试者接受专门饮食，其中所述治疗剂或所述专门饮食预防、减少或延迟胰腺癌的进展。
根据本发明的第五方面，提供了一种治疗患有胰腺癌的个体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)确定来自测试受试者的样品中标志化合物的浓度，其中与参照相比(i)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C3醛、C1-C3醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自测试受试者的身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，表明该受试者患有胰腺癌，或有患胰腺癌的倾向，或具有负性预后；以及
(ii)向测试受试者施用或已经向测试受试者施用治疗剂或使测试受试者接受专门饮食，其中所述治疗剂或所述专门饮食预防、减少或延迟胰腺癌的进展。
在第六方面中，提供了选自C1-C3醛、C1-C3醇、第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃；C1-C20烷烃，C4-C10醇，C1-C6羧酸和C4-C20醛，或其类似物或衍生物的标志化合物作为用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的生物标志物的用途。
如实施例1中所述，发明人已经表明，甲醛、甲醇、异丙醇或乙偶姻(acetoin)的浓度升高，或者戊烷、正己烷、1-丁醇、丙酸、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十四烷的浓度降低指示胰腺癌。本文所述的方法、设备和用途还可包括分析本文所述的标志化合物的类似物或衍生物的浓度。具有可测定化学基团的合适类似物或衍生物的示例包括醇、酮、芳香族、有机酸和气体(诸如CO、CO2、NO、NO2、H2S、SO2、CH4)。
在标志化合物为C1-C3醛的实施方式中，优选地该化合物为C1、C2或C3醛，最优选地为C1醛，即甲醛。
在标志化合物为C1-C3醇的实施方式中，优选地该化合物是C1、C2或C3醇，最优选地为C1醇(即甲醇)或C3醇(即异丙醇)。
在标志化合物为第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的实施方式中，优选地该化合物为第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10。优选地，被＝O基团取代的碳原子不是末端碳原子。更优选地，该化合物是C3-C6烷烃，并且最优选地，该化合物是第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C4烷烃，即乙偶姻。
在标志化合物为C1-C20烷烃的实施方式中，优选地，该化合物为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷烃，更优选地C3-C15烷烃。优选地是该化合物为C5-C14醇。例如，优选地，该化合物为C5醇，即戊烷。优选地，该化合物为C6醇，即己烷。优选地，该化合物为C14醇，即十四烷。
在标志化合物为C4-C10醇的实施方式中，优选地，该化合物为C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10醇。优选地，该化合物为C4-C7醇，最优选地为C4醇，即丁醇。
在志化合物为C1-C6羧酸的实施方式中，优选地该化合物为C1、C2、C3、C4、C5、C6羧酸。优选地，该化合物为C2-C4羧酸，更优选地为C3羧酸，即丙酸。
在标志化合物为C4-C20醛的实施方式中，优选地该化合物为C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20醛。优选地，该化合物为C5-C15醛，更优选地为C7-C13醛。优选地，该化合物为C8醛，即辛醛。优选地，该化合物为C9醛，即壬醛。优选地，该化合物为C10醛，即癸醛。优选地，该化合物为C11醛，即十一醛。
因此，在一个最优选的实施方式中，第一方面包括一种用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患胰腺癌的个体中该标志化合物的浓度的参照进行比较，其中与参照相比(i)在来自测试受试者的身体样品中选自甲醛、甲醇、异丙醇和乙偶姻，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自测试受试者的身体样品中选自戊烷、己烷、丁醇、丙酸、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十四烷，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，表明该受试者患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向，或者提供受试者的病症的负性预后。
应当理解的是，在它们的一些最优选的实施方式中，第二至第六方面也涉及检测与以上段落中相同的标志化合物。
发明人然后将他们的注意力转向结直肠癌的诊断。如实施例2中所述，使用2升双层Nalophan袋收集呼出气样品，并使用选择离子流管质谱法进行分析。用于比较的金标准测试是用内窥镜进行腔内检查并用CT确认癌症复发。进行了三项研究：(i)分型研究：150名患者；50名CRCa和100名对照；(ii)i诊断验证：79名患者；25名CRCa和54名对照；以及(iii)肿瘤复发的临床验证：40名患者；19名术后(无复发)和21名CRCa复发。在多变量分析中，与对照患者相比，癌症队列中的单一VOC(丙醛)显著升高。使用28ppbv的阈值时，这产生了针对CRCa诊断为96％的敏感度和为76％的特异性。丙醛类似地在具有CRCa时升高，并且使用28ppbv的阈值时，这提供了为83.3％的灵敏度和为84.7％的特异性。在手术后，丙醛降低到对照患者中预期的水平，并且随着复发，水平显著升高。使用28ppbv的阈值时，鉴定CRCa复发的灵敏度为71.4％并且特异性为90.9％。
因此，在第七方面中，提供了一种用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患结直肠癌的个体中该标志化合物的浓度的参照进行比较，其中与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度增加，表明该受试者患有结直肠癌，或具有患结直肠癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
在第八方面中，提供了一种确定用治疗剂或专门饮食治疗患有结直肠癌的受试者的功效的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患结直肠癌的个体中该标志化合物的浓度的参照进行比较，其中(i)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是有效的，或者其中(ii)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是无效的。
在第九方面中，提供了一种用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的设备，所述设备包括：-
(i)用于确定来自测试受试者的样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(ii)来自未患结直肠癌的个体的样品中标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度增加，从而表明该受试者患有结直肠癌，或有患结直肠癌的倾向，或对受试者的病症提供了负性预后。
在第十方面中，本发明提供了一种用于确定用治疗剂或专门饮食治疗患有结直肠癌的受试者的功效的设备，所述设备包括：-
(a)用于确定来自测试受试者的样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(b)来自未患结直肠癌的个体的样品中标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：
(i)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度降低，从而表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是有效的；或者
(ii)与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度升高，从而表明使用治疗剂或专门饮食的治疗方案是无效的。
第七方面和第八方面的方法可包括向受试者施用或已经向受试者施用治疗剂或使受试者接受专门饮食，其中所述治疗剂或所述专门饮食预防、减少或延迟结直肠癌的进展。
根据本发明的第十一方面，提供了一种治疗患有结直肠癌的个体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)确定来自测试受试者的样品中标志化合物的浓度，其中与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度增加，表明该受试者患有结直肠癌，或具有患结直肠癌的倾向，或具有负性预后；以及
(ii)向测试受试者施用或已经向测试受试者施用治疗剂或使测试受试者接受专门饮食，其中所述治疗剂或所述专门饮食预防、减少或延迟结直肠癌的进展。
在第十二方面，提供了选自C2或C3醛，或其类似物或衍生物的标志化合物作为用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向的受试者或用于提供受试者病症的预后的生物标志物的用途。
标志化合物可包括或为C2醛，即乙醇。
优选地，标志化合物包括或为C3醛，即丙醛。
因此，在一个最优选的实施方式中，第七方面的方法提供了一种用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法，所述方法包括分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患结直肠癌的个体中该标志化合物的浓度的参照进行比较，其中与参照相比在来自测试受试者的身体样品中选自丙醛，或其类似物或衍生物的标志化合物的浓度增加，表明该受试者患有结直肠癌，或具有患结直肠癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
应当理解的是，在它们的一些最优选实施方式中，第八方面至第十二方面也涉及检测丙醛。
如实施例2中所述，发明人已表明，丙醛的增加指示结直肠癌。本文所述的方法、设备和用途还可包括分析本文所述的标志化合物的类似物或衍生物的浓度。具有可测定化学基团的合适类似物或衍生物的示例包括醇、酮、芳香族、有机酸和气体(诸如CO、CO2、NO、NO2、H2S、SO2、CH4)。
在疾病诊断和预后中使用的任何有用的生物标志物的重要特征是，其表现出对特定疾病的高灵敏度和特异性。如实施例中所解释的，发明人已令人惊讶地证明，在来自测试受试者的呼出气中存在的多种标志化合物充当疾病(例如胰腺癌和结肠直肠癌)的稳健生物标志物，并且因此可用于检测这些疾病和疾病预后。另外，本发明人已经表明，使用此类标志化合物作为疾病的生物标志物采用简单、可重现、非侵入并且廉价，并且对患者而言不便性最小的测定。
有利地，本发明的方法和设备提供了用于诊断多种癌症的非侵入性手段。根据第一方面和第七方面的方法可用于使临床医生能够分别针对当前患有胰腺癌或结肠直肠癌或可能患有胰腺癌或结肠直肠癌的受试者做出关于最佳治疗过程的决定。优选的是，第一方面和第七方面的方法可用于使临床医生能够决定如何治疗当前正患有癌症的受试者。另外，第一方面和第二方面以及第七方面和第八方面的方法可用于监测相关癌症的推定治疗的功效。例如，如果癌症是胰腺癌，则治疗可以包括施用化学疗法、有或没有手术的放化疗。例如，如果癌症是结肠直肠癌，则治疗可以包括施用化学疗法、有或没有手术的放化疗，或内窥镜切除术。
因此，根据第三方面、第四方面、第九方面和第十方面的设备可用于提供受试者病症的预后，使得临床医生能够根据第五方面或第十一方面进行治疗。第三方面或第九方面的设备可用于监测推定治疗对癌症的功效。因此，该方法和设备对于指导临床医生的治疗方案和监测此类治疗方案的功效非常有用。临床医生可以结合现有的诊断测试来使用本发明的设备，以提高诊断的准确性。
受试者可以是任何具有兽医学意义的动物，例如猫、狗、马等。然而，优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人，无论是男性还是女性。
优选地，从受试者得到样品，然后测量身体样品中的标志化合物的浓度。
被检测的标志化合物被称为挥发性有机化合物(VOC)，它们产生发酵谱(fermentation profile)，并且它们可以通过多种技术在身体样品中检测到。在一个实施方式中，这些化合物可在它们所溶于的液体或半固体样品中被检测。然而，在一个优选的实施方式中，这些化合物从气体或蒸气中被检测。例如，由于标志化合物为VOC，因此它们可散发自样品或形成样品的一部分并且由此可以气态或蒸气形式被检测。
第三方面、第四方面、第九方面或第十方面的设备可包括用于从测试受试者获得样品的样品提取装置。样品提取装置可包括针或注射器等。该设备可包括用于接纳提取的样品的样品收集容器，该提取的样品可为液体、气体或半固体。
优选地，样品是标志化合物存在或分泌到其中的任何身体样品。例如，样品可包括尿液、粪便、毛发、汗水、唾液、血液或眼泪。发明人认为VOC是血液中发现的其他化合物的分解产物。在一个实施方式中，可以立即测定血液样品中标志化合物的水平。可替代地，可以在标志化合物的浓度被确定之前将血液储存在低温下(例如在冰箱中)，或甚至冷冻。可以在全血或经处理的血液中进行身体样品中标志化合物的测量。
在另一些实施方式中，样品可以是尿液样品。优选的是，身体样品中标志化合物的浓度是从取自受试者的尿液样品中体外测量的。可以从尿液样品中散发的气体或蒸气中检测化合物。应当理解的是，检测从尿液排出的气相中的化合物是优选的。
还应当理解的是，“新鲜”身体样品可以在从受试者取得之后立即进行分析。或者，可以将样品冷冻并储存。然后可以将样品解冻并在稍后的日期进行分析。
然而，最优选地，身体样品可以是来自测试受试者的呼吸气样品。样品可以通过由受试者经嘴执行呼气，优选地在鼻吸气之后，来收集。优选地，样品包括受试者的肺泡空气。优选地，通过捕获呼气末呼吸气(end-expiratory breath)来收集肺泡空气而不是死腔空气。然后优选地通过将呼吸气穿过热解吸管转移将来自呼吸袋的VOC预浓缩到该管上。
在第二方面或第八方面的方法或第四方面或第十方面的设备中，标志化合物的浓度差异可以是与参照相比增加或减少。如实施例中所述，发明人监测了许多患有胰腺癌或结直肠癌的患者中标志化合物的浓度，并将它们与未患疾病的个体中这些相同化合物的浓度(即参照或对照)进行比较。他们证明在患有疾病的患者中，这些化合物的浓度在统计学上显著地升高或降低。
应当理解的是，患有疾病的患者中标志化合物的浓度高度依赖于多个因素，例如疾病进展到何种程度以及受试者的年龄和性别。还应理解的是，未患该疾病的个体中的标志化合物的参照浓度可能波动至某种程度，但是平均地在给定的时间段内浓度趋于基本上恒定。另外，应当理解的是，在患有疾病的一组个体中标志化合物的浓度可以不同于在未患有疾病的另一组个体中该化合物的浓度。然而，可以确定未患癌症的个体中标志化合物的平均浓度，并且这被称为标志化合物的参照或“正常”浓度。正常浓度对应于上述讨论的参照值。
在一个实施方式中，本发明的方法优选地包括确定呼吸气中化学物质的比率(即，使用呼吸气中的其他组分作为参照)，然后将这些标志物与疾病进行比较以显示它们是升高还是降低。
标志化合物优选是导致发酵谱的挥发性有机化合物(VOC)，并且其可以通过多种技术在身体样品中或从身体样品检测。因此，可以使用气体分析仪来检测这些化合物。用于检测标志化合物的合适检测器的示例优选地包括电化学传感器、半导体金属氧化物传感器、石英晶体微天平传感器、光学染料传感器、荧光传感器、导电聚合物传感器、复合聚合物传感器，或光谱量测术。
发明人已经证明，可以使用气相色谱法、质谱法、GCMS或TOF可靠地检测标志化合物。专用传感器可用于该检测步骤。
参照值可以通过测定统计上显著数量的对照样品(即来自未患该疾病的受试者的样品)获得。因此，根据本发明的第三方面、第四方面、第九方面或第十方面的设备，参照(ii)可以是对照样品(用于测定)。
设备优选地包括阳性对照(最优选地提供在容器中)，该阳性对照对应于标志化合物。所述设备优选地包括阴性对照(优选地提供在容器中)。在一个优选的实施方式中，设备可以包括参照、阳性对照和阴性对照。必要时，设备还可包括其他对照，诸如用于提供浓度参照的“掺入(spike-in)”对照，以及关于标志化合物或其类似物或衍生物中的每一者的其他阳性对照。
因此，发明人已经认识到，参照正常(即对照)与升高/降低的水平之间的标志化合物浓度差异可以用作生理标志物，提示测试受试者中疾病的存在。应当理解的是，如果受试者具有升高/降低浓度的一种或多种标志化合物，该浓度远高于/低于参照、对照值中该化合物的“正常”浓度，则与该化合物的浓度仅略高于/低于“正常”浓度相比，他们将有更高的患上该疾病的风险或具有更晚期的病症。
发明人已经注意到，测试个体中本文所提及的标志化合物的浓度在统计学上高于参照浓度(如使用实施例中所述的方法计算的)。在本文中这可以被称为标志化合物的“升高的”浓度。
技术人员将理解如何测量统计学上显著数量的对照个体中标志化合物的浓度，以及测试受试者中该化合物的浓度，然后使用这些相应的数字来确定测试受试者在该化合物的浓度方面是否具有统计学上显著的升高/降低，并由此推断该受试者是否患有已筛查的疾病。
在第二方面或第八方面的方法和第四方面或第十方面的设备中，与参照中的对应浓度相比，身体样品中标志化合物的浓度差异指示用治疗剂和手术切除治疗受试者的疾病的功效。差异可以是身体样品中标志化合物浓度与参照值相比的升高或降低。在身体样品中化合物的浓度低于参照中对应浓度的实施方式中，则这将表明治疗剂或专门饮食成功地治疗了测试受试者的疾患。相反，在身体样品中标志化合物的浓度高于参照中的对应浓度的情况下，则这表明该治疗剂或专门饮食未成功治疗该疾患。
本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或所公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合与上述方面中的任何组合，这些特征和/或步骤中的至少一些互斥的组合除外。
为了更好地理解本发明，并示出可如何实施本发明的实施方式，现在将以举例的方式参照附图，在附图中：
图1示出了用于将来自钢制呼吸袋的VOC浓缩到热解吸管上的设备和方法的实施方式；
图2示出了使用来自开发队列(袋)的数据针对A)癌症对照非癌症和B)所有腺癌对照非癌症产生的灵敏度对比1-特异性的ROC图。下表汇总了ROC分析数据，包括曲线下面积(AUC)；
图3示出了使用来自验证队列(ReCIVA)的数据针对A)癌症对照非癌症和B)所有腺癌对照非癌症产生的灵敏度对比1-特异性的ROC图。下表汇总了ROC分析数据，包括曲线下面积(AUC)；
图4示出了研究(i)—分型诊断调查的结果：关于将丙醛作为与结直肠癌的诊断标志物阴性对照患者相比的ROC分析(AUC＝0.90±0.03，95％CI 0.83-0.96)；
图5示出了研究(ii)—独立诊断验证的结果：对丙醛用于诊断结直肠癌的独立验证研究的ROC分析(AUC＝0.79±0.06，95％CI 0.66-0.91)；
图6示出了研究(iii)—肿瘤复发的临床验证的结果：与首次CRCa手术切除后CRCa复发的存在相关的丙醛上调(AUC＝0.81±0.07，95％CI0.68-0.94)；和
图7示出了在所研究的三项研究和四种疾病状态下所观察到的平均丙醛浓度中的变化。
实施例
发明人研究了VOC用于检测多种不同的癌症，包括胰腺癌和结直肠癌的用途。
实施例1-胰腺癌
胰腺癌的预后很差，因为大多数患者在不可能进行治愈性治疗的晚期时被诊断出。呼吸挥发性有机化合物已显示出作为用于检测其他癌症类型的新颖生物标志物的潜力。该研究鉴定并验证了与胰腺癌的存在有关的独特的呼吸挥发性有机化合物特征，表明了呼吸分析被纳入胰腺癌诊断途径的潜力。
该研究的主要目的是针对具有原发性胰腺癌、阳性对照疾病和正常胰腺的患者使用热解吸气相色谱质谱法(TD-GC-MS)分析观察到的呼出气VOC变化。第二目的是开发诊断模型以鉴定胰腺肿瘤，尤其是腺癌，并在独立收集的第二患者队列中进行进一步验证。第三目的是量化胰腺癌的呼出气中挥发性有机化合物与非癌症队列相比的差异，并生成癌症诊断模型。
材料和方法
进行了两项研究。在第一项分析研究中，收集呼出气并进行分析以鉴定在癌症患者与对照患者之间浓度不同的VOC。这些化合物被用于开发胰腺癌诊断模型。然后使用第二独立收集的患者队列验证该模型。
研究群体
所有入选患者均是从2016年3月至2016年12月从帝国理工学院NHS信托基金会(Imperial College NHS trust)招募的。已获得区域伦理批准的许可(REC参照：14/LO/1136)。研究的细节已向所有合格患者进行了解释，并在入选前已获得充分知情和书面同意。收集人口统计学和临床信息。
在分析和验证研究两者中，均将胰腺癌患者与包括良性胰腺疾病的对照组进行了比较。对于胰腺癌组，在手术前在外科病房或在进行内镜超声之前从内窥镜检查单位对患有局部胰腺癌的患者进行取样。从肿瘤诊所招募患有转移性胰腺疾病的患者。对于对照组，招募被诊断为包括以下的其他胰腺病症的患者：导管内乳头状黏液瘤(intra-ductalpapillary mucinous neoplasm,IPMN)、囊肿、假囊肿和慢性胰腺炎。将计划进行选择性上腹部超声(US)并且具有成像时正常出现的胰腺的患者入选到该组中。
参照测试
所有病例均用标准参照测试进行确认。通过腹部计算机断层扫描(CT)或内镜超声，并在组织学上通过细针穿刺活检证实了胰腺癌。腹部CT或超声检查了对照组内的患者的胰腺。
呼出气收集
使用通过发明人进行的对呼吸操作和医院环境对VOC测量的影响的调查[17,18]所获悉的经先前验证的方法[11]来执行呼出气收集。所有患者都要在进行呼吸取样之前禁食最少4小时，以最小化口腔污染或饮食摄入作为混杂因素的风险。还分析了来自样品收集室和实验室的大气空气，以调查背景VOC对收集的呼吸气样品的影响。呼吸气取样方法是从初始分析研究中的惰性铝袋(Bedfont Scientific Ltd.,Maidstone,UK)改变为验证研究中的ReCIVA呼吸气样品系统(Owlstone Medical Inc.,Cambridge,UK)。
参照图1，示出了根据本发明的用于呼吸取样的ReCIVA设备。ReCIVA设备是可重现的系统，其允许将直接呼吸收集到热解吸管中，该系统是将在未来的多中心研究中使用的系统。
使用500ml惰性铝袋收集呼吸，在取样之前将500ml惰性铝袋用合成空气洗涤。要求患者执行深鼻吸气，之后经由嘴完全呼出。通过捕获呼气末呼吸，优先收集肺泡空气而不是死腔空气。然后通过将250ml呼吸以50ml/秒在具有直径为10mm的管道和手持式空气泵(210-1002MTX,SKC ltd.,Dorset,UK)的热解吸管上转移，将来自呼吸袋的VOC预先浓缩(参见图1)到该管上。
对于ReCIVA系统，呼吸取样保持为完全非侵入性的，并且涉及将一次性面罩放置在患者的鼻子和嘴巴周围并指示患者执行正常的潮式呼吸。通过Capser系统(OwlstoneMedical Inc.,Cambridge,UK)向患者的面罩通气以持续供应空气，从而确保患者仅吸入干净的空气。ReCIVA设备使用内部CO2监测器和压力传感器来优先捕获肺泡呼吸并将其直接转移到热解吸管上。与袋收集类似，将总共250ml的肺泡呼吸转移到热解吸管上。
质谱分析
在收集的48小时内分析所有空气样品。来自降解研究的数据已表明，呼吸袋中的挥发物保持稳定达48小时[19]。TD-GC-MS是一种用于鉴定和量化挥发性化合物和半挥发性化合物的分析方法。进入装置的VOC行进穿过色谱柱(7890B GC,Agilent technologies,Cheadale,UK)，根据它们与固定相的亲和力进行分离，并在特定的保留时间时离开色谱柱。然后，VOC进入质谱仪(5977A MSD,Agilent technologies,UK)，它们在质谱仪处离子化、加速、偏转，并根据它们的质量/电荷(m/z)比进行检测。与单独使用任一种部件相比，气相色谱法和质谱法的组合允许改善的化合物鉴定。
使用热解吸管来在GC-MS分析之前通过将挥发物固定到衬于管内的Tenax吸附剂上来浓缩该挥发物。将所有Tenax TA管(Markes International,UK)在300℃下调理(TC-20,Markes International,UK)1小时10分钟。将该管装载到圆盘传送带上，检查管是否泄漏，然后干燥吹扫3分钟以去除多余的水分以确保VOC在加热时不会被氧化。然后使该管在280℃下解吸(TD-100,Markes International,UK)到10℃冷阱上，持续10分钟(氮气流率为50ml/min)。然后将冷阱快速加热至290℃，从而将VOC转移至色谱柱。为了最小化固定到该管的背景VOC，从管调理到预浓缩的时间不得超过一小时。
GC-MS方法
将初始烘箱温度在40℃保持4分钟，然后以5℃/min升至100℃，保持1分钟，以5℃/min升至110℃，保持1分钟，以5℃/min升至200℃，并最后以10℃/min升至240℃，保持4分钟。总GC分析时间为47分钟。将质谱仪以电子碰撞电离模式运行，从而以5.9次扫描/秒扫描20-250m/z的质量离子。质谱仪的四极和源的温度分别为230℃和150℃。在运行开始时使用3分钟的溶剂延迟，以最小化来自水的干扰。
数据提取
将色谱图和质谱数据提取到定性分析软件(Agilent Masshunter QualitativeAnalysis,UK)上。然后使用NIST数据库确认保留时间介于3-47分钟之间的每个峰的化学身份。将来自经鉴定的VOC的保留时间和特征m/z离子用于量化它们在所有色谱图中的丰度(Agilent Masshunter Quantitative Analysis,UK)。在量化中使用为±0.1分钟的保留时间范围，从而确保仅量化来自0.2分钟范围的特征离子。
统计分析
所有统计分析均使用IBM SPSS 24(IBM corp.,Armonk,NY)执行。小于0.05的P值被认为是显著的，并且所有统计检验都是双边的。癌症疾病状态和混杂因素被认为是独立变量，并且VOC丰度被认为是因变量。执行Shapiro-Wilk统计检验。
使用单变量Mann-Whitney U统计检验(由于数据呈非正态分布)评定开发队列中癌症组与非癌症组之间挥发物丰度的显著差异。将在单变量分析时被认为显著的VOC包括在逻辑回归分析中，以形成用于在验证队列中使用的诊断模型的基础。观测者操作特性(ROC)曲线图是通过绘制真实阳性率(灵敏性)对比假阳性率(1-特异性)的曲线而产生的。两条ROC曲线是针对癌症对照非癌症的比较以及腺癌对照非癌症的比较绘制的。使用曲线下面积(AUC)来评定模型的预测能力及其区分癌症与非癌症的能力。从ROC曲线图的坐标中提取灵敏度和特异性值。癌症组包括胰腺癌的所有子组，而非癌症组包括阳性对照组和正常胰腺组两者。腺癌组由局部腺癌亚组和转移性腺癌亚组组成。
还执行了统计分析以鉴定各组之间在年龄、种族、性别、胃食管反流病(GERD)、胰腺炎、肝病、肝炎、糖尿病、吸烟状况和饮酒量方面的显著差异。采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)用于连续年龄数据，而所有其他名义上潜在的混杂因素数据则取决于预期计数数目和检验的变量的数目而使用卡方检验(Chi-squared)/费希尔精确检验(Fisher exact test)/似然比(likelihood ratio)进行评定。随后使用线性回归测试所有混杂因素对比VOC丰度。
结果
患者
共有68名患者(参见表1)被招募至模型开发队列中。将患者分配为癌症组(n＝25)和非癌症组(n＝43)，包括局部腺癌(n＝7)、局部神经内分泌肿瘤(NET)(n＝4)、转移性腺癌(n＝10)、转移性NET(n＝4)、阳性对照(n＝20)和正常胰腺(n＝23)。
表1-两个队列的人口统计学和患者特征。显示了年龄的中值和四分位差数据。所 有其他数据在括号中呈现为n值和百分比。将克鲁斯卡尔-沃利斯检验用于年龄。将卡方/费 希尔精确检验/似然比用于所有其他因素。
将另外64名患者招募到验证队列中。将患者再次分为癌症组(n＝32)和非癌症组(n＝32)，包括局部腺癌(n＝14)、局部NET(2)、转移性腺癌(14)、转移性NET(3)、阳性对照(24)和正常胰腺(8)。癌症组和对照组之间的患者人口统计学或合并症没有显著差异(参见表1)。
VOC分析
色谱图的定性分析得到了可从NIST数据库中鉴定出的66种VOC。这些VOC中有22种被排除不用于进一步分析，因为它们要么被发现在背景空气中是高浓度的，要么被认为不太可能是内源性产生的。随后将剩余的44种VOC的身份以及它们的保留时间和特征m/z比用于量化VOC丰度。
夏皮罗-维尔克检验(Shapiro-Wilk testing)显露所有VOC的丰度数据均不是正态分布的。单变量曼-惠特尼U检验(Mann Whitney U test)显露9种VOC(表2)在开发队列内的癌症中具有显著改变的丰度(甲醛、甲醇、戊烷、异丙醇、正己烷、乙偶姻、辛醛、十一醛、十四烷)。
表2-11种重要VOC的表格。箭头指示癌症队列的变化方向。对于非显著的VOC，省略 了箭头。从曼-惠特尼U检验产生的P值针对癌症对比非癌症以及腺癌对比非癌症
进一步的分析还显示，11种VOC(表2)在腺癌对照非癌症比较中具有显著变化的丰度(甲醛、甲醇、戊烷、异丙醇、正己烷、1-丁醇、乙偶姻、丙酸、辛醛、壬醛、癸醛)。
在这些重要的VOC中，据发现4种的丰度在癌症中增加(甲醛、甲醇、异丙醇、乙偶姻)，并且据发现剩余9种的丰度在癌症呼吸气中降低(戊烷、正己烷、1-丁醇、丙酸、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十四烷)(表2)。发现对于来自开发队列和验证队列两者的数据中的所有显著VOC，该变化方向都是相同的。
线性回归分析(表3)显示，胰腺癌疾病状态是所有显著的VOC丰度的最强预测因子。没有混杂因素被发现是任何显著VOC的丰度的独立预测因子。
观测者操作特性(ROC)分析
仅使用据发现在来自发展队列中的癌症患者的呼吸中显著变化的VOC来构建两种队列的ROC曲线(参见图2和图3)。
对于模型开发研究，ROC曲线产生了为0.892的AUC(95％CI，0.806-0.978)以区分癌症与非癌症，灵敏度为84％并且特异性为88.4％。从腺癌与非癌症ROC产生的AUC为0.943(95％CI，0.886-0.999)，灵敏度为88.2％并且特异性为90.7％。对于模型验证研究，用于区分癌症和非癌症的AUC为0.768(95％CI，0.65-0.885)，从而产生了为78.8％的灵敏度和为75.0％的特异性。用于区分腺癌和非癌症的AUC为0.851(95％CI，0.753-0.948)，并且灵敏度为85.2％并且特异性为70.0％。
讨论
对呼出气中的VOC的气相色谱质谱量化已经鉴定出共13种化合物会因胰腺癌的存在而发生显著变化。显著的VOC来自三种主要化学基团，即醛、脂肪酸和醇。所有ROC模型均显示出AUC超过0.7的良好区分度。在区分腺癌和非癌症的模型中辨别力也更强。这些结果为进行更大型的多中心研究提供了基础，该更大型的多中心研究能够进一步确立呼吸VOC测试作为胰腺癌诊断工具的潜力。
在胰腺癌中具有最大数目的被显著异常调节的呼吸VOC的化学基团是醛类。目前，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)是胰腺癌的最常用肿瘤标志物。然而，它通常是非特异性的，在许多良性和恶性病症被升高，所述良性和恶性病症包括胰腺炎、肝硬化、急性胆管炎和结直肠癌[3]。由于Lewis a-/b-基因型，它也没有在5-10％的白种群体中表达出[24]。总体而言，仅65％的具有可手术切除的胰腺癌的患者将具有升高的CA19-9[3]。考虑到该研究的发现和早期验证阶段，不建议在呼吸VOC与CA19-9测试之间进行严格的比较。
该研究的优势在于其新颖性和设计。该研究为进行非侵入性呼吸测试以诊断胰腺癌提供了潜力，胰腺癌是一种在晚期出现时具有不良的长期存活率的需求未得到满足的疾病。研究设计的优势包括纳入阳性对照组、每名患者的参照测试以及独立的患者队列，以采用不同的呼吸收集方法来验证挥发性生物标志物。验证研究中采用的方法适用于多中心临床调查，因为ReCIVA提供了可重现的呼吸收集方法，而热解吸管提供了稳健的传输系统，所述稳健的传输系统使挥发性化合物保持稳定达约4周。
应在早期胰腺癌中检查测试的性能作为呼吸测试的终极目标，该终极目标能够改变就诊时的癌症分期方式并影响疾病存活。本研究包括患有局部晚期和转移性疾病的患者，因为该组代表临床实践中的大多数胰腺癌患者并且不应被诊断模型遗漏。
呼吸气VOC取样是一种完全非侵入性的测试，其如在由我们团队执行的当前研究以及其他研究中观察到的均被患者和临床医生非常高度地接受[11,17,18,19]。发明人设想使用呼出气测试作为分类调查来确立表现出非特异性症状的患者的胰腺癌风险，以指导用于CT成像的转诊。另一个测试位置是筛查高风险组，诸如遗传性胰腺炎、家族性胰腺癌、最近发病的糖尿病，以及导管内乳头状黏液瘤。呼气测试在患者护理途径中的最终位置将取决于大型多中心临床试验中的测试灵敏度和特异性，以及呼气测试在早期胰腺癌阶段和高风险组中的表现。
结论
呼吸气挥发物具有将胰腺癌患者与非癌症患者区分开的明显潜力。
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实施例2-结直肠癌
在结直肠癌(colorectal cancer,CRCa)的最早期时被诊断出结直肠癌时，超过十分之九的CRCa患者将带病存活五年或更长时间，相比之下当在疾病的最晚期诊断出的时不到十分之一的人将带病存活五年或更长时间[1]。然而，利用肠道症状作为CRCa的主要诊断依据已显示具有非常差的阳性预测值[2]。该研究鉴定并验证了与结直肠癌的存在有关的独特的呼吸挥发性有机化合物特征，表明了呼吸气分析被纳入结直肠癌诊断途径的潜力。
这项研究的目的是：(i)根据前瞻性队列研究确定CRCa患者的呼出气中VOC浓度与具有其他结直肠疾病或正常下胃肠道(对照)的患者相比的变化；(ii)在另一前瞻性收集的具有结直肠症状或疾病的患者的队列中验证这些发现；以及(iii)确定在CRCa手术切除后存在复发的情况下观察到的来自呼出气的VOC变化。
材料和方法
样品量：
研究(i)—对150名患者进行分析诊断调查(50名结直肠癌；50名阳性对照(包括炎症性肠病、息肉和憩室病)，以及具有正常的下胃肠道(lower gastrointestinal,LGI)内窥镜检查的50名阴性对照)。
研究(ii)—对79名患者进行独立诊断验证；25名患有CRCa的患者和54名对照患者，该54名对照患者包括阳性对照患者和阴性对照患者。
研究(iii)—对40名患者进行肿瘤复发临床验证；其中19名为术后无复发迹象的患者并且21名为具有记录的肝或腹膜复发的患者。所有患者均为在初始结直肠手术后至少6个月。
地点：圣玛丽医院(St Mary's Hospital)。
伦理批准：于2014年7月16日获得了NHS健康研究机构(伦敦NRES委员会—卡姆登和伊斯灵顿(NRES Committee London-Camden and Islington))的批准(REC参照14/LO/1136)。试验注册号：UKCRN18063
纳入标准：参加圣玛丽医院的下胃肠道内窥镜检查或结直肠癌手术或LGI症状调查的患者(研究(i)和(ii))。招募参加肿瘤诊所随访的患者进行研究(iii)。
排除标准：具有记录的活动性感染或肝脏疾病的患者。
呼吸气取样方法：要求所有患者签署知情同意书以纳入本研究。发明人遵循了先前临床研究[9]中使用的取样方案，该取样方案通过他们对呼吸操作和医院环境对VOC测量的影响的调查得以获悉[14,15]。在收集呼吸样品之前，使患者禁食最少四个小时。在进行呼吸取样之前，让患者在同一区域休息至少20分钟，并在进行内窥镜检查或手术之前取回所有呼吸样品。要求患者执行单次深鼻吸气，之后经嘴进行经由1mL的Luer lok注射器(Terumo Europe,Leuven,Belgium)到安全的双层厚(2×25μm)Nalophan(Kalle UK Ltd.,Witham,UK)袋中的完全呼气。
样品分析：对于每次VOC测量，将注射器柱塞从1ml Luer lok注射器中取出，并将Nalophan袋经由注射器筒直接连接到SIFT-MS仪器的样品入口臂。对于多离子监测模式，分析来自呼吸的选择性VOC总计60秒，并对该时间内每种VOC的测量浓度取平均。由于这是一项单中心研究，每个呼吸样品在从患者采集该样品的一小时内进行分析，因此将Nalophan呼吸袋用于我们小组进行的先前研究中[9]。方法学研究表明了痕量VOC在从患者取样时间开始直至两小时内的稳定性[16]。
选定的离子流动管质谱法(SIFT-MS)：SIFT-MS允许在线、实时VOC量化[11,12]。SIFT-MS的原理基于通过对空气或蒸气样品中的VOC进行化学电离来进行直接质谱分析。将选定的前体离子(H3O+、NO+和O2 +)注入氦气载气中，并使呼吸样品内的VOC电离，并生成特征性产物离子，这些离子由下游的四极质谱仪检测到。通过在下游检测系统处测量前体离子和特征性产物离子的计数率，实现了实时量化，从而实现了痕量和挥发性化合物的绝对浓度为按体积计十亿分之几或按体积计百万分之几。SIFT-MS已用于研究来自患有包括囊性纤维化和膀胱癌在内的病症的的患者的呼吸和尿液中的VOC[17,18]。SIFT-MS技术允许实时检测和量化生物样品(诸如呼出气)内的VOC，而无需进行样品制备[19]。发明人先前已经证实了使用SIFT-MS进行VOC测量的可重现性[20]。
临床数据：详细的医学预编报表由同意的执业医师或研究人员使用患者提供的信息以及临床调查完成。这些数据包括患者的人口统计学、肿瘤特征、合并症、用药和生活方式措施。记录每名患者的诊断性内窥镜检查和/或手术结果。
用于比较的标准：将经组织学检查确认的内窥镜检查结果用作将患者分类为CRCa还是对照组的金标准。对于术后患者，执行最近的CT扫描作为常规随访的一部分来用于鉴定那些具有术后复发的患者。
统计分析：SIFT-MS输出数据提供了来自呼出气的VOC的测得浓度。然后在各研究组中使用单变量统计、克鲁斯卡尔-沃利斯检验来比较这些浓度。然后将单变量统计中显著的VOC带入因变量为CRCa的存在的多变量对数回归模型。为了构建观测者操作特性(ROC)曲线，将癌症状态用作因变量，并将来自多变量对数回归模型的显著VOC的总浓度用作自变量。将＜0.05的P值用于分配统计学显著性。所有统计分析均使用统计软件SPSS(版本22)执行。
跨平台GC-MS验证：为了确认使用SIFT-MS在呼出气中获得的VOC，发明人进行了跨平台验证，其中GC-MS为标准分离技术。使用相同的方法从20名患者收集呼出气。使用SKC210-1002系列空气取样袖珍泵(PA,USA)以50mL/min将来自每个Nalophan呼吸袋的VOC含量转移到有惰性涂层的不锈钢Tenax/Carbograph-5TD吸附剂管(Markes InternationalLtd,Llantrisant,UK)上，然后进行GC-MS分析。使用具有5977A MSD(AgilentTechnologies,Cheshire,UK)，并且与Markes TD-100热解吸单元(TDU)联接的的Agilent7890B GC。以50mL/min的恒定氦气流率使用两阶段热解吸程序。在主要解吸阶段中，将TD管样品干燥吹扫3分钟，然后加热到280℃持续10min。在次级解吸阶段期间，将来自冷阱(U-T12ME-2S)的VOC以99℃/min的加热速率从10℃迅速解吸到290℃，并保持4分钟以将VOC完全转移到GC上。将从TDU到GC的流动路径不断在140℃下加热。
在以1.0mL/min的氦载气编程的ZB-624毛细管柱(60m×0.25mm ID×1.40μm df；Phenomenex Inc,Torrance,USA)上执行VOC分离。将烘箱温度剖面最初设置为40℃持续4分钟，升至100℃(5℃/分钟，保持1分钟)，升至110℃(5℃/分钟，保持1分钟)，升至200℃(5℃/分钟，保持1分钟)，最终以10℃/min升至240℃持续4min。MS传输线路保持在240℃，同时将EI源设置为70eV和230℃。将MS分析器设置用于在20-250m/z的范围内进行采集，其中数据采集约为6次扫描/秒。使用MassHunter软件版本B.07SP1(Agilent Technologies)处理GC-MS数据，同时将分离的VOC组分的MS数据与NIST质谱库(美国国家标准与技术研究院2.0版(National Institute of Standards and Technology version 2.0))比较以进行鉴定。
结果
研究(i)–分型诊断调查
150名患者(50名结直肠癌患者、50名患有下胃肠道的其他病症的患者(阳性对照)和50名具有正常下胃肠道的患者(阴性对照))。在阳性对照患者中，15名(30％)有炎症性肠病，21名(42％)有下胃肠道内息肉，并且14名(28％)有憩室病。在呼吸取样时，所有患有憩室病和炎性肠病的患者均不具有活动性憩室炎或结肠炎。
对患者医学合并症的比较分析显示，除CRCa组中70岁或以上的患者的比例增加外，各组之间无显著差异(参见表1a)。
表1a：患者医学共患病的比较
*7名患者的数据缺失
对照组中接受肠道准备的患者的比例也有所增加(表1a)。对刺激下胃肠道内镜检查转诊的主要症状的比较分析表明，除CRCa组中贫血患者的比例增加外，各组之间无显著差异(参见表1b)。
表1b：表现症状的比较
*7名患者的数据缺失
各组之间的药物利用的比较分析表明，CRCa组中质子泵抑制剂和氯吡格雷的使用增加(参见表1c)。
表1c：药物利用的比较
*7名患者的数据缺失
在50名CRCa患者中，52％为直肠肿瘤，66％为中度分化肿瘤，48％为T3肿瘤并且52％为N0肿瘤，并且34％为术前接受新辅助疗法的患者(参见表2)。
表2：包括结直肠癌患者的肿瘤特征
在多变量分析中，发现七种化合物在癌症组与对照组之间显著不同，其中仅丙醛(NO+)与结直肠癌显著相关(参见表3)。
表3：结直肠患者的SIFT-MS呼出气分析
**在多变里分析中的唯一显著的VOc
先前的调查已表明，由于饱和醛与NO+试剂之间发生的特异性氢化物转移反应，因此通过SIFT-MS对丙醛进行了可靠的量化[18]。与SIFT-MS分析并行，通过GC-MS进行的跨平台分析阐明，在癌症呼吸样品中在保留时间(RT)为8.92min的气相色谱图中明显观察到了丙醛峰。选定的ZB-624毛细管柱提供了足够的分离效能来将丙醛与丰富的丙酮峰分离(RT为9.11min)，尽管它们都具有为58m/z的共同碎片离子。发明人已经显示了丙醛峰的去卷积质谱细节(29m/z、39m/z和58m/z的特征离子)与NIST文库匹配的高度相似性。
表4显示了一系列被作为生物标志物测试的VOC，并且在多变量分析中丙醛再次显示为与结直肠癌显著相关。
表4：结直肠患者的SIFT-MS呼出气分析
*在多变量分析中，VOC与结直肠癌显著相关。
当与阴性对照(ROC曲线下的面积＝0.90±0.03(参见图1a))和阳性对照(ROC曲线下的面积＝0.83±0.04(参见图1b)相比，丙醛(NO+)作为结直肠癌的单一呼吸生物标志物表现良好。在CRCa与阴性对照的区分中，基于28ppbv的阈值将丙醛用作单一呼吸生物标志物具有的灵敏度为96％并且特异性为76％。在28ppbv的阈值下丙醛也能够将CRCa与阳性对照患者区分开，其中灵敏度为90％并且特异性为66％。
为确保在CRCa中看到的升高的丙醛浓度不是各组之间不同的混杂因素的结果，执行了多变量线性回归分析，并且表明CRCa的存在是与丙醛水平升高显著相关的唯一因素。
研究(ii)–独立的诊断验证
共研究了79名患者，其中25名为CRCa患者并且54名为对照患者。在54名对照患者中，31名(57.4％)在内窥镜检查时具有正常的下胃肠道，12名(22％)具有息肉，7名(13％)具有憩室病并且4名(7％)具有炎症性肠病。对患者医学合并症、药物使用和主要症状的比较分析显示除结直肠癌组中70岁或以上并且贫血表现增加的患者的比例增加外，各组之间无显著差异。
当与对照组相比时，CRCa组中的丙醛显著升高(中值30对比19ppbv；P<0.01)。与ROC曲线下面积为0.79±0.06的对照患者相比时，丙醛(NO+)作为CRCa的单一呼吸生物标志物表现良好(图2)。同样，使用28ppbv的阈值时，这给予丙醛对CRCa的诊断灵敏度为83.3％并且特异性为84.7％。
研究(iii)–肿瘤复发临床验证
共研究了40名患者，其中19名为术后无复发迹象的患者并且21名为有复发迹象的患者。在有复发的患者中，5名患者具有了孤立的肝复发，并且16名患者仅具有腹膜复发或同时具有肝复发和腹膜复发。对患者医学合并症和药物使用的比较分析显示各组之间无显著差异。
与非复发组相比，具有CRCa复发的患者中丙醛浓度显著升高(中值38对照19ppbv；P<0.01)。将丙醛(NO+)用作单一呼吸生物标志物以识别ROC曲线下面积为0.81±0.07的术后CRCa复发患者(图3)。使用为28ppbv的阈值时，这给出在确定术后复发患者时丙醛的灵敏度为71.4％并且特异性为90.9％。图4示出了在四种疾病状态下丙醛浓度的变化。
在所有三项研究中，所有被邀请参加研究的患者均接受邀请并参加了研究，从而给出患者的可接受率为100％。
讨论
该研究的结果表明，丙醛具有成为用于CRCa诊断的单一呼吸生物标志物的潜力。丙醛表现出以良好的诊断准确性区分CRCa患者与具有其他结直肠疾病的患者和具有内镜下正常的下胃肠道的受试者。这些发现已在独立诊断研究和结直肠癌复发患者中得到了验证。如多变量分析所示，患者的因素不影响丙醛浓度的升高。丙醛不是先前生成和验证的食管-胃癌VOC呼吸模型的组分[9]，表明上胃肠道和下胃肠道的癌症具有不同的不重叠呼吸特征，这可允许在未来的临床实践中进行癌症特异性分析。
Altomare等人使用GC-MS进行的先前研究从呼出气中鉴定出了在CRCa患者与对照患者之间显著不同的15种VOC[10]。在这些VOC中，壬醛和癸醛是唯一检测到的醛。Altomare等人确实尝试在前瞻性患者队列中验证他们的发现，然而在78位患者中开发的初始模型仅在25名患者中得到了验证。Altomare等人采用的方法使用在GC-MS上对醛的非衍生化分析，这允许测量长链醛(例如壬醛和癸醛)，但不能测量较短的醛(例如丙醛)，因为较短的醛挥发性更高因此会丢失。这可能是影响我们的调查与Altomare研究之间观察到的结果差异的主要因素[10]。此外，Amal等人进行的类似地使用GC-MS的最近研究，并未在呼出气中鉴定出在CRCa组与对照组之间不同的醛[21]。不同的质谱技术可解释研究之间的差异。短链和长链醛的组合作为CRCa诊断模型的基础需要进一步调查。
丙醛(CH3CH2CHO)是饱和的3碳醛，并且是丙酮的结构异构体。使用气相色谱质谱法进行的跨平台验证确认了丙醛的身份。丙醛浓度升高的最合理解释是结直肠癌中醛代谢的紊乱[22]。具体地，醛脱氢酶-1表达已被证明在结直肠癌中是被异常调节的，并且独立地影响长期存活以及对新辅助化疗的反应[23,24]。导致丙醛升高的另一个影响因素是肠道菌群变化以及微生物群与癌症发展中的适应性免疫应答之间的复杂相互作用[25,26]。
作为用于开发结直肠癌呼吸测试的初步调查，这些研究的优势包括：(i)发现了单一挥发性生物标志物，(ii)使用不需要样品制备的定量质谱技术设置用于诊断的测试阈值；(iii)在患有CRCa或具有切除后肿瘤复发的患者的两个前瞻性队列中进行独立验证，并且(iv)所有患者均具有下胃肠道内镜检查作为用于比较的规范标准。使用为28ppbv的阈值时，可以将癌症组与对照组区别开来，其中诊断准确度在79％到90％的范围内，并且与目前临床实践中的粪便潜血和粪便免疫化学测试可比[3-6]。先前的呼吸研究在很大程度上依赖于几种VOC的变化组合来生成风险预测模型[9,10,21]。只有很少的研究证明了单一VOC生物标志物与疾病状态的关联；氰化氢与铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)感染的关联，以及戊烷与炎性肠病的关联[27,28]。在另一方面，发明人的调查在临床和分析方面都具有单一中心研究的局限性。当前正在计划进行较大型的多中心研究，以促进提供测试准确度的明确答案。呼吸测试的性能需要在CRCa的早期阶段进行调查。尽管发明人已经显示出实验测量结果在短时间段内的可再现性[20]，但是在进行对任何提议的呼吸测试的临床应用之前，应仔细检查在长时间内使用不同实验室中的质谱仪器或使用在中央实验室中的相同仪器对结果的可重现性。此外，丙醛产生和醛调节异常的机理仍然是未来工作的重要领域，所述机理可以改进对混杂因素的理解并改善对施用测试的控制措施。
本文所述的发现和验证实验是在具有结直肠癌、良性疾病或内窥镜正常结肠的有症状结直肠患者中进行的。在计划明确的诊断准确性研究时，重要的是研究建议的结直肠癌呼出气测试的位置。发明人设想将此类测试用作分类调查以指导患者进行内窥镜检查。如果该测试具有可接受的灵敏度和特异性以及患者可接受性，则可证明成本效益并改善患有结直肠症状的患者的诊断途径；这种影响需要进行几项研究来进行调查，但在早期阶段就需要勾勒出重要的愿景。
结论
该研究表明单一呼吸生物标志物(丙醛)与CRCa的主要存在和复发有关。需要进一步的多中心验证研究来验证这些发现。
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Claims (26)

1.一种用于制备诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法中使用的试剂盒的用途，所述方法包括：分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患胰腺癌的个体中所述标志化合物的浓度的参照进行比较，其中与所述参照相比(i)在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度降低，表明所述受试者患有胰腺癌，或有患胰腺癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
2.一种用于制备确定用治疗剂或专门饮食治疗患有胰腺癌的受试者的功效的方法中使用的试剂盒的用途，所述方法包括：分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患胰腺癌的个体中所述标志化合物的浓度的参照进行比较，其中(i)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度降低，或者(ii)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度升高，表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是有效的，或者其中(i)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度升高，或者(ii)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度降低，表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是无效的。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述标志化合物为C1醛。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述标志化合物为C1醇或C3醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃时，被＝O基团取代的所述碳原子不是末端碳原子。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃时，所述化合物为第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C3-C6烷烃或C4烷烃。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C1-C20烷烃时，所述化合物为C3-C15烷烃或C5-C14醇。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C1-C20烷烃时，所述化合物为C5醇、C6醇或C14醇。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C4-C10醇时，所述化合物为C4-C7醇或C4醇。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C1-C6羧酸时，所述化合物为C2-C4羧酸或C3羧酸。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C4-C20醛时，所述化合物为C5-C15醛或C7-C13醛。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中当所述标志化合物为C4-C20醛时，所述化合物为C8醛、或C9醛、或C10醛、或C11醛。
13.一种用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的设备，所述设备包括：-
(i)用于确定来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(ii)来自未患胰腺癌的个体的样品中所述标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：与所述参照相比(i)在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度升高，或者(ii)在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度降低，从而表明所述受试者患有胰腺癌，或有患胰腺癌的倾向，或对受试者的病症提供了负性预后。
14.一种用于确定用治疗剂或专门饮食治疗患有胰腺癌的受试者的功效的设备，所述设备包括：-
(a)用于确定来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(b)来自未患胰腺癌的个体的样品中所述标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：
(i)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度降低，或者与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度升高，从而表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是有效的；或者
(ii)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇和第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃的所述标志化合物的浓度升高，或者与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C1-C20烷烃、C4-C10醇、C1-C6羧酸和C4-C20醛的所述标志化合物的浓度降低，从而表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是无效的。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的设备，其中所述标志化合物按照权利要求3-12中任一项定义。
16.选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇、第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃；C1-C20烷烃，C4-C10醇，C1-C6羧酸和C4-C20醛的标志化合物作为用于诊断患有胰腺癌或有患胰腺癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的生物标志物的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述标志化合物按照权利要求3-12中任一项定义。
18.用于测量选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇、第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃；C1-C20烷烃，C4-C10醇，C1-C6羧酸和C4-C20醛的标志化合物的浓度的试剂在制备诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向受试者或用于提供受试者的病症的预后的方法中使用的试剂盒的用途，所述方法包括：分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患结直肠癌的个体中所述标志化合物的浓度的参照进行比较，其中与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度增加表明所述受试者患有结直肠癌，或有患结直肠癌的倾向，或对所述受试者的病症提供负性预后。
19.用于测量选自C1醛、C3醛、C1醇、C2醇、第一碳原子被＝O基团取代并且第二碳原子被-OH基团取代的C2-C10烷烃；C1-C20烷烃，C4-C10醇，C1-C6羧酸和C4-C20醛的标志化合物的浓度的试剂在制备确定用治疗剂或专门饮食治疗患有结直肠癌的受试者的功效的方法中使用的试剂盒的用途，所述方法包括：分析来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度，以及将该浓度与未患结直肠癌的个体中所述标志化合物的浓度的参照进行比较，其中(i)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度降低表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是有效的，或者其中(ii)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度升高表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是无效的。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的用途，其中所述标志化合物为C2醛。
21.根据权利要求18或权利要求19所述的用途，其中所述标志化合物为C3醛。
22.一种用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的设备，所述设备包括：-
(i)用于确定来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(ii)来自未患结直肠癌的个体的样品中所述标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度增加，从而表明所述受试者患有结直肠癌，或有患结直肠癌的倾向，或对受试者的病症提供负性预后。
23.一种用于确定用治疗剂或专门饮食治疗患有结直肠癌的受试者的功效的设备，所述设备包括：-
(a)用于确定来自测试受试者的身体样品中的标志化合物的浓度的装置；以及
(b)来自未患结直肠癌的个体的样品中所述标志化合物的浓度的参照，
其中所述设备用于鉴定：
(i)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度降低，从而表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是有效的；或者
(ii)与所述参照相比在来自所述测试受试者的所述身体样品中选自C2或C3醛的所述标志化合物的浓度升高，从而表明使用所述治疗剂或所述专门饮食的治疗方案是无效的。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的设备，其中所述标志化合物按照权利要求20或权利要求21定义。
25.选自C2或C3醛的标志化合物作为用于诊断患有结直肠癌或有患结直肠癌的倾向的受试者或用于提供受试者的病症的预后的生物标志物的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述标志化合物按照权利要求20或权利要求21定义。
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