CN111601667B - 用于声介导的胞内递送的方法和装置 - Google Patents

Abstract

胞内递送装置(1)，其包含：压电基底(3)，其具有工作表面(8)；至少一个叉指换能器(5)，其位于所述工作表面(8)上并与之接触；以及容器(11)，其位于所述工作表面上以用于在其中容纳待靶向用于胞内递送的细胞，其中施加至所述叉指换能器的交流信号产生通过所述压电基底的声波能，所述声波能可被转移到所容纳的细胞。

Description

用于声介导的胞内递送的方法和装置

技术领域

本发明涉及出于研究和治疗目的的胞内递送的方法和装置。

背景技术

将治疗剂和成像剂，例如核酸、肽、蛋白质、纳米/分子探针和纳米粒等插入细胞内在目前正在开发的用于诊断和治疗多种疾病的许多下一代策略(基因/细胞治疗、基因编辑、干细胞重编程或多种治疗诊断方法，作为一些实例)中代表一个关键步骤。然而，这些外源物质的内化受到构成细胞膜的脂双层的疏水性和非极性性质所施加的屏障的严重限制。因此，已投入非常大的努力来研究物理的(膜破坏介导的)或生物化学的(载体介导的)方法的使用以促进更容易地通过脂双层进行胞内运输。

物理膜破坏介导的方法的一些实例包括电穿孔、声穿孔和显微注射，其中利用物理力，特别地通过形成孔来破坏细胞膜的结构。虽然这允许将广泛范围的亚微颗粒物质递送到细胞内，但这些方法中大部分具有的缺点在于穿孔过程期间对细胞造成的损伤。例如，需要在穿过细胞膜时施加高电位的电穿孔通常导致对细胞膜的不可逆损伤，从而导致细胞内稳态的丧失，并最终导致凋亡。在另一方面中，声穿孔主要利用由细胞膜附近的声波诱导的微泡的空穴化(cavitation)来增强其透化作用。鉴于已发现由单独的单一振荡微泡引起的机械应力足以对细胞壁造成深远的膜损伤，因此，很可能发生相当的细胞死亡，由于作为空穴化事件期间产生的强烈冲击波和伴随的微射流(microjet)的结果，使细胞经受了巨大应激。另外，显示细胞遭受了空穴化后DNA损伤，这是由于活性氧类(reactive oxygenspecies，ROS)的产生，其产生是在空穴化期间自由基形成的结果。已记载在暴露于超声辐射之后，细胞的再接种生存力和集落形成能力很差。

在另一方面中，涉及使用病毒载体或非病毒载体(例如肽、囊泡或纳米粒)通过多种内吞途径增强细胞摄取的生物化学载体介导的方法没有对细胞加予这样的有害负担。然而，其通常导致内体区室内的高局部浓度的纳米粒货物，所述内体区室最终与溶酶体融合。除非其具有逃脱该内体再循环途径的罕见(＜1％)能力，以使得其能够进入其中存在胞内途径以将纳米粒运输至细胞核的胞质中，否则大多数治疗性货物在溶酶体中终结，溶酶体的高度酸性和富含酶的环境导致货物降解。因此，通常需要这样的策略：允许内体和溶酶体逃逸，或者更好地通过进入到胞质溶胶内的直接途径而规避这些细胞器以增强治疗性货物的核摄取，引起转染效率提高。

当使用声穿孔时，哺乳动物细胞的最佳转染已在1至3MHz内通过超声(其被称为“体声波”(bulk acoustic wave，BAW))实现。然而，如上所示，使用微泡的声空穴化来改变细胞质膜的通透性可损伤细胞，导致细胞死亡。使用超过150MHz的甚高频(very highfrequency，VHF)的BAW的一种替代方法提出可在不使用微泡的情况下将基因和蛋白质递送到胞质内。参见‘Sangpil Yoon et al，‘Direct and sustained intracellular deliveryof exogenous molecules using acoustic-transfection with high frequencyultrasound’，Scientific Reports 6，文章编号：20477(2016)doi二10.1038/srep20477’，和‘Sangpil Yoon et al，‘Acoustic-transfection for genomic manipulation ofsingle-cells using high frequency ultrasound’，Scientific Reports 7，文章编号：5275(2017)doi二10.1038/s41598-017-05722-1’。该方法要求使用超声换能器探头将VHFBAW聚焦到直径为10μm或更小的单一细胞上。虽然该技术可潜在地导致细胞生存力提高，但其确实具有许多实际的缺点。因为使用了超过150MHz的高得多的频率，所以需要使探头更靠近单独细胞。这是因为随着频率的提高，声波在流体中随距离衰减更快；衰减长度随频率提高呈指数降低。因此，这要求熟练的操作员使用显微镜来原位定位靶细胞并移动探头靠近该细胞，精度为数十微米。需要控制距细胞的距离以确保细胞受到来自探头的声辐射的影响，同时不能太靠近以防止细胞损伤。此外，我们注意到，由于高频引起的声波衰减的急剧梯度通常产生可不利影响细胞的局部化增温效应(heating effect)，其中一些细胞对热休克易感。另外，由于声束的限制，细胞需要被逐个地靶向，使得对于大细胞数目而言非常耗时，并且因此在商业规模上使用是不切实际的。

以上对背景技术的讨论被包括在内以解释本发明的上下文。在说明书的权利要求书中任一项的优先权日，不应认为背景技术是已知的或是公知常识的一部分。

发明概述

因此，提供这样的简单的方法和装置将是有利的：其允许一次地将治疗性分子和纳米粒有效地胞内递送至大数目的细胞，同时维持高水平的细胞生存力。

出于这种考虑，根据本发明的一个方面，提供了胞内递送装置，其包含：压电基底(piezoelectric substrate)，其具有工作表面；至少一个叉指换能器(interdigitatedtransducer)，其位于工作表面上并与之接触；以及容器(receptacle)，其位于工作表面上以用于在其中容纳待靶向用于胞内递送的细胞，其中施加到叉指换能器的交流信号产生通过压电基底的声波能，该声波能可转移到所容纳的细胞。

在另一个方面中，本发明提供了胞内递送装置，其包含：压电基底，其具有工作表面；至少一个叉指换能器，其位于工作表面上并与之接触；以及容器，其位于工作表面上以用于容纳细胞培养基；

所述细胞培养基包含多个细胞，所述多个细胞待靶向用于胞内递送；以及

治疗性分子或纳米粒，其待通过胞内递送转移到细胞内；

其中施加到叉指换能器的交流信号产生通过压电基底的声波能，该声波能可转移到多个细胞。

声波能优选地作为表面声波(surface acoustic wave，SAW)沿工作表面传播。声波能还优选地作为表面反射体波(surface reflected bulk wave，SRBW)在压电基底内传播，并且在压电基底的工作表面与邻近表面之间进行内反射。当工作表面上的SAW在压电基底的工作表面与邻近表面之间内反射时，可产生SRBW。因此，将以与SAW相同的频率产生SRBW。因此，当存在于基底内时，在本申请中对SAW施加的提及也可涵盖SRBW的施加。关于SRBW的另一些信息可见于国际公布No.WO 2016/179664(RMIT大学)。

至少一个叉指换能器可适于传播频率大于10MHz，并且优选地频率为约30MHz的表面声波。

容器可具有声耦合至工作表面的基壁(base wall)。可在工作表面与容器基壁之间提供耦合介质，以促进其间的声耦合。耦合介质可以是硅油层。还设想了在其中容器不具有基壁，并且细胞培养基直接接触工作表面的情况下，工作表面直接耦合至细胞培养基。

优选地，容器包含多个孔以用于在其中容纳细胞培养基。压电基底优选地由铌酸锂(LiNbO₃)形成，尽管也设想了使用替代压电材料。

根据本发明的另一个方面，提供了胞内递送方法，其包括将包含待靶向用于胞内递送的多个细胞以及用于其中所述胞内递送的治疗性分子和/或纳米粒的细胞培养基暴露于声波能，所述声波能包括表面声波。

在另一个方面中，本发明提供了胞内递送方法，其包括将细胞培养基暴露于声波能，所述声波能包括表面声波，

所述细胞培养基包含多个细胞；以及

治疗性分子和/或纳米粒；

其中将治疗性分子和/或纳米粒通过胞内递送转移到经暴露的细胞内。

声波能优选地还包括表面反射体波。

该方法可包括将细胞培养基暴露于由频率大于10MHz的表面声波产生的声能。更具体地，该方法可包括将细胞培养基暴露于由频率为约30MHz的表面声波产生的声能。

可将细胞培养基暴露至少30秒。更具体地，可将细胞培养基暴露5分钟。或者，可将细胞培养基暴露10分钟。

本发明显示，将细胞暴露于短持续时间的高频(优选＞10MHz)声波激发在细胞膜的脂质结构上诱导声辐射并且在其中可能诱导共振模式以促进瞬时和快速自愈纳米孔的产生，所述纳米孔不仅能够使例如特别难以向细胞内递送的金纳米粒的内化在仅几分钟内非线性地增强四倍至五倍同时保持高水平的细胞生存力(＞97％)，而且鉴于纳米粒均匀地分布在整个胞质溶胶中也避免了对内体策略的需要。siRNA在细胞中的内化也通过施加上述波进行探索。与其中不存在声波的对照实验相比，当将细胞暴露于声波激发时，siRNA的内化是对照实验的2倍。如所预期的，siRNA也存在于整个胞质溶胶中，而不是存在于细胞的内体和溶酶体区室中。此外，还检查了分别对应于约3.3nm、6nm和10nm的斯托克斯半径(stokes radius)的三种不同分子量的荧光标记的(FITC)葡聚糖(dextran)分子，当将其暴露于声波时，与对照相比观察到其中最低分子量的葡聚糖(20kDa)的内化提高了2倍，并且70kDa和250kDa的葡聚糖分别提高了1倍和0.5倍。

附图简述

参照附图进一步描述本发明将是方便的，这些附图举例说明了根据本发明的声介导的胞内递送装置和方法的一个优选实施方案。本发明的另一些实施方案是可能的，并且因此，附图的特殊性不应被理解为代替本发明在先描述的一般性。

在附图中：

图1a是根据本发明的声介导的胞内转移装置的示意图；

图1b是示出了使用电感耦合质谱法(inductively-coupled mass spectrometry，ICP-MS)对内部的细胞纳米粒浓度进行定量测量的图；

图1c是示出了当暴露于SAW 5分钟时使用流式细胞术(flow cytometry，FACS)对内部的细胞纳米粒浓度进行定量测量的图；

图1d是示出了使用流式细胞术(FACS)对内部的细胞纳米粒浓度进行定量测量的图，其显示了暴露时间的影响；

图2是示出了在MTT测定中细胞生存力的图；

图3是细胞的细胞骨架、肌动蛋白网络和细胞核的共焦显微术图像；

图4是示出了使用JC-1染料时SAW随时间推移对线粒体膜电位的作用的图像；

图5是示出了在实验开始时(T0)和SAW暴露10分钟(T10)之后与未施加声波激发的对照相比，进入到细胞内的钙通量的Fura-2AM-钙通量测定图；

图6a至6f是透射电子显微术(transmission electron microscopy，TEM)图像，其中6a至6c是对照样品，而6d至6f是经声波能暴露的样品，显示了当通过声波能辐射介导内化的纳米粒摄取时，所述纳米粒均匀分布在整个胞质溶胶中；

图7是示出了在对照和经声波能暴露的细胞内溶酶体和线粒体的共焦图像；

图8示出了在存在SAW持续5分钟的情况下，不同的化学品以及环境抑制剂对受体介导的内吞途径的作用；

图9分别示出了不存在声激发的情况下的对照实验以及暴露于声波能辐射的细胞的扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM)图像；

图10a至10d是示出了来自碘化丙啶(propidium iodide，PI)摄取实验的结果的图；

图11示出了显示在对细胞进行声激发后脂质结构的组织结构变化的傅立叶变换红外(Fourier Transform Infrared，FTIR)光谱；

图12示出了在HeLa细胞中SAW介导的荧光(Cy3)标记的GAPDH siRNA转染的效率；

图13a至13d示出了对照(图13a)、裸siRNA(图13b)、lipofectamine与siRNA的组合(图13c)，以及lipofectamine、siRNA与SAW的组合(图13d)的转染效率的流式细胞术图；

图14示出了使用SAW递送的不同葡聚糖分子的递送效率；以及

图15a至15c示出了使用流式细胞术，分子量为20kDa(图15a)、70kDa(图15b)和250kDa(图15c)的FITC标记的葡聚糖的胞内递送提高。

图16示出了使用流式细胞术，来自荧光强度测量的CCR5基因的敲除百分比。具体地，图16表明了在假对照、缠绕的RNP(scrambled RNP)(非靶向阴性对照)、RNP+SAW(sgRNA、Cas9和SAW)、RNP+Lipo(sgRNA、Cas9和LipofectamineCRISPRmax)、RNP+Lipo+SAW(sgRNA、Cas9、LipofectamineCRISPRmax和SAW)中CCR5基因的敲除百分比。

发明详述

本发明提供了用于增强治疗性分子和纳米粒(作为治疗剂和诊断剂的纳米载体)的胞内递送同时维持高水平的细胞生存力的新方法。在本发明的上下文中，术语“胞内递送”及其变化形式是指化学或生物分子(例如治疗性分子和纳米粒)穿过细胞膜进入到细胞内的运输。在本发明的情况下，这通过将细胞暴露于表面声波(SAW)-高频(＞10MHz)机电瑞利波(Rayleigh wave)，并且优选地还暴露于表面反射体波(SRBW)来实现。SAW和SRBW，与其用于声穿孔的低频(＜1MHz)体声波(BAW)对应物不同，不会导致空穴化或过度剪切变性。重要地，与用于增强胞内递送的生物化学(载体介导的)方法(例如，使用病毒载体或非病毒载体(例如质粒DNA、磷酸钙或阳离子聚合物))或者甚至一些其中内吞构成主要的内化机制的物理(膜破坏)方法(例如，声穿孔、电穿孔、基因枪、显微注射等)不同，在根据本发明的方法中观察到，大多数所递送的治疗性分子或纳米粒均匀地分布在整个胞质溶胶中，而不是积聚在内体和溶酶体区室中。这是重要的，因为一旦所述分子/纳米粒被捕获在内体(其最终与溶酶体融合)内，则以下是罕见的(＜1％)：其从内体再循环途径中逃脱，以使得其能够进入其中存在胞内途径以将纳米粒运输至细胞核的胞质中。因此，大多数治疗性货物在溶酶体中终结，溶酶体的高度酸性和富含酶的环境导致其降解。通过将治疗性分子(siRNA)、模型分子(例如不同分子量的葡聚糖)或纳米粒(柠檬酸盐加帽的金纳米粒)直接分布在整个胞质溶胶中，根据本发明的方法由此促进了特异性地规避这些细胞器的直接途径，从而使细胞核中治疗性货物的摄取增强。这继而在不需要采取复杂的策略来影响内体/溶酶体逃脱的情况下，引起转染效率的提高。因此，根据本发明的方法构成了这样的离体技术，其允许在具有瞬时控制的可能性的情况下将所期望的治疗剂快速且瞬时地递送至从实验室中的患者血液或组织中分离的再工程化的靶细胞，所述靶细胞然后被输注回同一患者体内。

根据本发明的声波能装置1如图1a中所举例说明的进行设置。装置1包含压电基底3(在该情况下为铌酸锂(LiNbO3))，在压电基底之上的叉指换能器(interdigitatedtransducer，IDT)5的电极6在压电基底工作表面8上进行光刻图案化。电极6的IDT指状物(finger)7的宽度和间隙确定波长，并因此确定其共振频率。在本情况下，使用对应于30MHz频率的132μm波长，尽管原则上可使用10MHz及以上的任何SAW频率。以该共振频率借助于信号发生器和放大器(未示出)向IDT电极6施加交流电信号，然后发射表面声波(SAW)9，该表面声波9作为瑞利波沿基底3的工作表面8传播，在基底3的工作表面8上放置IDT电极6。

除SAW 9之外，表面反射体波(SRBW)也可在基底3内在基底3的工作表面8与邻近的相对表面15之间内部传播。SRBW在工作表面8与相对表面15之间进行内反射，并且优选地还为装置1提供声波能。SRBW的传播可通过配置基底3以使得其厚度约等于SAW波长来增强。对SRBW的进一步描述可见于国际公布No.WO2016/179664(RMIT大学)。

装置1还包含呈孔板形式的容器11，其优选地(尽管不必限于)具有由玻璃或另一些声传输材料(例如丙烯酸)制成的基底12和侧壁13，所述容器被置于基底表面8上，并且具有多个孔以用于在其中容纳细胞培养基15。可使用一些替代容器，例如培养皿、transwell培养板、微阵列板、细胞长颈瓶(cell flack)和由玻璃或其他材料制成的用于细胞培养的其他标准实验室物品。还设想了使用这样的容器，其仅具有侧壁而没有基壁，以使得细胞可与工作表面8直接接触(即，直接耦合至工作表面8)。细胞培养基15包含多个细胞17以及治疗性分子/纳米粒，所述治疗性分子/纳米粒将在胞内递送至细胞17中的期间进行转移。孔板11的位置将SAW9以及优选SRBW的声波能耦合至所容纳的细胞17。置于工作表面8与孔板11的基壁12之间的薄硅油层(或另外的流体耦合剂，包括水、甘油或另一些声传输材料，包括凝胶和磁带(tape))有助于将声波能耦合至孔中并使声阻抗失配最小化。然后将细胞17(作为模型，使用人胚胎肾细胞(HEK 293-T和HeLa))及其组成培养基(向其中添加了治疗性分子/纳米粒)暴露于声辐射持续特定期间(数分钟)，在此之后可评价细胞17内分子/纳米粒的摄取。在该情况下，将10nm金纳米粒、不同分子量的葡聚糖(20kDa、70kDa和250kDa分子)或短干扰核糖核酸(siRNA)用作所述分子/纳米粒。

从图1b中使用电感耦合质谱法(ICP-MS)对内部的细胞纳米粒浓度的定量测量中观察到，与其中在不存在外强迫(external forcing)的情况下被动发生纳米粒内化的情况相比，细胞纳米粒摄取水平显著增强。这通过流式细胞术(FACS)确定，其中在图1c中可见由于细胞密度的差异，随着摄取提高，侧向散射也提高。观察到纳米粒的浓度随着暴露时间而提高(图1b、d)，在仅30秒之后摄取增强了几乎两倍，在10分钟内增强了几乎四倍。对于被动摄取(尽管在存在纳米粒的情况下孵育细胞超过4小时)，这种相对于纳米粒摄取的缓慢且逐渐的线性变化的非线性偏离突出了将细胞暴露于声波能的重要性，并且强烈表明了这样的独特机制，其中与如果使纳米粒被细胞被动获取相比，声波能诱导不同的内化途径。

无论暴露持续时间长短，出人意料地很少观察到对细胞生存力的有害影响，如从图2中MTT测定的结果中所见。该图示出了5分钟的暴露持续时间，其中在暴露于声辐射之后0、4和24小时三个时间点处获得结果。观察到超过97％的细胞在处理后仍保持存活，这显著高于大多数其他膜破坏介导的递送方法，特别是声穿孔。相比之下，常规的BAW激发的激发频率通常在Hz至kHz范围内，并且从不超过5MHz，用于本发明的更高频率显著降低了所使用的功率(相比之下降低约一至两个数量级)。这不仅显著减少了增温(即使在声波能暴露10分钟之后，观察到温度提高也未超过约37至39℃)，而且完全抑制了对细胞膜施加显著应力直至达到形成孔的程度的任何空穴化事件。此外，在这样的高频下，与分子弛豫时间尺度相比，施加的电场以及因此的声场反转得太迅速，以使得大分子(例如肽和蛋白质)几乎从不被声波能降解，即使以与此处使用的功率相比显著更大的功率也是如此。通过仔细检查细胞的细胞骨架、肌动蛋白网络和细胞核的共焦显微术图像以及来自锥虫蓝(trypan blue)测定的结果，可进一步确定暴露后的细胞生存力，其表明高(≥90％)保留的接种后效率(图3)。这通过测量线粒体膜电位(mitochondrialmembrane potential，MMP)和跨细胞膜的钙通量水平来补充，这在应激诱导的凋亡中发挥重要作用。在前者中，在未暴露于声波能(对照)和暴露于声波能二者(图4)的细胞中提供了对细胞结构异常的指示的去极化MMP与超极化MMP之间的可忽略不计的差异表明声波能对线粒体膜电位具有可忽略不计的影响。在后者中，图5中Fura-2AM测定的结果表明，在暴露于声辐射后，进入到细胞内的钙通量立即提高。然而，在声波能激发的弛豫之后10分钟，钙通量恢复至基线值，表明细胞膜快速再封闭，并因此细胞在其被高频声强迫破坏之后进行恢复。因此，这解释了为什么维持了高的暴露后细胞生存力。现在将描述促进该快速再封闭和愈合的潜在纳米粒内化机制。

除细胞纳米粒摄取水平增强之外，还观察到当通过声波能辐射介导内化的纳米粒摄取时，所述纳米粒均匀分布在整个胞质溶胶中，如图6中通过透射电子显微术(TEM)图像所观察到的。图6a至6c示出了其中未施加声波能辐射并且因此使纳米粒集聚的对照样品。相比之下，图6d至6f非常清楚地示出了当通过声波能辐射介导纳米粒摄取时，所述纳米粒均匀地分布在胞质溶胶中。此外，针对线粒体和溶酶体染色的图7中的共焦图像清楚地示出了纳米粒不仅仅在细胞器内内化，而且分布在整个胞质溶胶中。这与不存在声波能辐射的情况下的对照实验完全相反，在该对照实验中，观察到纳米粒位于特定的细胞器(例如内体和溶酶体)内；这从纳米粒与经染色的细胞器之间的叠加观察到。这些观察不仅在其避免在内体内定位并因此在溶酶体区室内定位(这导致货物的显著降解)含义方面有重要意义。而且对于不遵循内吞途径的纳米粒的内化，还阐明了存在的替代机制。这通过使用化学抑制剂(例如氯丙嗪、甲基-β-环糊精和叠氮化钠(NaN₃))以及环境抑制剂，通过在4℃下进行实验以阻断受体介导的途径来确定。引入化学抑制剂和环境抑制剂以排除内吞参与纳米粒内化的可能性。在所有这些情况下，均未观察到在声波能激发下纳米粒内化的可辨别下降(图8)。

鉴于内吞在声介导的纳米粒摄取中发挥很少的作用或无作用，因此注意力转向在声强迫下膜破坏的可能性。然而，与声穿孔不同，未观察到如图9中扫描电子显微术(SEM)图像中所观察到的任何显著的孔形成的形成。相反，多个亚微压痕(submicron indentation)的存在是明显的，尽管仅在声波能暴露期间在4％甲醛下固定细胞以“冻结”其存在时；在不存在固定剂的情况下，即使在使声激发弛豫时立即对细胞成像时，也未观察到这些压痕(其被称为纳米孔，以使其与大的物理(大)孔(通常为1至2μm)区分开)。这些纳米孔的瞬时性质由来自图10中所示碘化丙啶(PI)摄取实验的结果证实，其中可见与对照样品的PI摄取(图10a)相比，在存在声激发的情况下，进入到细胞内的PI摄取提高了几乎50％(图10b)，表明通过这些瞬时纳米孔的扩散通量很大。然而，当以在不使用任何PI的情况下施加SAW，随后紧接着声波移除之后(T₀)添加PI来重复这些实验时，在细胞中内化的PI量快速降低至约20％(图10c)，表明纳米孔快速闭合。移除声波激发之后十分钟(T₁₀)添加PI，导致细胞中PI进一步降低至几乎12％(图10d)。因此，这些微孔的极短瞬时性质还确保了与穿孔期间形成的孔的显著区别。这是因为后者(大)孔通常在数分钟内恢复，如果有的话。这在图2中针对细胞生存力的MTT测定的结果中明显也不存在，其中可见在停止声波能激发后除立即使微孔封闭之外，随着时间的推移(超过数分钟)，没有发生进一步的细胞恢复。

鉴于在所使用的声波能激发频率和功率下不存在驱动孔形成所需的空穴化事件，更不必说甚至当继而发生雾化时在更高的功率下，(大)孔的这种不存在可能不足为奇。相反，本发明人假设低振幅但高频声波激发足以破坏组成细胞膜的脂质结构，以充分诱导脂质分子之间的瞬时间隙，所述间隙足够大以促进纳米粒通过其进行扩散移位，但显著地小于由常规电穿孔或声穿孔方法所形成的物理孔。

这并非没有先例，鉴于已经观察到即使在亚kHz(sub-kHz)的频率下使细胞机械振荡也会破坏细胞膜以提高其通透性，并且更相关地，已显示与本工作中所使用的频率相当频率的SAW诱导脂质结构的结构改变，这涉及脂质的头基团(headgroup)从平衡向倾斜的变化。图11中所示的傅立叶变换红外(FTIR)光谱确实表明在对细胞声激发后脂质结构的组织结构变化。

此外，本发明人已经表明了使用核酸进行细胞转染的声增强，其中，本发明人观察到在lipofectamine作为转染剂的情况下经Cy3标记的GAPDH siRNA的内化。其表明与使用相同转染参数的对照相比，在存在SAW的情况下进入到细胞内提高了两倍，如使用流式细胞术定量的(图12和图13a至13d)。

除增强细胞纳米粒摄取之外，通过使用不同分子量(20kDa、70kDa和250kDa)的模型荧光标记的葡聚糖分子，还表明了SAW介导的递送方法用于将其他分子递送至细胞。图14示出了与对照相比，在存在SAW的情况下葡聚糖分子的灌注率显著更高。本发明人注意到，如所预期的，在使用最低分子量(20kDa)的情况下，分子向细胞中的递送高于在更高分子量(250kDa)的情况下的那些(图14和图15a至c)。

SAW介导的递送方法还扩展至在悬浮细胞中CRISPR-Cas9基因编辑系统的递送(图16)。已显示一部分CCR5基因(5型趋化因子受体)的缺失针对HIV-1感染具有提高的抗性，并因此被选择作为显示SAW介导的核糖核蛋白(RNP)复合体的递送以敲除CCR5基因的模型。使用聚焦的IDT设计电极，将表达该基因的HUT-78细胞系(皮肤性人T细胞淋巴细胞)暴露于声辐射(30MHz)。使用由体外组装的Cas9蛋白和靶向CCR5基因座的指导RNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体进行转染。转染伴随有可商购获得的基于脂质的系统lipofectamineCRISPRmax的使用。在转染之后48小时借助于流式细胞术获得敲除效率。将样品与FITC标记的抗CCR5抗体一起孵育，以将荧光降低与细胞表面上的CCR5受体数相关联，并且因此解出敲除百分比。与对照样品的CCR5荧光相比，经声辐射的样品显示出CCR5荧光降低了～12％(图16)。对照样品包含RNP复合体和lipofectamine CRISPRmax，而经声辐射的样品除存在于对照样品中的所有组分之外还由SAW组成。使用的sgRNA序列是ATGTGGAAGTCACGCCCGTTGGG和GCAGTTGTGTGACACGGAAGCGG。

本发明人已经清楚且成功地证明了单独地驱使纳米粒、葡聚糖、核酸(包括siRNA和sgRNA)中的每一个以及其他生物分子或治疗性分子(包括蛋白质和脂质复合体，例如Cas9和Lipofectamine CRISPRmax)进入到如上所述的细胞内。然后可评价细胞内这些纳米粒和分子的摄取。

对本领域技术人员来说将被认为是显然的修改和变化形式包括在所附权利要求书所要求保护的本发明的范围内。

Claims (20)

1.胞内递送装置，其包含：压电基底，其具有工作表面；至少一个叉指换能器，其位于所述工作表面上并之接触；以及容器，其位于所述工作表面上以用于容纳细胞培养基；

所述细胞培养基包含多个细胞，所述多个细胞待靶向用于胞内递送；以及

治疗性分子或纳米粒，其待通过胞内递送转移到所述细胞内；

其中施加到所述叉指换能器的交流信号产生通过所述压电基底的声波能，所述声波能能够被转移到所述多个细胞；并且

其中所述胞内递送装置不包含配置为产生用于转移到所述容器的微泡的定位在所述工作表面上的区域。

2.根据权利要求1所述的胞内递送装置，其中所述声波能作为表面声波沿所述工作表面传播。

3.根据权利要求2所述的胞内递送装置，其中所述声波能还作为表面反射体波在所述压电基底内传播，并且在所述压电基底的所述工作表面与邻近表面之间进行内反射。

4.根据前述权利要求中任一项所述的胞内递送装置，其中所述至少一个叉指换能器适于传播频率大于10MHz的表面声波。

5.根据权利要求4所述的胞内递送装置，其中所述至少一个叉指换能器适于传播频率为约30MHz的表面声波。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的胞内递送装置，其中所述容器具有声耦合至所述工作表面的基壁。

7.根据权利要求6所述的胞内递送装置，其还包含在所述工作表面与所述容器基壁之间的耦合介质以促进所述工作表面与所述容器基壁之间的声耦合。

8.根据权利要求7所述的胞内递送装置，其中所述耦合介质是声流体、凝胶或磁带耦合剂。

9.根据权利要求8所述的胞内递送装置，其中所述耦合介质是薄硅油层。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的胞内递送装置，其中所述容器包含多个孔以用于在其中容纳所述细胞培养基。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的胞内递送装置，其中所述工作表面被配置为直接接触所述细胞培养基。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的胞内递送装置，其中所述压电基底由铌酸锂(LiNbO₃)形成。

13.胞内递送方法，其包括将细胞培养基暴露于声波能，所述声波能包括表面声波，

所述细胞培养基包含多个细胞；以及

治疗性分子和/或纳米粒，其不被微泡携带在液体中；

其中将所述治疗性分子和/或纳米粒通过胞内递送转移到所述经暴露的细胞内。

14.根据权利要求13所述的胞内递送方法，其中所述治疗性分子包括：核酸，例如DNA、siRNA、mRNA、微RNA和sgRNA；以及转染剂，例如Cas9和Lipofectamine CRISPRmax。

15.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其中所述声波能还包括表面反射体波。

16.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其包括将所述细胞培养基暴露于由频率大于10MHz的表面声波产生的声能。

17.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其包括将所述细胞培养基暴露于由频率为约30MHz的表面声波产生的声能。

18.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其包括将所述细胞培养基暴露至少30秒。

19.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其包括将所述细胞培养基暴露5分钟。

20.根据权利要求13或14所述的胞内递送方法，其包括将所述细胞培养基暴露10分钟。

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