CN111601609A - 与细胞毒性剂组合的细菌脂多糖的脂质体制剂及其在抗肿瘤疗法中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物组合产品，其包含：‑仅含有LPS的脂质体制剂；和‑至少一种细胞毒性化合物。本发明还涉及其在抗肿瘤疗法中的用途。

Description

与细胞毒性剂组合的细菌脂多糖的脂质体制剂及其在抗肿瘤 疗法中的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及肿瘤学领域，尤其涉及癌症治疗领域。更具体地，本发明涉及用于治疗肿瘤的药物组合物，所述组合物直接使用或作为另一种治疗化合物的佐剂组合物使用。本发明还涉及药物组合产品。

背景技术

癌症是以生物体内细胞不受控制的增殖为特征的疾病，这种增殖与影响其细胞DNA的遗传突变有关。由于暴露于诱变剂，这些突变以自发或诱导的方式出现，甚至以遗传方式传播。

多种来源的癌细胞，其具有过度的细胞增殖，引发“肿瘤”，即倾向于在原始组织中存留和生长并可能在其他组织中扩散的组织块。

在循环的，尤其是血液中的癌细胞的情况下，这些细胞的特征在于无序的、不受控制的生长和分裂能力。

目前，存在许多抗肿瘤疗法。可用的治疗包括但不限于手术切除肿瘤、化疗(施用用于破坏癌细胞的细胞毒性药物)、放射疗法(肿瘤辐照)、激素治疗、抗血管生成治疗和免疫疗法。

免疫疗法是一种治疗，其包括施用通常由免疫系统产生的生物物质，以增强和/或刺激生物体的免疫防御。实际上，已经观察到，在肿瘤发作时，受影响的生物体自身对该肿瘤产生免疫应答，如此，由免疫系统识别出肿瘤细胞。然而，这种免疫应答通常不足以消除所述肿瘤。因此，免疫疗法的目的是维持和/或替代这种不足的生物学应答。

免疫疗法中使用的生物学物质是例如抗体，特别是单克隆抗体、细胞因子、白介素、干扰素以及一般地任意免疫刺激化合物。

对于每种类型的肿瘤，临床医生都会根据先前验证的医疗方案和每个患者的具体情况来决定要采用的治疗。目前可用的治疗可以进一步改进，因为没有一种方法完全有效，也不适用于任何类型的患者。

在免疫疗法中，已经进行研究以增强治疗性抗体施用的有益效果。例如，专利申请WO 2013/129936描述了由封装在颗粒或囊泡材料中的抗体和免疫调节剂组成的组合的治疗用途。封装的免疫调节剂特别地是包裹在脂质体内的细胞因子，将其共同施用可刺激抗体的有益效果。

脂质体

脂质体是由同心的脂质双层形成的人工囊泡，在它们之间捕获分子。脂质体通常由单一类型或几种类型的磷脂组成。这些磷脂以热力学稳定的状态组织，从而聚集了极性头并能够形成双层。脂质体是纳米尺寸的结构。

脂质体可以保留几种类型的化合物，无论它们是水溶性的(封装在水相中)还是油溶性的或两亲性的(包裹在脂质双层中)。

在制药产业中将脂质体用作各种生物学目的的分子的载体已成为许多研究的目标，并且目前已经批准了这种类型的几种药物用于静脉内施用。

实际上，将活性物质封装在脂质体中能够保护所述物质。它还可以限制物质的毒性作用，并调节其释放速率。另外，脂质体允许水溶性物质通过细胞的疏水膜。

脂质体越来越多地作为药物载体用于疗法。它们的主要用途是靶向活性成分。

细菌脂多糖(LPS)

细菌脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要组分。LPS具有高度的免疫刺激能力：它在生物体内的存在会刺激整个免疫系统，特别是通过促炎性细胞因子的分泌，来对细菌性污染进行应答。由于这种强烈的免疫反应，以其可溶形式注射LPS对哺乳动物而言可能是有毒的，甚至在高剂量下也可能致命。在人体，LPS会诱发反应，例如体温过高，红血细胞聚集和败血性休克。

LPS分子包含三种实体：脂质A、细胞核和抗原O。呈现最大毒性的LPS部分的脂质A是高度保守的，细胞核的变异性非常低，而O抗原则对于LPS来源的细菌物种是特异的。

LPS的作用方式和信号途径是众所周知的。其靶细胞主要是巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和上皮细胞。一旦在生物体内释放，LPS就会与肝脏合成的LBP蛋白(LPS结合蛋白)结合，从而使其呈现并与单核细胞的膜受体CD14结合。LPS也因此以同型二聚体形式与膜共受体MD2和受体TLR 4相关联。这种膜复合物的形成诱导了MAP-激酶途径的活化和细胞中促炎性细胞因子的分泌。

在基础研究中，LPS可在体外和体内用于诱导与单核细胞或巨噬细胞型细胞强烈分泌促炎性细胞因子有关的炎症。

在治疗中，主要是在预防中，LPS或其实体“脂质A”用作疫苗佐剂，以刺激针对与所述LPS共同施用的抗原的免疫应答。

LPS的脂质体制剂

已经表明，将LPS封装在脂质体中在体外和体内均可将这些促炎作用最小化(Bakouche等人，1987；Dijkstra等人，1989)。

在抗肿瘤疗法中，LPS已被用作佐剂，以刺激针对特定抗原的免疫应答：Neidhart等人(Vaccine，2004)描述了一种针对结直肠癌患者的治疗方法，其包括施用由脂质体制剂组成的治疗性疫苗，该脂质体制剂包含重组KSA蛋白和单磷酰脂质A(LPS的活性组分)两者；用这种治疗性疫苗治疗的大多数患者对KSA蛋白都产生了特异性的免疫。

因此，已经在抗肿瘤疫苗组合物的制备范围内使用了LPS脂质体制剂，所述LPS因其佐剂性质而被使用。与抗原共同配制可以优化针对该抗原的特异性免疫应答。

然而，迄今为止，从未考虑将LPS作为脂质体制剂中的单一活性成分用于疗法。

另外，从未考虑仅含有LPS的脂质体制剂与至少一种细胞毒性化合物的结合，以及所述结合在治疗肿瘤中的用途。

发明内容

将LPS包封到脂质体中使得其毒性作用最小化，因此该脂质体制剂可用于疗法，特别是在通过全身性方式进行的抗肿瘤治疗的范围内的疗法。

本发明涉及药物组合产品，其包含：

-仅含有LPS的脂质体制剂；和

-至少一种细胞毒性化合物，例如治疗性抗体或化疗化合物。

本发明还涉及作为抗肿瘤疗法同时、分开或按顺序使用的所述治疗组合产品。

本发明还涉及用作抗肿瘤疗法的仅含有细菌脂多糖(LPS)的脂质体制剂。

更一般地，描述了用作药物的仅含有细菌脂多糖(LPS)的脂质体制剂。

附图说明

图1监测未治疗的(对照)或用未封装的LPS、利妥昔单抗、空脂质体、LPS脂质体制剂和利妥昔单抗+LPS脂质体制剂的组合治疗的淋巴瘤RL异种移植小鼠(CD20+人B淋巴瘤细胞参考ATCC CRL-2261)的肿瘤体积。

图2治疗的小鼠的脾脏的重量：对照小鼠(附图中的对照组)、用空脂质体治疗的小鼠(附图中的空的脂质体组)、用抗体利妥昔单抗治疗的小鼠(附图中的利妥昔单抗组)、用未封装的LPS治疗的小鼠(附图中的LPS组)、用LPS脂质体制剂治疗的小鼠(附图中的脂质体-LPS组)以及用抗体利妥昔单抗和LPS脂质体制剂的组合治疗的小鼠(附图中的利妥昔单抗+脂质体-LPS组)。

图3治疗的小鼠的脾脏中的NK细胞的数量：对照小鼠(附图中的对照组)、用抗体利妥昔单抗治疗的小鼠(附图中的利妥昔单抗组)，用未封装的LPS治疗的小鼠(附图中的LPS组)、用空脂质体治疗的小鼠(附图中的空的脂质体组)、用LPS脂质体制剂治疗的小鼠(附图中的脂质体-LPS组)以及用抗体利妥昔单抗和LPS脂质体制剂的组合治疗的小鼠(附图中的利妥昔单抗+脂质体-LPS组)。

图4监测用(i)利妥昔单抗、(ii)利妥昔单抗与LPS脂质体制剂的组合或(iii)利妥昔单抗与未封装的LPS组合治疗的RL淋巴瘤异种移植小鼠的肿瘤体积。

图5监测用LPS脂质体制剂治疗的(脂质体LPS，灰色曲线)或未治疗的(对照)MDA-MB-231癌细胞异种移植的scid小鼠的肿瘤体积。

图6体外培养的大鼠骨肉瘤细胞，其与以下物质孵育：

-用100ng/mL脂质体-LPS WO(LPS-Biosciences)刺激16小时的巨噬细胞，或

-5μM依托泊苷，或

-两者的组合。

对照细胞仅暴露于媒介物，其既不包含巨噬细胞也不包含依托泊苷。

癌细胞凋亡速率通过

Caspase-3/7化合物标记进行了监测。

具体实施方式

本发明基于对细菌脂多糖(LPS)的新的免疫刺激性质的鉴定。由于其毒性，这种免疫刺激化合物不能直接使用。在含有抗原和LPS的脂质体制剂的情况下，LPS已经在疫苗中被用作佐剂。

发明人已经强调了以下事实：不包含其他化合物特别是不包含抗原的LPS脂质体制剂可以用作药物，并且更特别地，该制剂在抗肿瘤治疗的范围内具有有益治疗效果。

根据第一方面，本发明涉及用作药物的、仅含有细菌脂多糖(LPS)的脂质体制剂。

根据第二方面，本发明涉及用作抗肿瘤疗法的、仅含有细菌脂多糖(LPS)的脂质体制剂。

换句话说，本发明涉及包含封装在脂质体中的细菌LPS的药物制剂，以用于疗法，特别是用作抗肿瘤疗法。

根据第三方面，本发明涉及药物组合产品，其包含：

-仅含有LPS的脂质体制剂；和

-至少一种细胞毒性化合物。

根据第四方面，本发明涉及用作抗肿瘤疗法的所述治疗组合产品。

定义

对于本发明的目的，“癌症”是指以在生物体中存在癌细胞为特征的病理学，其是由受该病理学影响的生物体的最初正常细胞转化形成的。具有这种癌细胞的活生物体被诊断为患有癌症。存在大约200种不同类型的癌症，这取决于被称为原发性肿瘤的第一肿瘤所发生的组织。

对于本发明的目的，“肿瘤”是指来自癌细胞过度细胞增殖的组织块，该组织块倾向于以非调节和自主的方式向生物体延续和生长。

本发明涉及所有类型的肿瘤，但更具体地涉及恶性肿瘤。恶性肿瘤通常快速生长，并在局部根除后有复发的趋势。恶性肿瘤局限性差，没有包膜，并且其周长不均匀。

本发明涉及原发性肿瘤和来自原发性肿瘤的转移性传播的继发性肿瘤的治疗。

肿瘤通常根据其原始组织进行分类：例如有皮肤、骨骼或血细胞肿瘤。

已经定义了两种主要的肿瘤类别：

·所谓的“实体”肿瘤是在诸如皮肤、粘膜、骨骼和器官等组织中发生的。这些是最常见的肿瘤：它们占人类癌症的90％。

在实体瘤中，存在来自上皮细胞(皮肤、粘膜、腺体)的癌；和来自结缔组织细胞的肉瘤。

·所谓的“液体”肿瘤来自血细胞，且不是正常的组织赘生物，而是以癌血细胞的存在为特征，所述癌血细胞具有无序的、不受控制的生长和分裂能力。

在液体肿瘤中，有白血病(血癌和骨髓癌)，其特征在于骨髓中白血细胞前体细胞的无序增殖；以及影响淋巴细胞的淋巴瘤(淋巴系统癌)。

根据本发明的特定方面，所治疗的肿瘤是液体肿瘤或实体瘤。

根据本发明的另一个特定方面，所治疗的肿瘤选自由乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(黑素瘤)、血液肿瘤(白血病)、骨肿瘤和淋巴瘤组成的组。

细胞免疫疗法

对于本发明的目的，“抗肿瘤治疗”或“抗肿瘤疗法”或“抗肿瘤疗法用途”是指用于减小体积、抑制生长、降低侵袭性、改变恶性功能特性和/或消除生物体中存在的肿瘤的治疗方法。

为了确定和监测抗肿瘤治疗的效率，指示性参数是生物体内肿瘤尺寸或体积随时间的进展。在实验动物中，肿瘤的尺寸大多通常是在牺牲动物后测量的。在患者中，可以通过本领域技术人员众所周知的非侵入性成像技术在体内测量肿瘤尺寸。

如图1和图5所示，与在对照、未治疗小鼠中观察到的肿瘤发展相比，仅含有LPS的脂质体制剂使得在小鼠中异种移植的人类肿瘤的发展显著降低。

图1显示了用RL淋巴瘤细胞异种移植的小鼠获得的结果，图5显示了用具有乳腺癌肿瘤(由MDA-MB361细胞形成)的小鼠获得的结果。

本发明特别涉及仅含有LPS的脂质体制剂，其用作免疫治疗剂。

仅含有本发明还涉及仅含有LPS的脂质体制剂，其用作刺激先天免疫系统的剂。

更特别地，本发明涉及仅含有LPS的脂质体制剂，其用作抗肿瘤细胞免疫疗法剂。

免疫疗法是一种治疗方法，其包括刺激患有癌症的生物体的体内免疫功能，以使该生物体的免疫系统能够抑制癌症生长甚至除去其中发展的肿瘤。

在涉及识别和破坏癌细胞的免疫操作剂中，可以提及以下称为NK细胞的“自然杀伤”细胞。这些是能够识别肿瘤组织，使其浸润并对肿瘤细胞产生特定细胞毒性的淋巴细胞。

抗肿瘤细胞免疫疗法是一种治疗方法，其包括刺激NK细胞、其发展和/或活性，从而使其识别并裂解肿瘤细胞。

如图2和图3所示，向小鼠施用仅含有LPS的脂质体制剂，可显著增加动物脾脏中存在的NK细胞的数量。

因此，似乎仅含有LPS的脂质体制剂通过促进对肿瘤细胞的细胞毒性细胞应答而刺激NK细胞的增殖，并因此作为细胞免疫治疗剂。

脂质体制剂

为了本发明的目的，脂质体制剂是指包含封装了活性成分的脂质体的组合物，所述活性成分被称为“封装的”或甚至“包含在脂质体制剂中”。

在本申请中，无差别地使用术语“LPS脂质体制剂”、“仅含有LPS的脂质体制剂”、“脂质体-LPS”和“封装在脂质体中的LPS”，并且它们均表示与上述定义相同的制剂，即由封装细菌脂多糖的脂质体组成的制剂/组合物。

脂质体，也称为脂质体颗粒，是一种囊泡，其中由两亲性分子(例如磷脂或胆固醇)的双层组成的脂质相捕获了水性内相。

包含单个脂质双层的单层脂质体与包含几个同心脂质双层的多层脂质体是不同的。

磷脂是包含“磷酸”基团的脂质。这些是由极性(亲水)的“头部”和两个脂肪族(疏水)的“尾部”组成的脂质。该家族尤其包括磷脂酸和磷酸甘油酯。磷脂的理化性质既取决于亲水头部的极性分子的性质，以及其疏水尾部的脂肪链(脂肪酸)的性质。

为了制备根据本发明的脂质体制剂，可以使用不同类型的磷脂。

例如，专利申请WO 2013/129936中所示的脂质体制剂适用于实施本发明。

无限制地，下列磷脂可以组合使用：

-“DOPE”，其表示1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；

-“DSPE”，其表示1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；

-“PEGXXXX”，其表示聚乙二醇，其中XXXX表示其分子量；特别地，可以使用PEG350和PEG5000；

-“DSPE-PEGXXXX”，它表示1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-(聚乙二醇)-XXXX]。

-胆固醇(3β-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3β-醇)。

根据本发明的特定实施方式，所述脂质体制剂由具有以下组成的磷脂组成：DOPE:DSPE-PEG 5000:DSPE-PEG-350:胆固醇(54:8:8:30％mol)。

根据本发明的另一个特定实施方式，所述脂质体制剂由具有以下组成的磷脂组成：

·18:1(delta9-Cis)DSPE(DOPE)

·18:0PEG5000DSPE(铵盐)

·18:0PEG350DSPE(铵盐)，以及

·胆固醇。

细菌脂多糖(LPS)

根据本发明的脂质体制剂仅含有细菌脂多糖，即不包含其他活性化合物，并且特别地不包含抗原(除了是LPS的组分的抗原O)。

在本发明的范围内，LPS被用作刺激先天免疫系统的剂，而不是被用作使对特定抗原的特异性免疫应答增加的佐剂。

LPS是革兰氏阴性细菌外膜的组分，其包含通过共价键彼此结合的三种分子实体：

-脂质A；

-由寡糖组成的“核”；

-以及抗原O。

最具免疫刺激性的LPS部分的脂质A从一种细菌物种到另一种都是高度保守的，细胞核的变异性非常低，而O抗原则对于LPS来源的细菌物种是特异的。

特别地，革兰氏阴性细菌包括但不限于以下科：

-肠杆菌(Enterobacteriaceae)科：

·沙门氏菌(Salmonella)属

·埃希氏菌(Escherichia)属，例如大肠杆菌(Escherichia coli)

·耶尔辛氏菌(Yersinia)属

-弧菌(Vibrionaceae)科：

·弧菌(Vibrio)属示例：霍乱弧菌(Vibriocholerae)(导致霍乱)

-假单胞菌(Pseudomonadaceae)科：

·假单胞菌(Pseudomonas)属

-奈瑟菌(Neisseriaceae)科

·奈瑟氏球菌(Neisseria)属示例：脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(引起细菌性脑膜炎)

-根瘤菌(Rhizobiaceae)科

·农杆菌(Agrobacterium)属示例：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

·根瘤菌(Rhizobium)属示例：发根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)

-产碱菌(Alcaligenaceae)科

·博德特氏菌(Bordetella)属

根据本发明的特定实施方式，脂质体制剂中包含的LPS来自肠杆菌科(不包括肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)物种)的细菌。

根据本发明的另一种特定实施方式，脂质体制剂中包含的LPS来自肠杆菌科的细菌，特别是埃希氏菌属的细菌，并且特别是大肠杆菌物种。

短语“来自细菌的LPS”表示所述LPS分子具有天然存在于所述细菌的外膜中的LPS的物理化学性质。这些特征特别是构成脂质A的脂肪酸的性质。

LPS可以是天然存在的LPS或合成的LPS。

更特别地，可以通过本领域技术人员众所周知的技术从细菌膜纯化天然存在的LPS，或者甚至可以从公司(如SIGMA-ALDRICH)以纯化形式获得。

合成的LPS可以通过本领域技术人员已知的任何合成技术获得。

所使用的LPS可以其完整形式(脂质A+核+抗原O)或仅使用LPS部分的不完整形式封装在脂质体中。

根据本发明的特定方面，封装的LPS以LPS部分形式的不完整形式被使用。更特别地，LPS仅由其抗原O或其脂质A或甚至两者的组合组成。

来自细菌物种大肠杆菌的LPS的脂质A是β-1-6葡萄糖胺二聚体。

更特别地，封装的LPS可以由以单磷酰基脂质A形式使用的脂质A组成。

意图修饰脂多糖，特别是为了抑制或增强其免疫刺激性。LPS也可以是经过修饰以改变其溶解度或毒性性质的LPS。

根据本发明的一个特定方面，在用于疗法特别是抗肿瘤疗法的脂质体制剂中，封装在脂质体中的LPS是修饰的LPS。

LPS脂质体制剂的制备和表征

可以使用本领域技术人员已知的任何技术来制备仅含有LPS的脂质体制剂。

意图是短语“仅LPS”表示脂质体制剂仅含有LPS分子，不包括任何其他活性化合物和/或抗原。

封装的LPS来自某些细菌物种，例如来自大肠杆菌。

根据本发明的特定实施方式，所述制剂仅含有LPS分子，其中这些分子可以具有不同细菌来源：因此，其可以是一种、两种、三种或甚至更多种不同细菌来源的LPS。例如，脂质体制剂可包含来自大肠杆菌的LPS、来自沙门氏菌属的细菌的LPS和来自假单胞菌属的细菌的LPS，所述LPS分子是完整或不完整的形式。

换句话说，药物制剂由封装在脂质体中的至少一种细菌LPS组成。

如在实施例部分中所示，短语“仅含有LPS的脂质体制剂”表示LPS被适当地掺入/封装在脂质体颗粒中，而不是仅简单地并置在本文的介质中。

根据一个特定方面，用于制备脂质体制剂的方法包括连续的冷冻/解冻步骤。

根据本发明的另一个方面，用于制备脂质体制剂的方法包括对脂质体制剂进行灭菌的步骤。

根据本发明的又一方面，用于制备脂质体制剂的方法包括过滤脂质体的步骤，以获得具有均一尺寸的脂质体颗粒。

根据本发明的优选方面，所述脂质体制剂由具有均一尺寸的脂质体颗粒组成。

根据本发明的优选实施方式，所述脂质体制剂适合全身施用。

药物组合物

本发明还涉及一种药物组合物，其包含在可接受的药物介质中的至少一种仅含有脂多糖的脂质体制剂。

换句话说，所述药物组合物包含在药学上可接受的介质中的至少一种脂质体制剂，所述脂质体制剂由封装在脂质体中的细菌脂多糖组成。

就本发明而言，药学上可接受的介质是指能够使脂质体制剂得以保存和施用的媒介物，以及任选地赋形剂，其对个体或动物的施用不会产生明显的有害作用，并且是本领域技术人员已知的。

根据本发明的药物组合物可以包含任何必需的药物赋形剂，例如缓冲剂或调节pH或等渗性的试剂，或甚至是润湿剂。根据本发明的药物组合物还可包含一种或多种抗氧化剂和/或一种或多种防腐剂。

如上所述的脂质体制剂或药物组合物可以通过任何合适的方式施用，例如口服、颊、舌下、眼科、直肠、局部或肠胃外方式施用，特别是通过腹膜内、皮内、皮下、静脉内或肌内方式。

根据本发明的优选实施方式，如上所述的脂质体制剂或药物组合物适合于全身施用。

可以将根据本发明的药物组合物配制成用于口服施用的片剂、缓释或控释的胶囊或硬胶胶囊、丸剂、粉剂、溶液、混悬剂、糖浆或乳液。

根据另一个实施方案，可以将根据本发明的药物组合物制备为用于肠胃外施用的注射剂。

根据本发明的药物组合物可以通过任何已知的常规方法灭菌，例如过滤。可以调节所得水溶液以直接使用或冻干。冻干制剂可在使用前与无菌溶液混合。

根据本发明的优选实施方式，药物组合物包含有效量的、仅含有LPS的脂质体制剂。

这种制剂的有效量对应于诱导期望的应答的量，所述期望的应答即治疗效应，更具体地，是对肿瘤细胞的抗增殖效应。有效量可以取决于一个或多个参数，例如施用方式、单剂量或多剂量施用、患者的特征，其包括年龄、身体状况、身高、体重以及除了所治疗的病况之外的其他病况的存在。这些参数及其影响是本领域技术人员众所周知的，并且可以通过任何已知的方法来确定。

本发明还涉及所述药物组合物，其用作药物，更特别地用作抗肿瘤疗法。

施用

可以根据本领域技术人员已知的任何技术，将用作抗肿瘤疗法的、仅含有LPS的脂质体制剂或包含其的药物组合物施用于患有癌症的患者。

特别地，所述脂质体制剂或包含它的药物组合物可以以一个剂量或连续多剂量施用。

根据本发明的一个特定方面，将如上所述使用的脂质体制剂或包含它的药物组合物每周一次施用于患有癌症的患者。

根据本发明的优选实施方式，将如上所述使用的脂质体制剂通过全身途径施用，即该制剂将通过患者的血液途径到达其靶细胞。更精确地，所述脂质体制剂可以通过消化途径或肠胃外途径施用。

本发明还涉及一种用于治疗肿瘤的方法，其包括向患有所述肿瘤的患者施用有效量的、仅含有LPS的脂质体制剂。

药物组合产品

根据第三方面，本发明涉及药物组合产品，其包含：

-仅含有LPS的脂质体制剂；和

-至少一种细胞毒性化合物。

对于本发明的目的，药物组合产品是指一起用于治疗一种病理的一组治疗剂，其中它们的施用可以是同时、分开或按顺序的。因此，可以将所述治疗剂混合在一种治疗组合物中，或者以一种试剂盒的形式存在，但是以完全分开或按顺序的方式施用。

仅含有LPS的脂质体制剂将如先前所定义，并且尤其可以是：

-含有LPS的制剂，所述LPS来自肠杆菌科的细菌，特别是来自埃希氏菌属

的细菌，并且特别是来自大肠杆菌物种；和/或

-含有LPS的制剂，所述LPS仅由其脂质A组成。

如前所述，LPS脂质体制剂可以直接或与另一种治疗剂组合在疗法中使用。所述另一种治疗剂尤其是细胞毒性化合物，其是对其起作用的细胞诱导细胞死亡的化合物。

有利地，所述细胞毒性化合物适于特异性地靶向某些细胞，特别是靶向癌细胞。

根据本发明的一种实施方式，所述细胞毒性化合物是免疫治疗剂，例如具有免疫调节和细胞毒性活性的肽或非肽小分子；更优选地，所述免疫治疗剂是治疗性抗体。

治疗性抗体是能够特异性识别要破坏的细胞的抗体，在癌症的情况下，要破坏的细胞是天然的肿瘤细胞。肿瘤细胞在其膜表面表达抗原，所述抗原可以被针对其的抗体识别。可以将所述治疗性抗体与毒性物质偶联，所述毒性物质能够诱导被抗体识别的肿瘤细胞裂解并因此诱导其死亡。所述治疗性抗体还可以通过阻断肿瘤细胞膜表面的某些受体来发挥作用。

这些治疗性抗体在抗肿瘤疗法的范围内越来越多地被使用。例如，可以提及利妥昔单抗，这是一种特异性结合跨膜抗原CD20(一种位于B淋巴细胞上，并在非霍奇金淋巴瘤的95％以上B细胞中表达的蛋白)的单克隆抗体。所述治疗性抗体可用于治疗III-IV期滤泡性淋巴瘤患者。还可以提及特异于某些乳腺癌的肿瘤细胞过度表达的HER-2受体的曲妥珠单抗。

根据本发明的特定实施方式，所述组合产品中包含的治疗性抗体是单克隆抗体。

根据本发明的另一个具体实施方式，所述组合产品中包含的治疗性抗体是多克隆抗体。

根据本发明的实施方式，治疗性抗体靶标选自由以下组成的组：CD20、CD52、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD22、CD38、CD138、HER2、ErbB2、CD1、CD30、CD33、CD52、CD25、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1)和CTLA-4。

根据本发明的又一实施方式，所述治疗性抗体选自以下抗体组成的抗体组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿替珠单抗(atlizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、培舍珠单抗(certolizumab pegol)、西妥木单抗(cixutumumab)、达克珠单抗(daclizumab)、地舒单抗(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英利昔单抗(infliximab)、伊匹木单抗(ipilimumab)(MDX-101)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、那他珠单抗(natalizumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)(GA-101)、奧卡拉妥珠单抗(ocaratuzumab)(AME-133v)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕木单抗(panitumumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、PR0131921、雷珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、SBI-087、托珠单抗(tocilizumab)、TRU-015、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)以及这些抗体的任意组合。

为了本发明的目的，所述组合产品意图含有至少一种治疗性抗体，因此它可以包含几种治疗性抗体的组合。

根据本发明的另一实施方式，所述治疗性抗体选自由抗肿瘤治疗应用中使用的抗体，特别是以下抗体所组成的组：阿仑珠单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、西妥木单抗、达克珠单抗、地舒单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊匹木单抗(MDX-101)、莫罗单抗、奈昔木单抗、奥比妥珠单抗(GA-101)、奧卡拉妥珠单抗、奥法木单抗、帕木单抗、培妥珠单抗、PR0131921,雷珠单抗、利妥昔单抗、SBI-087,托珠单抗、TRU-015,托西莫单抗、曲妥珠单抗、维妥珠单抗以及这些抗体的任意组合。

根据本发明的优选实施方式，所述治疗性抗体是抗CD20单克隆抗体，并且优选是利妥昔单抗。

图1所示的实验结果表明：

-在患有肿瘤的未经治疗的小鼠中，肿瘤体积随时间增加；

-如果通过施用利妥昔单抗治疗小鼠，则肿瘤体积仍会随时间增加，但在肿

瘤移植后46天，所述肿瘤体积比对照小鼠的肿瘤体积低两倍；

-如果用包含利妥昔单抗和LPS脂质体制剂的组合产品治疗小鼠，则移植后

23天和46天的肿瘤体积是相同的：因此肿瘤的发展被完全抑制了。

图4显示了在用这种组合产品治疗的小鼠与用包含利妥昔单抗和未封装在脂质体中的LPS的组合产品治疗的小鼠之间观察到的差异：LPS脂质体制剂可更有效地抑制肿瘤的发展。

根据本发明的另一种实施方式，所述细胞毒性化合物选自以下化合物：

·常规细胞毒剂(化疗剂)，例如：

-烷基化剂等，例如环磷酰胺、白消安、美法仑、异环磷酰胺、苯达莫司汀、替莫唑胺、博来霉素、甲氮芥、卡莫司汀、福莫司汀、BCNU；

-铂衍生物，例如顺铂、奥沙利铂、卡铂，

-核苷类似物、核酸碱基和其他抗代谢产物，例如aracytin、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、甲氨蝶呤、培美曲塞(pemetrexed)、6-巯基嘌呤、地西他滨(decitabine)、氮杂胞苷、曲沙他滨(troxacitabine)

-抗微管蛋白剂，例如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunnine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、埃博霉素(epothilones)、艾日布林(eribulin)、微粉化的紫杉醇(micronised paclitaxel)，

-抗拓扑异构酶2剂，例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱(camptothecin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、放线菌素(dactinomycin)；

·激酶抑制剂类型的靶向治疗剂，例如伊马替尼(imabinib)、达沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼洛替尼(nilotinib)、普纳替尼(ponatinib)、依鲁替尼(ibrubinib)、艾代拉里斯(idelalisib)、阿法替尼(afatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、克唑替尼(crizotinib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、阿西替尼(axitinib)、卡博替尼(cabozantinib)、尼达他尼(nindetanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、威罗菲尼(vemurafenib)；

·免疫调节剂，如沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马利度胺(pomalidomide)；

·凋亡促进因子(apoptosis enablers facilitator)，如venetoclax或navitoclax；

·抗肿瘤剂，如硼替佐米(bortezomib)，卡非佐米(carfilzomib)，依沙佐米(ixazomib)，伏立诺他(vorinostat)，帕比司他(panobinostat)，罗米地辛(romidepsin)，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid)，砷衍生物As2O3，坦罗莫司(temsirolimus)，奥拉帕尼(olaparib)，卢卡帕尼(rucaparib)，喷司他丁(pentostatin)，天冬酰胺酶，羟基脲和苯丁酸氮芥(chloraminophene)。

根据本发明的优选实施方式，所述细胞毒性化合物是化疗剂。

意图是，上述化合物可以其通常形式使用，特别是作为盐使用。例如，依托泊苷可以作为依托泊苷磷酸酯使用。

本申请的实施例4证明了，封装在脂质体中的LPS与依托泊苷(5μM)组合使用，根据增效剂模式，能够引起体外癌细胞的细胞死亡。

事实上，依托泊苷，一种常规使用的化疗剂，可以如预期的那样诱导癌细胞凋亡；另一方面，LPS脂质体制剂刺激巨噬细胞，从而诱导肿瘤细胞裂解；两种组分的组合效应使细胞死亡率远高于单独使用每种组分的两种效应之和。

本发明还涉及用于抗肿瘤疗法的如上所述的药物组合产品。

特别地，所述药物组合产品将用于治疗液体肿瘤或实体肿瘤。

所述肿瘤尤其可以选自乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(黑素瘤)、血液肿瘤(白血病)、骨肿瘤和淋巴瘤组成的组。

更准确地，本发明涉及在抗肿瘤疗法中同时、分开或按顺序使用的所述药物组合产品。换句话说，所述组合产品的每种组分的使用可以是同时的、分开的或按顺序的。

更具体地，本发明涉及在抗肿瘤免疫疗法中同时、分开或按顺序使用的如上所述的药物组合产品。

本发明还涉及用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有所述肿瘤的患者施用至少一种细胞毒性化合物和仅含有LPS的脂质体制剂，所述施用以同时、分开或按顺序的方式进行。

本发明还涉及一种试剂盒，其包括：

-仅含有LPS的脂质体制剂；和

-至少一种如上定义的细胞毒性化合物。

所述细胞毒性化合物尤其可以是化疗剂或治疗性抗体。

实施例

实施例1：其中封装了LPS分子(从大肠杆菌055:B5提取和纯化的LPS)的脂质体制剂：脂质体-LPS的制备、分析和表征

脂质体-LPS的制剂已按照以下步骤合成：

-脂质体制剂的脂质组成：DOPE:DSPE-PEG 5000:DSPE-PEG-350:Chol(54:8:8:30％mol)

-将脂质溶解在氯仿/甲醇混合物中(9:1)

-蒸发有机溶剂后制备脂质膜。使用旋转蒸发仪进行蒸发

-非真空下，通过在置于旋转蒸发仪中的烧瓶中加入含100μg LPS/mL的PBS(缓冲盐溶液)来进行脂质膜的水合作用。

-为提高封装率，将冷冻(液氮中)-解冻(温水中)系列应用于脂质体-LPS的悬浮液。

挤出脂质体-LPS的溶液能够获得具有均一尺寸的脂质体。为此，将脂质体-LPS溶液在800、400和200nm的聚碳酸酯膜上过滤。在每个过滤器上运行5次后，脂质体的大小均匀，并且脂质体-LPS的溶液是半透明的。

使用Malvern instruments(Worcestershire，英国)的ZetasizerNano-S，通过动态光散射，对脂质体制剂的尺寸(平均直径)、多分散性(PDI)和电荷进行了分析。对两种脂质体制剂3个月的分析可以证明这些制剂的稳定性(表1)。

表1：

体外分析由此产生的脂质体制剂(包括荧光组分)与人血白血细胞的相互作用可以证明，脂质体与粒细胞和单核细胞的强相互作用。尚未观察到与淋巴细胞部分的相互作用(结果未显示)。

另外，人血白血细胞与脂质体-LPS的孵育以及通过流式细胞术进行的分析使我们能够强调吞噬细胞活性的激活。

罗丹明B标记的脂质体-LPS制剂(其中LPS分子与荧光染料FITC偶联)的共聚焦显微镜分析，使我们能够强调将LPS掺入脂质体颗粒中。

最后，脂质体颗粒的均一性已在负染色后通过电子显微镜得到了证实。

实施例2：在RL细胞异种移植小鼠模型中LPS脂质体制剂对利妥昔单抗活性的佐剂效应的临床前评价

在此实验过程中，使用了六组Scid CB17小鼠。每组由六只小鼠组成。

组1＝对照(无治疗)

组2＝空脂质体

组3＝0.5mg/mL LPS

组4＝30mg/kg利妥昔单抗

组5＝0.5mg/kg脂质体-LPS

组6＝0.5mg/kg脂质体-LPS+30mg/kg利妥昔单抗

以每周一次注射的速率注射不同治疗物后监测肿瘤生长，可以通过制备脂质体-LPS来证明利妥昔单抗的抗肿瘤活性增强剂效应。与单独使用利妥昔单抗治疗的小鼠组相比，利妥昔单抗和脂质体-LPS组合后的肿瘤生长显著减少，体现了这种增强剂效应(图1)。

与来自其他组的动物相比，在用脂质体-LPS和利妥昔单抗与脂质体-LPS组合治疗的动物的情况下，在牺牲动物后对不同治疗对脾脏尺寸的影响的分析使得强调了脾脏大小和重量的显著增加(图2)。

NK细胞是先天免疫细胞，已知其在抗肿瘤应答中起重要作用。

流式细胞术分析了不同治疗对脾脏白细胞亚群的影响，这强调了，与其他组的动物相比，用脂质体-LPS和利妥昔单抗与脂质体-LPS组合治疗的动物脾脏中自然杀伤(NK)细胞的数量显著增加(图3显示了NK细胞相对于样品中所有白血细胞的百分比)。

图4显示，在移植有RL淋巴瘤细胞的同一SCID小鼠的动物模型中，每周一次施用以下药物获得的比较效果：

-利妥昔单抗(30mg/kg)

-利妥昔单抗和大肠杆菌的“常规”LPS(0.5mg/kg)

-利妥昔单抗和LPS脂质体制剂，剂量与之前相同。

后者的利妥昔单抗和封装的LPS组合能够在移植后实现对肿瘤发展的最佳抑制。

实施例3：LPS脂质体制剂在实体瘤异种移植模型中的抗肿瘤作用

LPS脂质体制剂的抗肿瘤作用也已在另一种动物模型(异种移植了乳腺癌肿瘤细胞(MDA-MB-231细胞)的SCID小鼠)中得到证实。

图5所示的结果显示了肿瘤体积随时间的变化，其为对小鼠施用的治疗的函数：

-组1：未经治疗的对照小鼠(3只小鼠)；

-组2：通过静脉内施用LPS脂质体制剂治疗的小鼠。

以每周一次注射的速率注射不同的治疗物后的肿瘤生长监测能够证明脂质体-LPS制剂的抗肿瘤活性。与未治疗的小鼠相比，在注射脂质体-LPS后肿瘤生长显著减少反映了这种活性。

实施例4：根据本发明的组合产品对SaOS细胞的细胞死亡率的体外效应

SaOS细胞是大鼠骨肉瘤细胞。这是恶性骨肿瘤。可以根据适合肿瘤细胞的3D球体模型培养这些细胞。

THP-1是源自急性单核细胞白血病的人单核细胞。

为了对这些SaOS细胞进行细胞死亡监测，已将荧光产品

Caspase-3/7用于评估凋亡细胞的数量。

已按照下表2中所示的方案处理细胞：

表2：THP-1效应细胞和靶SaOS细胞的治疗方案

结果以任意荧光单位示于图6。

对照细胞具有小的残余凋亡率。

依托泊苷处理的细胞的凋亡率相对于对照组显著增加(p<0.05)。用LPS脂质体制剂处理的细胞具有相似的凋亡率。

两种化合物：依托泊苷和脂质体制剂的联合能够使凋亡率相对于单独使用每种化合物所获得的凋亡率显著提高，从而证明两种化合物对靶癌细胞的协同效应。

参考文献

专利

WO 2013/129936

文献引用

Bakouche O,Koff WC,Brown DC,Lachman LB.Interleukin 1release by humanmonocytes treated with liposome-encapsulated lipopolysaccharide.J.Immunol.1987Aug 15；139(4):1120-6.

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Neidhart J,Allen KO,Barlow DL,Carpenter M,Shaw DR,Triozzi PL,ConryRM.Immunization of colorectal cancer patients with recombinant baculovirus-derived KSA(Ep-CAM)formulated with monophosphoryl lipid A in liposomalemulsion,with and without granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor.Vaccine.2004Jan 26；22(5-6):773-80.

Claims (13)

1.一种药物组合产品，其包括：

-仅含有细菌脂多糖(LPS)的脂质体制剂；和

-至少一种细胞毒性化合物。

2.根据权利要求1所述的药物组合产品，其特征在于，所述脂质体制剂中所含有的LPS来自肠杆菌科的细菌，特别是埃希氏菌属的细菌，特别是大肠杆菌物种。

3.根据权利要求1或2中的一项所述的药物组合产品，其特征在于，所述LPS仅由其脂质A组成。

4.根据权利要求1-3中的一项所述的药物组合产品，其特征在于，所述细胞毒性化合物是治疗性抗体。

5.根据权利要求4所述的药物组合产品，其中所述治疗性抗体靶标选自由以下组成的组：CD20、CD52、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD22、CD38、CD138、HER2、ErbB2、CD1、CD30、CD33、CD52、CD25、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1)和CTLA-4。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合产品，其中所述治疗性抗体选自由以下组成的抗体组：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑珠单抗、阿替珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、培舍珠单抗、西妥木单抗、达克珠单抗、地舒单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、奥比妥珠单抗、奧卡拉妥珠单抗(AME-133v)、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、培妥珠单抗、PR0131921、雷珠单抗、利妥昔单抗、SBI-087、托珠单抗、TRU-015、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维妥珠单抗以及其任意组合。

7.根据权利要求1-3中的一项所述的药物组合产品，其特征在于，所述细胞毒性化合物选自：

-化疗剂，例如：环磷酰胺、白消安、美法仑、异环磷酰胺、苯达莫司汀、替莫唑胺、博来霉素、甲氮芥、卡莫司汀、福莫司汀、BCNU、顺铂、奥沙利铂、卡铂、aracytin、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、6-巯基嘌呤、地西他滨、氮杂胞苷、曲沙他滨、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、埃博霉素、艾日布林、微粉化的紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、喜树碱、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌、放线菌素；

-激酶抑制剂类型的靶向治疗剂，例如伊马替尼、达沙替尼、博舒替尼、尼洛替尼、普纳替尼、依鲁替尼、艾代拉里斯、阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、克唑替尼、鲁索替尼、托法替尼、阿西替尼、卡博替尼、尼达他尼、帕唑帕尼、凡德他尼、瑞戈非尼、索拉非尼、舒尼替尼、达拉非尼、曲美替尼、威罗菲尼；

-免疫调节剂，如沙利度胺、来那度胺、泊马利度胺；

-凋亡促进因子，如venetoclax或navitoclax；

-其他抗肿瘤剂，如硼替佐米、卡非佐米、依沙佐米、伏立诺他、帕比司他、罗米地辛、全反式维甲酸、砷衍生物As₂O₃、坦罗莫司、奥拉帕尼、卢卡帕尼、喷司他丁、天冬酰胺酶、羟基脲和苯丁酸氮芥。

8.根据权利要求7所述的药物组合产品，其特征在于，所述细胞毒性化合物是化疗剂。

9.根据权利要求1-8中的一项所述的药物组合产品，其用作抗肿瘤疗法。

10.根据权利要求9所述使用的药物组合产品，其特征在于，所述肿瘤是液体肿瘤或实体肿瘤。

11.根据权利要求9或10的一项所述使用的药物组合产品，其特征在于，所述肿瘤选自由乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(黑素瘤)、血液肿瘤(白血病)、骨肿瘤和淋巴瘤组成的组。

12.根据权利要求9-11中的一项所述使用的药物组合产品，其特征在于，每个组分的使用是同时、分开或按顺序的。

13.根据权利要求9-12中的一项所述使用的药物组合产品，其特征在于，所述脂质体制剂适合全身施用。

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