CN111593084A - 一种天然来源的多肽及祛斑美白用途 - Google Patents

一种天然来源的多肽及祛斑美白用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然来源的多肽及祛斑美白用途。本发明提供了一种天然来源的多肽，该多肽具有抑制黑色素合成相关蛋白表达的活性，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素在细胞中的沉积，具有祛斑美白作用，因而具有开发成祛斑美白化妆品的前景，如祛斑美白洗面奶、面霜或面膜。

Description

一种天然来源的多肽及祛斑美白用途
技术领域
本发明属于化妆品领域，涉及多肽的祛斑美白应用，具体涉及一种天然来源的多肽及祛斑美白用途。
背景技术
黑色素是一种蛋白质衍生物类的生物色素，由细胞本身所合成，不溶于水溶于碱性溶液。黑色素可以吸收紫外线进而保护肌肤免受紫外线过度照射带来的皮肤损伤。但是，黑色素的过度合成又会导致肤色变暗甚至产生雀斑等美容问题。
有许多酶参与了黑色素的合成，其中最为关键的一个酶就是酪氨酸酶。在酪氨酸酶的作用下，黑色素细胞源源不断地向角质输送黑色素颗粒。人体接受阳光紫外线照射后，酪氨酸酶受到了紫外线的刺激与激活，黑色素细胞合成黑色素的过程就会被加快，皮肤变黑暗。
目前许多科研人员仍致力于黑色素合成方面的分子机制研究和美白药物的筛选和研发工作，以解决各类肌肤色素沉着问题，实现祛斑美白效果。
紫花地丁为一种多年生草本植物，有研究称紫花地丁提取物具有抗皮肤老化衰老的功效。目前还没有紫花地丁多肽在去除黑色素和祛斑美白方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然来源的多肽及祛斑美白用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种天然来源的多肽，通过如下步骤制备：将粉碎的紫花地丁种子先用石油醚脱脂，收集残渣，加入超纯水，用NaOH溶液调节pH至11.0，40℃水浴加热搅拌提取，冷却后3500r/min离心15min，收集上清液，用HCl溶液调节pH至4.7，离心弃上清，用超纯水洗涤沉淀至中性，得到种子蛋白。取种子蛋白，加入超纯水，45℃保温，用NaOH溶液调节pH至7.5，添加木瓜蛋白酶，酶添加量为10000U/g，酶解温度为50℃，酶解时间为8h，沸水浴灭酶，冷却后5000r/min离心20min，收集上清液，超滤膜超滤分离，收集分子量介于3000u和1000u之间的组分，冷冻干燥即得多肽。
进一步地，提取料液比1:10，kg/L。
进一步地，40℃水浴加热搅拌提取1.5h。
进一步地，NaOH溶液浓度为0.5mol/L。
进一步地，HCl溶液浓度为0.5mol/L。
上述多肽在祛斑美白方面的应用。
上述多肽在制备祛斑美白化妆品方面的应用。
进一步地，所述化妆品可以为洗面奶。
进一步地，所述化妆品可以为面霜。
进一步地，所述化妆品可以为面膜。
有益效果：
本发明提供了一种天然来源的多肽，该多肽具有抑制黑色素合成相关蛋白表达的活性，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素在细胞中的沉积，具有祛斑美白作用，因而具有开发成祛斑美白化妆品的前景，如祛斑美白洗面奶、面霜或面膜。
附图说明
图1为各组黑色素瘤细胞中的黑色素含量；与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中的黑色素含量显著降低；
图2为各组黑色素瘤细胞中黑色素合成相关蛋白的表达水平；与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中黑色素合成相关蛋白TYR、MITF的表达水平显著下调；
图3为各组黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性；与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性显著降低。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：多肽的制备
将粉碎的紫花地丁种子先用石油醚浸渍2d脱脂，收集残渣，加入超纯水，料液比1:10(kg/L)，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至11.0，40℃水浴加热搅拌提取1.5h，冷却后3500r/min离心15min，收集上清液，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至4.7，离心弃上清，用超纯水洗涤沉淀至中性，得到种子蛋白。
取种子蛋白，加入超纯水，45℃保温，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5，添加木瓜蛋白酶，酶添加量为10000U/g，酶解温度为50℃，酶解时间为8h，沸水浴灭酶，冷却后5000r/min离心20min，收集上清液，超滤膜超滤分离，收集分子量介于3000u和1000u之间的组分，冷冻干燥即得多肽。
实施例2：活性测试
一、实验试剂
小鼠黑色素瘤B16-F10细胞为实验室冻存，复苏后使用。
胎牛血清FBS和DMEM培养基购自美国Gibco公司。
紫花地丁多肽按照实施例1方法制备。
各种化学试剂均为常规试剂。
二、实验方法
1、细胞培养
将小鼠黑色素瘤B16-F10细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，待细胞长满培养瓶瓶底后，消化、传代。
2、对黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响
2.1作用浓度的选择
采用MTT法筛选出对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞无明显增殖抑制作用的浓度，方法为：
取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。适应性培养12h后，药物组更换为含有不同浓度紫花地丁多肽的DMEM完全培养基培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组，以及不含细胞的培养液为空白组。继续培养48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡使结晶物充分溶解，测定各孔490nm波长下OD值，根据公式计算不同药物对细胞的增殖抑制率。每个浓度3个复孔。
增殖抑制率(％)＝[1－(OD药物组－OD空白组)/(OD对照组－OD空白组)]×100％
结果显示，100μg/mL紫花地丁多肽对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞无明显增殖抑制作用，抑制率为(4.03±0.18)％，小于5％。因此，选择终浓度100μg/mL进行后续实验。
2.2对黑色素含量的影响
以对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞无明显增殖抑制作用浓度的药物测试对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞中黑色素含量的影响，方法为：
取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。适应性培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL紫花地丁多肽的DMEM完全培养基培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组。继续培养48h后，弃培养液，PBS洗涤，将细胞消化下来，加入含有1mol/L的NaOH吹打均匀，80℃水浴30min，再加入超纯水使NaOH浓度为0.2mol/L，吹打均匀后移入96孔板，测定各孔475nm波长下OD值，以对照组黑色素含量为100％计，根据公式计算药物组黑色素含量：黑色素含量(％)＝OD药物组/OD对照组×100％。每个浓度3个复孔。
3、对黑色素瘤细胞中黑色素合成相关蛋白表达的影响
取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。适应性培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL紫花地丁多肽的DMEM完全培养基培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组。继续培养48h后，弃培养液，PBS洗涤，将细胞消化下来，冰上裂解，BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，加入MITF、TYR和β-actin一抗4℃孵育过夜，TBS-T洗涤液洗膜，加入二抗室温孵育1h，ECL法显色、曝光，化学发光成像系统拍照。
4、对黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响
以对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞无明显增殖抑制作用浓度的药物测试对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞中酪氨酸酶活性的影响，方法为：
取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。适应性培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL紫花地丁多肽的DMEM完全培养基培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组。继续培养48h后，弃培养液，PBS洗涤，每孔加入0.1％的Triton-X-100(pH为6.8的PBS配制)溶液100μL，振荡5min，使细胞完全裂解，加入0.1％的L-DOPA(pH为6.8的PBS配制)溶液50μL/孔，37℃反应20min，测定各孔475nm波长下OD值，以对照组酪氨酸酶活性为100％计，根据公式计算药物组酪氨酸酶活性：酪氨酸酶活性(％)＝OD药物组/OD对照组×100％。每个浓度3个复孔。
5、数据处理
采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±SD表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。
三、实验结果
1、对黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响
结果如表1和图1所示，与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中的黑色素含量显著降低，具有统计学差异。
表1各组黑色素瘤细胞中的黑色素含量
组别 黑色素含量
对照组 100％
多肽组 (54.7±2.3)％
2、对黑色素瘤细胞中黑色素合成相关蛋白表达的影响
结果如图2所示，与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中黑色素合成相关蛋白TYR、MITF的表达水平显著下调。本领域技术人员知道，细胞中TYR蛋白的表达和活性直接决定了黑色素的含量，而TYR蛋白又受到关键转录因子MITF的调控，二者均是黑色素瘤细胞中黑色素合成的两个重要相关蛋白。
3、对黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响
结果如表2和图3所示，与对照组相比，多肽组黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性显著降低，具有统计学差异。
表2各组黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性
组别 酪氨酸酶活性
对照组 100％
多肽组 (61.5±2.9)％
以上结果说明，本发明提供的多肽具有抑制黑色素合成相关蛋白表达的活性，可以抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素在细胞中的沉积，具有祛斑美白作用，因而具有开发成祛斑美白化妆品的前景，如祛斑美白洗面奶、面霜或面膜。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (10)

1.一种天然来源的多肽，其特征在于，通过如下步骤制备：将粉碎的紫花地丁种子先用石油醚脱脂，收集残渣，加入超纯水，用NaOH溶液调节pH至11.0，40℃水浴加热搅拌提取，冷却后3500r/min离心15min，收集上清液，用HCl溶液调节pH至4.7，离心弃上清，用超纯水洗涤沉淀至中性，得到种子蛋白。取种子蛋白，加入超纯水，45℃保温，用NaOH溶液调节pH至7.5，添加木瓜蛋白酶，酶添加量为10000U/g，酶解温度为50℃，酶解时间为8h，沸水浴灭酶，冷却后5000r/min离心20min，收集上清液，超滤膜超滤分离，收集分子量介于3000u和1000u之间的组分，冷冻干燥即得多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：提取料液比1:10，kg/L。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：40℃水浴加热搅拌提取1.5h。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：NaOH溶液浓度为0.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：HCl溶液浓度为0.5mol/L。
6.权利要求1所述的多肽在祛斑美白方面的应用。
7.权利要求1所述的多肽在制备祛斑美白化妆品方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为洗面奶。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为面霜。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为面膜。
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