CN111592476B - 一种甲砜霉素半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲砜霉素半抗原、抗原及其化学发光免疫检测试剂盒与应用。本发明公开一种甲砜霉素半抗原，同时也公开相应的人工抗原和化学发光酶联免疫检测试剂盒及其应用。本发明提供的甲砜霉素半抗原与载体蛋白偶联可得到甲砜霉素抗原。所述甲砜霉素抗原可应用于制备甲砜霉素特异性抗体。在抗体制备基础上建立了甲砜霉素化学发光酶联免疫检测方法，线性检测范围为0.1～8.1μg/L，灵敏度为0.26μg/L，检出限为0.1μg/L，添加回收率为105.41～125.93％，灵敏度高、稳定性好，为动物组织样品中甲砜霉素的残留检测提供一种更方便、快捷和简单的方法。

Description

一种甲砜霉素半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂 盒与应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，涉及一种甲砜霉素的半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂盒与应用。

背景技术

甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)是一种抗生素类药物，通过抑制肽酰基转移酶活性而产生广谱抑菌作用，抗菌谱广，包括各种革兰氏阳性、阴性菌和支原体等。然而，甲砜霉素具有胚胎毒性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害人体的健康。

在甲砜霉素的检测方法中，高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等色谱法具有灵敏度高、结果准确的优点，但这些方法均需要仪器，检测成本高，耗时长，设备的维护费用高昂，而且对检测人员的技术要求高，不适用于现场检测和监控。

相比色谱法，酶联免疫法具有成本低、操作简单、速度快、特异性强、一次检测样本量大、仪器化程度低等特点，可用于高通量检测。而化学发光酶联免疫分析法(ELCIA)是将化学发光体系与酶联免疫法相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种标记免疫测定技术。其检测原理是：固相载体表面的抗原和样品中相应抗原竞争性地与抗体结合，再加入酶标二抗形成抗原抗体酶标复合物，最后洗涤加入化学发光底物酶促发光，检测发光强度值，而抗原浓度与发光强度值呈负相关。

化学发光酶联免疫分析法具有酶联免疫分析法的主要优点，快速、简便、特异性好、高通量、可用于现场检测，同时具有化学发光分析法的高灵敏度，精确性、重复性更好，检测毒性更低。现有技术已有检测甲砜霉素的酶联免疫检测试剂盒，但还没有相关的化学发光酶联免疫检测试剂盒可用于甲砜霉素的快速、安全检测。因此，研究高灵敏的免疫检测方法对甲砜霉素的有效监控和药代动力学研究具有非常积极的意义。

公布号为CN 105524174 A的中国专利文献公开了一种用于检测甲砜霉素和氟苯尼考的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒，以氟苯尼考胺半琥珀酸酯(结构式如式(II)所示)作为半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体能同时识别氟苯尼考和甲砜霉素，对甲砜霉素的IC₅₀为0.35μg/L，以该单克隆抗体对甲砜霉素的交叉反应率为100％，对氟苯尼考的交叉反应率为167％，说明该半抗原对氟苯尼考的特异性比较强，但是对甲砜霉素的特异性比较低。因此，该方法对甲砜霉素的特异性较低。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供一种甲砜霉素的半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂盒与应用。由于制备出具有高特异性的抗体是建立酶联免疫检测方法的关键，而制备出相关抗原是制备特异性抗体的前提，因此本发明的首要目的是提供一种甲砜霉素半抗原。

本发明的第二个目的是提供一种甲砜霉素抗原。

本发明的第三个目的是提供一种甲砜霉素抗体。

本发明的第四个目的是提供甲砜霉素半抗原、甲砜霉素抗原、甲砜霉素抗体在制备检测甲砜霉素的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种甲砜霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种甲砜霉素半抗原，其分子结构式如式(I)所示：

本发明所述甲砜霉素半抗原的制备方法，包括以下步骤：

S1.将甲砜霉素与戊二酸酐加入高氯酸中，加热进行回流反应，得到产物A；

S2.将产物A溶于有机溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温条件下搅拌反应，得到产物B；

S3.将产物B溶于四氢呋喃(THF)溶液中，获得产物B溶液；将对氨甲基苯甲酸溶液滴入产物B溶液中，调节pH为8～10，室温条件下搅拌反应，得到所述甲砜霉素半抗原；

S2中，所述有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿。

其中，步骤S1中，控制甲砜霉素与戊二酸酐的摩尔比为1～3:2；S1回流反应的条件为40～50℃反应12～20h；

步骤S2中，控制产物A与NHS、EDC·HCl的摩尔比为1:1～3:1～3；S2搅拌反应时间为16～20h；

步骤S3中，控制产物B与对氨甲基苯甲酸的摩尔比为1:0.5～1.5；S3搅拌反应时间为2～4h；

步骤S3中，反应结束后加入酸调节pH为4～6，经乙酸乙酯萃取后提纯。

本文中，室温指20～25℃。

本发明还提供一种甲砜霉素抗原，由所述甲砜霉素半抗原与载体蛋白偶联得到。其中，所述载体蛋白可采用常用载体蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、鼠血清白蛋白(MSA)或甲状腺球蛋白(TG)中的一种或几种，优选采用BSA。

本发明所述甲砜霉素抗原的制备方法，包括以下步骤：

S11.按摩尔比1～5:2～10:2～10将所述甲砜霉素半抗原、二环己基碳二亚胺(DCC)和NHS溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，4～8℃搅拌反应12～24h，离心取上清，得到甲砜霉素半抗原反应液；

S12.将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到载体蛋白溶液；

S13.在搅拌条件下，将甲砜霉素半抗原反应液逐滴加入载体蛋白溶液中，4～8℃搅拌反应过夜；

S14.离心取上清液，在2～4℃下用PBS透析2～3d，期间每天换液2～3次，得到所述甲砜霉素抗原；

步骤S12中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L。

步骤S14中及下文中，未特别提及时，所述PBS的浓度为0.05mol/L。

本文中，过夜指8～16h。

所述甲砜霉素抗原可以作为免疫原制备甲砜霉素抗体，也可以作为包被原制备化学发光酶标板。

本发明还提供一种甲砜霉素抗体，其特征在于，由所述甲砜霉素半抗原或所述甲砜霉素抗原制备得到。所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明还提供所述甲砜霉素半抗原、所述甲砜霉素抗原或所述甲砜霉素抗体在制备检测甲砜霉素的产品中的应用。

本发明还提供一种甲砜霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有所述甲砜霉素抗原和/或所述甲砜霉素抗体。

优选地，所述化学发光酶联免疫检测试剂盒包括：包被有所述甲砜霉素抗原的化学发光酶标板、所述甲砜霉素抗体工作液、酶标二抗、甲砜霉素标准溶液、化学发光液和洗涤液。

其中，包被的所述甲砜霉素抗原优选为所述甲砜霉素半抗原与BSA的偶联物；包被的所述甲砜霉素抗原的工作浓度为20～40μg/L，优选为29μg/L。

所述甲砜霉素抗体工作液工作浓度为100～200μg/L，优选为135μg/L。

所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)，所述酶标二抗为抗鼠-HRP，工作浓度为20～1000μg/mL，优选为100μg/mL。

所述甲砜霉素标准溶液一种优选的制备方法为：用0.05mol/LPBS(pH 6.50)将甲砜霉素标准品溶液稀释成浓度为0.0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L的一系列甲砜霉素标准溶液。

所述化学发光液由A液和B液组成，其中，A液一种具体的制备方法为：将8mg鲁米诺、20mg对碘苯酚、1.21g Tris溶于100mL去离子水，最后使用HCl调pH至8.0；B液一种具体的制备方法为：将1.21g Tris和体积分数0.40％H₂O₂溶于100mL去离子水，最后使用HCl调pH至7.0。优选地，所述化学发光液由A液和B液按体积比1:1的比例混合。其中，A液中的鲁米诺为化学发光底物；对碘苯酚为增强剂，可使体系中的化学发光强度增强，提高检测方法的灵敏度。

本文中，所述洗涤液为磷酸盐吐温缓冲液(PBST)。

本发明中化学发光酶标板一种优选的制备方法为：用包被液将包被抗原按需要稀释，加入化学发光酶标板微孔中，放入4℃环境进行孵育过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后在每孔中加入封闭液，25℃孵育4h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

更优选地，所述化学发光酶标板为48孔或96孔可拆不透明白色发光板，材质为聚苯乙烯。所述化学发光酶标板上包被有能与抗甲砜霉素抗体特异性结合的甲砜霉素抗原，并封闭微孔表面未吸附甲砜霉素抗原的位点。

另外，所述化学发光酶标板微孔内用作固定甲砜霉素抗原的固相载体物质可为聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；所述固相载体物质的形式可为凹孔、纸片、小珠等。

所述包被液由1.69～2g Na₂CO₃和2.95～4g NaHCO₃溶于1～1.5L去离子水中得到。

优选地，所述封闭液的制备方法为：将0.10g BSA、5.00g甘氨酸、5.00g蔗糖溶于100mL PBS(0.01mol/L，pH 7.40)。所述封闭液能封闭所述化学发光酶标板微孔表面未吸附甲砜霉素抗原的位点。

本发明还提供了所述化学发光酶联免疫检测试剂盒在检测甲砜霉素中的应用。

具体地，所述化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包含如下步骤：

S21.取出试剂盒，置于室温平衡30min以上；

S22.取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的甲砜霉素标准溶液，往样品孔中加入待测样品，然后每孔中加入酶标二抗，再加入甲砜霉素抗体工作液，盖上盖板膜振摇混匀，37℃孵育15min；

S23.吸除微孔中的反应液，用洗涤液进行洗涤5次，将酶标板拍干；

S24.每孔加入化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后测定各孔的发光强度值(RLU)；

S25.检测结果的计算与分析：确定样品中甲砜霉素的含量；

步骤S23中所述洗涤液为20倍浓缩洗涤液用去离子水稀释20倍得到；所述20倍浓缩洗涤液为20×PBST。

以抑制率为纵坐标，甲砜霉素浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中甲砜霉素的含量，

其中，抑制率(％)＝B/B₀×100％，式中：B为标准孔中不同浓度甲砜霉素标准溶液或样品孔中待测样品的RLU；B₀为标准孔中0.00μg/L甲砜霉素标准溶液的RLU。

优选地，步骤S22中所述待测样品可为鸡肉/肝、猪肉/肝等动物组织样品。

具体地，所述待测样品一种前处理方法如下：

(1)称取3g组织样品于均质机中进行均质，将均质后的组织样品置于离心管中；

(2)加入2mL水溶液振荡混匀后，加入2mL乙酸乙酯充分混合2～5min，室温下以2000r/min的转速离心2min；

(3)吸取离心后的上清液1mL，加入4mL正己烷、0.3mL 0.01mol/L的PBS，震荡1min混合均匀，离心或者静止，收集分层后的下层水相。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的甲砜霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，检测时间大大缩短，完成整个检测过程只需30min左右；对检测人员的技术要求低，无需考虑检测人员技术水平的影响。

2.本发明提供的甲砜霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，采用包被有抗原的化学发光酶标板，大大提升了试剂盒的稳定性和精密度，检测更稳定、更准确；与现有的甲砜霉素的试剂盒相比，克服了试剂盒检测过程中易受到内源性酶干扰、发光度的检测也易受到多种外在因素的影响的弊端，采用高特异性、高亲合力的抗体，特异性高，灵敏度可达到0.26μg/L。

3.另外，本发明所述试剂盒采用化学发光方法，不使用ELISA试剂盒中的浓硫酸等有强腐蚀性的试剂、以及有强致癌性的底物，更加环保安全；且操作简单、成本低，适合大量样品或现场筛查的痕量分析与批量检测，具有重要的实际应用推广意义。

附图说明

图1为甲砜霉素化学发光免疫试剂盒的标准曲线图；

图2为甲砜霉素半抗原合成路线的示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1甲砜霉素半抗原的制备

(1)将494.2mg甲砜霉素(1.400mmol)置于三颈瓶中，加入228.2mg戊二酸酐(2.000mmol)搅拌，再加入0.18mL高氯酸搅拌溶解，将油浴升温至45℃搅拌回流反应16h；

反应结束后减压蒸干，残液用15mL水溶解，水溶液用二氯甲烷萃取，合并有机相，并用15mL水洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，转干后得到470mg产物A；

(2)在50mL圆底烧瓶中，将470mg(1.0mmol)产物A溶于15mL的二氯甲烷中，加入155mg(1.35mmol)的NHS和258mg(1.35mmol)的EDC·HCl，20℃搅拌反应18h；

反应结束后，将反应液转入125mL的分液漏斗中，依次用15mL 0.1mol/L盐酸水溶液，15mL水，15mL的饱和碳酸氢钠溶液和15mL的饱和氯化钠溶液洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，转干后得436.77mg(0.770mmol)产物B；

(3)将116.38mg(0.770mmol)对氨甲基苯甲酸溶于5mL水和10mL四氢呋喃的混合液中，获得对氨甲基苯甲酸溶液，待用；将436.77mg(0.770mmol)产物B溶于10mL的四氢呋喃溶液中，获得产物B溶液；将对氨甲基苯甲酸溶液缓慢滴入产物B溶液中，加入1.2mL的1mol/L氢氧化钠水溶液调至pH＝9，在20℃搅拌反应3h；

反应结束后滴加6mol/L的盐酸水溶液调至pH＝5，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，经干燥，过滤，转干后得到白色泡状固体，将该白色泡状固体溶于5mL无水乙醇中，用薄层层析法纯化得到甲砜霉素半抗原。

甲砜霉素半抗原合成路线的示意图如图2所示。

实施例2甲砜霉素人工抗原、包被原及特异性抗体的制备

1.甲砜霉素人工抗原的制备

(1)称取5.60mg半抗原溶于1mL DMF，加入4.3mg DCC和5.2mg NHS，室温搅拌反应2h，得到甲砜霉素半抗原反应液；

(2)称取50mgBSA溶于5mL的0.1mol/L的PBS中，得到载体蛋白溶液；

(3)将甲砜霉素半抗原反应液逐滴加入到载体蛋白溶液中，室温搅拌过夜，在4℃下用PBS透析3d，期间每天换液2次；在无菌条件下将透析液用0.22μm孔径的滤膜过滤，分装于安培瓶中，-20℃保存。

2.甲砜霉素包被原的制备

方法同人工抗原的制备方法。

3.甲砜霉素单克隆抗体的制备

(1)动物免疫：用上述制备得到的甲砜霉素人工抗原作为免疫原，以生理盐水溶解后，与弗氏完全佐剂等体积混匀，对6～8周龄的Balb/c雌鼠进行颈背部皮下注射；初次免疫后第7、14、28天各追加免疫一次，将免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，进行皮下注射；细胞融合前3天，再用不加弗氏佐剂的免疫原追加免疫一次，注射免疫原的量均为150μg/只；

(2)细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时进行全换液；

(3)阳性杂交瘤的筛选：细胞融合后，待细胞长到微孔面积的25％时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞；

初选采用间接ELISA方法，用上述制备得到的甲砜霉素包被原包被酶标板(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度)，将培养上清加入包被好的酶标板的微孔中，孵育，清洗后加入酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，加入邻苯二胺(OPD)进行显色反应，显色则为阳性；

筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将培养上清与100μg/mL的甲砜霉素等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中，显色反应后测量OD_450nm值；同时用PBS取代甲砜霉素作对照，其余步骤同上；

若经甲砜霉素阻断后的微孔中的OD_450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2、3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化；

(4)杂交瘤细胞的扩大培养：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA方法测定效价，冻存；并取8～10周龄的Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL液体石蜡，7～10天后每只腹腔注射1～2×10⁶杂交瘤细胞，7～10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

4.包被原浓度与抗体浓度的优选

(1)用PBS对甲砜霉素抗原进行梯度稀释，初始浓度为2.32mg/mL，稀释倍数为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000，纵向按150μL/孔包被至不透明白色发光板，4℃孵育过夜，用洗涤液洗涤两次，吸水纸上拍干。

(2)每孔中加入170μL封闭液，25℃封闭4h，甩干放入烘箱。

(3)每孔中分别加入50μL不同梯度浓度的甲砜霉素标准溶液(工作浓度分别为0.0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L)。

(4)每孔中加入50μL酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP(工作浓度为100μg/mL)，再加入50μL用PBS稀释的不同梯度的甲砜霉素抗体工作液，初始浓度为10.8mg/ml，稀释倍数为1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000，37℃孵育15min，用洗涤液洗板5次，吸水纸上拍干。

(5)每孔分别加入化学发光液A液和B液各50μL，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU。

以发光值随包被原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释浓度为最佳浓度进行特异性测定。

得到包被原最佳浓度为29.00μg/L；抗体稀释倍数为80000倍，抗体工作浓度为135μg/L。

5.抗体灵敏度的测定

以包被浓度为包被原最佳浓度29.00μg/L，甲砜霉素单克隆抗体稀释80000倍后(工作浓度为135μg/L)，进行抗体灵敏度的测定。

(1)取96孔不透明白色发光板，将包被原用PBS稀释至29.00μg/L，每孔加入150μL，37℃孵育过夜，用洗涤液洗涤两次，吸水纸上拍干。

(2)每孔中加入170μL封闭液，37℃封闭2h，甩干放入烘箱。

(3)每孔中分别加入50μL用PBS缓冲液稀释的不同梯度的甲砜霉素标准品溶液。

(4)每孔中依次加入50μL酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP和50μL的80000倍稀释的甲砜霉素抗体，37℃孵育15min，用洗涤液洗板5次，吸水纸上拍干。

(5)每孔分别加入化学发光液A液和B液各50μL，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU。

(6)结果以抑制率计算，抑制率(％)＝B/B₀×100％，B为不同标准浓度溶液竞争的发光值，B₀为不加标准品的发光值，计算IC₅₀为0.26μg/L，即甲砜霉素单克隆抗体的灵敏度。

实施例3甲砜霉素化学发光酶联免疫试剂盒的制备

1.准备试剂

(1)包被有甲砜霉素抗原的酶标板：96孔可拆酶标板，包被甲砜霉素抗原及封闭液，包被浓度为29.00μg/L。所述甲砜霉素抗原为甲砜霉素半抗原与BSA的偶联物；

将包被抗原用包被液稀释至29.00μg/L，每孔内加入150μL包被液，37℃孵育过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤2次，拍干。然后每孔中加入170μL封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，置于37℃烘箱中烘干后，用铝箔袋真空密封4℃保存。

(2)甲砜霉素标准品溶液的配制：准确称取甲砜霉素标准品溶液，用色谱级甲醇稀释成1.00mg/mL，再用0.05mol/L PBS分别配制0.0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L的甲砜霉素标准溶液，4℃保存；PBS的配制方法为：将1.16g NaH₂PO₄·12H₂O和0.12g Na₂HPO₄用去离子水定容至1L。

(3)甲砜霉素单克隆抗体初始浓度为10.8mg/mL，其稀释倍数为1:80000，使用时用PBS进行稀释。

(4)化学发光液：由A液和B液组成；使用时将A液和B液按体积比1:1的比例混合。A液的配制方法为：将20.00mg对碘苯酚、8.00mg鲁米诺、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.50；B液的配制方法为：将体积分数0.40％H₂O₂、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.00。

(5)20倍浓缩洗涤液；使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。

(6)酶标二抗的配置：羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗用PBS缓冲液稀释至100μg/mL。

2.试剂分装

将各试剂测定合格后无菌分装，已稀释的甲砜霉素标准品系列溶液l mL/6瓶，甲砜霉素抗体7mL/瓶，酶标二抗7mL/瓶，化学发光液A液7mL/瓶，化学发光液B液7mL/瓶，20倍浓缩洗涤液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。

3.试剂盒的组装

分别将上述包被有甲砜霉素抗原的化学发光酶标板1块，甲砜霉素抗体、酶标二抗、化学发光液A液、化学发光B液、20倍浓缩洗涤液各1瓶，甲砜霉素标准品溶液6瓶和使用说明书1份置于试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，4℃保存。

实施例4甲砜霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用

1.样品前处理：

(1)称取3g鸡肉组织样品于均质机中进行均质，将均质组织样品置于离心管中。

(2)加入2mL水溶液振荡混匀后，然后加入2mL乙酸乙酯萃取剂充分混合2～5min，于室温下以2000r/min的转速离心2min。

(3)吸取离心后的上清液1mL，加入4mL正己烷、0.3mL 0.01mol/L的PBS，震荡1min使其混合均匀，离心或者静止，收集分层后的下层水相。

2.利用本发明实施例3的试剂盒进行检测

(1)取出实施例3的试剂盒，置于室温平衡60min。

(2)取出化学发光酶标板，在标准孔分别加入50μL不同浓度的标准品溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL酶标二抗，再加入50μL甲砜霉素抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后，置于37℃孵育15min。

(3)吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20s左右，除去其中液体，重复上述洗涤步骤5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打，每轮洗板拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。

(4)每孔分别加入化学发光液A液和B液各50μL，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据。

3.检测结果计算与分析

抑制率(％)＝B/B₀×100％，式中：B为不同浓度甲砜霉素标准溶液或待测样品的发光值；B₀为0浓度甲砜霉素标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，甲砜霉素质量浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，以样品孔的发光值代入上述标准曲线中求出待测样品中甲砜霉素的含量。不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要30min即可完成，检测结果还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。

4.标准曲线

通过对标准溶液的检测结果分析得到甲砜霉素标准曲线图(如图1所示)，本发明试剂盒对甲砜霉素的线性检测范围为0.1～8.1μg/L，灵敏度为0.26μg/L，检出限为0.1μg/L。

实施例5甲砜霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用评价

1.试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的线性检测范围为0.1～8.1μg/L，IC₅₀的浮动范围为0.22～0.30μg/L；对20份空白的不同鸡肉组织样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分发光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差(SD)表示检测限，结果显示，该方法对鸡肉组织的检测限为0.1μg/kg。

2.准确度和精密度试验

向不含甲砜霉素的鸡肉组织样品中添加甲砜霉素标准品，添加量分别为：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg，将加标后的样品按照实施例4中样品前处理方法进行处理，得到加标待测样品溶液。从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如上所述，每个实验重复4次，分别计算变异系数。其中：

(1)以加标回收率作为准确度评价指标，计算方法为：

平均回收率＝测定值与真实值的比值×100％。

(2)变异系数的计算方法：

变异系数(CV)＝(各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值)×100％；

其中，批内变异系数的计算方法：

批内CV＝同一次测定中各平行样本的变异系数，取其平均值；

批间变异系数的计算方法：

批间CV＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

(3)结果见表1，实验结果表明：本发明的试剂盒的平均回收率在105％～126％之间；批内、批间的变异系数均小于20％。

表1甲砜霉素鸡肉样品添加回收试验结果(n＝4)

3.试剂盒保存期的试验

(1)将实施例3的试剂盒放置于2～8℃，分别取放置0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对甲砜霉素标准样品的发光值、IC₅₀、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(2)将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对甲砜霉素标准样品的发光值、IC₅₀、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(3)将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对甲砜霉素标准样品的发光值、IC₅₀、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

结果表明，经过三种条件保存试验，该试剂盒各项指标完全符合要求，因此，从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃保存12个月。

4.交叉反应率试验

选择与甲砜霉素结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验，通过各种药物的标准曲线分别得到IC₅₀和交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明甲砜霉素化学发光检测试剂盒对甲砜霉素的检测特异性越好。结果见表2。

表2甲砜霉素试剂盒交叉反应率

参照本发明上述实施例的检测方法，在其他条件相同的情况下，将鸡肉组织样品分别替换为鸡肝、猪肉、猪肝等动物组织样品，另外对鸡肝、猪肉和猪肝组织样品中的甲砜霉素含量进行检测。实验发现，本发明检测方法在鸡肝、猪肉和猪肝等动物组织样品中，线性检测范围为0.1～8.1μg/L，灵敏度为0.22～0.30μg/L，检出限为0.1μg/L，添加回收率为105％～126％。说明本发明检测方法适用于检测鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝等动物组织样品中的甲砜霉素残留。

实验结果表明：除了与氟苯尼考有交叉以外，甲砜霉素抗体与其他甲砜霉素的结构类似物或功能类似物的交叉反应率均小于0.01％，使用本发明得到的抗体建立免疫检测试剂盒即能特异、快速检测甲砜霉素，也能同时检测氟苯尼考，可以应用于实际样品中甲砜霉素残留的筛查检测，这对动物组织中甲砜霉素残留的快速检测具有很重要的现实意义。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种甲砜霉素半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述甲砜霉素半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将甲砜霉素与戊二酸酐加入高氯酸中，加热进行回流反应，得到产物A；所述回流反应的条件为40～50℃反应12～20h；

S2.将产物A溶于有机溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温条件下搅拌反应，得到产物B；

S3.将产物B溶于四氢呋喃溶液中，获得产物B溶液；将对氨甲基苯甲酸溶液滴入产物B溶液中，加入碱调节pH为8～10，室温条件下搅拌反应，得到所述甲砜霉素半抗原；S2中，所述有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1中，控制甲砜霉素与戊二酸酐的摩尔比为1～3:2；S2中，控制产物A与N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1～3:1～3；S2搅拌反应时间为16～20h；S3中，控制产物B与对氨甲基苯甲酸的摩尔比为1:0.5～1.5；S3搅拌反应时间为2～4h。

4.一种甲砜霉素抗原，其特征在于，由权利要求1所述甲砜霉素半抗原或权利要求2或3所述制备方法制得的甲砜霉素半抗原，与载体蛋白偶联反应得到。

5.根据权利要求4所述的甲砜霉素抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、鼠血清白蛋白或甲状腺球蛋白中的一种或几种。

6.权利要求4或5所述甲砜霉素抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S11.按摩尔比1～5:2～10:2～10将所述甲砜霉素半抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，4～8℃搅拌反应12～24h，离心取上清，得到甲砜霉素半抗原反应液；

S12.将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；

S13.在搅拌条件下，将甲砜霉素半抗原反应液逐滴加入载体蛋白溶液中，4～8℃搅拌反应过夜；

S14.离心取上清液，在2～4℃下用磷酸盐缓冲液透析2～3d，期间每天换液2～3次，得到所述甲砜霉素抗原。

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