CN111575184A - 可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片及制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片及其制作方法，包括基底、细胞培养室层、液体层及气体层，细胞培养室层上设置有多个细胞培养腔室，液体层上设置有细胞注入管道、培养基注入管道、细胞培养腔室进料孔，细胞培养腔室进料孔位于细胞培养腔室的正上方，且两者水平方向的位置重合，细胞培养腔室进料孔与细胞培养腔室相通，细胞注入管道与细胞培养腔室进料孔相连通，用于向细胞培养腔室注入细胞，培养基注入管道与细胞培养腔室进料孔相连通，用于向细胞培养腔室注入培养基，气体层上设置有多个进气管道，进气管道位于培养基注入管道的正上方，且两者水平方向的位置重合，进气管道内气体能够透入培养基注入管道内。

Description

可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片及制作方法
技术领域
本发明属于微流控细胞培养芯片技术领域，尤其是涉及可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片及制作方法。
背景技术
癌症已成为全世界最主要的死亡原因，肿瘤转移是导致癌症死亡的主要原因之一。癌细胞的快速增殖和肿瘤内血氧供应不足导致实体瘤内是缺氧环境，而缺氧是诱导肿瘤转移的重要原因之一。此外，由于缺氧环境降低了肿瘤化疗和放疗的效果，目前通常采用缺氧激活药物提高肿瘤治疗效果。因此，肿瘤的缺氧环境促进肿瘤转移，筛选缺氧激活治疗药物，已成为揭示癌症转移制、评价缺氧活性药物效果的重要研究方向。
现有技术中，例如中国科学院过程工程研究所开发了一种模拟肿瘤内环境和药物筛选的构建方法，专利名称：模拟肿瘤微环境的微流控芯片及肿瘤微环境的构建方法，专利号：CN109517737A；大连医科大学附属第二医院发明了一种肿瘤转移芯片，专利名称：一种用于监测肿瘤转移过程的仿生微流控芯片，专利号：CN204625653U。这些设计都围绕肿瘤转移，及相关抗癌药物筛选功能，但是缺乏肿瘤内缺氧内环境状态对肿瘤转移的影响，及缺氧依赖药物的筛选模型。
发明内容
本发明针对目前用于癌症转移研究的微流控芯片所存在的问题，而提供可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片及制作方法。
本发明提供的微流控芯片能够进行体外三维细胞培养环境溶氧调控，能够实现在缺氧条件下研究肿瘤转移机理及缺氧激活抗癌药物的筛选。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，包括由下到上依次设置的基底、细胞培养室层、液体层及气体层，
所述细胞培养室层上设置有多个细胞培养腔室，
所述液体层上设置有细胞注入管道、培养基注入管道、细胞培养腔室进料孔，所述细胞培养腔室进料孔位于细胞培养腔室的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述细胞培养腔室进料孔与细胞培养腔室相通，所述细胞注入管道与细胞培养腔室进料孔相连通，用于向细胞培养腔室注入细胞，所述培养基注入管道与细胞培养腔室进料孔相连通，用于向细胞培养腔室注入培养基，
所述气体层上设置有多个进气管道，所述进气管道位于培养基注入管道的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述进气管道内气体能够透入培养基注入管道内。
在本发明的一个实施方式中，所述液体层与气体层之间设有一个透气膜，所述透气膜使得进气管道与培养基注入管道之间相隔开，且保证进气管道内气体能够透入培养基注入管道内。
在本发明的一个实施方式中，所述透气膜为PDMS膜。
在本发明的一个实施方式中，透气膜的厚度为0.1mm。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道与培养基注入管道均为蛇形管道。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道包括多段形状与进气管道相同的区域，作为进气管道与培养基注入管道之间的气液交换区，用于实现进气管道内气体透入培养基注入管道内。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道的宽度大于培养基注入管道的宽度，保证进气管道能充分覆盖培养基注入管道，使气液交换更充分。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道的宽为0.3mm，所述培养基注入管道的宽度为0.2mm，作为进气管道与培养基注入管道之间的气液交换区的管道长度为60mm左右。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道分别设有三个，每个进气管道对应设置有相应的进气口与出气口。气体层可以输入任意比例氧浓度的气体混合。比如输入缺氧气体(5％二氧化碳，95％氮气)，常氧气体(20.9％氧气，5％二氧化碳，74.1氮气)。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道分别设有三个，第一进气管道对应设置有相应的第一进气孔与第一出气孔，第二进气管道对应设置有相应的第二进气孔与第二出气孔，第三进气管道对应设置有相应的第三进气孔与第三出气孔。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞注入管道的设置数量与细胞培养腔室的数量相同，分别通过不同的细胞注入管道实现向细胞培养腔室内注入细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞培养腔室设置有四个。可以将其中两个作为肺癌细胞培养室，另外两个作为肝细胞培养室。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞培养腔室为直径4mm高2mm的圆柱体，可以在里面3D培养细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞注入管道设置有四个，分别对应四个不同的细胞培养腔室。第一细胞注入管道相应设置有第一细胞注入孔与第一细胞流出孔，第二细胞注入管道相应设置有第二细胞注入孔与第二细胞流出孔，第三细胞注入管道相应设置有第三细胞注入孔与第三细胞流出孔，第四细胞注入管道相应设置有第四细胞注入孔与第四细胞流出孔。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道能够与每一个细胞培养腔室进料孔相连通，用于向细胞培养腔室注入培养基，所述培养基注入管道。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道设置有一个共用的培养基注入孔和两个废液孔，分别为第一废液孔和第二废液孔，在培养基注入孔接入培养基，通过培养基注入管道，将培养基运输到各个细胞培养腔室中。最后细胞培养腔室内的废液从第一废液孔和第二废液孔中流出，分别接入到不同的废液管中，以便分析细胞分泌物。
本发明还提供所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的制作方法，芯片整体使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃基底制作而成。制作方法包括以下步骤：
液体层及气体层采用软光刻技术制作而成，均为PDMS材质；
细胞培养室层是直接固化PDMS膜后，在相应位置打出细胞培养腔室而成，
基底为玻璃片均匀铺上一层PDMS所构成；
液体层与气体层之间有一层PDMS材质的透气膜；
然后把基底、细胞培养室层、液体层及气体层按图案要求重合在一起，放在80℃键合得到所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片。
在本发明的一个实施方式中，采用软光刻技术制作液体层及气体层的方法如下：在硅片上均匀涂一层光刻胶，通过设计的掩模经紫外曝光后显影洗出设计图案，然后将聚二甲基硅氧烷胶倒在所需图案的硅片上固化之后再揭下来切割打孔，得到所需的气体层和液体层。
优选地，液体层在制备时是将制作好的气体层PDMS按图案贴合在硅片上固化好的PDMS液体层上面，两者键合后再一起揭下来。这样气体层和液体层管道之间就天然存在一层PDMS膜。
在本发明的一个实施方式中，细胞培养室层厚度为2mm。
在本发明的一个实施方式中，透气膜的厚度为0.1mm。
由于PDMS具有良好的透气性，可以使流进芯片的液体经过气液交换管道之后的氧气浓度与注入气体氧浓度一致，流入下游细胞培养腔室的培养基的氧浓度通过调控注入芯片的气体氧气浓度来调节。
本发明还提供所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的应用，所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片用于研究缺氧对肺癌肝转移的影响，还能够用于进行缺氧激活抗癌药物的筛选。
与现有技术相比，本发明的优点在于：能够精确调节3D细胞培养腔室内的溶氧水平，使肺癌细胞培养腔室内的细胞处于缺氧状态中，而其下游正常肝细胞处于常氧状态。同时该芯片设计为轴对称结构，可以同时对肺癌细胞培养腔室进行常氧和缺氧调控，在其他条件相同的情况下，研究缺氧对肺癌肝转移的影响。同时，还能进行缺氧激活抗癌药物的筛选，在该缺氧依赖药物在缺氧环境中诱导癌细胞死亡，正常氧浓度环境中对正常细胞不造成损伤。该系统为集缺氧诱导癌症转移研究和缺氧激活抗癌药物筛选为一体的微流控芯片。
附图说明
图1为实施方式中可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片整体结构示意图；
图2为实施方式中可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片分解结构示意图；
图3为实施方式中可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的管道结构示意图；
图4为实施方式中可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的液体层的功能分区示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明。
本发明提供一种可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，参考图1-图4，包括由下到上依次设置的基底4、细胞培养室层3、液体层2及气体层1，所述细胞培养室层3上设置有多个细胞培养腔室31，所述液体层2上设置有细胞注入管道21、培养基注入管道22、细胞培养腔室进料孔23，所述细胞培养腔室进料孔23位于细胞培养腔室31的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述细胞培养腔室进料孔23与细胞培养腔室31相通，所述细胞注入管道21与细胞培养腔室进料孔23相连通，用于向细胞培养腔室31注入细胞，所述培养基注入管道22与细胞培养腔室进料孔23相连通，用于向细胞培养腔室31注入培养基，
所述气体层1上设置有多个进气管道11，所述进气管道11位于培养基注入管道22的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述进气管道11内气体能够透入培养基注入管道22内。
在本发明的一个实施方式中，所述液体层2与气体层1之间设有一个透气膜，所述透气膜使得进气管道11与培养基注入管道22之间相隔开，且保证进气管道11内气体能够透入培养基注入管道22内。
在本发明的一个实施方式中，所述透气膜为PDMS膜。
在本发明的一个实施方式中，透气膜的厚度为0.1mm。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道11与培养基注入管道22均为蛇形管道。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道22包括多段形状与进气管道11相同的区域，作为进气管道11与培养基注入管道22之间的气液交换区，用于实现进气管道11内气体透入培养基注入管道22内。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道11的宽度大于培养基注入管道22的宽度，保证进气管道11能充分覆盖培养基注入管道22，使气液交换更充分。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道11的宽为0.3mm，所述培养基注入管道22的宽度为0.2mm，作为进气管道11与培养基注入管道22之间的气液交换区的管道长度为60mm左右。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道11分别设有三个，每个进气管道11对应设置有相应的进气口与出气口。气体层可以输入任意比例氧浓度的气体混合。比如输入缺氧气体(5％二氧化碳，95％氮气)，常氧气体(20.9％氧气，5％二氧化碳，74.1氮气)。
在本发明的一个实施方式中，所述进气管道11分别设有三个，第一进气管道对应设置有相应的第一进气孔101与第一出气孔102，第二进气管道对应设置有相应的第二进气孔103与第二出气孔104，第三进气管道对应设置有相应的第三进气孔105与第三出气孔106。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞注入管道21的设置数量与细胞培养腔室31的数量相同，分别通过不同的细胞注入管道21实现向细胞培养腔室31内注入细胞。
参考图4，在本发明的一个实施方式中，所述细胞培养腔室31设置有四个。可以将其中两个作为肺癌细胞培养室，另外两个作为肝细胞培养室。图4中A为气液交换区域1，B为肺癌细胞培养室，C为气液交换区域2，D为肝细胞培养室。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞培养腔室31为直径4mm高2mm的圆柱体，可以在里面3D培养细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞注入管道21设置有四个，分别对应四个不同的细胞培养腔室31。第一细胞注入管道相应设置有第一细胞注入孔201与第一细胞流出孔202，第二细胞注入管道相应设置有第二细胞注入孔203与第二细胞流出孔204，第三细胞注入管道相应设置有第三细胞注入孔205与第三细胞流出孔206，第四细胞注入管道相应设置有第四细胞注入孔207与第四细胞流出孔208。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道22能够与每一个细胞培养腔室进料孔23相连通，用于向细胞培养腔室31注入培养基，所述培养基注入管道22。
在本发明的一个实施方式中，所述培养基注入管道22设置有一个共用的培养基注入孔301和两个废液孔，分别为第一废液孔302和第二废液孔303，在培养基注入孔301接入培养基，通过培养基注入管道22，将培养基运输到各个细胞培养腔室31中。最后细胞培养腔室31内的废液从第一废液孔302和第二废液孔303中流出，分别接入到不同的废液管中，以便分析细胞分泌物。
本发明还提供所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的制作方法，芯片整体使用聚二甲基硅氧烷PDMS和玻璃基底制作而成。制作方法包括以下步骤：
液体层2及气体层1采用软光刻技术制作而成，均为PDMS材质；
细胞培养室层3是直接固化PDMS膜后，在相应位置打出细胞培养腔室31而成，
基底4为玻璃片均匀铺上一层PDMS所构成；
液体层2与气体层1之间有一层PDMS材质的透气膜；
然后把基底4、细胞培养室层3、液体层2及气体层1按图案要求重合在一起，放在80℃键合得到所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片。
在本发明的一个实施方式中，采用软光刻技术制作液体层2及气体层1的方法如下：在硅片上均匀涂一层光刻胶，通过设计的掩模经紫外曝光后显影洗出设计图案，然后将聚二甲基硅氧烷PDMS胶倒在所需图案的硅片上固化之后再揭下来切割打孔，得到所需的气体层和液体层。
优选地，液体层在制备时是将制作好的气体层PDMS按图案贴合在硅片上固化好的PDMS液体层上面，两者键合后再一起揭下来。这样气体层和液体层管道之间就天然存在一层PDMS膜。
在本发明的一个实施方式中，细胞培养室层3厚度为2mm。
在本发明的一个实施方式中，透气膜的厚度为0.1mm。
由于PDMS具有良好的透气性，可以使流进芯片的液体经过气液交换管道之后的氧气浓度与注入气体氧浓度一致，流入下游细胞培养腔室的培养基的氧浓度通过调控注入芯片的气体氧气浓度来调节。
本发明还提供所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的应用，所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片用于研究缺氧对肺癌肝转移的影响，还能够用于进行缺氧激活抗癌药物的筛选。
本发明还提供一种具体的应用场景，详细说明如下：
1.水凝胶包被后的细胞通过第一细胞注入孔201、第二细胞注入孔203、第三细胞注入孔205、第四细胞注入孔207注入细胞培养腔室形成3D细胞培养环境。注入细胞后将第一细胞注入孔201、第一细胞流出孔202、第二细胞注入孔203、第二细胞流出孔204、第三细胞注入孔205、第三细胞流出孔206、第四细胞注入孔207、第四细胞流出孔208全部用封口后的针头堵住，防止细胞培养过程中培养基从这些孔流出来。
2.在培养基注入孔301接入培养基，通过培养基注入管道22，将培养基运输到各个细胞培养腔室31中，最后细胞培养腔室31内的废液从第一废液孔302和第二废液孔303中流出，分别接入到不同的废液管中，以便分析细胞分泌物。
3.从第一进气孔101中输入缺氧混合气体(5％二氧化碳，95％氮气)，第二进气孔103输入常氧气体(20.9％氧气，5％二氧化碳，74.1氮气)，74.1氮气以实现在气液交换区域将流入肺癌细胞培养室中的培养基分别调节为缺氧状态和常氧状态。从第三进气孔105输入常氧气体，将两侧流入肝细胞培养室的液体调节为常氧状态。
4.将芯片放入37度恒温箱中进行长期细胞培养。之后可以通过检测细胞培养基研究癌细胞的在不同氧水平下对正常组织的癌转移损伤指标，此外还可以进行缺氧激活抗癌药物的试验。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，包括由下到上依次设置的基底(4)、细胞培养室层(3)、液体层(2)及气体层(1)，
所述细胞培养室层(3)上设置有多个细胞培养腔室(31)，
所述液体层(2)上设置有细胞注入管道(21)、培养基注入管道(22)、细胞培养腔室进料孔(23)，所述细胞培养腔室进料孔(23)位于细胞培养腔室(31)的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述细胞培养腔室进料孔(23)与细胞培养腔室(31)相通，所述细胞注入管道(21)与细胞培养腔室进料孔(23)相连通，用于向细胞培养腔室(31)注入细胞，所述培养基注入管道(22)与细胞培养腔室进料孔(23)相连通，用于向细胞培养腔室(31)注入培养基，
所述气体层(1)上设置有多个进气管道(11)，所述进气管道(11)位于培养基注入管道(22)的正上方，且两者水平方向的位置重合，所述进气管道(11)内气体能够透入培养基注入管道(22)内。
2.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述液体层(2)与气体层(1)之间设有一个透气膜，所述透气膜使得进气管道(11)与培养基注入管道(22)之间相隔开，且保证进气管道(11)内气体能够透入培养基注入管道(22)内。
3.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述进气管道(11)与培养基注入管道(22)均为蛇形管道。
4.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述培养基注入管道(22)包括多段形状与进气管道(11)相同的区域，作为进气管道(11)与培养基注入管道(22)之间的气液交换区，用于实现进气管道(11)内气体透入培养基注入管道(22)内。
5.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述进气管道(11)的宽度大于培养基注入管道(22)的宽度，保证进气管道(11)能充分覆盖培养基注入管道(22)，使气液交换更充分。
6.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述进气管道(11)分别设有三个，每个进气管道(11)对应设置有相应的进气口与出气口。
7.根据权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片，其特征在于，所述细胞注入管道(21)的设置数量与细胞培养腔室(31)的数量相同，分别通过不同的细胞注入管道(21)实现向细胞培养腔室(31)内注入细胞。
8.如权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
液体层(2)及气体层(1)采用软光刻技术制作而成，均为PDMS材质；
细胞培养室层(3)是直接固化PDMS膜后，在相应位置打出细胞培养腔室(31)而成，
基底(4)为玻璃片均匀铺上一层PDMS所构成；
液体层(2)与气体层(1)之间有一层PDMS材质的透气膜；
然后把基底(4)、细胞培养室层(3)、液体层(2)及气体层(1)按图案要求重合在一起，放在80℃键合得到所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片。
9.根据权利要求8所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的制作方法，其特征在于，采用软光刻技术制作液体层(2)及气体层(1)的方法如下：在硅片上均匀涂一层光刻胶，通过设计的掩模经紫外曝光后显影洗出设计图案，然后将聚二甲基硅氧烷胶倒在所需图案的硅片上固化之后再揭下来切割打孔，得到所需的气体层和液体层。
10.如权利要求1所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片的应用，其特征在于，所述可以控制细胞培养环境溶氧水平的微流控芯片用于研究缺氧对肺癌肝转移的影响，还能够用于进行缺氧激活抗癌药物的筛选。
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