CN111567243B

CN111567243B - 一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法

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Publication number: CN111567243B
Application number: CN202010526046.2A
Authority: CN
Inventors: 高秀兵; 郭灿; 周玉锋; 杨文�; 孟泽洪; 李帅
Original assignee: Guizhou tea research institute
Current assignee: Guizhou tea research institute
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111567243A

Abstract

本发明涉及扦插育苗技术领域，尤其是一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，对扦插繁育茶苗，经叶面喷施球囊霉素相关土壤蛋白溶液。促进了茶苗扦插繁育效果，实现减少农药、化肥施用量，有助于提高茶苗质量，尤其能够促进茶苗生长以及保证高质量茶苗的产量。

Description

一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法

技术领域

本发明涉及扦插育苗技术领域，尤其是一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法。

背景技术

球囊霉素相关土壤蛋白(Glomalin-related soil protein，GRSP)是丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)随着宿主植物根系生长分泌产生的糖蛋白，内含有金属离子，且主要为铁离子，存在于AMF菌丝体和孢子壁层结构中，随着菌丝体和孢子降解而进入土壤。GRSP为土壤有机质的主要组成成分，是土壤有机碳的重要来源，且难溶于水，不易分解，在自然状态下稳定性较强，因此是土壤稳定性有机碳库的重要组成部分。GRSP是1996年被Wright等首次发现，普遍存在于各种生态系统土壤中，具有改良土壤有机结构、土壤特性和促进土壤物质循环等作用。

目前，GRSP提取方法较为普遍，例如专利申请号为201810597831.X、谢小林等在2011年的菌物学报30(1)：92-99中所发表的《球囊霉素相关土壤蛋白的提取条件》等文献中所进行的提取工艺与条件的研究。在所提取得到的产物中，均发现：GRPS中含有蛋白质、腐殖酸、脂质、无机物质等的混合物，还含有类酪氨酸、类色氨酸、类腐殖酸、类富里酸、类可溶性微生物代谢产物等，能够吸附或螯合土壤中金属元素养分，含有C、Al、K、P、O、Si、Ca、Fe、Mg、N、Na等对植物有益的营养元素，其中Fe含量高达0.8-8.8％，C含量高达36-59％，N含量高达3-5％，P含量高达0.03-0.1％，能够为植物生长补充丰富的营养元素，保障植物的正常生长，提高植物的生长性能。尤其是在土壤中金属离子含量下降时，球囊霉素相关蛋白能够通过可逆反应释放相应的金属离子，故而被看作是土壤中金属离子的储备库和营养库。

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科、山茶属茶树种，为灌木或小乔木，嫩枝无毛，是重要的经济作物之一。目前，茶树繁育方式主要为扦插繁育，即选用2.5-3cm半木质化，且具有一片完整的成熟叶片和一个饱满腋芽为扦插穗。相较于传统播种育苗来说，扦插繁育能够保留母穗的优良性状，便于茶园标准化生产和管理；可是，该方法也存在着：扦插插穗成活率低，生长缓慢，生根率低，茶苗移栽之后适应性差，导致移栽成活率低等缺陷。

基于此，现有技术中出现了大量关于改善茶树扦插繁育成活率，改善生长性能的研究，例如：专利申请号为201710942127.9的茶苗菌根化扦插繁育新方法中，公开了通过接种丛枝菌根真菌，以促进茶苗扦插繁育目的，且是经种植白三叶草，实现丛枝菌根真菌菌种扩繁，在苗床上接种扩繁的菌土，以促进茶苗根系生长，提高繁育茶苗质量，缩短茶苗繁育周期。但是经该文献研究显示可见，对不同AMF将对不同品种的茶树根的长度(cm)，造成不同影响，具体为下表1所示(具体参见文献说明书具体实施例部分：接种105天调查根长)：

表1

再例如：专利申请号为201910097626.1的提高茶苗田间菌根化扦插繁育效果的方法中，公开了预先在扦插苗床上撒施AMF高效菌株根内根孢囊酶，再在扦插后喷施独角金内脂，从而提高茶苗田间菌根化扦插繁育效果，使得AMF对茶苗浸染率增加，提高茶苗发芽率、愈伤组织出现率和成活率，进而提高茶苗茎高、根长、干鲜重。且在文献中开展了以福鼎大白茶树品种进行扦插育苗实现，相关指标见下表2所示(详细内容见文件说明书实施例部分介绍：接种250天，调查株高、根长、干鲜重)：

表2

可见，目前对于茶树扦插育苗方面改善，以丛枝菌根真菌接种处理，能够在一定程度上改善茶树扦插枝条的生长性能，使得扦插枝条根生长性能得到了一定幅度的改善，以此来提高茶树扦插育苗的成活率。

据相关文献报道研究，茶园土壤中含有丰富的GRSP，能够直接中茶园土壤中提取分离获得。GRSP不仅含有AMF分泌产生的糖蛋白，还含有大量的类氨基酸、类腐殖酸以及其他营养成分和金属阳离子成分，能够为作物生长补充营养，改善作物生长性能。目前，GRSP促茶苗繁育技术的研究未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

本发明创造的目的之一是提供利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，对扦插繁育茶苗，经叶面喷施球囊霉素相关土壤蛋白溶液。促进了茶苗扦插繁育效果，实现减少农药、化肥施用量，有助于提高茶苗质量，尤其能够促进茶苗生长。

采用的球囊霉素相关土壤蛋白是经采集茶园中土壤，并根据Wright andUpadhyaya(1998)的方法分离所得，其球囊霉素相关土壤蛋白浓度能够达到12.96mg/g，该浓度下，优选加入清水配制成浓度为6.48mg/g的溶液之后，再用于喷施。

具体在制备过程中：是将茶园采集来的土壤风干，称取10.00g风干土壤，加入100mL离心管中，其中，离心管中加入有摩尔浓度为20mmol/L、pH7.0的柠檬酸钠溶液8mL，充分摇匀，再在121℃、0.1MPa下灭菌30min，冷却至常温后，在4750r/min下离心10min，取棕红色上清液；再向离心管中加入与第一次等体积量的相同柠檬酸钠溶液，重复提取，直至上清液棕红色消失为止，合并上清液，即得球囊霉素相关土壤蛋白溶液。经该法所得的溶液，优选，加入清水，调配至球囊霉素相关土壤蛋白浓度为6.48mg/g的溶液后，再将其喷施。

优选，所述的叶面喷施是在扦插繁育茶苗时，待扦插在苗床上60-80d后，再采用球囊霉素相关土壤蛋白溶液进行叶面喷施。在该条件下喷施，能够充分利用叶片的光合作用，促进茶苗的改善，从而提高茶苗繁育效果，改善生长性能。

优选，所述的扦插，是选择半木质化的嫩侧枝作为扦插穗，扦插穗长为2.5-3cm，且含一片成熟叶片和一个饱满腋芽；扦插穗顶端的剪口距腋芽2mm；所述苗床，长8-10m，宽1.2-1.3m，高20-25cm，且在相邻苗床间预留10-15cm宽的人行道。

优选，所述的方法还包括在叶面喷施球囊霉素相关土壤蛋白溶液后，对茶园人工除草、喷洒1次浓度为8mL/25kg的联苯菊酯溶液来防治茶苗虫害和在追施一次尿素，追施量为20kg/亩。

本发明创造的目的之二是还提供上述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法应用于福鼎大白、湄潭苔茶、都匀毛尖、石阡苔茶的品种扦插繁育茶苗中。

本发明创造的目的之三是提供球囊霉素相关土壤蛋白在扦插繁育茶苗中的应用。

优选，所述的应用，制备成球囊霉素相关土壤蛋白溶液后，再以叶面喷施方式喷洒在扦插苗上。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

①采用GRSP喷施在茶苗中，充分利用茶苗光合作用，结合GRSP中养分，实现对养分吸收，为茶苗生长补充养分，减少了农药、尿素的使用，提高了茶苗质量，改善了茶苗生长性能，提高了达到国家二级茶苗标准的茶苗亩产量。

②利用茶园土壤作为球囊霉素相关土壤蛋白提取原料，不仅原料来源丰富，而且环保，经济，同时能够加快茶苗生长，提高茶苗的环境适应能力，保障茶苗移栽后的成活率。

具体实施方式

下面结合具体的试验和实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

试验1：

(1)GRSP溶液制备：

a)在地址为贵州省遵义市湄潭县湄江镇核桃坝村学堂组的茶园中选择茶树生长良好的地段，且在茶树行间，去除土壤表面的杂草、枯枝、石子等杂质，刮出表面土壤，再挖取0-40cm深度之间的土壤，混合均匀，置于阴凉通风处风干，待用；

b)称取10.00g风干土，加入100mL离心管中，且在离心管中加入有摩尔浓度为20mmol/L、pH7.0的柠檬酸钠溶液8mL，充分摇匀，在121℃、0.1MPa下灭菌30min，冷却至常温后，在4750r/min下离心10min，取棕红色上清液；再向离心管中加入相同的柠檬酸钠溶液8mL，重复离心提取操作，直至上清液棕红色消失为止(1-3次)，混合每次所得的上清液，即得GRSP提取液；

c)将所得的GRSP提取液作为原液，测定原液浓度，其GRSP含量为12.96mg/g；再向其中加入清水配制成6.48mg/g的溶液，即得GRSP溶液。

(2)苗床建立：

地点：贵州省遵义市湄潭县湄江镇核桃坝村学堂组：贵州省茶叶研究所茶苗繁育基地。

苗床标准：长8-10m，宽1.2-1.3m，高20-25cm，且在相邻苗床间预留10-15cm宽的人行道；深翻苗床土壤，整地耙平，再在表面覆盖一层厚为3-5cm的心土。

(3)插穗扦插：

a)于当年(2018年)5-6月份之间，在采春茶后10-15d施肥，采茶后，喷施叶面肥，促进芽叶生长，促使腋芽长成30-50cm长半木质化枝条，作为母穗；

b)剪去母穗一芽一叶或一芽二叶，打顶，促使侧芽萌发；

c)于当年(2018)10-11月份之间，待母穗侧芽长到10-15cm后，剪穗扦插，扦插穗长为2.5-3cm，且含一片成熟叶片和一个饱满腋芽；扦插穗顶端的剪口距腋芽2mm；扦插密度为株距0.5-1cm，行距3-5cm；

d)扦插前：采用水浇苗床土壤至含水量为70-80％，并压实；扦插后盖上白色塑料薄膜，且在苗床上方搭建遮阴棚，覆盖遮阳网。

(4)苗圃管理：

a)次年(2019年)3-4月份之间，揭开薄膜，保留遮阳网，人工除草，喷施GRSP溶液；

b)次年(2019年)5-6月份之间，根据茶苗实际情况，喷施联苯菊酯(8ml/25kg)防治茶树虫害；再待茶苗章到第四片叶时，开始追肥1次，追肥为尿素，追肥量为20kg/亩。

(5)试验品种：

福鼎大白茶茶树品种。

(6)试验统计指标

①在喷施GRSP溶液120d后，每个试验组随机选择三片茶苗新生长叶片(芽下第二片叶)，用LI-6400光合测定仪测定叶片净光合速率、胞间CO₂浓度、气孔导度、蒸腾速率等光合指标；用乙醇提取法测定叶片的叶绿素含量，如表3所示；

②在喷施GRSP溶液120d后，每个试验组随机选择20株茶苗，统计的株高、根长、茎粗等生长指标，如表4所示。

③在喷施GRSP溶液120d后，每个试验组随机采取7株，测定植株、根系的干重和鲜重，以监测茶苗生长情况，如表5所示。

③在每个试验组随机选择10块区域，每块区域的面积为1m²，调查达到国家二级茶苗的株数，并换算成亩产量(每亩＝666.7m²)，统计茶苗亩产量，如表6所示。

(7)试验组设计：

试验组共设为4组，每组试验扦插两个苗床，且每组苗床之间的间距为2m，具体试验组设计如下：

试验组1：将喷施GRSP溶液替换成喷施清水，其余步骤相同，记录为CK；

试验组2：采用GRPS溶液浓度为3.24mg/g喷施，其余步骤相同，记为A；

试验组3：采用GRPS溶液浓度为6.48mg/g喷施，其余步骤相同，记为B；

试验组4：采用GRPS溶液浓度为12.96mg/g喷施，其余步骤相同，记为C；

(8)试验结果：

表3.不同处理对扦插茶苗光合作用参数的影响

注：同一指标不同处理不同字母表示差异显著(P＜0.05)；下同。

由表3可知，与对照相比，喷施GRSP溶液的扦插茶苗，除对茶苗叶片胞间CO₂浓度无显著影响外，对茶苗叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b等光合作用参数均有显著改善作用。不同浓度GRSP溶液喷施比较，喷施6.48mg/g的GRSP溶液组，茶苗叶片叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b显著高于其他浓度，净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等与喷施高浓度GRSP溶液组无显著差异，但是显著高于喷施低浓度组(p<0.05)。

表4不同处理对扦插茶苗生长指标影响

注：同一指标不同处理不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

由表4可知，喷施GRSP溶液的扦插茶苗，其株高、茎粗均显著高于CK组，根长与CK组无显著差异(p<0.05)。不同浓度GRSP溶液喷施比较，喷施6.48mg/g的GRSP溶液组，对扦插茶苗株高、茎粗、根长效果更好，但相对其他组无显著差异。

表5不同试验组对扦插茶苗干、鲜重的影响

注：同一指标不同处理不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

由表5可知，喷施GRSP溶液的扦插茶苗，其根鲜重、株鲜重、根干重、株干重均高于CK组，除浓度为3.24mg/g的GRSP溶液组的根鲜重与对照(CK)无显著差异外，其余均达到显著差异(p<0.05)。不同浓度GRSP溶液比较，以喷施浓度为6.48mg/g的GRSP溶液组，对扦插茶苗根鲜重、株鲜重、根干重、株干重最好，均显著高于浓度为3.24mg/g的GRSP溶液，但部分指标(根鲜重、根干重、株干重)与喷施浓度12.96mg/g的GRSP溶液组，无显著差异。

表6不同试验组对扦插茶苗产量影响

注：同一指标不同处理不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

国家二级茶苗标准(GB11767-2003)-茶树种苗：一足龄茶苗，苗高高于20cm，茎粗大于2mm，侧根数大于2个，品种纯度为100。

由表6可知，喷施GRSP溶液的扦插茶苗，其达到国家二级茶苗标准均高于对照，除喷施浓度为3.24mg/g的GRSP溶液差异不显著外，其他浓度均达到显著水平(p<0.05)。喷施浓度为6.48mg/g的GRSP溶液组的产量最高，显著高于喷施其他浓度的GRSP溶液(p<0.05)，且与对照(CK)相比产量增加了37.45％。

经试验对比：常规扦插法繁育茶苗，需要施大量尿素，才能满足扦插茶苗的生长需求，通常施肥量达到了40-60kg/亩，相比本发明创造采用20kg/亩的施追肥来说，其用量较大，成本较高；而且，常规扦插育苗技术中，通常需要喷洒8ml/25kg的联苯菊酯2-3次来防治虫害，同时需要采用1500倍稀释液甲基托布津1-2次来防治病害，化学农药施药量大，影响环境，而本发明创造则在后续开展1次喷洒80ml/25kg联苯菊酯来防治虫害即可，大幅度减小了农药喷施量，有助于改善环境质量。

除此之外，本发明创造是将GRSP溶液进行叶面肥喷施方式对扦插茶苗进行喷施，有效改善了茶苗叶片光合性能，促进了茶苗叶片光合作用能力，进而达到提高茶苗生长性能目的。

本发明创造其他未尽事宜参照现有技术所公开的技术手段或者本领域技术人员所掌握的常规技术手段或者公知常识加以实现即可。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，其特征在于，对扦插繁育茶苗，经叶面喷施球囊霉素相关土壤蛋白溶液；

所述的球囊霉素相关土壤蛋白溶液浓度为6.48mg/g；

所述的叶面喷施是在扦插繁育茶苗时，待扦插在苗床上60-80d后，再采用球囊霉素相关土壤蛋白溶液进行叶面喷施。

2.如权利要求1所述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，其特征在于，所述的扦插，是选择半木质化的嫩侧枝作为扦插穗，扦插穗长为2.5-3cm，且含一片成熟叶片和一个饱满腋芽；扦插穗顶端的剪口距腋芽2mm；所述苗床，长8-10m，宽1.2-1.3m，高20-25cm，且在相邻苗床间预留10-15cm宽的人行道。

3.如权利要求1所述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，其特征在于，所述的球囊霉素相关土壤蛋白溶液，是从茶园中采集土壤，将土壤风干，加入离心管，且离心管中有柠檬酸钠溶液，充分摇匀，在121℃、0.1MPa灭菌30min，冷却至常温，在4750r/min下离心10min，取棕红色上清液，并反复向离心管中加入柠檬酸钠溶液，重复操作，直至上清液棕红色消失为止，混合上清液，加水调配成球囊霉素相关土壤蛋白浓度为6.48mg/g的溶液，即可。

4.如权利要求3所述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，其特征在于，所述的球囊霉素相关土壤蛋白溶液是将10.00g土壤风干，加入100mL离心管中，且离心管中含有摩尔浓度为20mmol/L、pH为7.0的柠檬酸溶液8mL。

5.如权利要求1所述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法，其特征在于，所述的方法还包括在叶面喷施球囊霉素相关土壤蛋白溶液后，对茶园人工除草、喷洒1次浓度为8mL/25kg的联苯菊酯溶液来防治茶苗虫害和在追施一次尿素，追施量为20kg/亩。

6.如权利要求1-5任一项所述的利用球囊霉素相关土壤蛋白扦插繁育茶苗的方法应用于福鼎大白、湄潭苔茶、都匀毛尖、石阡苔茶的品种扦插繁育茶苗中。

7.球囊霉素相关土壤蛋白在扦插繁育茶苗中的应用，其特征在于，制备成球囊霉素相关土壤蛋白溶液后，再以叶面喷施方式喷洒在扦插苗上；所述的球囊霉素相关土壤蛋白溶液浓度为6.48mg/g。