CN111565759B - 纳米载体及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米载体用于在体内递送特别是用于治疗肿瘤的活性物质的领域。特别地，这些纳米载体的使用使得可以在例如肿瘤组织中以更选择性的递送来改进活性物质的药代动力学。

Description

纳米载体及用途
技术领域
本发明涉及用于在体内递送特别是用于治疗肿瘤的活性物质的纳米载体领域。特别地，这些纳米载体的用途使得可以通过更选择性地递送(例如递送到肿瘤组织中)来改进活性物质的药代动力学。
背景技术
自1990年第一种商业化纳米颗粒(Sigma-Tau Pharmaceuticals,Inc.,MD,USA)进入市场以来，为了将纳米颗粒用于生物医学目的，已经进行了大量研究(C.A.Schültz et al.,Nanomedicine,2013)。在这些纳米体系中，超过20％的纳米体系通过药物递送来致力于治疗癌症。实际上，与无化疗的直接静脉注射相比，使用纳米颗粒进行药物递送具有许多优势：(i)提高药物溶解度；(ii)改进药代动力学；(iii)延长血流中的半衰期时间(/>为45小时，而游离阿霉素为10小时)(A.C.Anselmo et al.,Journal ofControlled Release,2015)；(iv)最大限度地减少了与非靶向器官递送相关的副作用(Q.Qu et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,2016)。
据发明人所知，目前，包封已在监管级别获得批准的抗癌药的大多数体系均基于聚乙二醇化或非聚乙二醇化的脂质体(基于白蛋白的除外)(A.C.Anselmo,Bioengineering&Translational Medicine,2016)(表1)。
表1：批准用于癌症的纳米颗粒
尽管取得了少数成功，但是与致力于所述纳米体系的研究工作相比，临床使用的纳米体系的数量仍然很少。近期研究表明，即使包封在脂质体中的阿霉素制剂已显示出对动物有效，但它们仍在努力表明对人的临床益处(G.H.Petersen et al.,Journal ofControled Release,2016)。
除了在人中显示功效的这些困难外，从化学角度来看，这些体系通常被证明是复杂的，这使得它们的合成昂贵且难以转入工业规模(J.Shi et al.,Nature ReviewsCancer,2017)。新的研究导致许多纳米体系太大而无法在肿瘤中有效渗入的想法。因此，即使对于流体动力学直径为约100nm的脂质体，从血管开始，对肿瘤的渗透也仅限于几个细胞层(A.A.Manzoor et al.,Cancer Research,2012)。这种限制与活性物质从纳米颗粒中的相对缓慢的释放相结合，可能使得难以以有效浓度递送活性物质。
与在有机纳米颗粒上完成的工作同时，还开发了无机纳米颗粒。除了用于IRM的氧化铁(GastroMARKTM、/>等)外，2013年还没有一个产品进入市场(C.A.Schültz et al.,Nanomedicine,2013)，这通常是出于潜在毒性的原因。开发用于生物医学应用的无机纳米颗粒的原因之一是要利用可以在纳米级出现的特性：氧化铁的磁热疗/>(K.Maier-Hauff et al.,Journal of Neurooncology,2011)、金纳米颗粒的光学高温疗法/>(J.M.Stern et al.,International Journalof Toxicology,2016)等。
与这些应用并行的是，已经开发了用于药物递送的多孔无机纳米体系。在这些多孔体系中，介孔二氧化硅纳米颗粒已经取得了许多进展，由于它们的良好生物相容性以及它们的低细胞毒性，它们在2000年代初被提议应用于肿瘤学(M.Vallet-Regi et al.,Chem.Mater.,2001)。对于比表面积为200-1000m2.g-1的物体，这些纳米颗粒的孔可以以尺寸2-50nm获得(Y.Yang,Nanomedicine:NBM,2016)。然而，应该指出的是，具有小于50nm的尺寸的介孔二氧化硅纳米颗粒仍然难以合成并且具有聚集的趋势(F.Lu et al.,Small,2009)。
为了增加渗入和肿瘤穿透，研究人员因此越来越强调减小纳米体系的尺寸(Z.Popovic et al.,Angew.Chem.Int.Ed..,2010)。但是，将纳米颗粒的尺寸减小到10nm以下会阻止合成稳定的多孔结构。
因此，目前仍然需要开发用于递送活性物质的新的纳米载体，其将表现出以下一项或多项优势：
-非常高的表面积/体积比，有利于高度的活性物质负载量，
-快速消除肾脏中的纳米载体，限制了毒性问题，
-施用后用活性物质治疗肿瘤的深层渗入和穿透，
-快速有效地体内释放活性物质，
-有可能在体内施用后通过成像(MIR、扫描或闪烁显像)监测纳米载体，
-通过结合在一个和同一纳米物体中的高Z金属螯合物的放射增敏方面，有可能通过放疗进行补充治疗作用。化疗和放疗的联合作用可能使克服多重耐药细胞的辐射抗性成为可能。
通过本公开中描述的纳米载体获得这些优点和许多其他优点。
发明内容
在这种情况下，发明人实际上已经注意到，可以使用最近的策略来合成流体动力学直径小于5nm的聚硅氧烷的稳定纳米颗粒(例如，F.Lux et al.,Angewandte ChemistryInternational Edition,2010)，以开发用于药物递送的新的纳米载体，所述纳米载体通过在基于聚硅氧烷的超细纳米颗粒的表面上对活性物质的简单物理吸附来负载。这些超细纳米颗粒的高表面积/体积比使得可以为纳米载体获得高度的活性表面负载量。
在一个有利实施方案中，纳米颗粒在其表面上还具有金属螯合物，使其具有多模态性，特别是作为造影剂或放射增敏剂。
因此，本公开涉及制备用于在人或动物中递送活性物质的纳米载体的方法，所述方法包括将可以在人或动物中施用的两种溶液混合：
·第一溶液，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒选自平均直径小于10nm，优选小于5nm的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，和
·第二溶液，其包含选自有机分子的活性物质或活性物质的混合物，该有机分子优选具有为所述纳米颗粒分子量的2％-40％，优选为所述纳米颗粒分子量的5％-25％的分子量，在浓度比、pH和温度条件下，其允许通过所述活性物质在所述纳米颗粒表面上的物理吸附而相互作用。
为了本发明的目的，术语“纳米载体”表示颗粒药物系统，其特征在于：
-具有生物相容性结构(其不会引起毒性反应)，
-易于从生物体中清除，
-为了确保所述活性物质的运输和释放，最好是在生物学靶标上的活性物质负载，
-小于100nm的尺寸。
根据本公开的术语“纳米载体”表示具有其活性物质负载的纳米载体。
可用于制备纳米载体的纳米颗粒
可用于制备纳米载体的纳米颗粒包含两个基本特征：
-它们是基于聚硅氧烷的，
-它们具有非常小的平均直径，例如小于10nm，优选小于5nm的流体力学直径。
为了本发明的目的，术语“平均直径”意指颗粒直径的调和平均值。例如，使用商业粒度仪(例如其特征在于平均流体动力学直径的基于PCS(光子相关光谱法)的MalvernSizer Nano-S粒度仪)来测量纳米粒径分布。在标准ISO 13321：1996中也描述了测量该参数的方法。
术语“基于聚硅氧烷的纳米颗粒”意指其特征在于硅的重量百分比至少为8％的纳米颗粒。
术语“聚硅氧烷”表示由一系列硅氧烷组成的无机交联聚合物。
可以相同或不同的聚硅氧烷结构单元具有下式：
Si(OSi)nR4-n
其中，
R是通过Si-C共价键与硅结合的有机分子，
n是1-4的整数。
作为优选实例，术语“聚硅氧烷”特别涵盖由原硅酸四乙酯(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)通过溶胶-凝胶法缩合得到的聚合物。
在一个特定实施方案中，可用于制备纳米载体的纳米颗粒是基于聚硅氧烷和任选地与金属元素络合的螯合物的纳米颗粒。
在此优选实施方案中，它们包含以下成分或基本上由以下成分组成：
(i)聚硅氧烷，其硅的重量比为所述纳米颗粒总重量的至少8％，优选为所述纳米颗粒总重量的8％-50％，
(ii)螯合剂，优选以每纳米颗粒5-100个，优选5-20个的比例，
(iii)在适当情况下，金属元素，例如以每纳米颗粒5-100个，优选5-20个的比例，所述金属元素与螯合剂络合。
为了本公开的目的，术语“螯合剂”意指能够络合金属阳离子的有机基团。例如，在一个特定实施方案中，螯合剂选自其络合常数log(KC1)相对于目标金属阳离子大于15，优选大于20的那些。
因此，螯合剂的功能是络合纳米载体的任选的无机元素(例如金属阳离子)并减少其在人或动物中施用纳米载体后的释放。
螯合剂可以通过将以下产品之一接枝(共价结合)到纳米颗粒上而获得(在接枝到纳米颗粒上之前)：
ο聚羧酸聚氨基酸及其衍生物，甚至更优选地选自下组：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、下式(I)的DO3A-吡啶：
EDTA(2,2',2”,2”’-(乙烷-1,2-二基二氮基)四乙酸)、EGTA(乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸)、BAPTA(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1.]十五碳-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸)、DOTAGA(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)戊二酸)和以下式(II)的TMPAC：
及其混合物。
ο包含卟啉、氯、1,10-菲咯啉、联吡啶、三联吡啶、环己酰胺、三氮杂环壬烷、其衍生物及其混合物的组的产品；
及其混合物。
优选地，上述螯合剂通过共价键直接或间接键合至纳米颗粒的聚硅氧烷的硅。术语“间接”键合意指在纳米颗粒和螯合剂之间存在分子“接头”或“间隔基”，所述接头或间隔基共价键合至纳米颗粒的成分之一。
在一个优选实施方案中，通过将DOTAGA接枝到纳米颗粒上获得螯合剂。
在一个实施方案中，可用于制备纳米载体的纳米颗粒不包含金属元素。
在另一个实施方案中，纳米颗粒可以包含离子形式的金属元素，例如阳离子或非离子形式。
以金属阳离子为例，可以优选选择可以特别是根据所需的应用被螯合剂络合的金属阳离子，
-碱土金属阳离子，
-碱金属阳离子及其放射性同位素，
-过渡金属阳离子及其放射性同位素，
-后过渡金属阳离子及其放射性同位素，
-稀土阳离子及其放射性同位素，
-及其混合物。
在另一个实施方案中，金属元素选自碱土金属阳离子，特别是镁和/或钙。
特别地，取决于所需应用，金属元素选自具有高原子序数Z的金属阳离子。
在下文中，术语“高Z元素”是指原子序数Z至少大于40，优选大于50的元素(以其离子或非离子形式)。
具有高原子序数Z的金属元素特别用于联合使用用于递送抗癌物质纳米载体以及在放疗中作为扫描造影剂或放射增敏剂的作用。
为了联合使用用于递送抗癌物质纳米载体以及在居里疗法或闪烁显像术中的作用，金属元素也可以选自适当的同位素。
为了联合使用用于递送抗癌物质纳米载体以及磁共振成像，还可以选择具有适当磁性的金属元素。
过渡金属特别包含Hf、Cu、Pt、Au、Tc、Y、Mn、Ru、Fe和Zr及其混合物。
后过渡金属包含Bi、Ga和In及其混合物。
稀土金属包含镧系元素，诸如Gd、Dy、Eu、Tb、Nd、Yb、Er、Ho和Lu、及其混合物，优选为Gd。
Gd、Dy、Mn和Fe可在磁共振成像(MRI)中更特别地用作造影剂。
Eu、Tb、Nd、Yb和Er可更特别地用作成像中的荧光剂。
Ho、Bi、Y和Lu可特别地用作居里疗法的试剂。
Lu、Yb、Gd、Bi、Hf和Ho可特别地用作放射增敏剂。
Cu、Ga、Tc、Y、In和Zr可特别地用作闪烁显像仪的探针。
在一个具体实施方案中，每个纳米颗粒的高Z元素(例如，镧系元素，例如Gd)的比例为每个纳米颗粒5-100个，优选5-20个高Z元素。
在甚至更优选的实施方案中，纳米颗粒包含：
-聚硅氧烷，
-DOTAGA，其作为与聚硅氧烷共价键合的螯合剂，
-Gd3+阳离子，其与螯合剂络合。
基于聚硅氧烷和基于金属元素螯合物的纳米颗粒是本领域技术人员众所周知的。特别在以下出版物中描述优选实施方案：WO2011/135101，WO 2013/153197。
超细纳米颗粒
用于制备根据本发明的纳米载体的更特别优选的实施方案是被称为“超细”或“无机-无核(inorganic-core-free)”的纳米颗粒，其基于聚硅氧烷并且平均直径小于10nm，或者甚至小于5nm。
这些超细纳米颗粒实际上积累了多模态性和被动靶向肿瘤(在其表面不存在靶向分子)的优势，特别是通过EPR(“增强的渗透性和滞留性”)效应。因而，它们特别适用于制备根据本公开的纳米载体，特别是与抗癌物质联合用于抗癌治疗，特别是用于化疗或将化疗与至少一种选自放疗或居里疗法的其他疗法联合。
除了体积小之外，与许多核-壳型纳米颗粒相反，它们的特征还在于不存在基于金属元素的无机核。超细纳米颗粒的特征在于下式(I)：
Sin[O]m[OH]o[Ch1]a[Ch2]b[Ch3]c[My+]d[Dz+]e[Gf]f (I)
其中：
·n为20-5000，优选为20-200，
·m大于n且小于4n，
·o为0-2n，
·Ch1、Ch2和Ch3是潜在的螯合有机基团，其可以相同或不同，其通过Si-C共价键与聚硅氧烷的Si原子连接；a、b和c是0-n的整数，并且a+b+c小于或等于n，优选a+b+c为5-100，例如为5-20，
·My+和Dz+是金属阳离子，其可以彼此相同或不同，y和z＝1-6；d和e是0-a+b+c的整数，并且d+e小于或等于a+b+c，
·Gf是靶向移植物，其可以彼此相同或不同，每个都通过Si-C键与Si连接，并且通过允许将纳米颗粒靶向目标生物组织，例如肿瘤组织的靶向分子的接枝而实现，f是0-n的整数。
在一个具体实施方案中，超细纳米颗粒具有下式(II)：
Gd5-20Si20-100C150-600N25-150O100-500Hx (II)
H取决于其他原子的数目并且难以测量，例如，通过元素分析，数目x(整数)未在式(II)中表示。
这些纳米颗粒的平均直径优选小于5nm。
为了方便起见，以下将式(I)或式(II)的纳米颗粒称为“超细纳米颗粒”。
有利地，根据下述方式之一获得上述通式的这些纳米颗粒。
获得超细纳米颗粒的方法
可以通过原始的“自上而下”方法获得超细纳米颗粒，其基本步骤如下：
a.制备金属元素(M)氧化物的无机核，M优选选自稀土金属和过渡元素，任选地掺杂有掺杂剂(D)，D是不同于M的金属元素，其选自稀土金属和/或过渡元素，
b.通过溶胶-凝胶缩合合成围绕金属元素(M)氧化物核的聚硅氧烷壳，
c.通过-Si-C-共价键将螯合剂接枝到聚硅氧烷上，以获得核-壳前体纳米颗粒，和
d.将核-壳前体纳米颗粒转移到水溶液中，所述螯合剂的量足以导致金属元素(M)氧化物的无机核溶解并与所述金属元素(M)和(适当时)掺杂剂(D)形成络合物，
所述无机核的溶解导致最终纳米颗粒相对于前体纳米颗粒的直径减小，超细颗粒的最终平均直径为1-5nm。
实际上，该方法将通过以下方式进行：
通过溶胶/凝胶合成，经由用聚硅氧烷壳改性的多元醇路线制备具有金属元素氧化物(例如稀土氧化物)核的核/壳型前体纳米颗粒。例如，该物体的尺寸为5-10nm。
更具体地，可以通过以下出版物中描述的方法之一在醇中制备非常小尺寸(可以调节，小于10nm)的金属元素氧化物的无机核(P.Perriat et al.,J.Coll.Int.Sci,2004,273,191；O.Tillement et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5076和P.Perriat et al.,J.Phys.Chem.C,2009,113,4038)。在合成无机核的步骤之后，可以通过遵循例如以下出版物中描述的方案，用聚硅氧烷层涂覆这些无机核：C.Louis et al.,Chem.Mat.,2005,17,1673和O.Tillement et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5076。
接下来，将特定于目标金属元素的螯合剂接枝到聚硅氧烷的表面；所述螯合剂的一部分也可以插入层内，但是控制聚硅氧烷的形成是复杂的，并且简单的外部接枝以这些非常小的尺寸提供了足够的接枝比例。
然后，可以通过渗析或切向过滤的方法，在包含合适尺寸的孔的膜上，将纳米颗粒与合成残余物分离。
在随后的步骤中，无机核在转移至水性介质后通过溶解而被破坏(例如，通过改变pH值或通过将螯合剂引入溶液中)。然后，无机核的这种破坏允许聚硅氧烷层的散布(根据缓慢腐蚀或塌陷的机理)，这使得最终可以得到超细纳米颗粒，即具有复杂形态的聚硅氧烷物体，其特征尺寸大约为初始聚硅氧烷层的厚度的数量级。
超细纳米颗粒具有高含量的螯合剂和金属元素，因为它们最初接枝在聚硅氧烷表面，并且尺寸很小，该表面占颗粒材料的比例很高；表面与体积之比作为尺寸(计为1/r(半径))的函数而变化。在这种结构塌陷机理中，其他络合物也可以结合到新形成的“新鲜”表面直至饱和。因此，获得的络合剂含量远高于用较细的二氧化硅颗粒的表面常规官能化所获得的络合剂含量，前提是这类颗粒的可用性。特别地，螯合剂与纳米颗粒的比率可以为5-100，优选为5-20。
因此，去除核可以将其从约5纳米或更大的平均粒径减小到小于5nm的尺寸。此外，与相同尺寸但仅在表面上包含M(例如钆)的理论聚硅氧烷纳米颗粒相比，该操作使得可以增加每nm3的金属元素M(例如钆)的数量。
可以借助于通过EDX或通过元素分析测量的M/Si原子比来评估纳米尺寸的金属元素M的数量。它通常基本上类似于每个纳米颗粒的螯合剂的数量，例如为5-100，优选为5-20。
关于这些超细纳米颗粒，其合成方法及其应用的进一步细节在专利申请WO 2011/135101中(该专利申请以引用方式并入本文)，以及在论文Mignot et al.,2013,Chem.Eur.J.2013,19,6122-6136中有所描述。
通过“一锅法”合成纳米颗粒
在另一实施方案中，可以通过以下方法获得直径小于10nm且包含聚硅氧烷(在适当的情况下，包含金属元素螯合剂)的无机-无核超细纳米颗粒：
“一锅法”合成方法在于将至少一种在生理pH下带负电荷的硅烷与以下混合
-至少一种在生理pH下为中性的硅烷，和/或
-至少一种在生理pH下带正电荷的硅烷，
其中：
-中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比A定义如下：0≤A≤6，优选0.5≤A≤2；
-带正电荷的硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比B定义如下：0.25≤B≤3，优选0.5≤B≤2；
-带正电荷的或中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比C定义如下：0≤C≤8，优选1≤C≤4。
然后，所述纳米颗粒可以结合其它分子，诸如螯合剂或靶向移植物。
术语“生理pH”对应于pH7.4。
术语“硅烷”是指包含被四个取代基包围的硅原子的化合物。
在优选实施方案中，硅烷选自烷氧基硅烷、羟基硅烷及其混合物。可在该实施方案中使用的硅烷的实例是以下实例：原硅酸四乙酯(Si(OC2H5)4，也称为TEOS)、原硅酸四甲酯(Si(OCH3)4，也称为TMOS)、氨丙基三乙氧基硅烷(H2N(CH2)3-Si(OC2H5)3，也称为APTES)、APTES-DOTAGA、N-(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺三乙酸三钠盐((CH3O)3Si-(CH2)3N(CH2COONa)(CH2)2N(CH2COONa)2，也称为TANED)和羧基乙基硅烷三醇钠盐((HO)3Si-(CH2)2COONa，也称为CEST)。
本文使用的术语硅烷还包含含有螯合的金属阳离子的硅烷化合物。本文使用的术语硅烷还包含将如下所述的任何靶向试剂共价接枝到硅烷前体上获得的化合物。
本文使用的术语“烷氧基硅烷”是指式(III)化合物：
RnSi(ORi)4-n (III)
其中：
-R是有机基团；
-Ri是包含1-12个碳，优选1-6个碳的烷基；
-n为0、1、2或3。
根据一个特定实施方案，n为0或1。
本文使用的术语“羟基硅烷”是指式(IV)化合物：
RnSi(ORi)4-n (IV)
其中：
-R是有机基团；
-n为0、1、2或3。
根据一个实施方案，n为0或1。
本文使用的术语“有机基团”是指通过Si-C键与硅原子键合的任何有机基团，而与官能化类型无关。有机基团的实例包含但不限于烷基胺。
本文使用的术语“烷基”是指直链或交联烷基。所需的烷基包含：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、戊基及其异构体(例如正戊基、异戊基)以及己基及其异构体(即正己基、异己基)。
根据该方法的一个优选实施方案，获得的纳米颗粒的平均流体动力学直径为0.5-15nm，优选为0.5-10nm。
在一些特定实施方案中，硅烷(选自烷氧基硅烷、羟基硅烷及其混合物)可以占试剂总重量的至少80％、85％或90％，该试剂是用于合成纳米颗粒的起始化合物。
该反应可以在质子溶剂(诸如醇或水溶液)中进行。在一个特定实施方案中，唯一使用的溶剂是水。在其他实施方案中，反应在醇或醇混合物中进行。可用于该实施方案的醇包含在以下列表中：乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇、乙二醇和二甘醇。
该反应优选在胶体溶液中进行，这允许更好地控制纳米颗粒的尺寸。因此，为了避免形成交联凝胶，反应不是通过常规的溶胶-凝胶法进行的。
该方法的优点之一是可以通过“一锅法”反应进行，从而可以避免纯化和分离中间产物的步骤。
优点在于，选择特定比例A、B和C允许控制表面电荷以及二氧化硅颗粒的尺寸，特别是对于生产具有0.5-15nm的流体动力学直径的纳米颗粒。特别地，为了将纳米颗粒的尺寸减小至低于10nm，优选具有例如低于2且更优选低于1.5的比率。
根据一个特定实施方案，混合步骤包含至少一种带正电的硅烷，带正电的硅烷包含至少一种带正电的胺官能团。APTES是包含带正电荷的胺官能团的硅烷的实例。
在一个实施方案中，反应包含将至少一种在生理pH下带负电荷并且包含至少一种螯合剂的羟基硅烷或烷氧基硅烷与以下混合：
-至少一种在生理pH下为中性的羟基硅烷或烷氧基硅烷，和/或
-至少一种在生理pH下带正电荷并且包含氨基官能团的羟基硅烷或烷氧基硅烷，
其中：
-中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比A定义如下：0≤A≤6，优选0.5≤A≤2；
-带正电荷的硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比B定义如下：0≤B≤5，优选0.25≤B≤4；
-带正电荷的或中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比C定义如下：0≤C≤8，优选1≤C≤4。
根据一个特定实施方案，该合成包含将至少一种在生理pH下带负电荷的烷氧基硅烷(所述烷氧基硅烷选自APTES-DOTAGA、TANED和CEST及其混合物)与以下混合：
-至少一种在生理pH下为中性的烷氧基硅烷，所述烷氧基硅烷选自TMOS、TEOS及它们的混合物；和/或
-在生理pH下带正电荷的APTES，
其中：
-中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比A定义如下：0≤A≤6，优选0.5≤A≤2；
-带正电荷的硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比B定义如下：0≤B≤5，优选0.25≤B≤4；
-带正电荷的或中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比C定义如下：0≤C≤8，优选1≤C≤4。
根据一个特定实施方案，该合成包含将在生理pH下带负电荷的APTES-DOTAGA与以下混合：
-至少一种在生理pH下为中性的烷氧基硅烷，所述烷氧基硅烷选自TMOS、TEOS及它们的混合物，和/或
-在生理pH下带正电荷的APTES，
其中：
-中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比A定义如下：0≤A≤6，优选0.5≤A≤2；
-带正电荷的硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比B定义如下：0≤B≤5，优选0.25≤B≤4；
-带正电荷的或中性硅烷数量与带负电荷的硅烷数量的摩尔比C定义如下：0≤C≤8，优选1≤C≤4。
靶向分子
纳米颗粒还可包含直接或间接共价键合至纳米颗粒的硅的靶向试剂。靶向分子的实例如下所述。将靶向剂接枝在纳米颗粒的表面，并且以每纳米颗粒1-20个靶向试剂，优选1-5个靶向试剂的比例存在。
对于靶向分子的表面接枝，可以使用与存在的反应性基团的常规偶联，任选地在活化步骤之前。偶联反应是本领域技术人员已知的，并且将根据纳米颗粒表面层的结构和靶向分子的官能团进行选择。例如，参见“Bioconjugate Techniques”,G.T Hermanson,Academic Press,1996,in“Fluorescent and Luminescent Probes for BiologicalActivity”,Second Edition,W.T.Mason,ed.Academic Press,1999。优选的偶联方法描述如下。优选地，根据之前章节所述的“无核”超细纳米颗粒变体，将这些靶向分子接枝到纳米颗粒的螯合剂上。
根据设想的应用选择靶向分子。
在一个具体实施方案中，将选择适合于肿瘤的主动靶向的分子。以靶向可接枝到纳米颗粒上的分子为例，可以提及含有能够识别αvβ3整联蛋白的RGD三肽的分子。这种肽及其衍生物(特别是环五肽)特别描述于WO 2004/026894中。
适合于靶向肿瘤组织的靶向分子已在例如国际公开WO01/00621中进行了描述，并且包括季铵衍生物、适配子、多肽、抗体等。
可用于制备纳米载体的活性物质
为了本发明的目的，术语“活性物质”意指：
(i)对人或动物疾病具有治愈或预防作用的任何物质，
(ii)可以用于人或动物，或者可以通过发挥药理、免疫或代谢作用而用于恢复、校正或改变生理功能的任何物质。
优选地，可用于制备根据本公开的纳米载体的活性物质是有机分子。
在本公开中，术语“有机分子”意指基本上由以下元素组成的分子：C、H、O、N、P、S。它们可以是生物学或合成来源的分子。为了本发明的目的，术语“有机分子”还涵盖螯合金属(特别是选自Pt、Ti、Ru、Au和Rh的金属)的有机化合物。
特别地，可用于制备纳米载体的活性物质选自有机分子，该有机分子的分子量为纳米颗粒重量的2％-40％，优选为纳米颗粒重量的5％-25％。
在一个特定实施方案中，可用于制备纳米载体的活性物质是分子量至多5000g.mol-1，优选为100-2000g.mol-1的有机分子(以下记为“小分子”)。
在另一实施方案中，它们是核酸，特别是寡核苷酸、核糖核酸(RNA)、microRNA、siRNA(短干扰RNA)或iRNA(干扰RNA)。
在另一实施方案中，它们是至多50个氨基酸，例如5-30个氨基酸的肽。
在一个具体实施方案中，活性物质选自抗癌物质。
作为抗癌物质的实例，可以提及以下分子：放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、多西氟啶、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、达比丁、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、托泊替康、戊柔比星、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、来那度胺、依鲁替尼、阿比特龙、厄洛替尼、依维莫司、尼洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、戈舍瑞林、奈达铂、乐铂和依铂或其混合物。
在一个特定实施方案中，活性物质选自阿霉素、TATE肽和顺铂或其混合物。
根据本公开的纳米载体的制备
用于制备根据本公开的纳米载体的方法在于将可以在人或动物中施用的两种溶液混合：
·第一溶液，其包含基于聚硅氧烷的平均直径小于10nm，优选小于5nm的纳米颗粒，和
·第二溶液，其包含活性物质或活性物质的混合物，
在浓度比、pH和温度条件下，其允许通过所述活性物质在所述纳米颗粒表面上的物理吸附而相互作用。
为了本公开的目的，术语“通过物理吸附而相互作用”意指范德华相互作用，特别是不包括配体/受体、抗原/抗体或其他分子特异性分子相互作用等类型的特定蛋白质/蛋白质相互作用。
在之前章节中已经描述了可用于制备纳米载体的纳米颗粒和活性物质，特别是某些优选的实施方案。
为了本公开的目的，负载量对应于连接至纳米载体的活性物质的量，以mg/克纳米颗粒表示。
在一个特定实施方案中，确定[第二溶液中的活性物质]：[第一溶液中的纳米颗粒]的重量浓度比，以允许纳米颗粒的活性物质负载量大于0.5mg/g，优选大于1mg/g，例如为1mg/g-100mg/g。
本领域技术人员将能够根据所选择的纳米颗粒和活性物质的结构容易地确定最佳浓度、pH和温度比，特别是为了优化活性物质负载量。
在一个具体实施方案中，该第一溶液是纳米颗粒(例如超细纳米颗粒)的胶体水溶液，其浓度为5-500g.L-1，pH为6-8。
在一个可以优选与前述实施方案联合的具体实施方案中，该第二溶液是活性物质的水溶液，其pH为6-8，浓度为1mg.L-1-10g.L-1。
发明人已经证明，可以通过两种溶液的简单混合，通过在基于聚硅氧烷的纳米颗粒的表面上物理吸附来连接活性物质。
因此，有利地，在将其施用于受试者之前，不必纯化在混合步骤之后获得的纳米载体。
但是，如果需要，可以进行纯化在混合溶液后获得的纳米载体的步骤，以去除在溶液中保持游离的可能的活性物质，以回收所述包含纳米颗粒的纳米载体，所述活性物质通过物理吸附键合到所述纳米颗粒的表面。
用于在人中递送活性物质的纳米载体
因此，本公开涉及用于在人中递送活性物质的纳米载体，其包含纳米颗粒，所述活性物质通过物理吸附键合到所述纳米颗粒的表面，其特征在于，所述纳米颗粒选自平均直径小于10nm，优选小于5nm的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，并且所述活性物质选自摩尔量为所述纳米颗粒重量的2％-40％，优选为所述纳米颗粒重量的5％-25％的有机分子。
该纳米载体可以通过混合上述两种溶液的简单方法直接或间接获得。
在一个具体实施方案中，所述纳米颗粒包含：
(i)基本上由以下成分组成的纳米颗粒：
a.聚硅氧烷，其特征在于硅的重量百分比8％-50％，
b.螯合剂，优选以每纳米颗粒5-100个，优选5-20个的比例，
c.在适当情况下，金属元素，例如Gd或Bi，优选以每纳米颗粒5-100个，优选5-20个的比例，所述金属元素与螯合剂络合；以及
(ii)活性物质，其通过物理吸附键合到纳米颗粒表面。
在前述实施方案的更优选实施方案中，纳米颗粒是如上所述的超细纳米颗粒。在使用超细纳米颗粒的甚至更特定的实施方案中，超细纳米颗粒包含作为螯合剂接枝到超细纳米颗粒表面的DOTAGA，和作为络合到DOTAGA的金属元素的Gd或Bi。
包含纳米载体的药物组合物
将如上所述的纳米载体有利地配制为与至少一种药学上可接受的赋形剂一起在人中施用。
因此，本发明涉及包含根据本公开的纳米载体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
特别地，药物组合物是包含如上所述的纳米载体和具有有效剂量的活性物质的至少一种药学上可接受的赋形剂的可注射药物溶液。
药学上可接受的赋形剂可以包括任何可以在人或动物中施用并且实质上不改变生物中活性物质的生物学活性的成分。它们特别描述于参考书Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company中。
在一个具体实施方案中，所述可注射药物溶液的特征在于，纳米载体包含金属元素，优选铋或钆，并且在于所述金属元素的浓度为5-200mM。
在可与前述实施方案联合的一个实施方案中，所述可注射药物溶液的特征在于所述纳米载体包含抗癌活性物质。
在可与前述实施方案联合的一个特定实施方案中，纳米载体的所述活性物质选自阿霉素、顺铂和TATE肽。
有利地，可注射药物溶液通过如上所述混合两种溶液以制备纳米载体的步骤直接获得，而无需随后的纯化步骤。它们可以预先制备，然后在施用于患者之前储存，或者恰好在将其施用于混合物之前，通过将2种溶液混合制备(例如在向患者施用之前，少于4小时、少于3小时、少于1小时，或少于30分钟、或少于15分钟)。
因此，本发明涉及用于制备如上所述的纳米载体或可注射溶液的试剂盒，该试剂盒包含至少两个单独的容器，一个容器包含为待混合形式或浓缩形式的第一溶液并且另一个容器包含含有活性物质的第二溶液。在适当的情况下，可以将一种或两种溶液替换为待在稀释溶液中稀释的冻干物，以获得适合于混合的水溶液。任选包括在所述试剂盒中的所述稀释溶液还可以包含用于在人中施用的缓冲液或其他药学上可接受的赋形剂。
根据本公开的纳米载体和可注射溶液的用途
由于纳米颗粒的被动靶向特性，特别是针对肿瘤的被动靶向特性，上述纳米载体和可注射溶液可特别用于治疗人或动物中的癌症，所述活性物质选自抗癌物质，特别是细胞毒性物质。
通过基于聚硅氧烷的纳米颗粒，特别是超细纳米颗粒被动靶向肿瘤已描述于Detappe et al.,Nano Letters 2017；C.Verry et al.,Nanomedicine,2016；Dufort etal.,Small 2015Bianchi et al.,PNAS,2014。
因此，本公开还涉及用于治疗患者癌症的方法，包括向所述患者施用所述纳米载体，所述纳米载体包含有效剂量的作为用于治疗所述癌症的活性物质的抗癌物质。
在之前章节中提供了抗癌物质的实例。
根据本公开的纳米载体可特别用于通过化疗治疗实体瘤，特别是：中枢神经系统、肺、前列腺、子宫、结肠、胰腺、肝、肾、乳腺、头颈、或结肠肿瘤。该列表当然是非限制性的。
除了其高的活性物质负载量外，纳米载体还可以包含高负载量的金属阳离子螯合物形式的放射增敏剂。因此，在一个特定实施方案中，用于治疗癌症的纳米载体的用途的特征在于，其包含纳米颗粒(所述纳米颗粒包含具有放射增敏作用的原子序数大于40的元素的螯合物)，优选如上所述的超细纳米颗粒，并且在于，在待治疗的受试者中施用有效剂量的所述纳米载体允许通过联合化疗和放疗效果来治疗癌症。
有利地，由于活性物质在纳米颗粒上的物理吸附，因此活性物质应表现出改进的药代动力学，特别是通过EPR作用更好地靶向肿瘤，如在许多临床前模型中对超细聚硅氧烷纳米颗粒所指出的以及Detappe et al.,Nano Letters 2017；C.Verry et al.,Nanomedicine,2016；Dufort et al.,Small 2015；Bianchi et al.,PNAS,2014中所描述的。
根据本发明的纳米载体(或可注射溶液)可以优选地静脉内、肿瘤内、腹膜内、动脉内或经由气道(例如鼻内或气管内)施用，特别是如公开WO 2013/153197中所述。
纳米载体还允许通过选择包含金属元素螯合物的纳米颗粒(特别是在MRI、扫描或闪烁照相术中用作造影剂)通过放疗进行治疗。
因此，在一个具体实施方案中，其中纳米载体包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含用于通过磁共振成像、扫描或闪烁显像成像的造影剂，并且在待治疗的受试者中施用有效剂量的所述纳米载体，使得有可能监测治疗的疗效。
本公开还涉及用于监测人或动物中的治疗处理的治疗功效的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在治疗开始后，向患者施用上述纳米载体，其包含有效剂量的造影剂和有效剂量的活性物质，
(ii)通过适当的成像技术捕获图像，以便借助造影剂可视化病变，
(iii)在治疗患者期间，重复步骤(i)和(ii)，必要时进行多次，
(iv)通过比较治疗期间病变的进展来推导疗效。
该方法的具体应用涉及监测人或动物中的治疗的疗效，例如抗肿瘤治疗，例如通过针对实体瘤的化疗、放疗、居里疗法、光疗或热疗。
在一个优选实施方案中，本发明针对用于监测在人或动物中抗肿瘤治疗的疗效的方法，特别是化疗治疗，并在适当的情况下与放疗、居里疗法、光疗或热疗治疗联合，以针对实体瘤，所述方法包括以下步骤：
(i)在治疗开始后，向患有实体瘤的癌症患者施用如之前章节所定义的纳米载体，其优选基于超细纳米颗粒，包含有效剂量的造影剂和抗癌物质，
(ii)通过适当的成像技术捕获图像，以检测肿瘤，
(iii)在适当的情况下，在治疗患者期间，重复步骤(i)和(ii)，
(iv)通过比较在治疗期间获得的肿瘤的图像来监测抗癌物质的疗效。
因此，有可能在治疗患者之前、期间和之后监测肿瘤随时间的演变，特别是随着时间的推移肿瘤的大小、所述肿瘤的数量及其分布。
有利地，在上述方法中，纳米载体可以同时包含有效剂量的对肿瘤具有活性的物质，并且在适当的情况下，包含有效剂量的用于治疗肿瘤的放射增敏剂、光敏剂或放射性试剂和/或有效剂量的造影剂。
因此，在上述方法中，在一个具体实施方案中，用作造影剂的纳米颗粒与用作放射增敏剂的纳米颗粒相同。
在以下实例中还说明了其他用途和实施方案。
附图说明
图1：纳米载体上物理吸附的一般原理。将活性物质添加至纳米颗粒。步骤1：活性物质在纳米颗粒表面通过物理吸附作用相互作用。步骤2：活性物质饱和了纳米颗粒的相互作用范围。步骤3：活性物质不再与纳米颗粒表面相互作用，并且在溶液中保持游离。
图2：曲线表示代表下清液中活性物质浓度的变化作为在基于聚硅氧烷的纳米颗粒存在下放置的药物浓度的函数。
图3：实施例1和2的下清液的吸收光谱。
图4：实施例3和4的下清液的吸收光谱。
图5：在100mM AGuIX存在下，阿霉素溶液下清液在497nm处的吸收值作为引入的阿霉素量的函数。
图6：稀释20倍的实施例6和7的下清液的吸收光谱。
图7：稀释20倍的实施例9和10的下清液的吸收光谱。
图8：稀释20倍的实施例8的下清液的吸收光谱。
图9：稀释20倍的实施例6和7的下清液的荧光光谱。
图10：稀释20倍的实施例9和10的下清液的荧光光谱。
图11：稀释20倍的实施例8的下清液的荧光光谱。
图12：在100mM AGuIX存在下，TATE肽溶液的下清液(稀释20倍)在280nm处的吸收值作为引入的TATE肽量的函数。
图13：在实施例中所述的处理之后，实施例12、13和14的下清液的吸收光谱。
图14：在实施例中所述的处理之后，实施例15和16的下清液的吸收光谱。
图15：在实施例中所述的处理之后，实施例17和18的下清液的吸收光谱。
图16：在100mM存在下，顺铂溶液的下清液在706nm处的吸收值作为引入的顺铂量的函数。为了允许通过吸收检测顺铂，对下清液预先进行实施例中所述的处理。
图17：在如前述实施例中所述的处理之后，实施例18和19的下清液的吸收光谱。
图18：在实施例中所述的处理之后，实施例18和20的下清液的吸收光谱。
具体实施方式
下面的实施例可以举例说明本发明，但绝非限制性的。
下文提出的各种实施例的目的是说明聚硅氧烷纳米颗粒充当化疗中使用的分子转运蛋白的可能性。预期的分子根据图1中提出的机理吸附在纳米颗粒的表面。下面的实施例还使得可以测定药物浓度极限，超过该极限药物将不再保持在纳米颗粒的表面。
在各个实施例中，当所述颗粒以与所研究的纳米颗粒的临床试验期间所使用的浓度相对应的浓度存在时，测定聚硅氧烷纳米颗粒上的最大药物负载量。因此，使浓度增加的活性物质与纳米颗粒接触。通过切向过滤纯化溶液。不能吸附到纳米颗粒表面的分子穿过膜，并在下清液中发现，可以通过光谱技术(诸如UV/可见吸收或荧光光谱法)检测它们(图2)。
基于聚硅氧烷的超细纳米颗粒溶液的制备
根据出版物G.Le Duc et al.,Cancer Nanotechnology,2014中描述的程序合成基于聚硅氧烷的超细纳米颗粒的溶液。
通过DLS用633nm的激光分析钆浓度为10mM的的溶液。获得3.2nm的平均流体力学直径。
用于阿霉素递送的纳米载体
实施例1：将50μmol(Gd3+)的纳米颗粒再分散在125μl超纯水中，以获得400mM的溶液([Gd3+])。将2.85mg的阿霉素置于2.5ml的烧瓶中。向烧瓶中添加1.1ml超纯水，搅拌直至阿霉素完全溶解。然后，获得2.6g/l的阿霉素溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将215μl的该溶液以及160μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得含有100mM钆和112mg/l阿霉素的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得200μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。将上清液稀释50倍，并通过UV-可见分析进行分析。
实施例2(对比例)：根据实施例1中所述的程序制备112mg/l的阿霉素溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例3：将50μmol的(Gd3+)纳米颗粒再分散在125μl超纯水中，以获得400mM([Gd3+])的溶液。将2.85mg的阿霉素置于2.5mg的烧瓶中。向烧瓶中添加1.1ml超纯水，搅拌直至阿霉素完全溶解。然后，获得2.6g/l的阿霉素溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将327μl的该溶液以及48μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得含有100mM钆和170mg/l阿霉素的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得200μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。将上清液稀释50倍，并通过UV-可见分析进行分析。
实施例4(对比例)：根据实施例3中所述的程序制备170mg/l的阿霉素溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例1/2和3/4的对比结果：
图3和图4分别表示实施例1和2的溶液以及实施例3和4的溶液的下清液的吸收光谱。这些数据表明阿霉素与纳米颗粒相互作用。实际上，对于含有100mM([Gd3+])的/>和112mg/l的溶液，与单独的阿霉素溶液相反，阿霉素被吸附在纳米颗粒的表面，并且未在切向过滤后的下清液中检测到。对于含有100mM([Gd3+])的/>和170mg/l的溶液，通过UV/VIS分光光度法检测到非常弱的信号，表明大多数阿霉素被吸附在纳米颗粒的表面，并且少量穿过膜。
将通过实施例3的方法获得的溶液(170mg/l的阿霉素和100mM[Gd3+]的)稀释50倍，并通过DLS用633nm的激光进行分析。获得的平均流体力学直径为3.7nm，其大于纳米颗粒获得的3.2nm的直径，表明纳米颗粒与阿霉素的表面相互作用。
对于相当于100g/l纳米颗粒的100mM([Gd3+])的纳米颗粒溶液，观察到阿霉素的保持量达到最低浓度112mg/l，其对应于重量负载量大于1.12mg/g的纳米颗粒(图5)。
用于递送TATE肽的纳米载体
实施例6：将50μmol(Gd3+)的分散在125μl超纯水中，以获得400mM([Gd3 +])的溶液。将14.94mg的tyr3-octreotate(TATE)肽置于2.5ml烧瓶中。将498μl超纯水添加到烧瓶中，搅拌直至肽完全溶解。然后，获得含有30g/l肽的溶液。然后，将48μl的该溶液以及328μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和2.90g/l肽的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得200μl的上清液。稀释20倍后，通过紫外线-可见分析和荧光分析法分析下清液。
实施例7(对比例)：根据实施例6中所述的方法制备2.90g/l的TATE肽溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例8：将50μmol(Gd3+)的纳米颗粒再分散在125μl超纯水中，以获得400mM的溶液([Gd3+])。将6.1mg的tyr3-octreotate(TATE)肽置于2.5ml烧瓶中。向烧瓶中添加203.3μl超纯水，将其搅拌直至肽完全溶解。然后，获得包含30g/l肽的溶液。然后，将97μl的该溶液以及279μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和5.80g/l肽的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得320μl的上清液。通过UV-可见分析(20倍稀释)和荧光法(40倍稀释)分析该下清液。
实施例9：将50μmol(Gd3+)的纳米颗粒再分散在125μl超纯水中，以获得400mM的溶液([Gd3+])。将14.94mg的tyr3-octreotate(TATE)肽置于2.5ml烧瓶中。将498μl超纯水添加到烧瓶中，搅拌直至肽完全溶解。然后，获得包含30g/l肽的溶液。然后，将193μl的该溶液以及182μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和11.60g/l肽的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得200μl的上清液。稀释20倍后，通过紫外线-可见分析和荧光分析法分析下清液。
实施例10(对比例)：根据实施例5中所述的程序制备11.60g/l的TATE肽溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例11：将50μmol(Gd3+)的纳米颗粒再分散在250μl超纯水中，以获得200mM([Gd3+])的溶液。将0.6mg的tyr3-octreotate(TATE)肽置于2.5ml烧瓶中。向烧瓶中添加20μl超纯水，将其搅拌直至肽完全溶解。然后，获得包含30g/l肽的溶液。然后，将20μl的该溶液以及230μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和1.20g/l肽的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得320μl的上清液。通过UV-可见分析(20倍稀释)或荧光法(40倍稀释)分析该下清液。
实施例6-10的结果
图6、7和8分别代表了实施例6和7的溶液、实施例9和10的溶液以及实施例8的溶液的20倍稀释的下清液的吸收光谱。这些数据表明，TATE肽在纳米颗粒表面吸附的浓度高达约2g.L-1(图12)。实际上，在该极限浓度之前，在通过切向过滤纯化的溶液的下清液中，未通过UV/VIS分光光度法检测到TATE肽。
图9、10和11分别表示实施例6和7、实施例9和10以及实施例8的20倍稀释的下清液的荧光光谱。以与通过UV/VIS分光光度法检测相同的方式进行，这些数据表明TATE肽与纳米颗粒相互作用。
将通过实施例8的方法获得的溶液(TATE为2.90g/l)稀释10倍，并通过DLS用633nm的激光分析。
获得了3.4nm的平均流体力学直径，该直径大于纳米颗粒获得的3.2nm的直径，表明纳米颗粒与TATE肽发生了表面相互作用。
对于相当于100g/l纳米颗粒的100mM([Gd3+])纳米颗粒溶液，观察到TATE肽的保留量达到最小浓度2g/l，这对应于重量负载量大于20mg/g的纳米颗粒(图12)。
用于顺铂递送的纳米载体
实施例12：将50μmol(Gd3+)的再分散在125μl的超纯水中，以获得400mM[Gd3+]的溶液。将3.1mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.2ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要加热至40℃直至其完全溶解。然后，获得含有2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将24μl该溶液和351μl超纯水添加到溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和120mg/l顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得160μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μl ODPA中。将得到的溶液在100℃加热15分钟。一旦反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
实施例13：将50μmol(Gd3+)的再分散在125μl超纯水中，以获得400mM[Gd3+]的溶液。将3.1mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.2ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要加热至40℃直至完全溶解。然后，获得含有2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将36μl的该溶液以及339μl的超纯水添加到的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和180mg/l顺铂的溶液。
将该溶液放置在3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得160μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μl ODPA中。将得到的溶液在100℃加热15分钟。一旦反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV/VIS分光光度法分析。
实施例14：将50μmol(Gd3+)的再分散在125μl超纯水中，以获得400mM[Gd3+]的溶液。将3.1mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.2ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要加热至40℃直至完全溶解。然后，获得包含2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将72μl的该溶液以及303μl的超纯水添加到的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和360mg/l顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得160μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μlODPA中。将得到的溶液在100℃加热15分钟。反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
实施例15：将50μmol(Gd3+)的再分散在125μl超纯水中，以获得400mM[Gd3+]的溶液。将2.8mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.1ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要加热至40℃直至完全溶解。然后，获得包含2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后将142μl的该溶液以及233μl的超纯水添加到的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和720mg/l顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环，以获得140μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μl ODPA中。将得到的溶液在100℃加热15分钟。一旦反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
实施例16(对比例)：根据实施例15中所述的方法制备720mg/l的顺铂溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例17：将50μmol(Gd3+)的再分散在125μl超纯水中，以获得400mM[Gd3+]的溶液。将2.8mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.1ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要加热至40℃直至完全溶解。然后，获得包含2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将229μl的该溶液以及146μl的超纯水添加到/>的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得包含100mM钆和1160mg/l顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得160μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μl ODPA中。将得到的溶液在100℃加热15分钟。一旦反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
结果(实施例12、13、14、15和17)
实施例12、13、14、15和17(顺铂为120-180-360-720-1160mg/l)通过DLS(稀释10倍的样品)用633nm的激光进行分析。各自的平均流体力学直径为：3.8、3.7、3.8、3.4、3.7nm。它们大于用纳米颗粒获得的3.2nm的直径，表明纳米颗粒与顺铂的表面相互作用。
实施例18(对比例)：根据实施例15中所述的方法制备1160mg/l的顺铂溶液，用超纯水代替的溶液。
实施例15/16和17/18的结果
图13表示如实施例中所述的处理后，实施例12、13和14的下清液的吸光度。
图14和图15分别表示实施例15和16的溶液以及实施例17和18的溶液的下清液的吸收光谱。这些数据表明顺铂在纳米颗粒的表面吸附至高达约240mg.L-1的浓度(图16)。实际上，在此极限浓度之前，通过OD/UV分光光度法在706nm处在经ODPA处理的下清液中检测到的信号并未改变。
对于对应于100g/l纳米颗粒的100mM([Gd3+])的纳米颗粒溶液，在直至最小浓度240mg/l时观察到顺铂的保留，这对应于重量负载量大于2.4mg/g的纳米颗粒(图16)。
实施例19：基于聚硅氧烷和基于游离螯合物的用于顺铂递送的纳米颗粒。
为了合成这些纳米颗粒，将6.187ml(26.17mmol)的APTES添加到90ml的二甘醇中。将溶液在环境温度下搅拌1h，然后添加10g(17.45mmol)的DOTAGA酸酐。将该溶液搅拌5天。最后，将7.952ml的TEOS(34.90mmol)添加到溶液中，搅拌1h。然后，添加900ml超纯水，然后，在50℃搅拌加热18h。然后，将溶液在具有截留阈值为5kDa的膜的Vivaflow盒上浓缩至200ml。通过添加盐酸将pH调节至2。通过Vivaflow将溶液纯化50倍，然后通过控制添加1M氢氧化钠将其中和至pH 7.4。过滤溶液，然后冻干。在水中再分散后，纳米颗粒的流体力学直径为5.2nm。
将50μmol(DOTAGA)二氧化硅纳米颗粒(62.5mg)重新分散在141μl超纯水中，以获得354mM DOTAGA和443mg/l的溶液。将3mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.2ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要在40℃加热直至完全溶解。然后，获得含有2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将229μl的该溶液以及130μl的超纯水添加到二氧化硅纳米颗粒溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得含有100mM的游离螯合物(125g/l的纳米颗粒)和1160mg/l的顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的中，并进行切向过滤循环以获得200μl的上清液。通过UV-可见分析来分析该下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此溶液添加到200μl缓冲液和100μl ODPA中。将该新溶液在100℃加热15分钟。反应完成并且温度恢复到室温后，添加560μl DMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
图17表示实施例18和19的溶液的下清液的吸收光谱。对于添加到二氧化硅纳米颗粒溶液中的顺铂，在下清液中可以观察到较弱的信号。两个紫外光谱在706nm处的信号使得可以估算出125g/l的纳米颗粒溶液的顺铂浓度保持为260mg/l，对应于重量负载量为2.1mg/g的纳米颗粒。
实施例20：通过铋离子的螯合改性纳米颗粒表面来改变负载量的可能性。
将实施例19中所述的纳米颗粒分散在水中(283mg，227μmol的DOTAGA)中，以获得约200mM的DOTAGA浓度。通过添加NaOH将溶液的pH调节至5.5。在70℃搅拌下，分3批缓慢添加817μl的250mM的BiCl3在6M HCl中的溶液，以加速络合。在每次添加之间，通过缓慢添加10M氢氧化钠溶液将pH重新调节至5.5。最终添加后，将溶液加热至80℃、1小时。最后，添加超纯水，以在pH值为5.5时达到100mM的螯合浓度。然后，将该溶液在80℃加热18h。通过切向过滤去除过量的Bi3+，然后通过添加氢氧化钠将溶液中和至pH为7，然后在0.2μm膜上过滤并冻干。在水中再分散后，纳米颗粒的流体力学直径为6.0nm。
将30μmol AGuIX@DOTA@Bi(Bi3+)(67.8mg)再分散在75μl超纯水中，以获得400mM的溶液(904g/L纳米颗粒)。将3mg顺铂置于2.5ml烧瓶中。将1.2ml超纯水添加到烧瓶中，搅拌。由于顺铂在环境温度下不易溶解，因此有必要在40℃加热直至完全溶解。然后，获得含有2.5g/l顺铂的溶液，并用铝保护免受光照射。然后，将118μl的该溶液以及107μl的超纯水添加到AGuIX@DOTA@Bi的溶液中。将烧瓶在黑暗中搅拌30分钟。由此获得含有100mM的铋(226g/l的纳米颗粒)和1000mg/l的顺铂的溶液。
将该溶液置于3kDa的溶液中，并进行切向过滤循环以获得80μl的上清液。通过UV-可见分析来分析下清液。与ODPA反应后，可通过706nm波长的UV/VIS吸收来检测顺铂。为了与顺铂反应，制备1.4mg/ml的ODPA溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。将下清液稀释5倍。将140μl此浓度添加到200μl缓冲液和100μlODPA中。将该新溶液在100℃加热15分钟。一旦反应完成并且温度恢复到环境温度，则添加560μlDMF。过滤最终溶液，然后通过UV-可见分析进行分析。
实施例18和20的结果
图18表示实施例18和20的溶液的下清液的吸收光谱。
如图18所示，铋在纳米颗粒表面的螯合导致顺铂在纳米颗粒表面的不保留，证明了在纳米颗粒表面上螯合的金属元素的数量的变化使得可以改变纳米颗粒的负载量。

Claims (26)

1.制备用于在人或动物中递送活性物质的纳米载体的方法，所述方法包括将可以在人或动物中施用的两种溶液混合：
a.第一溶液，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒选自平均直径小于10nm的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，和
b.第二溶液，其包含选自有机分子的活性物质或活性物质的混合物，
在浓度比、pH和温度条件下，其允许通过所述活性物质在所述纳米颗粒表面上的物理吸附而相互作用，
其特征在于，所述纳米颗粒包含：
a.聚硅氧烷，其硅的重量比为所述纳米颗粒总重量的至少8％，
b.螯合剂，所述螯合剂通过将DOTAGA接枝到纳米颗粒上而获得，
c.在适当情况下，金属元素，所述金属元素与螯合剂络合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，[所述第二溶液中的活性物质]：[所述第一溶液中的纳米颗粒]的浓度比大于0.5mg/g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述活性物质选自摩尔质量小于5000的有机小分子。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述活性物质选自以下抗癌物质之一：放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、多西氟啶、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、达比丁、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、托泊替康、戊柔比星、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、来那度胺、依鲁替尼、阿比特龙、厄洛替尼、依维莫司、尼洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、戈舍瑞林、奈达铂、乐铂和依铂或其混合物。
5.根据权利要求1或2所述的方法，包含以下步骤：纯化在混合溶液后获得的纳米载体，以去除在溶液中保持游离的可能的活性物质，并回收所述包含纳米颗粒的纳米载体，所述活性物质通过物理吸附键合到所述纳米颗粒的表面。
6.用于在人中递送活性物质的纳米载体，其包含纳米颗粒，所述活性物质通过物理吸附键合到所述纳米颗粒的表面，其特征在于，所述纳米颗粒选自平均直径小于10nm的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，并且所述活性物质选自摩尔质量为所述纳米颗粒的总质量的2％-40％的有机分子，其特征在于，所述纳米颗粒包含：
a.聚硅氧烷，其硅的重量比为所述纳米颗粒总重量的至少8％，
b.螯合剂，所述螯合剂通过将DOTAGA接枝到纳米颗粒上而获得，
c.在适当情况下，金属元素，所述金属元素与螯合剂络合。
7.根据权利要求6所述的纳米载体，其特征在于，以毫克活性物质/克纳米载体表示的负载量大于0.5mg/g。
8.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，所述纳米颗粒具有以下式(I)：
Sin[O]m[OH]o[Ch1]a[Ch2]b[Ch3]c[My+]d[Dz+]e[Gf]f(I)
其中：
·n为20-5000，
·m大于n且小于4n，
·o为0-2n，
·Ch1、Ch2和Ch3是螯合剂，其可以相同或不同，其通过Si-C共价键与聚硅氧烷的Si原子键合；a、b和c是0-n的整数，并且a+b+c小于或等于n，
·My+和Dz+是金属阳离子，其可以彼此相同或不同，y和z＝1-6；d和e是0-a+b+c的整数，并且d+e小于或等于a+b+c，
·Gf是靶向移植物，其可以彼此相同或不同，每个都通过Si-C键与Si键合，并且通过允许将纳米颗粒靶向目标生物组织的靶向分子的接枝而实现，f是0-n的整数。
9.根据权利要求8所述的纳米载体，其特征在于，n为20-200。
10.根据权利要求8所述的纳米载体，其特征在于，a+b+c为5-100。
11.根据权利要求8所述的纳米载体，其特征在于，a+b+c为5-20。
12.根据权利要求8所述的纳米载体，其特征在于，所述目标生物组织是肿瘤组织。
13.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，其包含选自具有大于40的原子序数Z的元素的金属元素。
14.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，所述纳米颗粒是平均直径为1-5nm的基于聚硅氧烷的纳米颗粒，其包含与通过将DOTAGA接枝到纳米颗粒上而获得的螯合剂络合的钆。
15.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，所述活性物质选自摩尔质量小于5000g.mol-1的有机小分子。
16.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，所述纳米颗粒包含共价接枝到所述聚硅氧烷上并允许对目标生物区域进行主动靶向的靶向试剂。
17.根据权利要求6或7所述的纳米载体，其特征在于，其可以通过根据权利要求1-5之一所述的方法获得。
18.根据权利要求6-17之一所述的纳米载体在制备用于治疗人或动物中的癌症的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述活性物质选自抗癌物质。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其特征在于，所述抗癌物质选自以下物质：放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、多西氟啶、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、达比丁、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、托泊替康、戊柔比星、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、来那度胺、依鲁替尼、阿比特龙、厄洛替尼、依维莫司、尼洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、戈舍瑞林、奈达铂、乐铂和依铂或其混合物。
21.根据权利要求18或19所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒包含具有放射增敏作用的原子序数大于40的元素的螯合物，其特征还在于，在待治疗的受试者中施用有效剂量的所述纳米载体允许通过联合化疗和放疗效果来治疗癌症。
22.根据权利要求18或19所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒包含金属元素螯合物，选择所述金属元素用于通过磁共振成像、扫描或闪烁显像成像，其特征还在于，在待治疗的受试者中施用有效剂量的所述纳米载体允许通过化疗治疗癌症并监测治疗的治愈作用。
23.可注射药物溶液，其包含根据权利要求6-17之一所述的纳米载体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
24.根据权利要求23所述的可注射药物溶液，其特征在于，所述纳米载体包含具有大于40的原子序数Z的元素，其特征还在于，在所述溶液中所述具有大于40的原子序数Z的元素的浓度为10-200mM。
25.根据权利要求23和24之一所述的可注射药物溶液，其特征在于，所述纳米载体的所述活性物质选自阿霉素、顺铂和TATE肽。
26.根据权利要求23和24之一所述的可注射药物溶液，其特征在于，其通过根据权利要求1-5之一所述的方法直接获得。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3116197A1 (fr) * 2020-11-19 2022-05-20 Nh Theraguix Procédé de traitement de tumeurs par captation du cuivre et/ou du fer
CN113941005A (zh) * 2021-10-29 2022-01-18 上海唯可生物科技有限公司 二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子、制备、复合物、用途
CN117088825A (zh) * 2023-10-12 2023-11-21 成都威斯津生物医药科技有限公司 一种可离子化脂质、含该可离子化脂质的药物组合物及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE202008010019U1 (de) * 2008-02-19 2009-07-02 Guerbet Pharmazeutische Formulierung von Kontrastmitteln
CN101827614A (zh) * 2007-10-16 2010-09-08 克洛德·贝纳尔-里昂第一大学 基于镧系元素的纳米颗粒作为放射增敏剂的应用
CA2869689A1 (fr) * 2012-04-13 2013-10-17 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nanoparticules ultrafines comme agent de contraste multimodal
WO2017079535A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Long-lived gadolinium based tumor targeted imaging and therapy agents

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2795412B1 (fr) 1999-06-23 2001-07-13 Adir Nouveaux derives d'ammonium quaternaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
DE60310958T2 (de) 2002-09-19 2007-10-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Synthese und charakterisierung neuer systeme zum hinführen und zur vektorisierung von molekülen von therapeutischem interesse zu targetzellen
FR2959502B1 (fr) * 2010-04-30 2012-09-07 Nanoh Nanoparticules ultrafines a matrice polyorganosiloxane fonctionnalisee et incluant des complexes metalliques ; leur procede d'obtention et leurs applications en imagerie medicale et/ou therapie

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101827614A (zh) * 2007-10-16 2010-09-08 克洛德·贝纳尔-里昂第一大学 基于镧系元素的纳米颗粒作为放射增敏剂的应用
DE202008010019U1 (de) * 2008-02-19 2009-07-02 Guerbet Pharmazeutische Formulierung von Kontrastmitteln
CA2869689A1 (fr) * 2012-04-13 2013-10-17 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nanoparticules ultrafines comme agent de contraste multimodal
JP2015518478A (ja) * 2012-04-13 2015-07-02 ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ マルチモーダル造影剤としての超微細ナノ粒子
WO2017079535A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Long-lived gadolinium based tumor targeted imaging and therapy agents

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A surface-grafted ligand functionalization strategy for coordinate binding of doxorubicin at surface of PEGylated mesoporous silica nanoparticles: Toward pH-responsive drug delivery;Zhang Q 等;《 Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20170101;第 149 卷;全文 *
Active targeting with Y-90 radiolabelled octreotate functionalized AGuIX ultra-small nano particles;M.MAURIN 等;《 NUCLEAR MEDICINE AND BIOLOGY 》;20140801;第 41卷;全文 *
Advantages of gadolinium based ultrasmall nanoparticles vs molecular gadolinium chelates for radiotherapy guided by MRI for glioma treatment;Le Duc G 等;《 Cancer nanotechnology》;20140701;第 5 卷;全文 *
含有杂环基侧链的新型聚硅氧烷;周传健等;《化学通报》;20021218(第12期);全文 *

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