CN111565748A

CN111565748A - 疫苗组合物

Info

Publication number: CN111565748A
Application number: CN201880085403.7A
Authority: CN
Inventors: 理查德·惠廷顿; 奥里奥尔·珀迪; 库穆迪卡·德席尔瓦; 凯伦·普莱恩; 道格拉斯·贝格; 奥姆·敦杰尔
Original assignee: University of Sydney; Meat and Livestock Autralia Ltd
Current assignee: University of Sydney; Meat and Livestock Autralia Ltd; Australian Meat and Live Stock Research and Development Corp
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2020-08-21
Also published as: EP3710051A1; WO2019090386A1; BR112020008840A2; AU2018363876A1; GB201718251D0; US20210220459A1; EP3710051A4

Abstract

本发明涉及用于针对鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis)免疫受试者的新的疫苗组合物和方法。本发明涉及使用矿物油佐剂或白矿物油(white mineral oil)佐剂、更具体地具有CAS 8042‑47‑5、CAS 1335203‑18‑3、CAS 1174522‑45‑2、CAS 1335203‑17‑2(或分别为232‑455‑8、932‑078‑5、934‑954‑2和934‑956‑3的EC等同物)的那些来减少损伤或不良反应。

Description

疫苗组合物

发明领域

本发明涉及用于给动物疫苗接种以使鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacteriumavium subspecies paratuberculosis)感染的严重性降低或最小化的新的组合物。

相关申请

本申请要求来自GB专利申请第1718251.0号的优先权，将其全部内容在此通过引用并入。

发明背景

约内氏病(Johne's disease)(也被称为副结核或JD)，是一种鸟分枝杆菌副结核亚种(Mptb或MAP)的慢性传染性感染。该疾病主要影响反刍动物，并且特征为间歇性腹泻或粪便变软、消瘦并且最终死亡。

约内氏病可以导致对农户重大的经济影响。目前，没有对于JD的治疗，而疫苗接种通常被用作关键的控制措施。自20世纪20年代以来，疫苗接种一直在使用，以使MAP感染对牛的影响最小化，并取得了不同程度的成功。

虽然目前可得的商业疫苗不能预防MAP感染，但它们能有效减少疾病的临床病征。有活跃的感染病征的动物也会将该生物体脱落在其粪便中，将感染传播给其他动物。疫苗接种可有助于减少粪便脱落物的水平，并且因此减少反刍动物群体成员之间的传播。特别地，减少粪便脱落可有助于减少向小牛的传播，而幼畜更容易获得感染(例如，由于从母体的乳房或分娩环境中吞咽少量粪便)。新生畜也可能在子宫中时或通过吞咽乳汁或初乳中传递的细菌而获得感染。

可用于针对MAP感染免疫家畜的现有疫苗的一个缺点是，疫苗在大部分动物的免疫部位引起损伤产生。例如，认为免疫原结合佐剂的组合在注射部位诱导严重的超敏反应，这可能引起脓肿的形成，然后形成持续性结节(肉芽肿)，而这也可能发生在局部淋巴结中。结节的偶尔破裂引起瘘管，引起动物遭受痛苦，并且引起屠宰时畜体的潜在降解，同时减少农户的收入。目前可用疫苗的使用者的另一个担心是人类安全，因为从意外的自我注射恢复可能需要数月的时间，并且可能需要多种医学治疗，包括手术。

因此，存在开发这样的疫苗和免疫刺激组合物的需求，其可以引发处于感染风险的动物对MAP的免疫应答，并且其对动物和使用者都更安全。

本说明书中对任何现有技术的引用并不表示承认或暗示该现有技术在任何司法管辖区内构成公知常识的一部分，或可以合理地预期该现有技术被本领域技术人员理解、认为是相关的和/或与现有技术的其他部分相组合。

发明概述

本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，包含：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原；

-用于增强受试者对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

在本发明的优选实施方案中，用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂包括矿物油、由矿物油组成或主要由矿物油组成，所述矿物油包括被标识为化学文摘服务社(ChemicalAbstract Service；CAS)no:8042-47-5的精制矿物油。矿物油CAS 8042-47-5也可以被称为欧洲化学品编号(EC)no:232-455-8。

其它也适用于本发明的疫苗组合物的矿物油包括具有标识符EC no:932-078-5、EC no:934-954-2和EC no:934-956-3的那些。

在一种特别优选的实施方案中，佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油。因此，本发明还提供了疫苗或免疫刺激组合物，包含：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原，

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油、由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成、或主要由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成，

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

本发明还提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原；其中免疫原呈多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体的形式，以及

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

佐剂可以包括以下、由以下组成或主要由以下组成：具有CAS no:8042-47-5或欧洲化学品编号(EC)no:232-455-8、EC no:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-956-3的矿物油。

因此，本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含：

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

优选地，本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含：

-用于增强对所述免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成，

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

所述多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体可以仅包括一种鸟分枝杆菌副结核亚种菌株，或者所述多于一个可以包括两种或更多种不同的鸟分枝杆菌副结核亚种菌株的混合物。

可选地，用于提供免疫应答的免疫原可以选自由以下组成的组：代表一种或更多种生物体菌株的多于一个活的减毒的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体；由多于一个鸟分枝杆菌副结核亚种生物体(包括不同菌株的生物体)形成的细胞裂解物；以及一种或更多种具有鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的序列的肽或多肽。

仍在另外的实施方案中，疫苗或免疫刺激组合物包括用于乳化免疫原和佐剂的乳化剂，使得本发明提供包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原；该免疫原被提供在水性介质中；

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括矿物油；

-用于乳化免疫原和佐剂的乳化剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

在某些实施方案中，乳化剂是二缩甘露醇单油酸酯。

相应地，本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含以下、由以下组成或主要由以下组成：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原；该免疫原被提供在水性介质中，并且其中免疫原呈多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体的形式；

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油或由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成；以及

-用于乳化免疫原和佐剂的乳化剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

此外，本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含以下、由以下组成或主要由以下组成：

-用于乳化免疫原和佐剂的呈二缩甘露醇单油酸酯形式的乳化剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

优选地，本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，其包含以下、由以下组成或主要由以下组成：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原；所述免疫原被提供在水性介质中，并且其中所述免疫原呈多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体的形式，

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

本发明还提供了用于诱导受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于增强受试者对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而诱导受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答。

佐剂可以包括具有CAS no:8042-47-5、或欧洲化学品编号(EC)no:232-455-8、ECno:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-956-3的矿物油。优选地，用于该方法的佐剂包括具有CAS no:8042-47-5的矿物油。

本发明还提供了减少有相应需要的受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性的方法，所述方法包括向受试者施用包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性。

佐剂优选地包括以下或由以下组成：具有CAS no:8042-47-5、或欧洲化学品编号(EC)no:232-455-8、EC no:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-956-3的矿物油。优选地，用于该方法的佐剂包括具有CAS no:8042-47-5的矿物油。

本发明还提供了减少受试者的约内氏病的一种或更多种病征的严重性的方法，所述方法包括向受试者施用包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于增强受试者对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而减少受试者的约内氏病的一种或更多种病征的严重性。

仍此外地，本发明提供了减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中传播的方法，所述方法包括向反刍动物的群体中的一个或更多个个体施用包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于提供个体对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的免疫原，

-用于增强个体对免疫原的免疫应答的佐剂；

从而减少鸟分枝杆菌副结核亚种在群体中的传播。

本发明提供了减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中传播的方法，所述方法包括向反刍动物的群体中的一个或更多个个体施用包含以下的疫苗或免疫刺激组合物：

-用于增强个体对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括矿物油；

从而减少鸟分枝杆菌副结核亚种在群体中的传播。

-用于增强个体对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油；

从而减少鸟分枝杆菌副结核亚种在群体中的传播。

本发明还提供了用于在以下方法中使用的试剂盒：

·减少受试者的约内氏病的一种或更多种病征的严重性；

·诱导受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答；

·减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中的传播；

所述试剂盒包含：

-用于增强个体对免疫原的免疫应答的佐剂，其中佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油、由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成、或主要由被标识为CASno:8042-47-5的矿物油组成。

任选地，所述试剂盒包含使用组分的说明书。

如本文使用的，除了上下文另有要求的情况下，否则术语“包括/包含(comprise)”及该术语的变体，诸如“包括/包含(comprising)”、“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprised)”，并不意图排除另外的添加物、组分、整数或步骤。

本发明的另外的方面和前述段落中描述的方面的另外的实施方案将从以下通过实例并参考附图给出的描述中变得明显。

附图简述

图1：遍及所有时间点，对于佐剂与热杀死的Mptb的不同制剂，在每个处理组的绵羊中观察到的注射部位损伤的百分比。单次剂量(常规方法)或双次剂量(初次疫苗接种后1个月给予加强剂，并且意图引起不良反应)的新疫苗制剂与阳性对照，商业疫苗或未疫苗接种的动物的比较。“A1”是指测试的佐剂1，“A2”是佐剂2，等等。在表1中列出了佐剂和抗原组分。“NV”＝无疫苗。

图2：在其中牛被用原型疫苗疫苗接种并且接种细菌的试验中，来自动物的Mptb特异性抗体应答。误差棒示出了平均值的标准误差。

图3：在牛被用新疫苗疫苗接种并且接种细菌的试验中的Mptb特异性IFNγ应答。误差棒示出了平均值的标准误差。

图4：在用新疫苗CV1(在矿物油CAS no:8042-47-5中的热杀死的Mptb)疫苗接种后，接种Mptb的动物的肠组织中组织学损伤的严重性。

实施方案详述

现在将详细述及本发明的某些实施方案。虽然将结合实施方案描述本发明，但是应当理解意图不是使本发明受限于这些实施方案。相反，意图本发明覆盖所有替代、修改和等同方案，它们可以被包括在由权利要求书定义的本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到类似或等同于本文描述的方法和材料的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践。本发明绝不受限于所描述的方法和材料。

应当理解，在本说明书中公开和定义的发明延伸到从本文本或附图中提及或显现的两个或更多个单独特征的所有可选的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多个可选的方面。

本文提及的所有专利和出版物均通过引用以其整体并入。

为了解释本说明书的目的，以单数使用的术语也将包括复数，并且反之亦然。

本发明是基于本发明人的该认知，即，尽管疫苗的佐剂部分在其功效方面起着重要作用，但它也可能是由疫苗接种引起的副作用(诸如注射部位损伤)的原因。

本发明人开发了新的疫苗组合物，其可以提供对现有技术的鸟分枝杆菌副结核亚种疫苗组合物的改善。特别地，本发明人开发了提供合适的功效的疫苗组合物，用于使鸟分枝杆菌副结核亚种感染的临床病征最小化，并且减少病原体在群体中的动物之间的传播，但是该疫苗组合物以注射部位处损伤数目减少的形式提供了更大的安全性。

重要的是，本发明人证明了目前要求保护的制剂相对于主要的商业可得的疫苗的显著优势。不希望受理论束缚，本发明人认为，改善的结果，呈注射部位处损伤的数目和尺寸减少的形式，源于所选择的特定的矿物油佐剂。特别地，虽然用于针对Mptb进行免疫的商业可得的疫苗制剂也包含矿物油，但是本发明人鉴定出的矿物油以对使用者和动物接受者都更安全的疫苗的形式提供了优越的结果。

如本文使用的，术语“疫苗”或“免疫刺激组合物”是指用于产生对疾病的免疫性的抗原制剂，以预防或减轻感染的影响。因此，本发明的疫苗组合物被用于预防或减轻鸟分枝杆菌副结核亚种生物体感染的影响。

技术人员将熟悉本文中可互换使用的鸟分枝杆菌副结核亚种的各种缩写或同义词，包括例如，缩写副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium ssp.paratuberculosis,)、MAP或Mptb。鸟分枝杆菌副结核亚种是牛和其他反刍动物的约内氏病的病原体。在牛约内氏病的上下文中，这可以被缩写为BJD。绵羊的约内氏病可以被称为OJD(代表绵羊约内氏病(ovine Johne's disease))。

通常，需要免疫应答的受试者是反刍动物。如本文使用的，术语“反刍动物”包括牛、绵羊、山羊、骆驼、鹿、野牛(bison)、水牛(buffalo)及相关物种，包括野生动物和动物园动物。在本发明的一种特别优选的实施方案中，本文描述的疫苗组合物用于引发牛(bovine)受试者(牛(cattle))或绵羊(ovine)受试者(绵羊(sheep))或山羊(caprine)受试者(山羊(goat))的免疫应答。

在某些实施方案中，本文描述的单一疫苗组合物可用于在多于一个物种的受试者中引发免疫应答(即，其可用于在牛和绵羊受试者两者中引发免疫应答)。

通常使用免疫有效量的免疫原连同佐剂的组合来制备疫苗，所述佐剂能有效增强疫苗接种的受试者针对免疫原的免疫应答。分配和施用疫苗的过程被称为“疫苗接种”。

术语“免疫”是指受试者被暴露于这样的物质的过程，该物质被设计成刺激受试者的免疫系统抵抗该物质。该物质被称为“免疫剂”或“免疫原”，或在某些情况下被称为“抗原”。当向受试者施用免疫剂时，受试者产生可以用于预防和治疗约内氏病的免疫应答。

如本文使用的，术语“佐剂”是指增强免疫原的效力(即，增强个体对免疫原的免疫应答)的组合物。佐剂甚至在仅施用单次剂量的疫苗后提供增强的免疫应答。

本领域已知的佐剂有许多实例。通常，用于根据本发明使用的佐剂是以非特异性的方式刺激受试者的免疫应答的疫苗成分。许多不同的佐剂是本领域已知的。佐剂的实例为：弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物和多胺类诸如硫酸右旋糖酐、卡波姆(carbopol)和吡喃、铝化合物诸如磷酸铝或氢氧化铝、皂苷。

本发明人鉴定了可以根据本发明使用的佐剂，并且其具有比其他常用佐剂更高的安全性谱。特别地，本发明人发现如本文描述的精制矿物油不仅可用于通过在需要免疫的个体中提供合适的免疫应答增强来制备疫苗组合物，而且还在以下方面有用，即，与目前可得的商业疫苗制剂相比，包含这些佐剂的疫苗通常以减少注射部位损伤的可能性和严重性的形式提供更高的安全性谱。

因此，在本发明的优选实施方案中，用于本发明的组合物的佐剂是精制矿物油。

如本文使用的，术语“矿物油”(和同义词诸如石蜡油或白矿物油)是指多种来自矿物质源的无色、无味、轻质的高级烷烃混合物，包括石油馏出物。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，用于增强对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的佐剂包括选自由具有以下标识符的油组成的组的精制矿物油：CAS no:8042-47-5(也被称为EC no:232-455-8)、EC no:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-965-3。在一种优选的实施方案中，本文描述的矿物油佐剂，例如，由CAS no:8042-47-5或EC no:232-455-8、EC no:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-956-3定义的矿物油佐剂，是疫苗或免疫刺激组合物中包含的唯一的佐剂。

被标识为CAS登记号8042-47-5的矿物油也被称为EC编号232-455-8或被称为术语“白矿物油，白油(petroleum)”。该矿物油可以从许多商业来源获得，如：Britol白矿物油(Sonneborn Inc,NJ,USA)、Drakeol矿物油(Penreco,PA,USA)或Marcol 52(ESSO)。技术人员将从本公开内容的教导中理解，任何被标识为含有被标识为CAS登记号8042-47-5的矿物油的制品，特别是那些被指示为适于注射的制品，都可以用在本发明的组合物中。

根据本发明可以使用的另一种精制矿物油是根据European REACH或IUPAC命名法被描述为“碳氢化合物，C-13-C23，正烷烃，异烷烃，环状化合物，<0.03％芳烃”的碳氢化合物的混合物。该混合物也可以通过其EC编号932-078-5述及。该矿物油通常也被称为具有相关的CAS登记号64742-46-7[R]或64742-47-8[R]，并且可以从许多商业来源作为Aqualane、Eolane 160或Hydroseal(Total Special Fluids,France)获得。

相关矿物油也可以被用作本发明的组合物中的佐剂。例如，也可以使用EuropeanREACH描述为“碳氢化合物、C13-C16、正烷烃、异烷烃、环状化合物、<0.03％芳烃”(具有EC编号934-954-2)或“碳氢化合物、C15-C20、正烷烃、异烷烃、环状化合物、<0.03％芳烃”(具有EC编号934-956-3)的油。这些矿物油可以分别作为Berylane 230和Berylane 250或分别作为Eolane 100或Eolane 130商购。

矿物油佐剂优选的是在4℃为液体并且在25℃具有低于100mPas的粘度的矿物油佐剂。它在20℃的密度优选地为约815kg/m³至870kg/m³，更优选地为约820kg/m³至860kg/m³。该油在25℃的动态粘度优选地为约5mPas至300mPas，优选地为20mPas至250mPas，更优选地为约30mPas至200mPas。

本发明还设想在本文描述的疫苗组合物中使用多于一种佐剂。这可以具有进一步增强对免疫原的免疫应答的作用。例如，可以使用不同矿物油的组合来增强对免疫原的免疫应答。此外，可以将矿物油与另外的化合物组合以形成疫苗组合物的佐剂组分。适于与矿物油佐剂组合的化合物的实例包括皂苷，它是表面活性糖苷化合物。可以将皂苷与免疫原组合，然后与矿物油佐剂混合。可选地，可以将矿物油和皂苷组合，然后与免疫原混合。商业上可得的皂苷的实例包括Quil A^TM(Brenntag)、Q-vac^TM(Biolang)、VaxSap^TM(Desert King)和Abisco 100^TM(lsconova)。根据本发明的疫苗中优选地包含10μg/ml和10,000μg/ml之间、更优选地50μg/ml和5000μg/ml之间、甚至更优选地100μg/ml和1000μg/ml之间的水平的皂苷佐剂。

技术人员将理解，在本发明的上下文中，免疫原可以呈任何数量的不同抗原的形式，接受者可以对其产生免疫应答。

例如，免疫原可以呈以下中的任一种形式：

-多于一个完整的被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体，

-多于一个活的减毒的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体，

-由多于一个鸟分枝杆菌副结核亚种生物体形成的细胞裂解物，

-一种或更多种具有鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的序列的肽或多肽。

在本发明的任一实施方案中，当免疫原呈完整的被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体的形式时，可以通过热处理杀死该生物体。通常，完整细胞的热杀死可以通过在约70℃孵育细胞2小时来实现，并且然后通过液体培养来证实(即，如果在标准培养条件后液体培养基中没有细胞生长，则证实被杀死)。

活的减毒菌株的产生将在本领域技术人员的技术范围内。分枝杆菌的减毒菌株是这样的菌株，其已经被遗传修饰以减少或去除其引起活动性疾病的能力(即，具有减少的毒力)，但其可以被识别为可以针对其产生免疫应答的抗原的来源。鸟分枝杆菌副结核亚种的减毒菌株是本领域已知的(例如，如Settles等人,(2014)Vaccine,11:32:2062-9中描述的)，然而，应当理解的是，任何减毒的MAP菌株都可以用在本发明的疫苗组合物中。

本发明的疫苗组合物还可以包含免疫原性多肽作为免疫原的相关来源。免疫原性多肽可以是来自鸟分枝杆菌副结核亚种的任何肽，接受该肽的受试者可以对其产生免疫应答。本领域中描述了来自鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫原性多肽的实例，例如，对应于副结核分枝杆菌的gcpE、pstA、kdpC、papA2、impA、umaA1、fabG2_2、aceAB、mbtH2、IpqP、mapO834c、cspB、HpN或map1634蛋白或这些蛋白的同源物的任何多肽(如WO2007/075308或WO2007/017635中描述的，在此将其全部内容通过引用以其整体并入)。在某些实施方案中，免疫原性多肽可以对应于分枝杆菌分泌的蛋白。因此，虽然在某些情况下，免疫原性多肽可以包括重组产生然后从细胞培养物纯化的蛋白，但是应当理解，从培养的分枝杆菌(使得上清液包含形成免疫原的分泌蛋白)的上清液制备合适的免疫原也是可能的。选择和制备用于本文描述的疫苗组合物和方法的免疫原性多肽的合适制剂将在本领域技术人员的能力范围内。

本发明还设想了使用从鸟分枝杆菌副结核亚种获得的全细胞裂解物用作免疫原。由多于一个培养的分枝杆菌形成的裂解物可以通过物理手段(弗氏压碎器(Frenchpress)、超声波破碎仪)或化学手段(去污剂、离液剂)产生。可以例如通过离心或过滤来进一步纯化或浓缩悬浮液。

本领域技术人员将理解，可以对疫苗或免疫刺激组合物进行改造以针对多于一种鸟分枝杆菌副结核亚种菌株(所谓的多价疫苗，即通过掺入多种不同的MAP抗原来提供针对多种不同的MAP菌株的保护的疫苗)。这可能是所期望的，例如，当需要开发靶向特定地理区域中流行的鸟分枝杆菌副结核亚种的特定菌株的疫苗时。此外，已知多种鸟分枝杆菌副结核亚种菌株比其他菌株更有可能感染特定的牛。因此，能够根据疫苗组合物的预期用途来确定利用哪种鸟分枝杆菌副结核亚种菌株来获得免疫原将在技术人员的能力范围内。

在本发明的任一实施方案中，疫苗组合物中使用的免疫原可以源自鸟分枝杆菌副结核亚种316F菌株的生物体。可选地，免疫原可以源自鸟分枝杆菌副结核亚种Telford菌株或CM 00/416菌株(绵羊常见菌株)，K10菌株(牛常见菌株，也被称为BAA-968)。

疫苗制剂将包含“治疗有效量”的免疫原，即，能够在被施用组合物的受试者中引发免疫应答的量。例如，在治疗和预防约内氏病方面，“治疗有效量”将优选地是增强疫苗接种的受试者对新的感染的抵抗力和/或减少疾病临床严重性的量。这样的保护将通过通常由感染约内氏病的受试者表现出的病征的减少或缺乏、更快的恢复时间和/或更低的副结核分枝杆菌细菌计数来证明。由本文公开的疫苗制剂提供的保护的其它实例包括：副结核分枝杆菌脱落的减少或预防、符合约内氏病的大体病理病征的减少或预防、符合副结核分枝杆菌的组织病理学损伤的减少或预防、副结核分枝杆菌侵袭肠和/或其它身体组织的减少或预防、乳汁中副结核分枝杆菌脱落的减少或预防、胎儿宫内感染的减少或预防、临床体征如体重减轻和腹泻的减少或预防。

技术人员对配制和制备本发明的疫苗组合物的技术将是熟悉的。以其最简单的形式，本发明的组合物可以简单地通过使用常规的疫苗制备方法，将适当量的相关免疫原与相关佐剂混合而形成。

在某些实施方案中，免疫原被提供在基本上为水性的相中(例如，如果免疫原是被提供在PBS缓冲液等中的杀死的全细胞细菌的样品)。在这些情况下，可能期望提供免疫原和佐剂的悬浮液或乳液，以施用至有相应需要的受试者。

在某些实施方案中，免疫原可被提供在疫苗制剂的脂质相(即非水相)中。

疫苗组合物可以是“油包水”型的可注射乳液，并且优选地具有以下粘度：约200mPas或更低，更优选地约100mPas至约150mPas。

在某些实施方案中，疫苗可以呈水包油型乳液的形式。

为了提供作为乳液的免疫原和佐剂，本发明的组合物还可以包含乳化剂。可用在本发明的组合物中的乳化剂的实例包括适用于乳化水和油的混合物的许多乳化剂中的任一种。乳化剂可以是动物或非动物来源的，包括来自植物来源的。可选地，乳化剂可以是化学合成的。

合适的乳化剂的实例包括二缩甘露醇单油酸酯，聚氧乙烯醚(或辛苯聚醇)诸如月桂基聚氧乙烯醚、十六烷基聚氧乙烯醚、油烯基聚氧乙烯醚、硬脂基聚氧乙烯醚和十三烷基聚氧乙烯醚；聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(通常以TWEEN商品名出售)，诸如聚氧乙烯20山梨聚糖单月桂酸酯(TWEEN 20；也被称为聚乙二醇山梨聚糖单月桂酸酯或聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)，聚氧乙烯(60)山梨聚糖单月桂酸酯(TWEEN 60)；聚氧乙烯醚，诸如TRITON X-100、X-102、X-165和X-305；脂肪酸二乙醇胺，诸如异硬脂酸DEA、月桂酸DEA、癸酸DEA、亚油酸DEA、肉豆蔻酸DEA、油酸DEA和硬脂酸DEA；脂肪酸单乙醇胺诸如椰子脂肪酸单乙醇胺；脂肪酸单异丙醇胺诸如油酸单异丙醇胺和月桂酸单异丙醇胺；烷基胺氧化物，诸如N-椰油二甲胺氧化物、N-月桂基二甲胺氧化物、N-肉豆蔻基二甲胺氧化物和N-硬脂基二甲胺氧化物；N-酰基胺氧化物，诸如N-椰油酰胺丙基二甲胺氧化物和N-塔罗酰胺丙基二甲胺氧化物；和N-烷氧基烷基胺氧化物诸如双(2-羟乙基)C12-C15烷氧基-丙胺氧化物。

在本发明的任一实施方案中，乳化剂是二缩甘露醇单油酸酯(也被称为二脱水-D-甘露醇单油酸酯；二脱水甘露醇单油酸酯)。二缩甘露醇单油酸酯的优选实例包括以商品名Arlacel(具有CAS登记号25339-93-9或CAS登记号9049-98-3)出售的那些。甘露醇油酸酯乳化剂优选地为脱水甘露醇醚十八烷酸酯。优选的乳化剂在25℃的粘度为约300cP至400cP，更优选地为约340cP至约360cP，特别优选的实施方案是其中乳化剂的粘度为约350cP的那些。乳化剂优选地在20℃的比重为约0.8至1.0，更优选地为约0.95至约0.99，特别合适的是在20℃的比重为约0.97的那些。特别优选的乳化剂是在25℃的折射率为约1.4至1.5的那些，更优选地为约1.47至1.48，特别是在25℃的折射率为约1.4748至1.4758的那些。

所使用的乳化剂的量将足以使水性组分(即，免疫原)与油性组分(用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂)乳化。技术人员对确定待与免疫原和佐剂一起被包括以用在本发明的组合物中的乳化剂的适当的量的方法将是熟悉的。

通常，呈矿物油的形式的佐剂优选地为按乳液的重量计约50％和约70％之间，更优选地为按乳液的重量计约53％和约63％之间。

通常，当使用甘露醇油酸酯乳化剂时，其优选地为按乳液体积计约2％和约10％之间，更优选地为约3％和约7％之间。

对本领域技术人员将明显的是，可以调整乳液中包含的油性佐剂与水相的比例以优化疫苗引发免疫应答的功效。

在配制本发明的组合物时，可以将乳化剂和佐剂组合，然后与免疫原混合。换言之，在水相中提供免疫原的情况下，首先将佐剂和乳化剂混合，并然后与免疫原组合以形成油包水乳液。总计水与油的总比例将优选地为30:70和70:30之间，并且更优选地为约50:50，以获得具有可接受的粘度的可注射乳液。

包含乳化剂和矿物油的预先制好的(ready-made)混合物的组合物也可以商购，并且根据本发明来使用。在该情况下，对于技术人员将明显的是，“用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂”和乳化剂可以一起被提供在单一混合物中，用于与免疫原组合以形成本发明的疫苗组合物。包含增强性化合物和乳化剂的商业上可得的组合物的实例包括由SeppicSA(75Quai D-Orsay,75007Paris)出售的Montanide系列佐剂，包括Montanide ISA 50V2、Montanide ISA 201VG、Montanide ISA 61VG和Montanide ISA 71VG。这些混合物包含高级可注射矿物油以及的从甘露醇和植物来源的纯化的油酸获得的乳化剂。

技术人员对本领域中用于制备疫苗组合物的技术将是熟悉的，所述疫苗组合物包含本文列举的组分(即，水性介质中的免疫原、用于增强免疫应答的碳氢化合物和乳化剂的混合物)。例如，可以通过在室温，在剧烈混合下，将含有免疫原的水性介质混合到等体积的增强化合物/乳化剂混合物中来制备疫苗组合物。在某些实施方案中，可能需要使用高剪切混合来确保制备稳定、均匀且有效的疫苗组合物。用于优化疫苗组合物组分的混合的方法将在本领域技术人员的技能范围内。

如本领域已知的，本文描述的组合物还可以包含稀释剂、赋形剂和载体，以使组合物能够被施用。“药学上可接受的载体”意指本领域中用于产生和施用疫苗的任何常规的药学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。药学上可接受的载体通常是无毒的、惰性的、固体或液体的载体。

在作为疫苗施用至受试者之前，根据本领域技术人员熟知的方法测试本文描述的疫苗。例如，在合适的动物模型例如牛、绵羊等中进行对毒性、毒力、安全性等的测试。同样地，通常在合适的动物模型例如牛、绵羊中测试疫苗制品引发免疫应答的能力。另外，可以使用合适的动物模型进行包括疫苗接种、加强免疫以及随后用活细菌攻击的保护性研究。

技术人员对确定待施用的免疫原的适当剂量将是熟悉的。例如，当免疫原呈减毒或杀死的全细胞分枝杆菌的形式时，待施用至需要免疫的动物的免疫原的适当剂量将为约1x 10⁷个细胞/剂量-1x 10¹⁰个细胞/剂量。在一种优选实施方案中，施用的剂量在1x 10⁹个细胞/剂量-1x 10¹⁰个细胞/剂量之间。

此外，技术人员将理解，剂量也可以取决于疫苗组合物所用来针对的菌株。例如，当疫苗组合物包含源自多于一种分枝杆菌菌株的免疫原时，技术人员将能够相应地调整剂量，以便使动物接受的免疫原的量最大化。

本发明的疫苗组合物对于减少鸟分枝杆菌副结核亚种感染的一种或更多种病征的严重性特别有用。在牛中，约内氏病的主要病征包括腹泻和消瘦。最初病征可能不明显，并且可能局限于体重减轻、产乳量减少或毛发粗糙。腹泻可能是断断续续的，并且通常没有血液或粘液或上皮碎屑。在腹泻发作若干周后，受感染的受试者的下颌下方可能出现软性肿胀(被称为“颌下水肿(bottle jaw)”或“下颌间水肿(intermandibular oedema)”)。该病征因蛋白从血流中流失进入消化道引起。

技术人员对用于确定任何MAP感染的临床显著性的方法将是熟悉的。例如，用于确定MAP的粪便脱落和组织负荷的程度的测试被描述于Kawaji等人,(2014)J.Vet.Med.Sci.,76:65-72；Whittington和Sergeant(2001)Australian Veterinary Journal 79:267-78；Whittington(2010)，Behr和Collins(编著)Paratuberculosis Organism,Disease,Control.CABI,Wallingford；以及Collins(2011)Veterinary Clinics of NorthAmerica；Food Animal Practice,27:581-591中，将其全部内容以其整体并入本文。

可以在感染之前施用疫苗，作为针对约内氏病的预防性措施。可选地，可以在受试者已经被分枝杆菌感染后施用疫苗(例如，以减少感染的严重性，减少或改善感染的临床病征，或减少感染向其他受试者的传播能力)。在暴露于分枝杆菌之后给予疫苗可能能够减弱疾病，引发比自然感染本身更优的免疫应答。

本发明提供的疫苗可以被皮下施用、肌内施用、皮内施用或施用至器官内。所选择的施用途径将取决于疫苗组合物和受试者的疾病状态。相关的考虑包括待被活化的免疫细胞的类型、抗原被暴露于免疫系统的时间和免疫程序。尽管许多疫苗是在短期内连续被施用的，但在较长时间内进行免疫可以维持有效的临床和免疫应答。

为了对受试者免疫，疫苗优选地被肠胃外施用，通常通过皮下注射。然而，其他施用模式，诸如肌内注射、腹膜内注射和静脉内注射也是可接受的。施用的量取决于待被治疗的受试者、受试者的免疫系统合成抗体的能力以及所期望的保护程度。本领域普通技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验可以容易地确定有效剂量。通过以至少一个剂量并且优选地两个至四个剂量施用疫苗，对受试者进行免疫。此外，受试者可以被施用如所需要的许多剂量，以维持对感染的免疫状态。

将通过合适的测试来监控制备过程的各个阶段，所述测试例如通过对抗原质量和数量的免疫学测试；通过关于灭活、无菌和外来物质不存在的微生物学测试；以及最终通过用于证实疫苗的有效性和安全性的动物研究。所有这些都是技术人员熟知的。适用于疫苗制备的一般技术和考虑是本领域熟知的，并且例如被描述在政府法规(药典)和熟知的手册中。

本发明还涉及用于针对约内氏病进行疫苗接种的试剂盒。试剂盒可以包括包含免疫原的一种或更多种样品和佐剂以及递送装置(例如，用于注射)。试剂盒可以包含使用该试剂盒的说明书。

实施例

实施例1-包含不同佐剂的疫苗的组织反应性

方法

动物

90只24-36月龄的Merino阉羊来源于先前没有JD病史的地区(Armidale,NewSouth Wales)的羊群。通过重复的全羊群粪便测试和抗体酶联免疫吸附测定(ELISA)证实了JD不存在(Begg等人2010)。将这些动物转移到悉尼大学坎姆顿校区(the University ofSydney Camden)的没有JD的农场并通过在露天牧场放牧维持在常规澳大利亚绵羊养殖条件下。

伦理学

所有动物实验都是在悉尼大学动物伦理委员会(the University of SydneyAnimal Ethics Committee)的批准下进行的。

处理组

征集绵羊并系统地随机分成18组，每组中5只绵羊。向前八组动物分配单次剂量的新疫苗，包括一种不含佐剂的疫苗(表1)。向后八组动物分配双次剂量方案的新疫苗。一组是通过以生产商推荐的单次剂量使用商业上可得的疫苗的“疫苗阳性”对照。阴性对照组未被疫苗接种。在表1中列出了佐剂和抗原组分。

表1：测试的疫苗制剂

佐剂

测试了不同的佐剂和佐剂与免疫原的水:油乳液。佐剂包括如CAS no:8042-47-5(白矿物油)、EC no:932-078-5(碳氢化合物，C-13-23，正烷烃、异烷烃、环状化合物，<0.03％芳烃)定义的矿物油或聚丙烯酸钠凝胶分散体。磷酸盐缓冲盐水(PBS)被用作对照(即，“无佐剂”对照)。一种商业上可得的Mptb疫苗被用作阳性疫苗对照。

疫苗

本研究中使用了八种疫苗制剂。商业上可得的疫苗包含由生产商制备在矿物油佐剂中的杀死的Mptb(菌株316f)细胞。单次剂量的新制剂包含约1x 10⁸个Mptb生物体(在70℃热杀死2小时的Telford菌株)。通过液体培养证实了Mptb灭活(Whittington等人1999)。

在无菌条件下将抗原与佐剂一起乳化。在使用前，通过在37℃在绵羊血琼脂上孵育48小时进行需氧培养来测试所有新疫苗制剂的无菌性。

疫苗接种

将疫苗以1mL剂量在耳后经由颈部高处皮下注射来施用。所有疫苗接种均在颈部右侧给予。初次施用后一个月，向需要加强剂量的组给予相同疫苗制剂的第二剂量。根据生产商的说明书，在颈部右侧以单次剂量施用商业可得的疫苗。

收集血液样品

在紧邻疫苗接种之前以及初次疫苗接种之后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、14周、18周、22周和26周，从所有动物收集血清样品(9mL)。在疫苗接种前以及疫苗接种后的6个月中的每个月，通过颈静脉穿刺将血液样品收集到真空收集管(Vacuette)中，以进行IFNγ测定。将血清样品储存于-200℃直到需要，同时将肝素化的血液保持在室温(≤5hr)，然后用抗原刺激以便于IFNγ测定。

评估注射部位损伤

每周监测注射部位直至疫苗接种后10周，并且然后每月监测注射部位直至疫苗接种后6个月。对注射部位附近区域进行触诊，以获知是否存在任何不良反应，诸如肿胀、肿块、开放性损伤或脓肿形成。注射部位损伤被定义为具有在一个轴上测量的大于0.5cm的直径。通过触诊检测到较小的损伤，但不频繁或不一致，并且因此未被包括在数据集中。注射部位损伤数据被表示为每种处理中遍及全部观察具有损伤的动物的总计百分比。

测量对Mptb疫苗接种特异的抗体的血清学测定

采用间接ELISA来检测血清中的Mptb特异性抗体(Gurung等人2013)。将血清样品(10μL)解冻至室温，并且吸收稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Amresco)Tween 20(0.05％，v/v)(PBST)(990μL)中的0.1％w/w胎牛血清(FCS)中的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)(1.3mg/mL)。将样品通过颠倒(end-to-end)旋转混合，同时在4℃孵育过夜。

将Mptb 316v抗原(EMAI,NSW,Australia)在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释至2μg/mL的浓度。用50μL稀释的抗原包被ELISA板(Nunc,MaxiSorp)的每个孔。将板在4℃孵育过夜。使用洗涤缓冲液(用0.05％w/w Tween 20反相渗透(RO))将板用机器洗涤五次(Tecan，Austria)，然后向所有孔添加100μl在PBST中的1％FCS，然后在室温孵育30分钟。

在4℃，将吸收了草分枝杆菌的血清在2500x g离心10分钟。使用洗涤缓冲液再次洗涤板(5x)，然后将50μl稀释的血清添加至适当的孔。随后在室温孵育1小时。添加稀释于PBS中的浓度0.5μg/mL的二抗(HRP标记的单克隆小鼠抗绵羊IgG克隆GT34，Sigma)(50μL)，在室温孵育1小时，并且然后洗涤5次。将TMB底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和过氧化氢，100μL)添加至每个孔，并且将板在黑暗中孵育20分钟。使用2M硫酸(50μL)停止反应。在ELISA读板器(Multiskan Ascent,Thermo Electric Corporation)中测量450nm处的光密度(OD)。结果表示为两次重复的平均光密度信号。

IFNF果表示为两次重测定

在48孔板中用0.5mL的20μg/mL的分枝杆菌纯化的蛋白衍生物(PPD)抗原(Prionics)刺激肝素化的血液(0.5mL)。每个样品的阴性对照由血液与0.5mL培养基组成，而阳性对照具有0.5mL添加有10μg/mL的美洲商陆有丝分裂原(Sigma)的培养基。在37℃在补充有5％CO₂的气氛中孵育48hr后，收集血浆上清液并储存于-20℃。ELISA按照Begg等人2010(Begg,de Silva等人2010)描述的来进行。

结果

注射部位损伤

使用商业上可得的疫苗的绵羊比被给予其他新Mptb疫苗制剂的绵羊出现注射部位损伤的可能性更大(表2和表3)。接受两次剂量的修饰的Mptb疫苗的绵羊比仅接受一次剂量的动物出现注射部位损伤的可能性更大(25％相比于7％)。当将单次剂量和双次剂量接种新Mptb疫苗的绵羊的数据组合时，动物可能出现注射部位损伤的概率没有显著差异，但是存在双次剂量疫苗接种的绵羊出现更多的注射部位损伤观察结果的趋势。在图1中示出了每个处理组具有鉴定到的损伤的动物的总体比例。与商业上可得的疫苗相比，并且对于单次剂量施用(这是优选的免疫方法)，测试的新制剂导致较少的具有损伤的动物，损伤的尺寸减小。甚至当施用2次剂量(即，意图实现不良反应)时，本文测试的新制剂也导致比用商业疫苗获得的更小、持续较短的损伤。

表2：给予杀死的Mptb和不同佐剂的疫苗制剂的一次剂量的绵羊的注射部位损伤

表3：给予杀死的Mptb和不同佐剂的制剂的两次剂量的绵羊的注射部位损伤

在产生的损伤尺寸方面也有显著差异(表2和表3)，总体上商业上可得的疫苗产生的损伤更大(P<0.05)。

结论

结果证明，用商业上可得的疫苗接种的绵羊的损伤数目和尺寸大于当用含有包含精制矿物油(如由矿物白油CAS no 8042-47-5或矿物油EC no932-078-5定义的)的佐剂的疫苗接种绵羊时。因此，使用白矿物油CAS no8042-47-5或矿物油EC no 932-078-5作为热杀死的Mptb的佐剂提供了优于商业上可得的疫苗的益处，因为其在疫苗接种后导致较少的损伤数目和尺寸。

实施例2-疫苗制剂的功效

方法

30只小牛源自澳大利亚NSW的一个畜群，通过对整个畜群使用抗体ELISA、粪便培养和IS900 PCR对其母畜的感染状态进行农场监测，证明该畜群没有约内氏病。在本研究之前，通过粪便培养、抗体和全血IFN-γELISA，证明所有小牛都没有可检测到的Mptb感染。这些动物是在常规的澳大利亚养殖条件下通过在开放围场进行草场放牧来管理的。

将1.5个月龄的小牛分成两个15只的组来接种。将一组加标签，并将第二组加标签，并用单次剂量的牛疫苗(CV)1进行疫苗免疫(表4)。

一个月后，将来自每个处理组的动物分成2组，一组为5个未暴露的对照(n＝5)，并且一组为接种Mptb的小牛(n＝10)(表4)。将对照动物与接种细菌的动物分开饲养在过去未饲养过Mptb感染的家畜的围场中。使用与先前描述的相同的方案(Begg等人,2010)对待被接种的20只动物口服给药，但使用Mptb牛菌株。接种细菌剂量为8.6x 10⁸个、4.2x 10⁹个和8.6x 10⁹个Mptb牛菌株的活细胞。

表4：接受单次剂量的牛疫苗的牛的处理组

疫苗接种

疫苗接种是在每只动物的右耳后使用1mL剂量的牛疫苗(CV1)。

死前取样和检查

以规律的间隔(1-3个月)从每只动物收集血液和粪便样本。通过目测定期监测所有动物，每周多于三次。

尸检和组织收集

所有动物在接种后9个月被宰杀。动物的安乐死和组织取样如Begg等人2010描述的，具有较少的修改。从每只动物收集的用于Mptb分离和组织学的组织为末端回肠、中间空肠、后部和中间空肠淋巴结以及肝和肝脏淋巴结和肩胛骨前淋巴结的一部分。将这些部分冷冻于-80℃以待Mptb分离，或放置在10％缓冲福尔马林中。

组织病理学

将储存在缓冲的福尔马林中的组织包埋在石蜡中，以5mm节段来切片，并且用苏木精和曙红染色和齐-尼染料(Ziehl–Neelsen stain)来染色。使用已建立的标准(Perez等人,1996)将肠的节段分级为评分0、1、2、3a(少菌)、3b(多菌)或3c(严重多菌)。在淋巴结中观察到的肉芽肿损伤被分级为1(轻度病灶)、2(轻度多病灶)或3(严重多病灶至弥散)。基于遍及所评估的所有肠区域观察到的损伤的最高分级对每只动物进行分类。

Mptb分离

如先前描述的，使用液体培养基M7H9C进行从粪便和组织培养Mptb(Plain等人,2015；Whittington等人,2013)。

Mptb特异性抗体检测

遵循生产商的说明书，使用商业上可得的试剂盒(来自Idexx的InstitutPorquier)来测量Mptb特异性抗体。数据被表示为S/P％，其被计算为：(OD样品-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)x100。

Mptb和MAP2698c特异性IFN-γ检测

如先前描述的，使用与Mptb特异性抗原(316v)一起培养48小时的全血进行IFN-γ测定(Begg等人,2009)。

结果

所有动物对疫苗接种耐受良好，并且未在疫苗接种的牛中观察到不良反应或注射部位损伤。

自疫苗接种后3个月(接种细菌后2个月)，用CV 1疫苗接种在疫苗接种的对照(未接种细菌的)动物中并且还在疫苗接种的接种细菌的动物中诱导了可检测到的弱的抗体应答。接种Mptb的CV1疫苗接种的牛往往具有比所有其他组更强的抗体应答(图2)。未疫苗接种的接种细菌的动物表现为具有低水平的抗体，在接种细菌后6-9个月增加。两种接种细菌的动物，一种接种了疫苗，而另一种未疫苗接种，具有大于50的SP％，表明在所用的IDEXXELISA测试中测试结果呈阳性。

疫苗接种后，IFN-γ应答更强，并且CV 1疫苗诱导了与暴露相关的强烈的早期应答(图2)。单独的疫苗接种产生的IFN-疫应答大于未暴露于Mptb的未疫苗接种的对照动物。

粪便脱落的Mptb仅可见于接种细菌的动物中。在脱落动物中，8只动物中的7只来自未接种疫苗的组。接种细菌后2-6个月的粪便中可见Mptb，所有动物仅显示出断断续续的脱落。

尸检时，未在任何动物中观察到眼观损伤(gross lesion)。从接种细菌Mtpb的牛中观察到组织病理学损伤。6/10的未疫苗接种的动物和1/10疫苗接种的动物在沿着肠的任何位置处具有大于评分1的损伤。在未疫苗接种的动物中，损伤更严重，一半接种细菌的动物具有评分3a的损伤。仅一只疫苗接种的接种细菌Mptb的动物具有3a损伤。发现所有6只未疫苗接种的具有损伤的动物都有粪便脱落，但具有评分3a损伤的疫苗接种的动物没有(参见图4)。

在疫苗接种和未疫苗接种的组中，从9/10接种Mptb的动物的组织中培养出Mptb。未从未暴露于Mptb的动物的任何组织中培养出Mptb。

讨论

在本试验中，用原型疫苗CV 1疫苗接种显示出赋予在免疫学标志物和疾病严重性度量方面的积极益处。

用CV 1疫苗接种的牛具有显著增强的对暴露的IFNγ应答，并且还显示出提高的抗体应答。

组织学和粪便脱落结果表明，用CV 1疫苗接种的动物感染不太严重，并且表现为被保护免受疾病影响。接种细菌的动物的抗体水平提高，在接种细菌后9个月有一只动物测试呈阳性。

本试验中的感染率为90％。两个处理组中组织培养阳性数目都很高，这支持了疫苗是保护性的观点，因为由此清楚的是，存在同等程度的组织侵袭/感染，但疫苗接种的动物具有减少的与此相关的损伤。

本试验中应用的原型CV 1型疫苗显示出理想疫苗的特征：针对疾病提供保护，减少粪便脱落，并且不会引起注射部位损伤。

应当理解，在本说明书中公开和定义的发明延伸到从该文本或附图中提及或显现的两个或更多个单独特征的所有可选的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多个可选的方面。

参考文献

Begg，D.J.，de Silva，K.，Bosward，K.，Di Fiore，L.，Taylor，D.L.，Jungersen，G.，Whittington，R.J.，2009.Enzyme-linked immunospot：an alternative method forthe detection of interferon gamma in Johne′s disease.J Vet Diagn Invest 21，187-196.

Begg，D.J.，de Silva，K.，Di Fiore，L.，Taylor，D.L.，Bower，K.，Zhong，L.，Kawaji，S.，Emery，D.，Whittington，R.J.，2010.Experimental infection model forJohne′s disease using a lyophilised，pure culture，seedstock of Mycobacteriumavium subspecies paratuberculosis.Vet Microbiol 141，301-311.

Plain，K.M.，Waldron，A.M.，Begg，D.J.，de Silva，K.，Purdie，A.C.，Whittington，R.J.，2015.Efficient，validated method for detection ofmycobacterial growth in liquid culture media by use of bead beating，magnetic-particle-based nucleic acid isolation，and quantitative PCR.J Clin Microbiol53，1121-1128.

Whittington，R.J.，Whittington，A.M.，Waldron，A.，Begg，D.J.，de Silva，K.，Purdie，A.C.，Plain，K.M.，2013.Development and validation of a liquid medium(M7H9C)for routine culture of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis toreplace modified Bactec 12B medium.J Clin Microbiol 51，3993-4000.

Claims

1.一种疫苗或免疫刺激组合物，包含：

-用于提供受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis)的免疫应答的免疫原，

-用于增强对免疫原的免疫应答的佐剂，

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

2.根据权利要求1所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述佐剂包括矿物油。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述佐剂包括被标识为CASno:8042-47-5(EC no:232-455-8)、EC no:932-078-5、EC no:934-954-2或EC no:934-965-3的矿物油。

4.根据权利要求3所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油。

5.根据权利要求3所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述佐剂包括被标识为EC no:932-078-5的矿物油。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述佐剂由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成。

7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述免疫原选自由以下组成的组：多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体、多于一个活的减毒的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体、由多于一个鸟分枝杆菌副结核亚种生物体形成的细胞裂解物以及一种或更多种具有鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的序列的肽或多肽。

8.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述免疫原是多于一个被杀死的鸟分枝杆菌副结核亚种生物体。

9.根据权利要求8所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述多于一个被杀死的生物体包括来自鸟分枝杆菌副结核亚种的不同菌株的生物体的混合物。

10.根据权利要求9所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述不同菌株选自菌株316F、K10、Telford和CM 00/416。

11.根据权利要求8所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述多于一个被杀死的生物体唯一地来自鸟分枝杆菌副结核亚种Telford菌株。

12.根据权利要求8所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述多于一个被杀死的生物体唯一地来自鸟分枝杆菌副结核亚种K10或316F菌株。

13.根据权利要求8所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述多于一个被杀死的生物体唯一地来自鸟分枝杆菌副结核亚种CM 00/416菌株。

14.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述组合物是包含所述免疫原和佐剂的乳液。

15.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述组合物还包含用于乳化所述免疫原和所述佐剂的乳化剂。

16.根据权利要求15所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述乳化剂被与油相中的所述佐剂混合，然后与包含所述免疫原的水相组合。

17.根据权利要求15或16所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述乳化剂是动物来源或植物来源的。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述乳化剂选自由以下组成的组：二缩甘露醇单油酸酯、聚氧乙烯醚；聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯醚；脂肪酸二乙醇胺；脂肪酸单乙醇胺；脂肪酸单异丙醇胺；烷基胺氧化物；N-酰基胺氧化物；和N-烷氧基烷基胺氧化物。

19.根据权利要求18所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油酸酯。

20.根据权利要求19所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述二缩甘露醇单油酸酯是植物来源的，并且被标识为CAS no:25339-93-9或CASno:9049-98-3。

21.一种疫苗或免疫刺激组合物，所述疫苗或免疫刺激组合物包含以下、由以下组成或主要由以下组成：

-用于增强对所述免疫原的免疫应答的佐剂，其中所述佐剂包括被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油或由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成；以及

-用于乳化所述免疫原和佐剂的乳化剂；

从而形成疫苗或免疫刺激组合物。

22.根据权利要求21所述的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油酸酯，优选地是植物来源的二缩甘露醇单油酸酯。

23.一种减少有需要的受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至22中任一项的疫苗或免疫刺激组合物。

24.一种诱导受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至22中任一项的疫苗或免疫刺激组合物。

25.一种减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染或约内氏病的一种或更多种病征的严重性的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至22中任一项的疫苗或免疫刺激组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述感染或疾病的一种或更多种病征选自由以下组成的组：鸟分枝杆菌副结核亚种的粪便脱落、鸟分枝杆菌副结核亚种的组织负荷、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的大体病理学、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的组织病理学、腹泻、体重减轻、低白蛋白血症、颌下水肿和恶病质。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述受试者是选自由以下组成的组的反刍动物：牛、绵羊、山羊、骆驼和鹿。

28.一种减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中传播的可能性的方法，所述方法包括向所述群体中的一个或更多个个体施用根据权利要求1至22中任一项的疫苗或免疫刺激组合物。

29.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物用于降低受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性的用途。

30.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物用于刺激受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的用途。

31.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物用于减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染或约内氏病的一种或更多种病征的严重性的用途。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述感染或疾病的一种或更多种病征选自由以下组成的组：鸟分枝杆菌副结核亚种的粪便脱落、鸟分枝杆菌副结核亚种的组织负荷、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的大体病理学、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的组织病理学、腹泻、体重减轻、低白蛋白血症、颌下水肿和恶病质。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的用途，其中所述受试者是选自由以下组成的组的反刍动物：牛、绵羊、山羊、骆驼和鹿。

34.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物用于减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中传播的可能性的用途。

35.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，用于减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性。

36.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，用于刺激受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答。

37.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，用于减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染或约内氏病的一种或更多种病征的严重性。

38.根据权利要求37所述的用于使用的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述感染或疾病的一种或更多种病征选自由以下组成的组：鸟分枝杆菌副结核亚种的粪便脱落、鸟分枝杆菌副结核亚种的组织负荷、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的大体病理学、符合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的组织病理学、腹泻、体重减轻、低白蛋白血症、颌下水肿和恶病质。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的用于使用的疫苗或免疫刺激组合物，其中所述受试者是选自由以下组成的组的反刍动物：牛、绵羊、山羊、骆驼和鹿。

40.根据权利要求1至22中任一项所述的疫苗或免疫刺激组合物，用于减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中传播的可能性。

41.一种试剂盒，所述试剂盒用于在以下方法中使用：

·减少受试者的鸟分枝杆菌副结核亚种感染的严重性；

·减少受试者的约内氏病的一种或更多种病征的严重性；

·诱导受试者对鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答；和/或

·减少鸟分枝杆菌副结核亚种在反刍动物的群体中的传播；

其中所述试剂盒包含：

-用于增强所述个体对所述免疫原的免疫应答的佐剂，其中所述佐剂包括被标识为CASno:8042-47-5的矿物油、由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成、或主要由被标识为CAS no:8042-47-5的矿物油组成；

任选地，其中所述试剂盒包含使用组分的说明书。