CN111562380A - 一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，包括如下步骤：(1)加样处理：向芯片中加入待测样本，并过滤处理；(2)识别反应：经过滤后的待测样本流入反应单元，在反应单元中待测样本与相应的预存储在反应单元中的荧光微球标记的单抗进行充分识别反应，形成待测样本的荧光微球标记的免疫复合物，识别反应时间为30‑90s；(3)免疫反应：反应后形成的免疫复合物通过限速单元后流入到检测单元，与相应的预存储在检测单元中的另一单抗发生免疫反应，识别反应时间为30‑90s；(4)检测并读取相应待测样本的浓度。本发明提供的快速免疫荧光检测方法中检测样本无需进行前处理，可直接加至加样槽中，操作简单，且灵敏度高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于体外即时检测技术领域，具体涉及一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法。
背景技术
目前，疾病标志物的检测方法很多，如生化检测方法、生物芯片技术以及POCT免疫层析法等。然而，生化检测方法涉及组分复杂，反应过程步骤繁琐，检测试剂保存条件要求高；生物芯片技术虽灵敏度高、分析时间短，但是其成本昂贵，难以批量化生产，目前难以普及；POCT免疫层析法检测结果的灵敏性和特异性不高，稳定性差，且影响因素较多。
因此，急需研发出一种操作简单，灵敏度高，特异性好的免疫荧光检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，该检测方法操作简单，检测灵敏度高，特异性好。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，包括如下步骤：
(1)加样处理：向微流控芯片的加样单元中加入50-500μL的待测样本，并进行过滤处理；
(2)识别反应：经过滤后的待测样本流入反应单元，在反应单元中待测样本与相应的预存储在反应单元中的荧光微球标记的单抗进行充分识别反应，形成待测样本的荧光微球标记的免疫复合物，识别反应时间为30-90s；
(3)免疫反应：步骤(2)中反应后形成的免疫复合物通过限速单元后流入到检测单元，与相应的预存储在检测单元中的另一单抗发生免疫反应，识别反应时间为30-90s；
(4)检测：将反应后的微流控芯片插入荧光检测仪中，进行荧光检测，检测时间为15min，仪器判断读取相应待测样本的浓度。
采用本发明提供的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法在识别反应过程中，识别反应时间为30-90s，若反应时间小于30s，不利于待测样本与荧光微球标记的单抗充分结合反应，从而导致待测样本检测值偏低失真；若反应时间大于90s，一方面会导致整体流动时间过长，另一方面容易导致免疫复合物发生团聚，导致检测位点上容易出现异常亮点，从而使得检测结果偏低或偏高，数据失真。因此，本发明在识别反应过程中，控制识别反应时间在30-90s。
进一步，所述微流控芯片的亲水角为40°-70°。这样检测灵敏度更高。
进一步，所述检测样本为全血、血清或血浆。
进一步，所述全血样本的识别反应时间为60-90s，所述血清或血浆样本的识别反应时间为30-60s。众所周知，全血中包含50％～60％的血浆和50％～40％的血细胞，全血的粘稠度比血浆高，则在相同的芯片中，全血样本流动速度会比血浆慢。所以血浆和全血样本的反应时间不同，且全血样本的反应时间更长。同时，本申请经大量实验数据表明：血浆或者血清样本反应时间一般是30～60s；全血样本因为粘稠度更大，流得更慢，一般反应时间集中在60s～90s。
进一步，所述检测单元为间隔设置的多个，用于同时进行多种待测样本的检测。不同的检测单元可预存储不同的反应试剂，使得芯片能够一次性进行多个待测样本的检测，提高检测效率。
进一步，所述反应单元和所述检测单元表面设有多个凸起的微柱。在反应单元和检测单元表面设置多个凸起的微柱，一方面可增大微流控芯片的比表面积，使得能够预存储更多的单抗；另一方面增大液体流动阻力，使抗原抗体识别时间更长，增强特异性。
进一步，所述微柱呈多层交叉设置。这样使得待测样本在微柱之间流动时间延长，保证了待测样本与反应单元和检测单元内的反应试剂能够充分反应，保证测量结果的准确性。
进一步，所述限速单元设置有时控阀门。这样待测样本在限速单元内流动速度缓慢，延长待测样本在反应单元内的滞留时间，增加待测样本与反应单元内试剂的反应时间。
进一步，所述时控阀门由5-10条连续的山行横截档条组成。时控阀门由5-10条山行横截档条组成，可进一步有效减缓检测样本流过反应区的时长，便于抗原与标记抗体足够的识别反应时间。
进一步，所述荧光微球标记的单抗为蛋白质单抗、鼠抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌红蛋白单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌钙蛋白I单克隆抗体、羊抗肌钙蛋白多克隆抗体、D-二聚体鼠抗单克隆抗体或B型尿钠肽鼠抗单克隆抗体/多克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法中检测样本无需进行前处理，可直接加至加样槽中，操作简单，且灵敏度高、特异性好。
(2)本发明采用的自驱动微流控芯片通过在反应区后端设置限速区，使得待测样本在限速区内流动速度缓慢，延长待测样本在反应区内的滞留时间，增加待测样本与反应区内试剂的反应时间，提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为本发明检测方法采用的微流控芯片的结构示意图；
图2为实施例1检测肌红蛋白的过程图；
图中标记为：1加样单元、2滤血单元、3反应单元、4限速单元、5检测单元。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明方法进行详细说明。
本发明提供了一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，采用如图1所示的微流控芯片，具体包括如下步骤：
(1)加样处理：向微流控芯片的加样单元1中加入50-500μL的待测样本，并在滤血单元2进行过滤处理；
(2)识别反应：经过滤后的待测样本流入反应单元3，在反应单元3中待测样本与相应的预存储在反应单元3中的荧光微球标记的单抗进行充分识别反应，形成待测样本的荧光微球标记的免疫复合物，识别反应时间为30-90s；
(3)免疫反应：步骤(2)中反应后形成的免疫复合物通过限速单元4后流入到检测单元5，与相应的预存储在检测单元5中的另一单抗发生免疫反应，识别反应时间为30-90s；
(4)检测：将反应后的微流控芯片插入荧光检测仪中，进行荧光检测，检测时间为15min，仪器判断读取相应待测样本的浓度。
其中，所述微流控芯片的亲水角为40°-70°。
其中，所述检测样本为全血、血清或血浆。
其中，所述全血样本的识别反应时间为60-90s，所述血清或血浆样本的识别反应时间为30-60s。
其中，所述检测点为设置的多个，用于同时进行多种待测样本的检测。
其中，所述检测单元为间隔设置的多个，用于同时进行多种待测样本的检测。
其中，所述反应单元和所述检测单元表面设有多个凸起的微柱。
其中，所述微柱呈多层交叉设置。
其中，所述限速单元设置有时控阀门。
其中，所述时控阀门由5-10条连续的山行横截档条组成。
其中，所述荧光微球标记的单抗为蛋白质单抗、鼠抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌红蛋白单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌钙蛋白I单克隆抗体、羊抗肌钙蛋白多克隆抗体、D-二聚体鼠抗单克隆抗体或B型尿钠肽鼠抗单克隆抗体/多克隆抗体。
实施例1
以下，以用于检测心肌标志物(Myo/CK-MB/cTnI)的微流控芯片为例，其中微流控芯片采用图1的微流控芯片，对本发明进行说明：
(1)向微流控芯片的加样单元1中加入50-500μL浓度为234ng/mL的阳性临床样本(即新鲜静脉全血)，该静脉全血流入滤血单元2中进行过滤；
(2)经过滤后的静脉全血流入反应单元3，在反应单元3中Myo与相应的预存储在反应单元3中的荧光微球标记的鼠抗人Myo单抗进行充分反应，形成Myo的荧光微球标记的免疫复合物，识别反应时间为60-90s；
(3)步骤(2)中反应后形成的免疫复合物通过限速单元4后流入到检测单元5，与相应的预存储在检测单元5中的鼠抗人Myo单抗发生免疫反应，识别反应时间为30-60s；
(4)将反应后的微流控芯片插入荧光检测仪中，进行荧光检测，检测时间为15min，仪器判断读取阳性样本的Myo的浓度值为228ng/mL。
本发明通过控制限速单元内的反应时间来确定反应单元的最佳识别反应时间，具体实验操作如下：
以单通道键合线高度为0.3mm的芯片为例，时控阀门高度0.07mm结构设置测试。对限速单元进行处理，使待测样本在流入检测区域前保持0s～150s的反应时间。分为1组：0s～30s、2组：30s～60s、3组：60s～90s、4组：90s～120s、5组：120s～150s。每组30片，其中设置5个待测样本浓度梯度，分别制作检测芯片(Myo项目原材料)，键合上盖和底板后，加入全血样本/血浆样本/血清样本，15min后进行荧光分析仪读数和荧光显微镜观测位点。由荧光信号结果可以看出，不管什么待测样本，流动时间介于30s-60s/60s-90s的信号值最高，数据最稳定。
表1反应单元最佳反应时间确定验证实验
表2五组荧光信号均值对比结果
表3五组荧光信号均值对应SD值
图2为采用本发明检测方法检测肌红蛋白过程图(图2中的过滤区对应为图1中的过滤单元，反应区对应图1中的反应单元)，从图中可知，血液样本加入微流控芯片后，待测样本在过滤单元滤掉血细胞，待测样本中的Myo(抗原)流进反应单元，反应单元点加了标记有荧光物质的鼠抗人Myo单抗，Myo抗原能够与反应区的鼠抗人Myo单克隆抗体识别并结合，形成荧光抗体与抗原的结合物；在微流控芯片毛细作用下，反应单元的抗原抗体结合物经过限速单元，流入检测单元，检测单元的检测点包埋有能够识别抗原的鼠抗人Myo单抗，可以识别已经与荧光抗体结合的Myo抗原，形成双抗体夹心；而质控点包埋的羊抗鼠IgG能识别捕获鼠源的抗体，将未反应的抗体捕获，显示较强且稳定的荧光。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)加样处理：向微流控芯片的加样单元中加入50-500μL的待测样本，并进行过滤处理；
(2)识别反应：经过滤后的待测样本流入反应单元，在反应单元中待测样本与相应的预存储在反应单元中的荧光微球标记的单抗进行充分识别反应，形成待测样本的荧光微球标记的免疫复合物，识别反应时间为30-90s；
(3)免疫反应：步骤(2)中反应后形成的免疫复合物通过限速单元后流入到检测单元，与相应的预存储在检测单元中的另一单抗发生免疫反应，识别反应时间为30-90s；
(4)检测：将反应后的微流控芯片插入荧光检测仪中，进行荧光检测，检测时间为15min，仪器判断读取相应待测样本的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述微流控芯片的亲水角为40°-70°。
3.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述检测样本为全血、血清或血浆。
4.根据权利要求3所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述全血样本的识别反应时间为60-90s，所述血清或血浆样本的识别反应时间为30-60s。
5.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述检测单元为间隔设置的多个，用于同时进行多种待测样本的检测。
6.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述反应单元和所述检测单元表面设有多个凸起的微柱。
7.根据权利要求6所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述微柱呈多层交叉设置。
8.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述限速单元设置有时控阀门。
9.根据权利要求8所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述时控阀门由5-10条连续的山行横截档条组成。
10.根据权利要求1所述的基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法，其特征在于，所述荧光微球标记的单抗为蛋白质单抗、鼠抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌红蛋白单克隆抗体/多克隆抗体、鼠抗肌钙蛋白I单克隆抗体、羊抗肌钙蛋白多克隆抗体、D-二聚体鼠抗单克隆抗体或B型尿钠肽鼠抗单克隆抗体/多克隆抗体。
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