CN111560344A - 使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法，其包括下述步骤：1)对人脐带间充质干细胞系进行干细胞培养，得到传代培养细胞；2)对传代培养细胞进行神经诱导分化，得到分化的神经元前体细胞，其为拟胚体样神经球；3)对拟胚体样神经球进行诱导培养，得到neural rosette神经管样结构神经球；4)将neural rosette神经管样结构神经球进行分化培养，得到类人脑器官，其包含多种类型的神经元混合体。本发明首次将人类间充质干细胞分化为多种神经元并构建出类脑组织，该类脑组织可以作为药筛平台，应用前景广阔。

Description

使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法，具体涉及一种使用人类脐带间充质干细胞通过体外诱导分化为功能成熟的多种神经元并构建类脑组织的方法。
背景技术
人类脐带间充质干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，既保持未分化状态，又具有无限增殖潜能。在一定条件下能够分化成各种功能细胞，如各种类型的神经细胞和神经胶质细胞。正是因为这种特性，使间充质干细胞具备了研究早期神经发育及疾病机制、进行移植替代治疗、基因治疗、药物筛选与开发的天然优势。因此间充质干细胞无论在神经退行性疾病治疗、抗衰老、神经再生等诸多方面都具有非常重要的应用价值。它为医学领域在许多疑难疾病的治疗上带来新的突破口。
体外类器官培养是一种模拟发育的新方法，该方法为相关疾病的病理学研究以及移植治疗的评估提供了实用的研究系统。已经有许多研究团队已报道了多种类脑器官的诱导方法，其中采用间充质干细胞通过构建神经元来制备类脑组织是一种重要的途径。
目前将人类间充质干细胞用于临床转化应用仍然存在诸多困难亟待解决，虽然已经有人类胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC，简称ES细胞)分化为神经元的方法，但是采用人类脐带间充质干细胞分化为神经元和神经胶质细胞的方法仍未发现；而进一步将间充质干细胞分化的神经元构建成体外类脑神经网络的方法则更是空白。而且，间充质干细胞分化的神经元功能和构建的类脑功能尚无鉴定方法。由于目前ES细胞获取非常困难，且存在难以解决的伦理问题，因此采用ES细胞分化的神经元构建类脑组织具有很大的临床应用局限性。间充质干细胞相比ES细胞更容易纯化，来源也更为方便，资源更多，因此容易大批量获得并进行大批量的分化，所能获得的分化神经元量能也更大。
发明内容
为了拓宽构建神经元和类脑组织的渠道，开发间充质干细胞在临床转化方面的应用范围，规避易造成的伦理问题，发明人对于多种来源的人类间充质干细胞进行了比较和研究，首次开发出一种使用人类脐带间充质干细胞经体外诱导分化出功能成熟的多种神经元、并进一步构建出类脑组织的方法，另外还开发出一种对构建的体外类脑组织成熟功能进行鉴定的方法。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法，其包括下述步骤：
1)对人脐带间充质干细胞系进行干细胞培养，得到传代培养细胞；
2)对步骤1)中得到的传代培养细胞进行神经诱导分化，得到分化的多种神经元(包括但不限于谷氨酸能神经元、GABA能神经元)前体细胞，其为拟胚体(embryonic body，EB)样神经球，简称EB球；
3)对步骤2)中得到的拟胚体样神经球进行诱导培养，得到neural rosette神经管样结构神经球；
4)将步骤3)中得到的neural rosette神经管样结构神经球进行分化培养，得到类人脑器官，其包含多种类型的神经元混合体比如VZ/SVZ/CP/MZ层神经元。
优选地，上述方法还包括下述步骤：
5)通过Sox2、Ctip2、Tbr1、SATB2、Reelin染色标记类人脑器官VZ/SVZ/CP/MZ层神经元，观察细胞的极性、增殖、分化和迁移，表达以上标记物的鉴定为成熟。
具体而言，上述步骤1)可以为：采用添加了2μM碱性成纤维细胞生长bFGF因子的干细胞培养基(NEM)对人脐带间充质干细胞系进行传代培养5-7天，得到传代培养细胞。
例如，间充质干细胞系在6孔板MEF上生长5-7天，采用人脐带间质干细胞完全培养基(NEM)每天换液2ml，每次换液都加入2μM的bFGF因子。
上述步骤2)可以为：采用分散酶disapase消化步骤1)中得到的传代培养细胞，例如消化2分钟左右，悬浮于添加了2μM的SB431542和2μM的DMH1的干细胞培养基(NEM)上培养4天(从消化后开始重新计算天数，下述“第n天”都是指从消化后计算的天数)，然后进行神经诱导分化，即，从消化后第5天起，将干细胞培养基(NEM)换成神经诱导培养基(NIM)继续悬浮培养至第7天，所述神经诱导培养基(NIM)中添加了2μM的SB431542和2μM的CHIR因子，得到多种神经元(包括但不限于谷氨酸能神经元、GABA能神经元)前体细胞，其为拟胚体(embryonic body，EB)样神经球。
例如，到可传代的第5-7天时，采用disapase消化克隆2分钟，并悬浮培养于干细胞培养基(NEM)(加入2μM的SB431542(Stemgent)和2μM的DMH1因子(Torcris)，不加入bFGF因子)至第4天；从第5天起，将干细胞培养基换成神经诱导培养基(NIM)继续悬浮培养至第7天，加入2μM的SB431542(Stemgent)和2μM的CHIR因子(Torcris)。
上述步骤3)可以为：将步骤2)中得到的拟胚体(embryonic body，EB)样神经球在添加了2μM的SB431542和2μM的CHIR因子的神经诱导培养基(NIM)(与步骤2)中相同)中进行贴壁培养至第16天，形成neural rosette神经管样结构神经前体细胞，然后吹起后悬浮培养7天(第23天)，得到neural rosette神经管样结构神经球。
例如，将形成的拟胚体(EB)样神经球转移至6孔板中贴壁。每2天换液2ml，加入SB431542和CHIR因子2μM加到第16天为止。培养至第16天，将贴壁培养形成的neuralrosette神经管样结构神经前体细胞吹起后悬浮培养。
上述步骤4)可以为：分化类人脑器官，即，将步骤3)中得到的neural rosette神经管样结构神经球包埋于matrigel胶中，在添加了胰岛素、N2和B27的神经诱导培养基(NIM)中培养至第30天，得到matrigel包被小球；然后将matrigel包被小球在摇床上培养至第70天；再在添加了BDNF、GDNF、非必需氨基酸、cAMP等因子的神经分化培养基(NDM)中培养至第120天，得到类脑器官，其包含多种类型的神经元混合体比如VZ/SVZ/CP/MZ层神经元。
例如，悬浮培养后7天(第23天)时，将neural rosette神经管样结构神经球包埋于matrigel胶中，在诱导培养基(NIM)中培养至第30天，此过程采用神经诱导培养基(NIM)培养+胰岛素、添加剂N2和B27。接着，将matrigel包被的小球转移至低吸附的6孔板中并在摇床上培养至70天。然后从70-120天，采用神经分化培养基(NDM)，该阶段加入BDNF、GDNF、非必需氨基酸、cAMP等因子。所形成的类脑器官中会形成多种类型的神经元混合体。
上述步骤1)至4)的所有细胞培养条件可以是在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养。
本发明的第二个方面在于提供一种鉴定类脑组织成熟功能的方法。为了鉴定类脑组织的成熟功能，本发明将一部分正常的人脐带间充质干细胞进行基因编辑，使其能表达光敏感通道(channelrhodopsin-2，ChR2)，形成基因编辑细胞系，然后与正常的人脐带间充质干细胞系混合，例如按照大约2：1的比例进行混合，再进行干细胞培养阶段，最终得到能够表达ChR2的类脑组织。借助ChR2，可以全面评估类脑组织的神经元功能成熟性。
具体而言，该鉴定方法包括下述步骤：
A)采用CRISPR-Cas系统对人脐带间充质干细胞进行基因编辑，构建表达光敏感通道(Channelrhodopsin-2，ChR2)的细胞系，称为基因编辑细胞系；
B)将步骤A)中得到的基因编辑细胞系与人脐带间充质干细胞系按照大约2：1比例进行混合，然后按照步骤1)进行传代培养5-7天，得到混合传代培养细胞；然后重复步骤2)至步骤4)，得到得到类人脑器官；
C)采用全细胞膜片钳方法鉴定神经元电生理功能，所述功能包括静态特性和动作电位形态，其中静态特性包括膜输入阻抗Rin(80±4.3MΩ)、静息电位RMP(-56±5.3mV)、动作电位阈值(-37±5.1mV)；
D)对于步骤C)中神经元电生理功能成熟的神经元，鉴定类人脑器官中经过基因编辑表达ChR2的神经元对光刺激是否具有稳定的线性的反应，从而确定光刺激的有效性。采用0.6mW/mm2的470nm的时程为2秒的蓝光刺激，在电流钳模式下能够稳定诱发连续发放的动作电位(Action potentials)，动作电位频率范围为13.1±2.55Hz。
在一种实施方式中，上述步骤A)中所述CRISPR-Cas系统包括但不限于传统的CRISPR/Cas9系统、Sam Sternberg等开发的INTEGRATE转座系统、张锋等开发的CAST转座系统。
例如，步骤A)包括下述步骤：
通过PCR扩增来自质粒载体pAAV-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP(BioVector NTCC典型培养物保藏中心)的ChR2(H134R)-EYFP cDNA，将ChR2(H134R)-EYFP片段插入到AAVS1-pur-CAG-EGFP供体质粒(构建该质粒时，采用EGFP基因替代AAVS1-pur-CAG-hrGFP质粒(plasmid#52344，Addgene)中的hrGFP基因，并把土拨鼠肝炎转录后调控元件(woodchuckhepatitis post-transcriptional regulatory element，WPRE)和人生长激素(humangrowth hormone，hGH)Poly A插入到EGFP基因的3'-末端)替代EGFP，构建出AAVS1-pur-CAG-ChR2(H134R)-EYFP供体质粒；
人脐带间充质干细胞采用Rho Kinase(ROCK)-inhibitor(0.5μM,Calbiochem,H-1152P)进行过夜孵育。然后用TrypleLETM(Life Technology)进行处理为单细胞状态，并重悬浮于电穿孔缓冲液(KCl 5mM,MgCl2 5mM,HEPES 15mM,Na2HPO4 102.94mM,NaH2PO447.06mM,pH＝7.2)中，并加入16μg的Cas9质粒、16μg的sgRNA T2质粒(plasmid#44719,plasmid#41818，Addgene)和30μg的上述AAVS1-pur-CAGChR2(H134R)-EYFP供体质粒；电穿孔后将细胞铺在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(MEF)上，并加入puromycin(0.5μg/ml,Invivogen,ant-pr-1)培养2周。采集单个克隆，用基因组PCR进行鉴定，构建出表达ChR2(H134R)-EYFP的人脐带间充质干细胞细胞系，即基因编辑细胞系。
上述步骤D)包括下述步骤：
D-1)在电流钳模式下，观察连续光刺激(2s)时，表达ChR2的神经元是否能够诱发出稳定的动作电位，并记录诱发动作电位的频率，分析光刺激诱发的动作电位的形态；能够诱发连续发放且频率范围为13.1±2.55Hz的神经元判定为成熟；
D-2)在电压钳模式下，观察光刺激诱发的动作电流和在1μM的TTX存在时的单纯光电流稳定性；在上述光刺激下能够稳定诱发光电流平台的为成熟，平台稳定电流强度为58.6±3.6pA，峰值电流强度为120.7±10.5pA；
D-3)鉴定下游未表达ChR2的神经元对光刺激的反应，在膜片钳与未表达ChR2的神经元形成全细胞模式后，采用蓝光刺激后，若在电压钳模式下能稳定诱发所封接神经元上的兴奋性突触后电流(eEPSCs)，则表示成熟，无法记录到该电流则为不成熟；
D-4)鉴定连续光刺激(2min)对未表达ChR2的神经元上mEPSCs和sEPSCs频率和幅度的稳定提升效果：在光刺激后，所封接的未表达ChR2的神经元上记录的mEPSCs和sEPSCs频率无明显提升则为不成熟，若明显提高则为成熟。
相对应地，本发明还提供了一种使用脐带间充质干细胞构建能够表达ChR2的类脑组织的方法，其包括上述步骤A)和B)。
本发明的另一方面在于提供上述类脑组织在神经精神疾病药物筛选中的应用，所述类脑组织通过上述方法构建得到。
本发明首次开发出将人类间充质干细胞分化为多种神经元、进而构建出体外类脑组织的方法；同时，还建立了鉴定体外类脑组织功能的方法。本发明构建的体外类脑组织可以作为药筛平台，用于开发治疗神经精神疾病的药物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为人脐带间充质干细胞从干细胞培养开始直至分化120天的类人脑器官的过程变化照片。
图2为类人脑器官的免疫荧光染色照片。通过Sox2免疫荧光染色标记侧脑室区(Ventricular Zone，VZ)及侧脑室下区(Subventricular Zone，SVZ)的神经前体细胞，通过Ctip2免疫荧光染色标记皮层CP(Cortical Plate)区神经元。
图3为神经元的电生理和光刺激检测图。A：连续光刺激(2s)时，表达ChR2的神经元能够诱发出稳定的动作电位，并记录诱发动作电位的频率；B：光刺激诱发的动作电位的形态，能够诱发连续发放且频率范围为13.1±2.55Hz的神经元判定为成熟；C：在电压钳模式下，观察光刺激诱发的动作电流和在1μM的TTX存在时的单纯光电流稳定性；D：在上述光刺激下能够稳定诱发光电流平台的为成熟。
图4为鉴定类人脑器官中神经元对光刺激是否具有稳定线性反应的表达和非表达ChR2的神经元蓝光刺激图。其中左图为基因编辑表达ChR2的细胞，右图为正常细胞，通过类人脑器官中一部分表达ChR2，一部分不表达ChR2，就形成了上下游的关系，从而能够进行功能研究，结果表明类脑组织的功能成熟。
具体实施方式
本发明改变了目前构建神经元和类脑组织时常用的细胞来源--人类胚胎干细胞(ES细胞)，原因在于ES细胞获取非常困难，而且存在难以解决的伦理问题，从而规避了采用ES细胞分化的神经元构建类脑组织的临床应用局限性。我们首次使用人类脐带间充质干细胞实现了神经元和类脑组织的构建，间充质干细胞相比ES细胞更容易纯化，来源也更为方便，资源更多，因此容易大批量获得并进行大批量的分化，所能获得的分化神经元量能也更大。
在对构建的神经元和类脑组织的功能(比如诱导学习记忆基础功能)进行鉴定时，我们开发的鉴定方法并非是以往采用的电刺激方法，而是采用光刺激的方法，激活其中表达ChR2的神经元，作为上游神经元，并同时对下游神经元进行去极化，并采用两者偶联的技术方法以实现。该发明在技术上相比以往电刺激方法的优势在于：在体外类脑神经网络中用电刺激方法无法寻找上下游投射关系，而用本发明采用的光刺激技术则可以实现；以往电刺激技术在体外类脑神经网络中存在刺激强度随距离衰减的缺陷，而且还存在无法同步刺激所有上游通路的缺陷，而本发明的光刺激可以实现全组织的同步、同强度刺激。
为描述方便起见，本文中有时将“人(类)脐带间充质干细胞”简称为“脐带间充质干细胞”、“间充质干细胞”或者“干细胞”。类似地，有时将“体外类(人)脑组织”简称为“类人脑组织”或者“类脑组织”。
术语“拟胚体(embryonic body，EB)样神经球”是指由诱导的多能干细胞在缺乏分化抑制剂悬浮的情况下形成的球状细胞聚团。本文中有时简称为“EB样神经球”、“神经球”或者“小球”。
术语“神经诱导分化”是指通过外源性添加特定的细胞因子诱导多能干细胞向神经前体细胞方向分化。
术语“神经分化”是指诱导神经前体细胞向成熟神经元分化。
为了判断神经元的功能成熟性，本发明可以在类脑组织中引入光敏感通道(ChR2)蛋白进行表达，借助光刺激反应测定来鉴定电生理功能成熟程度(功能成熟的类脑组织中，刺激上游神经元能够诱发下游神经元的反应。
光敏感通道(channelrhodopsin-2，ChR2)是一种受光脉冲控制的具有7次跨膜结构的非选择性阳离子通道蛋白，自1991年从莱茵衣藻中发现后被许多实验室所关注。依靠ChR2可以快速形成光电流，使细胞发生去极化反应的电生理特性，ChR2已被广泛应用于神经系统的研究。与传统的神经系统研究方法如电生理技术、神经药理学方法相比，用光脉冲控制带有ChR2的神经元的活动，具有更高的空间选择性和特异性。ChR2作为光基因技术的核心组成部分，对神经科学是一个崭新的应用前景广泛的研究工具。近年来ChR2不仅应用于视觉、躯体感觉、听觉和嗅觉等多条感觉神经回路的形态和功能研究，还被应用于各种临床神经系统疾病的研究。
作为一个示意性的实施方式，由人脐带间充质干细胞出发，经过拟胚体样神经球培养、神经诱导分化、神经分化、直至构建成能够表达ChR2的类人脑组织的过程可以包括下述步骤：
1.部分间充质干细胞采用Crispr技术构建表达ChR2的细胞系；其余直接采用正常间充质干细胞。
2.间充质干细胞系在6孔板MEF上生长5-7天，采用人脐带间质干细胞完全培养基每天换液2ml，每次换液都加入2μM的bFGF因子。
3.到可传代的第5-7天时，采用分散酶disapase消化克隆2分钟，并悬浮培养于干细胞培养基至第4天，加入2μM的SB431542(Stemgent)和2μM的DMH1因子(Torcris)，不加入bFGF因子；将干细胞培养基换成神经分化培养基继续悬浮培养至第7天，加入SB431542和CHIR因子。
4.将形成的拟胚体EB小球转移至6孔板中贴壁。每2天换液2ml。SB431542和CHIR因子加到第16天为止。
5.培养至第16天；将贴壁培养形成的neural rosette神经管样结构神经前体细胞吹起后悬浮培养。
6.制备前脑类人脑器官：悬浮培养后7天(第23天)时，将EB球包埋于matrigel胶中在分化培养基中培养至第30天；此过程采用神经诱导培养基(NIM)培养+胰岛素、N2、B27。将matrigel包被的小球转移至低吸附的6孔板中并在摇床上培养至70天。然后从70-120天，采用神经分化培养基(NDM)，该阶段加入BDNF、GDNF、Amino Acid、cAMP等因子。所形成的类人脑器官中会形成多种类型的神经元混合体。
上述步骤1中，采用Crispr技术进行基因编辑的ChR2表达细胞系与正常间充质干细胞之间混合比例大约是2：1左右，也可以根据实验需要进行适当调整。
应理解，本文中在表述数值特征时，术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。
在获得成熟功能的神经元基础上，可以获得具有学习记忆基础的、功能成熟的类人脑组织。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的“份”，除特别说明外，皆指“重量份”；所述的百分含量，除特别说明外，皆指重量百分含量。
实施例中如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-30℃)。
实施例中所用的人脐带间充质干细胞由领航干细胞公司保藏，任何单位和个人都可以获得该细胞用于验证本发明，但未经领航干细胞公司允许不得用作其他用途，包括治疗疾病、科学研究和教学。
培养基包括：
人脐带间质干细胞完全培养基(NEM)，即DMEM/F12/KSR培养基：DMEM/F12(LifeTechnology)基础培养基中添加20％血清替代物KSR(Life Technology)，2mM glutamax(Life Technology)，0.1mM非必需氨基酸(Life Technology)，0.1mMβ巯基乙醇(LifeTechnology)。
神经诱导培养基(NIM)：DMEM/F12基础培养基中添加1％的N2添加剂(LifeTechnology)和1％的MEM NEAA，2mM glutamax，0.1mM非必需氨基酸，0.1mMβ-巯基乙醇，20μg/ml FGF2(成纤维细胞生长因子)。
神经分化培养基(NDM)：1％N2(Life Technology)，2％B27(Life Technology)，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)10ng/ml(PeproTech)，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)10ng/ml(PeproTech)，抗坏血酸(200μM,Sigma-Aldrich)，cAMP(1μM,Sigma-Aldrich)，胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF-1)10ng/ml(PeproTech)和glutamax(1:1000，Life technologies)。
实施例1人脐带间充质干细胞的基因编辑
采用CRISPR/Cas9系统对人脐带间充质干细胞进行基因编辑，构建表达光敏感通道(ChR2)的细胞系，称为基因编辑细胞系，方法如下：
通过PCR扩增来自质粒载体pAAV-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP(BioVector NTCC典型培养物保藏中心)的ChR2(H134R)-EYFP cDNA，将ChR2(H134R)-EYFP片段插入到AAVS1-pur-CAG-EGFP供体质粒(构建该质粒时，采用EGFP基因替代AAVS1-pur-CAG-hrGFP质粒(plasmid#52344，Addgene)中的hrGFP基因，并把土拨鼠肝炎转录后调控元件(woodchuckhepatitis post-transcriptional regulatory element，WPRE)和人生长激素(humangrowth hormone，hGH)Poly A插入到EGFP基因的3'-末端)替代EGFP，构建出AAVS1-pur-CAG-ChR2(H134R)-EYFP供体质。
人脐带间充质干细胞采用Rho Kinase(ROCK)-inhibitor(0.5μM,Calbiochem,H-1152P)进行过夜孵育。然后用TrypleLETM(Life Technology)进行处理为单细胞状态，并重悬浮于电穿孔缓冲液(KCl 5mM,MgCl2 5mM,HEPES 15mM,Na2HPO4 102.94mM,NaH2PO447.06mM,pH＝7.2)中，并加入16μg的Cas9质粒、16μg的sgRNA T2质粒(plasmid#44719,plasmid#41818，Addgene)和30μg的上述AAVS1-pur-CAGChR2(H134R)-EYFP供体质粒；电穿孔后将细胞铺在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(MEF)上，并加入puromycin(0.5μg/ml,Invivogen,ant-pr-1)培养2周。采集单个克隆，用基因组PCR进行鉴定，构建出表达ChR2(H134R)-EYFP的人脐带间充质干细胞细胞系，即基因编辑细胞系。
实施例2拟胚体样神经球培养
将实施例1中得到的基因编辑的人脐带干细胞系与正常人脐带间充质干细胞系在干细胞阶段就按照2：1比例进行混合传代培养，步骤为：
2.1间充质干细胞系在6孔板MEF上生长5-7天，采用人脐带间质干细胞完全培养基(NEM)每天换液2ml，每次换液都加入2μM的bFGF因子。
2.2到可传代的第5-7天时，采用disapase消化克隆2分钟，并悬浮培养于干细胞培养基(NEM)至第4天(从消化后开始重新计算天数，加入2μM的SB431542(Stemgent)和2μM的DMH1因子(Torcris)，不加入bFGF因子)；从第5天起，将干细胞培养基换成神经诱导培养基(NIM)继续悬浮培养至第7天，加入2μM的SB431542(Stemgent)和2μM的CHIR因子(Torcris)。形成拟胚体(embryonic body，EB)样神经球。
实施例3分化类脑器官
3.1将实施例2中形成的拟胚体(embryonic body，EB)样神经球转移至6孔板中贴壁。每2天换液2ml，加入SB431542和CHIR因子2μM加到第16天为止。
3.2培养至第16天，将贴壁培养形成的neural rosette神经管样结构神经前体细胞吹起后悬浮培养。悬浮培养7天(第23天)后，得到neural rosette神经管样结构神经球。
3.3将neural rosette神经管样结构神经球包埋于matrigel胶中在诱导培养基(NIM)中培养至第30天，此过程采用神经诱导培养基(NIM)培养+胰岛素、N2(LifeTechnology)、B27(Life Technology)。
3.4将matrigel包被的neural rosette神经管样结构神经球转移至低吸附的6孔板中并在摇床上培养至70天。然后从70-120天，采用神经分化培养基(NDM)，该阶段加入BDNF、GDNF、Amino Acid、cAMP等因子。形成类人脑器官，其中会形成多种类型的神经元混合体。
图1显示了人脐带间充质干细胞从干细胞培养直至分化120天的类人脑器官的变化过程。
实施例4观察类脑器官的细胞极性、增殖、分化和迁移
通过Sox2、Ctip2、Tbr1、SATB2、Reelin染色标记类脑器官VZ/SVZ/CP/MZ层神经元，结果显示于图2。
图2显示了类人脑器官的免疫荧光染色照片。通过Sox2免疫荧光染色标记侧脑室区(Ventricular Zone，VZ)及侧脑室下区(Subventricular Zone，SVZ)的神经前体细胞，通过Ctip2免疫荧光染色标记皮层CP(Cortical Plate)区神经元。结果显示，与人脑皮层结构相似，类人脑器官VZ/SVZ区有大量Sox2免疫阳性细胞，VZ/SVZ区上方有大量Citp2+神经元形成皮层CP样结构区。这些染色结果说明10周的类人脑器官已初步形成皮层分层结构如VZ、SVZ、CP区等。
实施例5鉴定如类脑组织的功能成熟性
鉴定如类脑组织的功能成熟程度的方法包括下述步骤：
5.1采用全细胞膜片钳方法鉴定神经元电生理功能，所述功能包括静态特性和动作电位形态，其中静态特性包括膜输入阻抗Rin(80±4.3MΩ)、静息电位RMP(-56±5.3mV)、动作电位阈值(-37±5.1mV)。
5.2采用0.6mW/mm2的470nm的时程为2秒的蓝光刺激，在电流钳模式下，观察连续光刺激(2s)时，表达ChR2的神经元是否能够诱发出稳定的动作电位(Action potentials)，并记录诱发动作电位的频率，分析光刺激诱发的动作电位的形态；能够诱发连续发放且频率范围为13.1±2.55Hz的神经元判定为成熟。
5.3在电压钳模式下，观察光刺激诱发的动作电流和在1μM的TTX存在时的单纯光电流稳定性；在上述光刺激下能够稳定诱发光电流平台的为成熟，平台稳定电流强度为58.6±3.6pA，峰值电流强度为120.7±10.5pA。
5.4鉴定下游未表达ChR2的神经元对光刺激的反应，在膜片钳与未表达ChR2的神经元形成全细胞模式后，采用蓝光刺激后，若在电压钳模式下能稳定诱发所封接神经元上的兴奋性突触后电流(eEPSCs)，则表示成熟，无法记录到该电流则为不成熟。
5.5鉴定连续光刺激(2min)对未表达ChR2的神经元上mEPSCs和sEPSCs频率和幅度的稳定提升效果。在光刺激后，所封接的未表达ChR2的神经元上记录的mEPSCs和sEPSCs频率无明显提升则为不成熟，若明显提高则为成熟。
鉴定结果参见图3和图4。图3-4的实验数据证实了类脑组织中包含的成熟神经元，其中图4中左图是直接表达ChR2的神经元，在光刺激下可以直接诱发动作电流，因此属于上游神经元；右图是不表达ChR2的神经元，在光刺激下，假如已经形成成熟的神经元连接，则可以接受来自左图的神经元传导来的动作电位，从而形成兴奋性突触后电流(sEPSCs)。上述结果表明，本发明从人脐带间充质干细胞出发，构建出了神经元功能成熟的类人脑器官。

Claims (10)

1.一种使用脐带间充质干细胞构建类脑组织的方法，其包括下述步骤：
1)对人脐带间充质干细胞系进行干细胞培养，得到传代培养细胞；
2)对步骤1)中得到的传代培养细胞进行神经诱导分化，得到分化的神经元前体细胞，其为拟胚体样神经球；
3)对步骤2)中得到的拟胚体样神经球进行诱导培养，得到neural rosette神经管样结构神经球；
4)将步骤3)中得到的neural rosette神经管样结构神经球进行分化培养，得到类人脑器官。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：
5)通过Sox2、Ctip2、Tbr1、SATB2、Reelin染色标记类人脑器官VZ/SVZ/CP/MZ层神经元，观察细胞的极性、增殖、分化和迁移，表达以上标记物的鉴定为成熟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)为：
采用添加了2μM碱性成纤维细胞生长bFGF因子的干细胞培养基NEM对人脐带间充质干细胞系进行传代培养5-7天，得到传代培养细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)为：
采用分散酶disapase消化步骤1)中得到的传代培养细胞，悬浮于添加了2μM的SB431542和2μM的DMH1的干细胞培养基NEM上培养4天，然后进行神经诱导分化，即，从消化后第5天起，将干细胞培养基NEM换成神经诱导培养基NIM继续悬浮培养至第7天，所述神经诱导培养基NIM中添加了2μM的SB431542和2μM的CHIR因子，得到神经元前体细胞，其为拟胚体样神经球。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)为：
将步骤2)中得到的拟胚体样神经球在添加了2μM的SB431542和2μM的CHIR因子的神经诱导培养基NIM中进行贴壁培养至第16天，形成neural rosette神经管样结构神经前体细胞，然后吹起后悬浮培养7天，得到neural rosette神经管样结构神经球。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)为：
分化类人脑器官，即，将步骤3)中得到的neural rosette神经管样结构神经球包埋于matrigel胶中，在添加了胰岛素、N2和B27的神经诱导培养基NIM中培养至第30天，得到matrigel包被小球；然后将matrigel包被小球在摇床上培养至第70天；再在添加了BDNF、GDNF、非必需氨基酸、cAMP的神经分化培养基NDM中培养至第120天，得到类人脑器官。
7.一种鉴定如权利要求1所述的类脑组织成熟功能的方法，包括下述步骤：
A)采用CRISPR-Cas系统对人脐带间充质干细胞进行基因编辑，构建表达光敏感通道ChR2的细胞系，称为基因编辑细胞系；
B)将步骤A)中得到的基因编辑细胞系与人脐带间充质干细胞系按照2：1比例进行混合，然后按照步骤1)进行传代培养5-7天，得到混合传代培养细胞；然后重复步骤2)至步骤4)，得到得到类人脑器官；
C)采用全细胞膜片钳方法鉴定神经元电生理功能，所述功能包括静态特性和动作电位形态，其中静态特性包括膜输入阻抗Rin(80±4.3MΩ)、静息电位RMP(-56±5.3mV)、动作电位阈值(-37±5.1mV)；
D)对于步骤C)中神经元电生理功能成熟的神经元，鉴定类人脑器官中经过基因编辑表达ChR2的神经元对光刺激是否具有稳定的线性的反应，从而确定光刺激的有效性。采用0.6mW/mm2的470nm的时程为2秒的蓝光刺激，在电流钳模式下能够稳定诱发连续发放的动作电位，动作电位频率范围为13.1±2.55Hz。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述CRISPR-Cas系统选自CRISPR/Cas9系统、INTEGRATE转座系统、CAST转座系统。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤D)包括下述步骤：
D-1)在电流钳模式下，观察连续光刺激(2s)时，表达ChR2的神经元是否能够诱发出稳定的动作电位，并记录诱发动作电位的频率，分析光刺激诱发的动作电位的形态；能够诱发连续发放且频率范围为13.1±2.55Hz的神经元判定为成熟；
D-2)在电压钳模式下，观察光刺激诱发的动作电流和在1μM的TTX存在时的单纯光电流稳定性；在上述光刺激下能够稳定诱发光电流平台的为成熟，平台稳定电流强度为58.6±3.6pA，峰值电流强度为120.7±10.5pA；
D-3)鉴定下游未表达ChR2的神经元对光刺激的反应，在膜片钳与未表达ChR2的神经元形成全细胞模式后，采用蓝光刺激后，若在电压钳模式下能稳定诱发所封接神经元上的兴奋性突触后电流(eEPSCs)，则表示成熟，无法记录到该电流则为不成熟；
D-4)鉴定连续光刺激(2min)对未表达ChR2的神经元上mEPSCs和sEPSCs频率和幅度的稳定提升效果：在光刺激后，所封接的未表达ChR2的神经元上记录的mEPSCs和sEPSCs频率无提升则为不成熟，若提高则为成熟。
10.类脑组织在神经精神疾病药物筛选中的应用，所述类脑组织通过如权利要求1-6中任一项所述的方法构建得到。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725276A (zh) * 2021-01-14 2021-04-30 香港再生医学有限公司 提高msc分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法
CN113025569A (zh) * 2021-03-26 2021-06-25 成都云测医学生物技术有限公司 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用
CN113046309A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 成都云测医学生物技术有限公司 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用
CN113684181A (zh) * 2021-08-24 2021-11-23 南通大学 一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化的方法
CN117778313A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 成都云测医学生物技术有限公司 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486058A (zh) * 2018-04-17 2018-09-04 南京医科大学 一种促进人多能干细胞定向分化为成熟神经元的方法
CN108883137A (zh) * 2016-01-14 2018-11-23 俄亥俄州国家创新基金会 神经类器官组合物及使用方法
CN109136185A (zh) * 2017-06-28 2019-01-04 中国科学院生物物理研究所 一种类脑器官器的制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108883137A (zh) * 2016-01-14 2018-11-23 俄亥俄州国家创新基金会 神经类器官组合物及使用方法
CN109136185A (zh) * 2017-06-28 2019-01-04 中国科学院生物物理研究所 一种类脑器官器的制备方法和应用
CN108486058A (zh) * 2018-04-17 2018-09-04 南京医科大学 一种促进人多能干细胞定向分化为成熟神经元的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MADELINE A. LANCASTER等: "Cerebral organoids model human brain development and microcephaly", 《NATURE》 *
SWAPNITA PRADHAN等: "A highly efficient culture technique for derivation of motor neurons from human umbilical cord derived mesenchymal stem cells", 《JOURNAL OF NEUROLOGY AND NEUROLOGICAL DISORDERS》 *
YI DONG等: "Plasticity of Synaptic Transmission in Human Stem Cell-Derived Neural Networks", 《ISCIENCE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725276A (zh) * 2021-01-14 2021-04-30 香港再生医学有限公司 提高msc分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法
CN113025569A (zh) * 2021-03-26 2021-06-25 成都云测医学生物技术有限公司 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用
CN113046309A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 成都云测医学生物技术有限公司 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用
CN113025569B (zh) * 2021-03-26 2023-05-05 成都云测医学生物技术有限公司 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用
CN113046309B (zh) * 2021-03-26 2023-05-05 成都云测医学生物技术有限公司 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用
CN113684181A (zh) * 2021-08-24 2021-11-23 南通大学 一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化的方法
CN117778313A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 成都云测医学生物技术有限公司 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用
CN117778313B (zh) * 2024-02-23 2024-05-24 成都云测医学生物技术有限公司 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用

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