CN111549111A - 一种小分子蛋白在制备诊断不安腿综合征的试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小分子蛋白在制备诊断不安腿综合征的试剂盒中的应用。本发明首次发现原发性不安腿综合征患者外周血清α‑突触核蛋白水平较年龄、性别匹配的健康对照组呈现显著下降，多巴胺受体激动剂普拉克索治疗可以影响不安腿综合征患者外周血清α‑突触核蛋白水平，接受普拉克索治疗的患者较从未用药的患者，具有较高的血清α‑突触核蛋白水平。因此，血清α‑syn能够作为诊断不安腿综合征的生物标志物，其上调剂有望开发治疗不安腿综合征的药物。

Description

一种小分子蛋白在制备诊断不安腿综合征的试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及疾病诊断技术领域，具体地说，涉及一种小分子蛋白在制备诊断不安腿综合征的试剂盒中的应用。
背景技术
不安腿综合征(restless legs syndrome，RLS)是一种感觉运动障碍疾病，主要表现为睡眠或休息时双下肢极度不适感，迫使患者不停移动下肢或下地行走，致使患者极为痛苦，严重影响患者睡眠，导致白天疲倦，生活质量和工作效率明显降低。不安腿综合征的发病率远远高于其它神经系统疾病，国外流行病学资料表明，其患病率为总人口的4-29％，我国的患病率估计在0.7-7％左右。不安腿综合征可见于各种年龄，包括学龄前儿童，但是更多见于中老年人，女性多于男性。不安腿综合征发病机制目前仍不清楚，普遍观点认为同中枢多巴胺能系统功能障碍和铁缺乏相关。
目前不安腿综合征的诊断依据依赖于临床核心诊断标准及相关支持诊断标准(根据2012最新的国际不安腿综合征诊断指南)，但是目前尚缺乏有效的客观生物标记。然而，在临床工作中，部分患者表现为类似不安腿综合征表现的类似症“mimics”，这些“类不安腿”同真正的不安腿综合征较难鉴别，尤其在初诊时，从而导致误诊漏诊及误治。据统计，仅32-81％的不安腿综合征患者会寻求就诊，其中仅有6％的患者能得到正确诊断。许多患者在来到神经科寻求帮助之前，往往已经多方辗转于风湿科、骨科、心理科、疼痛科、内科等等，在长达几年甚至几十年的病程中始终未得到正确诊治。因此，如果能找到合适的客观诊断标记，将有助于提高诊断的准确性。
α-突触核蛋白(α-synuclein)是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质。国内期刊《中国校外教育》2014年刊出的论文“α-突触核蛋白在常见神经退行性疾病致病机理研究进展”，公开了α-突触核蛋白功能异常会导致路易小体疾病，以及路易小体的产生，被认为是帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病因，而路易小体相关轴退变被认为是阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)的病理之一。然后此文总结分析了突触核蛋白在PD和AD中的致病机理。国外期刊《Movement Disorders》2004年刊出的论文“Neuropathology of primary restless leg syndrome:Absence of specific T-andα-synuclein pathology”，对4名患有特发性RLS且脑和脊髓组织可用于神经病理学评估的患者进行了尸检，未发现路易小体，α-突触核蛋白免疫组织化学均为阴性，神经纤维缠结病理变化多且无特异性，表明α-突触核蛋白脑病理学不是原发性RLS的组成部分。目前未见α-突触核蛋白作为不安腿综合征诊断标志物的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小分子蛋白在制备诊断不安腿综合征的试剂盒中的应用。
第一方面，本发明提供了α-syn蛋白或其编码基因在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断不安腿综合征。
第二方面，本发明提供了特异性识别或扩增或结合α-syn蛋白或其编码基因的诊断试剂的用途，用于制备诊断不安腿综合征的试剂盒。
作为本发明的一种优选方案，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
作为本发明的另一优选方案，所述的诊断试剂选自：
特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗α-syn蛋白的抗体。
作为本发明的另一优选方案，所述的诊断试剂是通过检测血清样本来诊断不安腿综合征。
第三方面，本发明提供了一种用于诊断不安腿综合征的试剂盒，所述的试剂盒中含有：检测α-syn蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；其选自：
特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗α-syn蛋白的抗体。
作为本发明的另一优选方案，所述的试剂盒其中还包括：
核酸抽提试剂；和/或
聚合酶链反应试剂；和/或
蛋白免疫印迹试剂；和/或
酶联免疫反应试剂。
作为本发明的另一优选方案，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
第四方面，本发明提供了α-syn蛋白或其编码基因的上调剂在制备治疗不安腿综合征的药物中的潜在应用。
作为本发明的另一优选方案，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
第五方面，本发明提供了一种诊断不安腿综合征的方法，所述方法包括：检测待测样品中的α-syn蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若存在显著性降低，则可协助诊断不安腿综合征。
作为本发明的另一优选方案，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
本发明优点在于：
本发明首次发现原发性不安腿综合征患者外周血清α-突触核蛋白水平较年龄、性别匹配的健康对照组呈现显著下降(P<0.0001)。多巴胺受体激动剂普拉克索治疗可以影响不安腿综合征患者外周血清α-突触核蛋白水平。接受普拉克索治疗的患者较从未用药的患者，具有较高的血清α-突触核蛋白水平。进而：
1)为不安腿综合征的临床诊断和分型提供有效、可靠、便捷的生物标记，有助于患者得到及时精确的个体化诊治，少走弯路，降低医疗费用，提高生活质量。尤其对一些临床表现并不典型的患者来说，受益显著。
2)为各大医院不安腿综合征的临床诊断、分型检测、个体化治疗或防治提供新的手段，降低因患者症状不典型或医生经验不足造成的误诊漏诊风险。
3)为科研院所、医疗检测服务公司提供进一步研究方向与基础。
附图说明
附图1：对照组(n＝56)，RLS组(n＝71)，RLS-非用药组(n＝52)，RLS-用药组(n＝19)血清α-syn水平的柱状图。
附图2：对照组(n＝56)和RLS-非用药组(n＝52)血清α-syn水平的散点图。
附图3：亚组分析显示，不同病程的RLS患者的血清α-syn水平有差异(H＝9.638，P＝0.022)。
附图4：血清α-syn诊断不安腿综合征的ROC曲线。
具体实施方式
本申请发明人经过广泛而深入的研究，首次发现原发性不安腿综合征患者外周血清α-突触核蛋白水平较年龄、性别匹配的健康对照组呈现显著下降(P<0.0001)，多巴胺受体激动剂普拉克索治疗可以影响不安腿综合征患者外周血清α-突触核蛋白水平，接受普拉克索治疗的患者较从未用药的患者，具有较高的血清α-突触核蛋白水平。因此，血清α-syn能够作为诊断不安腿综合征的生物标志物，其上调剂有望开发治疗不安腿综合征的药物。
在本发明中，所述的“不安腿综合征”英文名称restless legs syndrome，英文缩写RLS，又称不宁腿综合征、Ekbom综合征，系指下肢(少数情况也见于身体其他部位)于傍晚/夜间、休息时出现难以忍受的不适，运动、按摩可暂时缓解的一种综合征。现代医学依据是否存在系统性疾病和继发因素，将RLS分为原发性和继发性两种类型。原发性不安腿综合征患者往往伴有家族史；继发性不安腿综合征患者可见于缺铁性贫血、孕妇或产妇、肾脏疾病后期、风湿性疾病、糖尿病、帕金森病、II型遗传性运动感觉神经病、I/II型脊髓小脑性共济失调及多发性硬化等。
本文中，所用的“α-syn蛋白”可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的α-syn蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组α-syn蛋白。优选的，本发明可采用重组的α-syn蛋白。
任何适合的α-syn蛋白均可用于本发明。所述的α-syn蛋白包括全长的α-syn蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的α-syn蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号RefSeq：NG_011851.1所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的α-syn蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。α-syn蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。
任何一种α-syn蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，α-syn蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的α-syn蛋白的全部或部分功能。优选的，所述的生物活性片段至少保持50％的全长α-syn蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长α-syn蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
本发明也可采用经修饰或改良的α-syn蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的α-syn蛋白。所述经过修饰或改良的α-syn蛋白可以是一种α-syn蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的α-syn蛋白可以是与天然存在的α-syn蛋白具有较小的共同点，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响α-syn蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
根据α-syn蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。
优选的，所述的α-syn蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号RefSeq：NG_011851.1所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同。
基于本发明人的新发现，可以以α-syn蛋白或其编码基因作为测定不安腿综合征，特别是检测原发性不安腿综合征的标志物。通过分析待测样品(样本)中α-syn蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的体液，较佳的是血清。
可采用各种技术来检测α-syn的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于)：基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法。
基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂。任何可识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作检测不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征的标志物。所述的特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗α-syn蛋白的抗体。
本发明还提供了一种特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于检测不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征。
作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗α-syn的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
所述的抗体可用于免疫化学技术中，检测标本中的α-syn水平，从而用于诊断不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征。
作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增α-syn基因的引物。
也可利用基因芯片技术来进行α-syn的检测。在得知了α-syn的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。
利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中α-syn蛋白或α-syn基因的水平，因而可用于检测不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征，或者用于制备检测制剂或试剂盒等。
本发明还提供了用于检测不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂。所述的特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗α-syn蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
所述的试剂盒中还可含有：核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：用于免疫化学分析的试剂，所述的试剂例如：第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA或RNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的试剂盒。
所述的特异性识别α-syn蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
基于本发明人的新发现，本发明还提供了α-syn蛋白或其编码基因的上调剂在制备治疗不安腿综合征的药物中的应用。
如本文所用，所述的α-syn的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高α-syn蛋白的活性、维持α-syn蛋白的稳定性、促进α-syn蛋白的表达、促进α-syn蛋白的分泌、延长α-syn蛋白有效作用时间、或促进α-syn的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于治疗不安腿综合征，尤其是原发性不安腿综合征的有效物质。
作为本发明的优选方式，所述的α-syn蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)α-syn的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码α-syn的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
本发明中，α-syn多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含α-syn的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
如现有技术已公开某种对α-syn具备上调作用的物质(称为X)在制备治疗不安腿综合征的药物中的应用，但现有技术并未阐明X用于治疗不安腿综合征的机理在于使α-syn血清含量升高，或上调α-syn的表达，在这种情况下，本发明将把X排除在外，保护X以外的α-syn蛋白或其编码基因的上调剂在制备治疗不安腿综合征的药物中的应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
(一)病例资料和实验材料
1、病例和对照资料
2017.2-2018.8我院专家门诊和运动障碍专病门诊收集的患者71例，以及体检中心收集的健康对照者56例。
1)病例组入组标准：
a.满足国际RLS研究组(IRLSSG)2012版RLS诊断标准。
b.中国汉族人群(三代)，年龄大于等于18岁，男女不限。
c.患者签署书面知情同意。
2)病例组排除标准：
a.继发性RLS患者：如缺铁性贫血、肾脏疾病、糖尿、妊娠、周围神经以及帕金森病等。
b.药物滥用、酗酒长期服精神类等可能引起内源性“坐立不安”表现者。
c.认知功能障碍(MMSE≤24分)或不能配合进行量表评者。
d.孕妇。
e.不愿意参加研究或不同意签署知情同意书者。
3)健康者入组标准：
a.中国汉族人群(三代)，年龄大于等于18岁，男女不限。
b.签署书面知情同意。
4)健康组排除标准：
a.有不安腿综合征或怀疑可能有不安腿综合征。
b.合并其他中枢神经系统疾病或严重内科疾病。
c.服用多巴胺能药物，抗多巴胺能药物及可能影响多巴胺水平的药物者。
d.不愿意参加研究或不同意签署知情同意书者。
2、主要试剂和仪器
1)试剂：
ELISA试剂盒：SensoLyteTM Anti-alpha-Synuclein Quantitative Elisa Kit(Human)，AS-55550-H，ANASPEC，Inc.试剂盒保存于4℃。
2)仪器：
低温离心机(Eppendorf)，酶标仪(Bio-Rad)。
(二)研究设计与技术方法
1、登记人口学资料和一般情况
年龄，性别家族史，饮食习惯，烟酒，咖啡，BMI，腰臀比，既往病史用药(包括多巴胺能物、Alpha-2-delta配体类药物及其它类药物使用情况(种类、剂量和时间))。
2、不安腿综合征临床症状评估
严重程度(IRLSRS评分)、发作频率、临床亚型(慢性持续型/间歇型)、感觉障碍类型、有无症状恶化等。
3、血清标本采集与处理
促凝管采血5ml，4℃直立静置半小时后离心(10min，3000rpm，4℃)，取上层淡黄色血清-80℃分装备用。
4、ELISA检测血清中α-突触核蛋白(α-syn)水平
1)-80℃冰箱取出冻存血清，冻融。
2)按试剂盒说明书系列稀释配制标准品，根据前期预实验结果稀释血清200倍，依次加入标准品，待测样品(每个样品重复三次)，检测抗体，孵育，洗涤，显色，终止，酶标仪450nm处读取各孔OD值。绘制标准曲线，得出各孔样品浓度。每个样本的浓度取三个均值。
5、统计分析
计量资料采用均数±标准差表示，计数资料以构成比进行统计描述。计量资料组间比较采用t检验或Mann-Whitney检验。计数资料组间比较采用X2检验或Fisher确切概率法。检验水准α＝0.05，统计分析采用双侧检验，P<0.05为差别有统计学意义。采用SPSS21.0统计软件进行分析。
(三)研究结果
本研究纳入RLS患者71例，对照56例，患者组和对照组在年龄、性别方面无显著差异(表1)。
表1不安腿综合征患者和对照人口学资料
Figure BDA0001968048950000101
1、不安腿综合征患者血清α-syn水平(10.4±6.3ng/ml)较年龄、性别匹配的健康对照组(38.6±9.9ng/ml)显著下降(P<0.0001，图1，图2)。
2、多巴胺能药物治疗会影响不安腿综合征患者血清α-syn水平(14.5±7.1ng/ml)，高于未使用多巴胺能药物的患者(8.9±5.2ng/ml)(Z＝-3.098，P＝0.002，图1)。
3、RLS患者病程长短同血清α-syn水平呈负相关，RLS病程5年以内者血清α-syn水平最低，而病程10年以上患者血清α-syn水平较高(图3)。
4、血清α-syn水平对不安腿综合征诊断具有很高的灵敏度和特异度，灵敏度95.8％，特异度96.4％。ROC曲线下面积达0.991，P<0.0001。血清α-syn对不安腿综合征有诊断意义，且诊断效能较大(图4)。
5、对照组和患者组中，血清α-syn水平在男性、女性之间没有显著差异(P>0.05)，血清α-syn水平和两组年龄没有相关性(P>0.05)。
6、研究者另纳入187例不安腿综合征患者和213例健康对照者，检测了α-syn启动子区Rep1的多态性，发现2型等位基因和等位基因2频率在不安腿综合征患者中呈现显著下降(分别P＝0.006和P＝0.003)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.α-syn蛋白或其编码基因在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断不安腿综合征。
2.特异性识别或扩增或结合α-syn蛋白或其编码基因的诊断试剂的用途，用于制备诊断不安腿综合征的试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂选自：
特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗α-syn蛋白的抗体。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂是通过检测血清样本来诊断不安腿综合征。
6.一种用于诊断不安腿综合征的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：检测α-syn蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；其选自：
特异性扩增α-syn蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别α-syn蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗α-syn蛋白的抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：
核酸抽提试剂；和/或
聚合酶链反应试剂；和/或
蛋白免疫印迹试剂；和/或
酶联免疫反应试剂。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
9.α-syn蛋白或其编码基因的上调剂在制备治疗不安腿综合征的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的不安腿综合征是原发性不安腿综合征。
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郭彦杰等: "帕金森病与不安腿综合征关联研究进展" *

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