CN105267954A - 肝细胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制备预防或治疗宫内生长迟缓的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝细胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制备预防或治疗宫内生长迟缓的药物中的应用。本发明建立了IUGR大鼠模型，通过比较IUGR鼠和正常对照鼠，发现IUGR幼鼠出生后肝脏中HNF-1α和HNF-4α蛋白表达及mRNA表达水平均少于正常对照鼠，提示HNF-1α和HNF-4α可用作预防或治疗IUGR的靶标，或诊断IUGR的标志物。本发明为首次证实IUGR中HNF-1α及HNF-4α表达水平下降，有助于IUGR发生发展机制的进一步研究，并有助于从生命的源头尽早地采取补救措施，降低IUGR和IUGR诱发的其他疾病的发生几率。

Description

肝细胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制备预防或治疗宫内生长迟缓的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及肝细胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制备预防或治疗宫内生长迟缓的药物中的应用。

背景技术

胎儿宫内生长迟缓(intrauterinegrowthrestriction，IUGR)是指出生体重低于同胎龄平均体重的第十百分位或两个标准差。IUGR是胚胎发育异常最常见的形式，其发生率一般为7％，我国的平均发病率为6.39％。造成IUGR的原因很多，如遗传因素、宫内感染、母体饮食不良、母体营养储存不良、子宫血流不足或营养物质通过胎盘缺陷等。流行病学研究显示，母体怀孕时的状况和胚胎的生长环境与个体成年后许多代谢性疾病的发生密切相关，IUGR的儿童成年后易患高脂血症、肥胖、高血压、冠心病和2型糖尿病等。目前医学研究人员对于该疾病发生的机制研究还没有深入和明确的方向或确定关键影响或调控因子。

肝细胞核因子(hepatocytenuclearfactor，HNF)是调节肝脏内基因特异性表达的一类转录因子，在肝脏有较多表达，并含有在进化上相当保守的DNA结合区，通过与各种靶基因调控区顺式作用元件的结合，调节靶基因的表达，在转录水平对肝细胞分化和代谢过程起重要作用。HNF家族主要包括CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、HNF-1、HNF-3、HNF-4、D结合蛋白、HNF-6等六大类，这些转录因子及其相互作用构成的复杂调控网络，精确地控制着肝脏的发育和肝细胞的功能。HNF-1包括HNF-1α和HNF-1β两个成员，HNF-1α只在分化完全的细胞中才能检测到，在低分化或未分化的细胞中无表达。HNF-4包括HNF-4α、HNF-4β和HNF-4γ三个成员，定位于人20号染色体长臂(20q)，为类固醇激素受体超家族的孤儿受体，属核受体超家族2A亚家族(NR2A)。HNF-4α在分化成熟的肝细胞中高表达，是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，在肝脏的形成和成人肝脏许多基因的转录调节中起关键的作用。

目前有研究表明HNF-1α、HNF-3β、HNF-4α和C/EBPα在高分化的4个肝癌细胞系中均表达，而在低分化的3个肝癌细胞系中均无表达，HNF-1α、HNF-4α的高表达提示肝癌分化良好，其中HNF-1α和HNF-4α可作为肝癌分化程度的标志物。

然而，目前关于HNF-1α、HNF-4α与IUGR之间的关系还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供肝细胞核因子HNF-1α、HNF-4α的新用途。

本发明提供了肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备预防和/或治疗胎儿宫内生长迟缓的药物中的应用。

所述的调节剂选自抑制剂或增效剂。

本发明还提供了含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备预防和/或治疗胎儿宫内生长迟缓的药物中的应用。

本发明还提供了肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备研究胎儿宫内生长迟缓分子机制的试剂中的应用。例如肝细胞核因子HNF-1α的增效剂或HNF-4α的增效剂用于制备降低胎儿宫内生长迟缓发生率的试剂以用于研究其中的分子调控机理，肝细胞核因子HNF-1α的抑制剂或HNF-4α的抑制剂用于制备提高宫内生长迟缓发生率的试剂以用于研究其中的分子调控机理。

本发明还提供了含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备研究胎儿宫内生长迟缓分子机制的试剂中的应用。

本发明还提供了肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备于胎儿期预防胎儿成年后患糖尿病、高脂血症、肥胖、高血压或冠心病的药物中的应用。

本发明还提供了含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备于胎儿期预防胎儿成年后患糖尿病、高脂血症、肥胖、高血压或冠心病的药物中的应用。

本发明还提供了HNF-1α或HNF-4α在作为胎儿宫内生长迟缓的诊断标志物中的应用。

本发明优点在于：

本发明采用Wistar大鼠受孕期间给予低蛋白饮食致胎鼠宫内营养不良，制作IUGR模型，利用IUGR鼠和正常对照鼠，采用Realtime-PCR、Westernblot和免疫组化方法检测肝脏中HNF-1α和HNF-4α的基因和蛋白水平的表达，通过比较发现IUGR幼鼠出生后肝脏中HNF-1α和HNF-4α蛋白表达及mRNA表达水平均少于正常对照鼠，提示HNF-1α和HNF-4α可用作预防或治疗IUGR的靶标，或诊断IUGR的标志物。本发明首次研究证实了IUGR中HNF-1α及HNF-4α水平的变化，有助于IUGR发生发展机制的进一步研究，并有助于从生命的源头尽早地采取补救措施，降低IUGR和IUGR诱发的其他疾病的发生几率。

附图说明

图1.两组幼鼠体重变化比较。与CON组比较，0天IUGR组体重明显低于CON组，差异有显著性，P<0.01，3周时两组幼鼠体重差异无显著性，P>0.05，8周时IUGR组体重超过CON组，差异有显著性，P<0.05。

图2.HNF-1α蛋白在肝脏中表达的Westernblot图谱。A图为肝脏GAPDH蛋白表达，B图为肝脏HNF-1α蛋白表达，1、3和5为CON组，2、4和6为IUGR组，1、2条带为0天，3、4条带为3周，5、6条带为8周。

图3.两组幼鼠肝脏HNF-1α蛋白相对表达量比较。

图4.RT-PCR检测IUGR对HNF-1α表达的影响。

图5.两组幼鼠肝脏HNF-1α阳性表达细胞相对密度值比较。

图6.两组幼鼠HNF-1α在肝脏细胞阳性表达图片。

图7.HNF-4α蛋白在肝脏中表达的Westernblot图谱。A图为肝脏GAPDH蛋白表达，B图为肝脏HNF-4α蛋白表达，1、3和5为CON组，2、4和6为IUGR组，1、2条带为0天，3、4条带为3周，5、6条带为8周。

图8.两组幼鼠肝脏HNF-4αmRNA相对表达量比较。

图9.RT-PCR检测IUGR对HNF-4α表达的影响。

图10.两组幼鼠肝脏HNF-4α阳性表达细胞相对密度值比较。

图11.两组幼鼠HNF-4α在肝脏细胞阳性表达图片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、IUGR动物模型的建立

1、材料

1.1实验动物

由中国医科大学盛京医院实验动物室提供，健康的清洁级雌性Wistar大鼠40只，雄性大鼠10只，体重220-280g。

1.2试剂

动物饲料：低蛋白饲料由中国医学科学院实验动物研究所提供，热卡为1572kJ/100g，其中脂肪6.7％，碳水化合物63.4％，蛋白质含量仅为8.0％；标准饲料热卡为1583kJ/100g，其中蛋白质23％，脂肪4.5％，碳水化合物57.8％。

50％葡萄糖注射液加蒸馏水配置成25％葡萄糖注射。

2、方法

将Wistar大鼠按雌:雄＝4:1的比例于前一晚上合笼，第二天晨起用盐水棉签做阴道涂片，以光学显微镜下见到发丝样团状物为受孕，记为受孕第一日，随机分为生长迟缓组(IUGR组)和正常对照组(CON组)，IUGR组喂给低蛋白饲料，CON组喂给标准饲料，温度24℃，湿度60％，光照12小时。每天更换垫料，添给饲料、水。孕鼠均自然分娩，子鼠出生后于生后12小时内测体重，精确到0.01g。IUGR诊断标准：体重低于正常对照组平均体重2个标准差者为IUGR鼠。

3、统计学处理

所有数据均以均数±准差表示，采用方差分析对组内各时间点的结果进行比较，两组间相同时间点用t检验，两组鼠出生体重比较采用x²检验，制作统计图表，数据用SPSS11.5软件处理，P<0.05为有显著性差异。

4、结果

两组母鼠孕期为21天，低蛋白饮食组IUGR发生率61.32％，标准饲料喂养组IUGR发生率为9.28％，低蛋白饮食组明显高于标准饲料组(x²＝58.36，P<0.001)，两组有显著性差异。IUGR组平均出生体重比对照组低22.88％(t＝6.58，P<0.05)，差异性显著。生后3周IUGR组体重仍稍低于CON组，4周时追赶上CON组，两组幼鼠体重无显著性差异，8周时体重明显高于CON组，有显著性差异(P<0.05)。两组幼鼠体重数值见表1、图1。

表1IUGR组和CON组幼鼠体重比较

注：﹡﹡P<0.01，﹡P<0.05。

二、IUGR对HNF-1α和HNF-4α影响的研究

1、材料

1.1实验动物

1.1.1动物分组

CON组：标准饮食组，正常体重新生鼠、3周、8周，各取8只，雌雄各半。IUGR组：低蛋白饮食组，体重低于2个标准差的新生鼠、3周、8周，各取8只，雌雄各半。

1.1.2标本的采集

新生鼠测体重，断头处死，3周龄和8周龄子鼠给5％水合氯醛腹腔注射麻醉，CON组和IUGR两组新生鼠、3周和8周子鼠，取胰腺和肝脏，各留取三份标本，两份胰腺、肝脏于-70℃冰箱保存，做Westernblot和Realtime-PCR备用；另一份胰腺、肝脏放入4％多聚甲醛溶液中，固定。

1.2试剂

组织蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司，总蛋白定量试剂由南京建成生物工程研究所提供。

HNF-1α、山羊抗大鼠和HNF-4α、兔抗大鼠抗体(SantaCruz，美国)，DBA显色试剂盒(ZLI-9032，北京中山)。

大鼠HNF-1α、HNF-4α和内参照磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydesphosphatedehydrogenase，GAPDH)引物参照GeneBank中的基因序列，由大连TaKaRa公司设计合成。

TrizolReagent：美国InvitrogenLifetechnologies公司。

DNAMarker购自大连TaKaRa公司。

RT-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。

琼脂糖购自美国Promega公司。

十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)、甲醇、脱脂奶粉等购于华美公司。

2、方法

2.1RealtimePCR半定量检测mRNA的表达

2.1.1总RNA的提取

按照Trizol总提取试剂盒说明书操作，每组8份样品雌雄各半，分别称取胰腺、肝脏组织，每份样品组织100mg，提取总RNA。然后用紫外分光光度计测260nm和280nm的吸光度值，检测提取RNA的质量及产量，-70℃保存备用。

2.1.2逆转录合成cDNA第一链

将提取的总RNA稀释成1μg/μl，然后按照RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA第一链。

2.1.3Realtime定量PCR反应

(1)引物序列

(2)PCR反应体系

(3)PCR反应条件

(4)溶解曲线条件

(5)扩增产物定量分析

通过RealtimePCR扩增仪，得到目的基因的RealtimePCR扩增产物，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA起始浓度进行定量分析，通过荧光定量PCR自动分析并计算结果，目的基因mRNA的相对表达量＝目的基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。

2.2Westernblot检测蛋白的表达

2.2.1组织总蛋白提取

按照总蛋白提取试剂盒说明书操作，每组8份样品雌雄各半，分别称取胰腺、肝脏组织，每份样品组织100mg，剪碎后加入6倍体积的预冷细胞裂解液，超声匀浆机匀浆粉碎20s，间隔20s，3次，15000rpm于4℃离心20min，吸取上清液为组织细胞总蛋白。采用酚试剂法对蛋白样品进行定量，用裂解缓冲液调整各标本至相同蛋白浓度。

2.2.2Western杂交检测蛋白的表达

取蛋白液40μl，加10μl的5倍的样品缓冲液，加5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺浓缩胶电泳，条件150V，30mA，1.5小时。硝酸纤维素膜在转印液中平衡10分钟，然后按照胶在负极、膜在正极的原则，经2小时50V的转印后TTBS洗膜1次。用含5％去脂奶粉的TTBS封闭4℃过夜，取出膜后，TBS洗膜5分钟×3次，分别加入各目的基因的多克隆一抗(1:400)，室温下孵育2小时。加入碱性磷酸酶标记的二抗(1:2000)，室温下孵育2小时，TTBS洗5分钟×2次，TBS洗5分钟×1次，酶显法显色。结果actin作为内参，采用FlourChemV2.0凝胶成像分析软件(America)分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。

2.3免疫组化检测HNF-1α和HNF-4α表达

2.3.1光镜切片的制作

2.3.2免疫组化染色采用SABC法

(1)操作步骤严格按照说明书进行，石蜡切片常规脱蜡至水。

(2)3％过氧化氢封闭过氧化物酶，反应10min，蒸馏水冲洗3次，每次2min。滴加复合消化酶以暴露抗原，室温5min，抗原修复。

(3)0.1MPBS冲洗5min。滴加正常山羊血清封闭液，室温40min。滴加一抗(不同种蛋白的特异性抗体)4℃过夜。

(4)次日晨取出PBS洗4次，每次5min。滴加生物素化二抗，37℃室温孵育20min。0.1MPBS洗4次，每次5min。滴加辣根过氧化物酶标记的SABC液，37℃室温孵育20min。0.1MPBS洗3次，每次5min。

(5)DBA显色：DBA显色，溜水洗。苏木素复染2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

2.3.3结果分析方法

每个切片取5个不同视野，在计算机图像分析仪上扫描数据，棕黄色为阳性表达，观察表达部位，数据进行统计学分析。

3、统计学处理

所有数据均以均数±标准差表示，同一组内比较采用方差分析F检验，不同组间相同时间点间比较采用t检验，制作统计图表，数据用SPSS11.5软件处理，P<0.05为有显著差异性。

4、结果

4.1IUGR幼鼠肝脏HNF-1α表达情况

4.1.1Westernblot结果

应用Westernblot方法检测HNF-1α蛋白在肝脏中的表达，Westernblot图谱见图2。

两组幼鼠肝脏HNF-1α蛋白相对表达量比较见表2、图3。

表2两组幼鼠肝脏HNF-1α蛋白相对表达量比较

注：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

RealtimePCR半定量检测HNF-1αmRNA的表达，两组幼鼠肝脏HNF-1α的基因转录水平表达情况见表3、图4。结果显示，相比于CON组，IUGR组新生鼠(t＝3.15，P<0.01)，3周鼠(t＝2.51，P<0.05)，8周鼠(t＝2.39，P<0.05)，即IUGR组HNF-1α的mRNA表达量均明显低于CON组，差异性显著。

表3两组幼鼠肝脏HNF-1α的基因转录水平表达

注：﹡P<0.05。

免疫组化检测HNF-1α表达，两组幼鼠肝脏HNF-1α阳性表达细胞的相对密度值比较见表4、图5，两组幼鼠HNF-1α在肝脏细胞阳性表达图片见图6。免疫组化方法观察到，棕黄色为阳性表达，在肝脏细胞内表达，通过图像分析仪检测相对表达量，两组比较分析，IUGR组新生鼠(t＝3.23，P<0.01)，3周鼠(t＝2.83，P<0.05)，8周鼠(t＝2.42，P<0.05)，IUGR组HNF-1α的表达量均明显低于CON组，差异性显著。

表4肝脏HNF-1α阳性表达细胞的相对密度值比较

注：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

4.2IUGR幼鼠肝脏HNF-4α表达情况

应用Westernblot方法检测HNF-4α蛋白在肝脏中的表达，Westernblot图谱见图7。

两组幼鼠肝脏HNF-4α蛋白相对表达量比较见表5。结果显示，与CON组相比，IUGR组新生鼠(t＝2.99，P<0.01)，3周鼠(t＝2.33，P<0.05)，8周鼠(t＝2.46，P<0.05)，IUGR组的HNF-4α蛋白的表达量均明显低于CON组，差异性显著。

表5两组幼鼠肝脏HNF-4α蛋白相对表达量比较

注：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

RealtimePCR半定量检测HNF-4αmRNA的表达，两组幼鼠肝脏HNF-4α的基因转录水平表达情况见表6、图8-9。结果显示，与CON组相比，IUGR组新生鼠(t＝2.62，P<0.05)，3周鼠(t＝2.79，P<0.05)，8周鼠(t＝2.89，P＞0.05)，IUGR组HNF-4α的mRNA表达量均明显低于CON组，差异性显著。8周鼠差异性不显著。

表6两组幼鼠肝脏HNF-4α的基因转录水平表达

注：﹡P<0.05。

免疫组化检测HNF-4α表达，两组幼鼠肝脏HNF-4α阳性表达细胞的相对密度值比较见表7、图10，两组幼鼠HNF-4α在肝脏细胞阳性表达图片见图11。免疫组化方法观察到，棕黄色为HNF-4α阳性细胞表达，通过图像分析仪检测相对表达量，两组比较分析，IUGR组新生鼠(t＝3.30，P<0.01)，3周鼠(t＝2.93，P<0.05)，8周鼠(t＝2.66，P<0.05)，IUGR组HNF-4α的表达量均明显低于CON组，差异性显著。

表7两组幼鼠肝脏HNF-4α阳性表达细胞的相对密度值比较

注：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

以上实验表明，在IUGR鼠出生后0天、3周和8周，HNF-1α和HNF-4α的蛋白和mRNA表达水平均显著少于CON组，提示HNF-1α和HNF-4α可作为IUGR的治疗靶标，或作为诊断IUGR的标志物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备预防和/或治疗胎儿宫内生长迟缓的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调节剂选自抑制剂或增效剂。

3.含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备预防和/或治疗胎儿宫内生长迟缓的药物中的应用。

4.肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备研究胎儿宫内生长迟缓分子机制的试剂中的应用。

5.含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备研究胎儿宫内生长迟缓分子机制的试剂中的应用。

6.肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂在制备于胎儿期预防胎儿成年后患糖尿病、高脂血症、肥胖、高血压或冠心病的药物中的应用。

7.含有肝细胞核因子HNF-1α及其调节剂或HNF-4α及其调节剂的试剂盒在制备于胎儿期预防胎儿成年后患糖尿病、高脂血症、肥胖、高血压或冠心病的药物中的应用。

8.HNF-1α或HNF-4α在作为胎儿宫内生长迟缓的诊断标志物中的应用。