CN111549035B - 能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用 - Google Patents

能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能特异性识别O‑GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用，属于生化检测技术领域。具体为以指数富集的配基系统进化技术(SELEX)为基础，以O‑GlcNAc修饰多肽为筛选靶标，以未修饰的多肽作为反筛。经多轮筛选后获得能够特异性识别O‑GlcNAc修饰的DNA适配体。以该适配体为核心，通过生物素等标记的DNA适配体用于检测蛋白质中O‑GlcNAc修饰水平。本发明提供了O‑GlcNAc修饰单链DNA适配体的筛选方法，生物素等标记的DNA适配体用于检测蛋白质O‑GlcNAc修饰，为O‑GlcNAc修饰的研究提供了新的方法以及为适配体在翻译后修饰中的应用开辟了新的方向，具有潜在应用前景。

Description

能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法 和应用
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
蛋白质O-GlcNAc修饰广泛存在于多种蛋白质中，是一种营养及应激反应的翻译后修饰。自发现以来已经有4000多种蛋白质被鉴定具有O-GlcNAc修饰，这些蛋白几乎参与了所有生理过程，如蛋白质结构的稳定、信号传导、调节转录活性、调节表观遗传、调节神经元功能以及蛋白质间的相互作用、应激反应等都具有非常重要的作用。蛋白O-GlcNAc修饰发生异常时，也会导致多种疾病的发生。如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病以及其它慢性疾病等都与O-GlcNAc修饰异常有关。
随着越来越多的研究，O-GlcNAc修饰的重要性不断展现出来。而研究O-GlcNAc修饰首要的方法就是要鉴定和富集出具有此种修饰的蛋白质，然而在O-GlcNAc修饰的鉴定方面却有不少困难，因为修饰不仅分子量小，丰度较低而且处于高度动态性变化中，在制备质谱样品时这种修饰极易脱落等。虽然目前有多种检测鉴定O-GlcNAc修饰的方法，但都无法满足对O-GlcNAc修饰进行大批量的鉴定研究。例如，凝集素法特异性较低，现有的O-GlcNAc修饰抗体不仅昂贵而且抗体具有氨基酸序列依赖性等等。开发新的O-GlcNAc修饰检测方法不仅是对已有方法的补充，也是更系统深入的探究O-GlcNAc修饰的需要。
指数富集配体系统进化技术(SELEX)一种体外筛选针对靶标的单链核酸分子的技术，该技术应用广泛，能筛选针对多种不同靶标。基于SELEX技术筛选出能够特异性识别O-GlcNAc修饰的ssDNA适配体不仅能够为检测O-GlcNAc修饰提供新方法，也能进一步拓宽核酸适配体的发展和应用。
发明内容
本发明的目的之一，提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的单链DNA核酸适配体的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的核酸适配体。
本发明的目的还在于提供上述适配体的应用。一种蛋白质O-GlcNAc修饰水平的检测方法，方法以O-GlcNAc适配体为核心，利用生物素或荧光分子等功能集团对该适配体进行标记，用于特异性识别蛋白质中或细胞中的O-GlcNAc修饰，利用蛋白印记或免疫荧光等方法检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰水平。
具体的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体的筛选方法，其特征在于：即是基于SELEX技术筛选识别O-GlcNAc修饰的单链DNA核酸适配体的方法；包含以下步骤：
(1)用人工合成的O-GlcNAc修饰多肽，多肽N-端为半胱氨酸其氨基被乙酰基保护，具体为：
用人工合成的有O-GlcNAc修饰多肽作为SELEX的筛选靶标，多肽信息为多肽序列：CGSGGTGGSGL，其中第三位丝氨酸、第六位苏氨酸和第九位丝氨酸羟基氧原子上被N-乙酰葡萄糖胺修饰，将修饰多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面以便于将结合和未结合的适配体分离；
(2)将多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面，用于筛选过程中将结合与未结合的适配体进行固液分离，具体为：
设计筛选所用单链DNA适配体文库(见序列表文件SEQ ID NO.2)，其两端为固定序列，用于结合引物进行PCR扩增，中间为30个nt的随机序列，用于形成丰富的形态结构；
(3)利用DNA寡核苷酸文库与O-GlcNAc修饰多肽进行反复的孵育-洗脱-扩增，获得每一轮富集后的次级文库，具体为：
通过文库和靶标多肽的共同孵育，去除未结合的适配体，将结合的适配体回收后进行PCR扩增，再通过不对称PCR得到次级文库，用于后续轮次的使用。通过加入未修饰的多肽进行反筛以增强筛选压力，经过多轮筛选将能与O-GlcNAc修饰糖肽结合的适配体进行富集；
(4)得到各轮富集的ssDNA亚文库通过酶联免疫吸附试验和微热量泳动技术测定亲和力最佳的次级分库，随后通过鉴定单个核酸适配体的亲和力筛选出具有较好特异性和亲和力的几条候选核酸适配体，具体为：
比较各轮筛选的次级文库与O-GlcNAc修饰多肽亲和力，将亲和力最高的次级文库进行高通量测序分析，选出富集较多且具有代表性的候选适配体进行验证，得到能特异性结合O-GlcNAc修饰的适配体。
作为优选方案，还包括以下步骤(5)：选出具有代表性的候选适配体以后，分别用微热量泳动技术(MST)和酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)法检测候选适配体的特异性和亲和力，选出特异性好，亲和力高的适配体。最后利用适配体检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰水平。
通过上述方法，得到识别O-GlcNAc修饰的单链DNA核酸适配体，命名为aptO-19。
进一步地，所述步骤(4)中筛选得到的候选核酸适配体的鉴定方法如下：通过高通量测序分析筛选结果得到结合的适配体群体信息并通过微热量泳动技术鉴定适配体与靶标的结合情况，筛选出特异性较好亲和力较高的适配体；结合解离常数及特异性结合情况，鉴定出其中最佳的DNA核酸适配体。
第二方面，本发明还提供一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体，其特征在于：所述单链DNA适配体通过权利要求2中筛选选方法得到，并利用权利要求3中的方法进行鉴定；所述单链DNA适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
第三方面，本发明提供一种如上述的单链DNA适配体在检测O-GlcNAc修饰水平中的应用，其特征在于：利用生物素/荧光/酶标/化学发光或多价化等标记的适配体用于检测细胞或组织中蛋白质O-GlcNAc修饰水平。
上述适配体在蛋白质O-GlcNAc修饰水平检测中的应用，具体为以该适配体为核心，利用生物素或者荧光分子标记该适配体作为检测试剂，再利用HRP标记的链霉亲和素或者共聚焦显微镜等观察蛋白质的O-GlcNAc修饰水平。
本发明的优点及有益效果如下：
(1)本发明应用了微热量泳动技术检测了核酸适配体与O-GlcNAc修饰多肽的结合，并用未修饰的多肽进行验证，保证了适配体结合的特异性，而且为微热量泳动技术在适配体筛选中的进一步应用提供了支持；
(2)本发明以从核酸适配体的角度出发，尝试了一种新的检测O-GlcNAc修饰的方法，同时拓宽了适配体的应用范围。
附图说明
图1、各轮次级文库与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力比较。用ELONA法检测次级文库亲和力。
图2、候选适配体与O-GlcNAc修饰多肽结合情况检测。MST检测各适配体与修饰多肽结合的适配体。筛选出6种能够结合O-GlcNAc修饰多肽的适配体。
其中：图2为各候选适配体与O-GlcNAc修饰多肽相互作用的剂量-反应曲线(基线 校正归一化荧光曲线)(注：信噪比(S/N)<5为配体和受体之间无特异性结合；>5为具有可信 的的结合信号；S/N>12表示结合信号良好；“/”为未检测到结合信号无对应拟合曲线)
图3为6种与修饰多肽结合的适配体的MST剂量-反应曲线(结合分数曲线)
图4、与O-GlcNAc修饰多肽结合的6种适配体与未修饰多肽相互作用的剂量-反应曲线(基线校正归一化荧光曲线)
图中：能与修饰多肽结合的适配体与未修饰多肽的结合情况检测。从6种能够结合 O-GlcNAc修饰多肽的适配体中筛选出三种仅结合O-GlcNAc修饰多肽结合的适配体。
图5、用ELONA法比较适配体aptO-14与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力大小。
图6、用ELONA法比较适配体aptO-19与多肽的亲和力大小。
图7、用ELONA法比较适配体aptO-31与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力大小。
图8、aptO-19适配体二级结构预测。用软件DNAMAN分析仅识别O-GlcNAc修饰多肽且亲和力最高的适配体aptO-19的二级结构。
图9、aptO-19适配体检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰。蛋白印记法检测人PKM2中O-GlcNAc修饰水平。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来说明本发明。
如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。
实施例1SELEX技术筛选出特异结合O-GlcNAc修饰多肽的核酸适配体
1、首先进行筛选靶标的制备。根据半胱氨酸上的巯基(-SH)能够和纳米金颗粒(gold nanoparticles，GNPs)在温和条件下发生金巯反应生成稳定的金巯键，反应后其紫外吸收峰会发生偏移这一特性，将其负载在纳米金表面进行固液分离。将多肽和纳米金颗粒在中性条件下室温孵育过夜，即可将O-GlcNAc修饰的多肽连接到纳米金(粒径为13nm)表面，通过离心去除未连接的多肽完成筛选靶标的制备。
2、筛选采用较为稳定的单链DNA适配体文库。文库信息为5’-GCGGAATTCAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’(68nt)(N代表A、T、C或G四种碱基)，SEQ ID NO.2。文库两端为固定序列，用于适配体的扩增引物的结合模板，文库上游引物P1：5’-GCGGAATTCAACAGTCCGAGCC-3’(22nt)(划线部分为EcoR I酶切位点)，SEQ ID NO.3,下游引物P2：5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’(25nt)(划线部分为BamH I酶切位点),SEQ IDNO.4。文库和引物均有生物公司合成。
3、将单链DNA文库与制备好的纳米金多肽在室温下进行孵育(适配体在使用之前都经过95℃处理10分钟后立即放入冰中5分钟)，然后离心洗涤去除未结合的，通过95℃加热后立即离心将结合在靶标上的适配体分离，然后进行对称PCR获得结合的双链适配体，切胶回收以后以双链为模板再通过不对称PCR，随后通过乙醇沉淀法回收得到下一轮的次级文库。筛选过程为梯度压力筛选并从第四轮开始用未修饰的多肽进行反筛，各轮筛选具体信息见表1：
表1.特异结合O-GlcNAc修饰多肽的核酸适配体筛选信息表
Figure BDA0002510682660000071
1.经过十轮筛选后，用生物素标记的适配体下游引物进行不对称PCR得到生物素修饰的各次级文库。用O-GlcNAc修饰的多肽(10ug)包被可拆卸96孔板，37℃包被2小时后紫外辐照45分钟以增强包被效果。随后用300ul BSA(5％)37℃封闭1小时，清洗5次后(每次3分钟)加入200nM对应各轮次的生物素标记的文库100ul(95℃10分钟后立即冰浴5分钟)，室温孵育2小时。洗涤5次后加入100ul辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素(用无菌PBS1:1000进行稀释使用)，37℃孵育30分钟，PBST洗涤8次后，加入100ulTMB(A液加B液等体积混匀)，37℃孵育5-10分钟，加入2M的硫酸终止反应后，酶标仪读板。
实施例2鉴定特异性结合O-GlcNAc多肽的适配体
将筛选中亲和力最高的次级文库进行高通量(HGS)测序，以测序结果为依据进行分析确定候选适配体。再从候选适配体中找到能特异性结合O-GlcNAc多肽的适配体进行鉴定。
一、候选适配体中能特异性结合O-GlcNAc多肽的适配体的鉴定
1、根据测序结果中序列信息以及二级结构等对结果中重复较多的适配体进行分析，寻找出比较具有代表性的十条适配体作为候选适配体进行后续实验；
2、候选适配体单链送生物公司合成后，先进行对称PCR获得全长的双链适配体模板；
3、用FITC标记的下游引物P2，进行不对称PCR，乙醇沉淀法进行回收后，每个适配体用300ml筛选缓冲液配成浓度为400nM工作液，95度，10min，立马放入冰上5min，避光备用；
4、将(4)中带有荧光集团的适配体先进行预实验，检测各单适配体的荧光值是否符合要求，并调整好统一荧光强度；
5、将O-GlcNAc修饰的多肽做倍比稀释，标记1-16号200ulEP管，每管加入10ul筛选缓冲液；
6、在第一管中加入10ul的O-GlcNAc修饰多肽(1mM)，轻轻吹打均匀(注意不要打出气泡)，取出10ul加入第二管中，如此重复并将最后一管中弃去10ul；
7、向上述1-16管中依次加入10ul的各适配体工作液(400nM)，轻轻吹打均匀，室温避光孵育5min；
8、在适配体孵育期间，打开MST仪器，选择亲和力检测并进行相关参数设置；
9、上样，将样品进行短暂离心后，小心打开，倾斜至水平，手持仪器配套的毛细管一端(切勿用手触碰毛细管中间检测部位)，小心插入管底，待样品吸入至4/5左右时，取出毛细管，依次放入样本架上对应位置，等所有样本加样完成后，压上磁性样品板，水平放入仪器中；
10、开始检测，并在进度到75％左右时开始准备下一组样本；
11、导出数据，进行结果分析。将能与O-GlcNAc修饰多肽的单适配体采取同样的方法检测和未修饰的多肽的结合能力。根据检查结果确定能特异性结合O-GlcNAc的适配体。
实施例3 ELONA法检测单适配体与O-GlcNAc多肽的亲和力
通过分析MST检测的结果发现，适配体aptO-19、aptO-31和aptO-14能够特异性结合O-GlcNAc修饰的多肽，而不结合无修饰的多肽。用法进一步测定三种适配体与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力的大小并以Kd值表示。
(1)用测序正确的适配体质粒做为模板，用生物素标记的下游引物P2作为引物进行不对称PCR获得生物素标记的各单适配体，用乙醇沉淀法回收；
(2)将回收后的适配体用筛选缓冲液倍比稀释，浓度依次为1uM、0.5uM、0.25uM、0.125uM、0.0625uM、0.031uM、0uM。稀释好后95℃，10分钟，立马置于冰上备用。
(3)用100ul含有10ug的O-GlcNAc修饰的多肽的筛选缓冲液包被可拆卸96孔板，37℃孵育2小时，孵育后用紫外灯进行辐照45分钟，增强包被效果；
(4)PBST(含0.05％的Tween-20)清洗5次，每次3分钟，加入300ul 5％BSA溶液，37℃封闭1小时；
(5)弃去封闭液，用PBST洗涤5次，每次3min；
(6)将准备好的倍比稀释的生物素标记的适配体依次加入每孔中，每孔100ul，室温孵育2小时；
(7)PBST清洗5次，每次3分钟，洗去未结合的适配体；
(8)每孔加入100ul辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素(用无菌PBS1:1000进行稀释使用)，37℃孵育30分钟；
(9)小心弃去孔中液体后，PBST洗涤8次，每次3min；
(10)每孔加入100ulTMB底物(A液加B液等体积混匀)，37℃孵育5-10分钟，加入2M的硫酸终止反应后，酶标仪读取OD450的值；
(11)用GraphPad Prism 8.0拟合各单适配体的Kd值。
适配体 Kd值(nM)
AptO-14 1378±237
AptO-19 813±131
AptO-31 1702±527
(12)可见适配体AptO-19的亲和力最高。
实施例4 O-GlcNAc修饰蛋白的免疫印记法检测
以筛选出来的亲和力最高的适配体aptO-19为核心，建立免疫印迹法检测蛋白质O-GlcNAc修饰水平。根据文献和实验室资源，用已经鉴定具有O-GlcNAc修饰的人PKM2作为验证载体。
(1)构建人PKM2突变真核表达质粒，根据PKM2基因编码序列(NM_002654.6)设计引物将PKM2发生O-GlcNAc修饰的关键位点第405号苏氨酸和406号丝氨酸突变为丙氨酸。构建至真核表达质粒pcDNA3.1上，得到pcDNA3.1-PKM2T405A/S406A。
(2)将构建好的PKM2突变质粒pcDNA3.1-PKM2T405A/S406A和pcDNA3.1-PKM2WT转染至HELA细胞中，同时共转染OGT真核表达质粒，培养48小时；
(3)在对应组中加入OGT抑制剂L01，孵育24小时。收集细胞，PBS洗涤2次后加入700ul(10cm细胞培养皿)弱RIPA细胞裂解液，冰上裂解20分钟；
(4)10000g，4℃，离心10分钟，吸取上清，加入20ul ProteinA/G，4℃孵育2小时去除内源性IgG后磁性分离，取上层清液；
(5)吸出100ul留做INPUT样品制备，在剩余体系中按1:100加入PKM2抗体，4℃孵育过夜，加入40ul ProteinA/G，再次4℃孵育2小时；
(6)磁性分离，将磁珠用PBST(0.5％Triton X-100)洗涤三次后向磁珠中加入100ul 2×SDS上样缓冲液，100℃煮样10分钟；
(7)进行12％SDS page电泳后将蛋白转印到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时；
(8)对照组分别加入抗PMK2一抗(和IP时的抗体最好不要同源，以免重链干扰)，抗O-GlcNAc修饰抗体(RL2等)(1:1000)，4℃孵育过夜，洗涤后，加入二抗，37℃孵育一个小时，洗涤后进行显色；
(9)实验组加入200nM的生物素修饰的aptO-19适配体或者生物素标记的原始文库，室温孵育2小时，洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素洗涤后进行显色。
实施例5荧光共聚焦法检测细胞O-GlcNAc修饰
以获得的适配体aptO-19为核心，建立荧光共聚焦法检测细胞O-GlcNAc修饰的方法。
(1)培养HELA细胞，细胞计数板计数后，调整细胞浓度为1×105个/ml，铺共聚焦小皿。
(2)将小皿置于摇床上PBS洗涤3次，每次5min；加入4％多聚甲醛(每皿加入50ul)，室温避光固定20min；弃去固定剂，PBS洗涤3次，每次5min；
(3)将10×细胞破膜剂用去离子水稀释至1×工作浓度，加入至固定好的细胞中(每皿加入140ul)，4℃孵育30min；弃去破膜剂，PBS洗涤3次，每次5min；
(4)加入5％BSA封闭液进行封闭(每皿加入100μl)，37℃孵育1h；弃去封闭液，倾去封闭液，PBS洗三次后，加入用PBS稀释的FITC标记的适配体(200nM),4℃避光过夜；
(5)加入DAPI(100×)室温避光孵育10min；弃去液体，用PBS洗涤3次，每次5min，激光共聚焦显微镜检测
附表1.单链DNA文库及aptO-19适配体序列信息
Figure BDA0002510682660000121
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggtcaatgc gtcataggat cccgcggcgc gatagcgacg gggcaattcc aagaaggctc 60
ggactgttga attccgc 77
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggaattca acagtccgag ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngggtcaat 60
gcgtcata 68
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggaattca acagtccgag cc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgggatcct atgacgcatt gaccc 25

Claims (2)

1.一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体，其特征在于：所述单链DNA适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1中所述的能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体在制备检测O-GlcNAc修饰水平的试剂中的应用，其特征在于：利用生物素/荧光/酶标记适配体，用于检测细胞或组织中蛋白质O-GlcNAc修饰水平。
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