CN111548397A - 幽门螺杆菌HpaA亚单位B细胞表位肽与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种幽门螺杆菌HpaA的B细胞表位肽，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为SEQ ID No：1和/或SEQ ID No：2；还提供一种多抗原肽表位疫苗，所述疫苗的活性成分为上述的B细胞表位肽。还提供一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其活性成分为上述的B细胞表位肽。将用于预防和治疗幽门螺杆菌感染疫苗的开发。

Description

幽门螺杆菌HpaA亚单位B细胞表位肽与应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种幽门螺杆菌HpaA亚单位B细胞表位肽与应用，将用于预防和治疗幽门螺杆菌感染疫苗的开发。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种定植于胃黏膜的微需氧、螺旋状致病菌。Hp感染可诱发慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及低度恶性胃黏膜相关淋巴组织样淋巴瘤等胃肠疾病，且与多种胃肠外疾病有关，如特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血等。在1994年，WHO就将Hp列为I类致癌原。在2015年东京全球共识报告中，Hp胃炎被定义为一种烈性传染(感染)性疾病，除非有抗衡因素存在，Hp阳性者均应根除Hp。因此，Hp感染的问题亟需得到人们的关注。

迄今为止，全球几乎有一半的人口均为Hp感染者。据统计，发展中国家的感染率(50.8％)要高于发达国家(34.7％)。我国Hp患病率高达84.62％，慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡患者超过2亿，2012年胃癌发病率已位居第二，胃癌死亡者达20万以上，治疗Hp所致疾病超过100亿元。临床上一直依靠抗生素治疗Hp感染，但抗生素滥用导致Hp耐药菌不断产生，发病人数并未因治疗而减少。面对如此严峻的形式，急需寻求新的Hp防治手段。而接种疫苗既能从源头上控制感染的传播与感染，又能大幅减少治疗费用，是预防感染性疾病的最有效策略。

黏附素作为定植的物质基础，是Hp得以在胃黏膜定植、繁衍的首要因素。受体特异性的粘附素可以直接与宿主细胞、粘蛋白及细胞外基质结合，这是Hp在同一宿主体内存活数十年的重要原因之一。如果Hp粘附胃黏膜的能力被削弱，就会随着表面上皮细胞和粘液层的脱落而被快速清除。因此从Hp的黏附素着手，来削弱Hp在胃内的定植，可为防治Hp感染提供新的思路。其中黏附素HpaA是Hp所特有的，且几乎存在于所有菌株。尽管HpaA基因同其他多数Hp基因一样具有限制性片段长度多态性的特性，但其蛋白却具有十分保守的唾液酸乳糖结合域，并且具有良好的抗原性及免疫原性。有研究报道，无论是全长还是截短形式的重组蛋白，免疫小鼠后都能获得保护性免疫应答。因此，HpaA是一种很有潜力的防治Hp感染及复发的潜在候选疫苗蛋白。

目前，在研的Hp疫苗的形式多样，包括全菌疫苗、载体疫苗和亚单位疫苗等。其中，全菌疫苗的抗原成分复杂，且与宿主有着大量的共同抗原，易引发不良反应，使全菌疫苗的研究和应用受到限制；载体疫苗(减毒或无毒的细菌或病毒作为载体)虽可以产生一定的保护性免疫应答，但它们产生的保护力通常较低，远远还未达到人们所期望的水平，而且存在一定的不足之处，如，表达产物与天然蛋白存在差异，表达水平低；表达载体不稳定，分泌性不确定；安全性未明确；存在潜在致癌和致病性等。目前对于亚单位疫苗如(尿素酶、毒素相关抗原、空泡毒素等)的研究较为深入和广泛，甚至已有疫苗进入临床试验如邹全明教授团队基于尿素酶研发的口服重组Hp疫苗已完成III期临床试验。相较于全菌Hp疫苗以及载体介导的Hp疫苗，亚单位疫苗更具显著优势，但是仍存在一定的不足，由于抗原中存在不同类型和功能的表位，可能存在保护性免疫应答强度不足或者正负反应相互抵消的现象。

随着对抗原中表位认识的深入，表位疫苗的设计已经成为新型疫苗研究的热点，但对于短肽疫苗(如：B细胞表位)而言，其分子量小，结构单一，往往造成免疫原性低下，在体内不能诱发理想的免疫反应。而通过将短肽疫苗交联载体蛋白的方法来提高对应表位的免疫原性则存在所诱发的抗体是针对载体蛋白的情况发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌HpaA亚单位B细胞表位肽与应用，有利于后续防治Hp感染疫苗的研发，以解决目前临床上抗Hp治疗方案单一以及抗Hp治疗方案耐药性增加的问题。

为了达到上述目的，第一方面，本发明实施例提供一种幽门螺杆菌HpaA的B细胞表位肽，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为SEQ ID No：1和/或SEQ ID No：2。

第二方面，本发明实施例提供一种多抗原肽表位疫苗，所述疫苗的活性成分为第一方面所述的B细胞表位肽。

进一步地，所述的B细胞表位肽具有8个。

第三方面，本发明实施例提供一种多抗原肽表位疫苗的构建方法，以赖氨酸为核心基质，将多个第一方面所述的B细胞表位肽偶联在一起，形成树枝状结构。

进一步地，将8个权利要求1所述的B细胞表位肽偶联在一起，形成树枝状结构。

第四方面，本发明实施例提供一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其活性成分为第一方面所述的B细胞表位肽。

进一步地，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：1。

本发明与背景技术相比，具有的有益效果是：

本发明提出多抗原肽(Multiple antigenic polypetide)的设计方案，即采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质，将若干条(一般为4条或8条)抗原表位相同或不同的单体肽偶联在一起，形成树枝状结构。这种设计模式不但能很好模拟天然表位构象，且无需再偶联载体蛋白，便能激活免疫反应，诱生高滴度、高亲和力抗体。另外，8分支的设计构象相较于4分支，最终形成的多抗原肽的相对分子质量高，根据现代小分子疫苗的研究观点，8分支的设计构象MAP肽具有更强的免疫原性，更易在体内诱发高滴度的抗体。相较于8分支构象设计MAP肽，16分支的设计具有更高的相对分子质量，理论上来讲应当具有更高的免疫原性。然而，在基于16分支合成时发现，16分支的构象设计MAP肽合成成功率低且合成肽混有较多杂质，纯度低。所以，本发明采用8分支的设计构象用于MAP疫苗的合成。团队前期研究发现，针对肝癌的肝素酶表位疫苗和针对炎症性肠病的肿瘤坏死因子α表位疫苗，不仅能诱导产生高滴度、高亲和力的特异性抗体，同时也在动物模型中证实它们有着缓解疾病进展的作用。因此，构建HpaA相关表位的MAP疫苗可能成为防治Hp感染的有效途径。本发明拟从鉴定Hp黏附素HpaA亚单位的B细胞表位入手，研制预防和治疗Hp感染的方法。

本发明实施例提供一种多抗原肽表位疫苗，用于预防和/或幽门螺杆菌感染，将HpaA的B细胞表位与多抗原肽设计构象结合。首先通过互联网表位预测工具，联合预测出具有良好亲水性，表面可及性和抗原性的B细胞表位，选取位于β转角和无规则卷曲区域易于形成表位的区段，挑选优势B细胞表位。此种初筛方案不仅可以减少人力物力的耗费，还能减少实验室研究表位疫苗的失败的风险。

多抗原肽的设计构象，相对于全菌疫苗而言，多抗原肽疫苗的抗原成分简单，可诱导产生较均一的抗体；相对于载体疫苗而言，此疫苗纯度较高，同时能避免因载体因素引起的疫苗纯度、安全性欠佳问题；相对于亚单位疫苗而言，此疫苗抗原成分单一，能诱导产生高特异性，高滴度的抗体。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为Genbank上登录的7株幽门螺杆菌黏附素HpaA核苷酸序列的同源性分析；

图2为Genbank上登录的7株幽门螺杆菌黏附素HpaA氨基酸序列的同源性分析；

图3为7株幽门螺杆菌黏附素HpaA氨基酸序列进化树分析；

图4为DNA Star软件对黏附素HpaA蛋白的二级结构预测图；

图5为DNA Star软件对黏附素HpaA亲水性、可及性及抗原指数的结果分析；

图6为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的亲水性预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的亲水性预测图，b，表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的亲水性预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的亲水性预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的亲水性预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的亲水性预测图；

图7为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的可及性预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的可及性预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的可及性预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的可及性预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的可及性预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的可及性预测图；

图8为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的可塑性预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的可塑性预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的可塑性预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的可塑性预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的可塑性预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的可塑性预测图；

图9为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的柔性区段预测图；a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的柔性区段预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的柔性区段预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的柔性区段预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的柔性区段预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的柔性区段预测图；

图10为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的转角区段预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的转角区段预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的转角区段预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的转角区段预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的转角区段预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的转角区段预测图；

图11为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的抗原性预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的抗原性预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的抗原性预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的抗原性预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的抗原性预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的抗原性预测图；

图12为Bcepred在线预测工具对黏附素HpaA的极性预测图：a表示黏附素HpaA第0-60序列氨基酸的极性预测图，b表示黏附素HpaA第61-120序列位氨基酸的极性预测图，c表示黏附素HpaA第121-180序列氨基酸的极性预测图，d表示黏附素HpaA第181-240序列氨基酸的极性预测图，e表示黏附素HpaA第241-260序列氨基酸的极性预测图；

图13为综合DNA Star和Bcepred预测结果设计的候选8分支多抗原肽结构示意图；

图14为MAP1和MAP2与抗幽门螺杆菌全菌抗体的抗原抗体结合力；

图15为抗原免疫后兔血清中抗体滴度的动态变化。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实例1：幽门螺杆菌HpaA蛋白B细胞表位的预测

1.基因序列分析与菌株选择登陆Genbank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)搜索幽门螺杆菌(Hp)的核苷酸序列和氨基酸序列，利用DNA Star Megalign软件对黏附素HpaA的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对。根据进化树分析结果，选择合适的某一菌株作为HpaA蛋白质免疫表位分析的源菌株。经查找NCBI登陆的黏附素HpaA的核苷酸序列共有7个，其开放阅读框长度为783bp，编码260个氨基酸。如图1和图2所示，7株幽门螺杆菌黏附素HpaA的核苷酸及氨基酸同源性分别为93.5％-97.3％和93.9％-98.1％。进化树分析结果示CH-CTX1菌株的黏附素HpaA序列在总体上更接近共同序列(图3)。因此CH-CTX1被选作源菌株用于表位预测分析。CH-CTX1的氨基酸序列如下所示：

MKTNGHFKDFAWKKCLLGASVVALLVGGCSPHIIETNEVALKLNYHPASEKVQALDEKILLLRPAFQYSDNIAKEYENKFKNQTALKVEQILQNQGYKVINVDSSDKDDFSFAQKKEGYLAVAMNGEIVLRPDPKRTIQKKSEPGLLFSTGLDKMEGVLIPAGFIKVTILEPMSGESLDSFTMDLSELDIQEKFLKTTHSSHSGGLVSTMVKGTDNSNDAIKSALNKIFANIMQEIDKKLTQKNLESYQKDAKELKNKRNR

2.表位预测软件分析黏附素HpaA的氨基酸序列

2.1 DNA Star Protean软件分析结果应用DNA Star Protean软件分析黏附素HpaA的二级结构(图4)。二级结构分析采用的方法是Chou-Fasman法和Garnier-Robson法，取两种方法分析结果的共同区域。柔性区域分析采用的是Karplus-Schulz法。根据图5，发现其中易于形成抗原表位的β转角和无规则卷曲区域位于第29-31、93-96、68-69、103-106、130-132、141-144、198-202、203-205、212-215氨基酸区段。HpaA含有多个柔性区域，位于第5-7、34-37、47-50、55-57、73-87、91-96、101-108、113-117、125、131-144、148-155、171-179、189-205、210-219、234-257氨基酸区段。

通过DNA Star Protean软件，应用Emimi、Kyte-Doolittle和Jameson-Wolf方法，预测黏附素HpaA蛋白质的表面可及性、亲水性和抗原性指数(图5)。综合分析得出DNA Star预测筛选出的表位肽。按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准，预测黏附素HpaA第1-12、32-34、37-41、43-54、59、65-86、89-118、128-144、151-153、171-179、182、186-202、211-222、233-260氨基酸区段是亲水性最高区域(≥0)。Emini方案提示，黏附素HpaA第1-6、10-11、36、42-50、54、64-68、70-83、90-91、93-95、102-108、112-117、130-142、150、152-153、172-173、180、183、185、188-190、192-194、196-200、212-216、218-219、223、234-260氨基酸区段出现在蛋白质表面的可能性比较大(≥1)。Jameson-Wolf方案提示：黏附素HpaA第1-8、10-12、17、31-32、34-40、45-59、67-83、85-87、89、92、93-96、100-118、123-125、127-145、148-155、168、171-181、183-204、211-221、223-224、233-260氨基酸区段抗原指数较高(≥0)

综合分析黏附素HpaA蛋白的亲水性、表面可及性及抗原性(图5)，满足上述条件的区域分别位于1-6、45-50、67-83、92-95、102-108、112-117、130-142、188-200、212-219、234-260氨基酸区段。进一步排除位于α螺旋和β折叠区域内不易形成表位的区段，将位于β转角和无卷曲区域者确定为B细胞表位，得到45-50(HPASEK)、67-83(YSDNIAKEYENKFKNQT)、102-108(DSSDKDD)、130-142(RPDPKRTIQKKSE)、212-219(GTDNSNDA)、234-249(EIDKKLTQKNLESYQ)共6个氨基酸区段。

2.2 Bce pred在线表位预测软件分析结果使用Bce pred在线预测工具(http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/)选取亲水性、可及性、可塑性、二级结构、柔性区段、抗原性、极性，共7个参数对HpaA的氨基酸序列进行进行分析，筛选出可能的B细胞表位肽。Bce pred在线预测工具结果见图6。选取亲水性佳(图6)，可及性(图7)、可塑性(图8)、抗原性(图11)、极性(图12)好，位于柔性区段(图9)和转角区段(图10)的氨基酸肽段。结果发现氨基酸第97-108(KVINVDSSDKDD)、129-142(PDPKRTIQKKSE)、195-204(KTTHSSHSGG)、211-210(KGTDNSNDAI)、248-260(QKDAKELKNKRNR)区段是可能的B细胞表位肽段。

3.黏附素HpaA的B细胞表位综合分析结果综合DNA Star Protean软件和Bce pred在线表位预测工具的分析结果，取各结果的重叠区域，最终得出黏附素HpaA可能的B细胞表位。结果发现，肽段RPDPKRTIQKKSE(127-145)、GTDNSNDA(212-219)可能是候选优势B细胞表位。

实例2：基于候选表位的合成的多抗原肽疫苗及其优势表位疫苗的筛选

1.B细胞表位多抗原肽的合成多抗原肽的合成委托华安生化(杭州)有限公司完成。以所选氨基酸肽段为基础，以赖氨酸为核心基质，本实施例采用8分支肽设计构象，在Fmoc固相合成法在多肽合成仪上合成，多肽经高压液相层析纯化，纯度达到90％以上。优选B细胞表位多抗原肽的平面示意图见图13。8分支RPDPKRTIQKKSE构成MAP1，8分支GTDNSNDA构成MAP2。

2.MAP抗原肽与Hp全菌抗体的结合力分别用浓度为10mg/L的不同MAP疫苗，按100μL/孔包被96孔酶联板，4℃过夜，PBST洗板3次，每次2min。1％BSA封闭2h，PBST洗板3次，每次2min。加入1:1000稀释的商品化抗体，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗板5次，每次2min，以1:1000正常WHBE兔血清作对照。加入1：5000稀释的酶标记山羊抗兔IgG，37℃孵育1h，PBST孵育1h，PBST洗板5次，每次2min。加入显色剂，37℃孵育20min后，终止反应。酶标仪上于450nm测定吸光度(Optical density,OD)A值。结果以双复孔A均值表示，实验重复3次。比较不同组间MAP亲和力方式：MAP1商品化抗体-MAP1阴性血清vs MAP2商品化抗体-MAP2阴性血清。结果发现两个多抗原肽均能与商品化Hp全菌抗体结合，且MAP1多肽的结合能力要强于MAP2。(图14)上述结果表明：MAP1和MAP2疫苗在体外均表现出与抗Hp全菌疫苗良好的亲和力。

3.动物分组雄性白毛黑眼兔10只，随机分成5组[8分支RPDPKRTIQKKSE组(后续简称MAP1组)、8分支GTDNSNDA组(后续简称MAP2组)、短肽RPDPKRTIQKKSE组(后续简称ShortPeptide Epitope1组，SPE1组)、短肽GTDNSNDA组(后续简称SPE2组)和及正常组(PBS组)]，每组2只。

4.免疫分组分别以8分支RPDPKRTIQKKSE、8分支GTDNSNDA、短肽RPDPKRTIQKKSE和短肽GTDNSNDA为免疫原，共注射5次，每次间隔2周。首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂。首次及加强免疫量为MAP 1mg/只，溶于0.5ml的PBS中，与0.5ml弗氏佐剂完全乳化后(形成油包水的状态)，在背部皮内作多点注射。正常组每只采用0.5ml PBS与等量弗氏佐剂完全乳化后注射。

5.标本采集与分离首次免疫前及每次免疫后7天采血，共采血7次。前6次耳中央动脉采血，最后一次采取颈总动脉放血，收集的血清置4℃冰箱过夜，后于4摄氏度预冷的离心机3000r/min离心10min，分离后的血清冻存于-20℃冰箱备用。

6.抗体检测通过标准间接酶联免疫吸附实验法测定WHBE兔血清中抗体滴度，分别用浓度为100μg/m1的MAP疫苗，按100μl/孔包被96孔酶联板，4℃过夜，1％BSA封闭2h，PBST洗板3次，每次2min。加入一抗，一抗为倍比稀释的待测免疫兔血清，免疫前血清作阴性对照，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗板5次，每次2min。加入1：5000稀释的酶标记山羊抗兔IgG，37℃孵育1h，PBST洗板5次，每次2min。加入显色剂，37℃孵育20min后，终止反应。阳性标准：待测样本OD值/阴性对照OD值≥2.1，以出现阳性反应的最高稀释度的倒数作为该样本的抗体滴度。结果发现，免疫5次后，MAP2组，PBS组，SPE1组和SPE2组均未检测到抗体。首次免疫后3周即检测到MAP1组的抗体滴度。如图6所示，免疫后，后者的抗体效价显着高于前者。其中，第5次免疫后血清特异性抗体滴度甚至达到1：908800的峰值。随后，血清抗体逐渐下降，但仍保持较高水平(图15)。2种MAP疫苗免疫血清与2种MAP疫苗之间均无交叉反应。结果表明：基于短肽RPDPKRTIQKKSE合成的8分支MAP1表现出良好的免疫原性，且在体内成功诱导出高滴度抗体。

根据上述实验结果可证明，本发明确定的B细胞表位，根据上述表位合成的8分支多抗原肽表位疫苗，活性成分为上述表位肽，经动物实验证明具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生特异性的免疫应答。表明基于上述优势表位构建疫苗的策略是可行的。

上述一种8分支多抗原肽表位疫苗的构建方法，以采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质，将B细胞表位肽偶联在一起，形成树枝状结构。

基于以上B细胞表位肽，还可以制备一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其活性成分为上述的B细胞表位肽，优选SEQ ID No：1。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江省人民医院

<120> 幽门螺杆菌HpaA亚单位B细胞表位肽与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 1

Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Glu

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 2

Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala

1 5

Claims (7)

1.一种幽门螺杆菌HpaA的B细胞表位肽，其特征在于，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为SEQ ID No：1和/或SEQ ID No：2。

2.一种多抗原肽表位疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分为权利要求1所述的B细胞表位肽。

3.根据权利要求2所述的一种多抗原肽表位疫苗，其特征在于，所述的B细胞表位肽具有8个。

4.一种多抗原肽表位疫苗的构建方法，其特征在于，以赖氨酸为核心基质，将多个权利要求1所述的B细胞表位肽偶联在一起，形成树枝状结构。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将8个权利要求1所述的B细胞表位肽偶联在一起，形成树枝状结构。

6.一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的B细胞表位肽。

7.根据权利要求6所述的一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其特征在于，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：1。

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