CN111518147A - 苯甲酰苯胺类化合物及在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苯甲酰苯胺类化合物，具有以下结构通式：
本发明还公开了一种所述的苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用。本发明还公开了氯硝柳胺在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用。本发明提供的苯甲酰苯胺类化合物可以作为用于治疗和/或预防由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体地说，涉及一种苯甲酰苯胺类化合物及在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂中的应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种资源丰富且普遍存在的革兰氏阴性细菌，从土壤、水生环境到动植物组织，是一种致病性生物，可在包括植物、动物和人类在内的多种生物中引发感染。无论在发达国家还是发展中国家，P.aeruginosa都是引起医院获得性感染(HAIs)的主要原因，它会导致医院获得性肺炎(HAP)以及呼吸机相关性肺炎，胃肠道感染，皮炎，泌尿道感染，皮肤感染(例如毛囊炎和外耳道炎)，菌血症，软组织感染等。对免疫功能低下的患者来说，P.aeruginosa是一种机会病原体。例如：在严重烧伤患者、囊性纤维化(CF)患者和免疫功能低下的个体(如艾滋病患者或患有癌症的患者)中，P.aeruginosa的流行通常是不良的，结果往往致命。但对CF患者来说，为了减少气道感染恢复肺部功能，抗生素的治疗必不可少。
P.aeruginosa DK2是自1973年以来从丹麦CF患者体内采集的一种铜绿菌株分离物，其谱系在肺环境中持续存在数十年，在感染患者的同时已发展成独立的亚系统(Marvig,Antimicrob Agents Chemother,2012,56,4519-4521.Yang,Proc Natl Acad SciU S A,2011,108,7481-7486)。由于长期的抗生素使用，以及P.aeruginosa自身广泛抗性机制的遗传能力，该菌株的耐药性越来越严重。
多粘菌素(Polymyxin)是一类古老的多肽类抗生素，以作为对抗广泛耐药的革兰氏阴性细菌而复活。例如：多粘菌素B(Polymyxin B)和粘菌素(Colistin)，其通过与脂多糖(LPS)核心的脂肪酸和磷酸盐以及革兰氏阴性细菌的脂质A相互作用而引起细胞裂解和死亡(Zhu,Chin.Chem.Lett.2017，28，703-708)。作为慢性感染的CF患者中少数可用且有效的抗生素之一，Polymyxin类抗生素被认为是对抗由革兰氏阴性细菌引起危及生命感染的最后一道防线。但随着最近临床实践中使用的增加，Polymyxin抗性已经产生并迅速传播(Nagarajan,Chin.Chem.Lett,2014,25,419-422.Zhu,Chin.Chem.Lett.2017,28,703-708)。目前已上市或临床在研的药物对多药耐药的铜绿假单胞菌均未表现出较好的抑制作用，特别是耐多粘菌素的铜绿假单胞菌，目前无有效药物治疗，无法解决临床上的已有困境。因此，为广泛耐药的铜绿假单胞菌提供有效的药物或药物组合，是一项极其重要且紧急的科学任务。
群体感应(QS)是一种基于细胞密度的细胞间通讯系统，可使单个细胞演变成群落，在调节细菌的毒力，耐药性和生物膜形成中起着重要作用。通常，群体感应细菌产生并释放小的化学信号，在高种群密度下，累积的信号与同源受体相互作用，以诱导各种靶基因包括编码毒力因子产生的靶基因的转录表达。在铜绿假单胞菌中，目前有四个已知的QS通信系统，Las，Rhl，Pqs和Iqs。Las系统由N-3-羰基十二酰基高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)信号分子介导，Rhl系统由N-丁酰-高丝氨酸内酯(C4-HSL)信号分子介导，Pqs系统由产生2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮信号分子或简单喹诺酮分子的自诱导合成酶PqsABCDH诱导，最后是Iqs系统，它具有自动诱导剂合成酶AmbBCDE，可产生2-(2-羟苯基)-噻唑-4-甲醛(IQS)。Las系统控制涉及急性感染和宿主细胞损伤的多种毒力因子的产生，包括LasA，Las，弹性蛋白酶，外毒素A和碱性蛋白酶；Rhl系统负责鼠李糖脂产生所需的基因，并抑制负责Ⅲ型分泌系统(T3SS)的组装和功能的基因；Pqs系统涉及花青素凝集素，HCN和鼠李糖脂等毒力因子的水平(Lee J,Protein Cell,2015,6,26-41.Azam,M.W.,Drug Discov Today,2019,24,350-359)。
发明内容
本发明的目的是提供一种苯甲酰苯胺类化合物。
本发明的另一个目的是提供一种所述苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种苯甲酰苯胺类化合物，具有以下结构通式：
式I中：Linker为
中的一个；
R1为羟基、2,3,4,6-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷基、脯氨酸基中的一个；
R2为H、卤素、羟基、甲基、甲氧基、三氟甲基中的至少一个；
R3为H、卤素、羟基、氨基、硝基、2,3,4,6-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷基、
中的至少一个，
不包括氯硝柳胺。
优选的，所述苯甲酰苯胺类化合物为以下化合物中的一种：5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯甲酰胺，(±)5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-脯氨酸苯甲酰胺，5-氯-N-(2-氯-4-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯基)-2-羟基苯甲酰胺，4-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，3-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，3-氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-三氟甲基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，4,5-二氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-氟-N-(4-(3-吗啉酮)苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-氟-N-(4-(吗啉磺酰基)苯基)-2-羟基苯甲酰胺；其结构按名称顺序依次为：
本发明的第二方面提供了一种所述苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病的药物中的应用。
所述苯甲酰苯胺类化合物不包括氯硝柳胺，为式I所示苯甲酰苯胺类化合物或其药学上可接受的盐或其异构体或其前药。
所述铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)DK2(下文简记为“DK2”)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1(下文简记为“PAO1”)。
所述铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)抑制剂是多粘菌素B(Polymyxin B)或粘菌素(Colistin)或其药学上可接受的盐。
所述由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病包括：由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染引起的囊性纤维化、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎或血流感染等。
所述铜绿假单胞菌抑制剂是铜绿假单胞菌DK2抑制剂。
所述铜绿假单胞菌DK2抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
本发明的第三方面提供了一种氯硝柳胺在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病的药物中的应用。
所述氯硝柳胺为氯硝柳胺或其药学上可接受的盐或其异构体或其前药。
所述铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)抑制剂是多粘菌素B(Polymyxin B)或粘菌素(Colistin)或其药学上可接受的盐。
所述铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)DK2(下文简记为“DK2”)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1(下文简记为“PAO1”)。
所述铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)抑制剂是铜绿假单胞菌DK2抑制剂。
所述铜绿假单胞菌DK2抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
所述由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病包括：由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染引起的囊性纤维化、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎或血流感染等。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物，是由式I所示所述苯甲酰苯胺类化合物与多粘菌素B或粘菌素以及药学上可接受的载体制成。
所述苯甲酰苯胺类化合物与多粘菌素B(Polymyxin B)或粘菌素(Colistin)的质量比为(0.001～32)：1。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，是由所述氯硝柳胺与多粘菌素B(Polymyxin B)或粘菌素(Colistin)以及药学上可接受的载体制成。
所述氯硝柳胺与多粘菌素B(Polymyxin B)或粘菌素(Colistin)的质量比为(0.001～32)：1。
本发明的第六个方面提供了一种所述药物组合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌DK2或铜绿假单胞菌PAO1；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
所述由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病包括：由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染引起的囊性纤维化、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎或血流感染等。
所述铜绿假单胞菌抑制剂是铜绿假单胞菌DK2抑制剂。
所述铜绿假单胞菌DK2抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的苯甲酰苯胺类化合物可以作为多粘菌素类抗生素增敏剂使用，提供一种新的用于治疗和/或预防由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的细菌感染疾病的药物。
本发明提供的苯甲酰苯胺类化合物对本发明中的铜绿假单胞菌具有较弱的生长抑制作用，能够在小于抑菌浓度的增敏浓度下恢复铜绿假单胞菌对多粘菌素B或粘菌素的敏感性，动物水平上表明增敏组合对铜绿假单胞菌有效，此外，通过实验测试还发现该系列化合物具有铜绿假单胞菌群体感应抑制作用，群体感应系统控制细菌多种毒力因子的表达及生物膜的形成，因此该类化合物与多粘菌素B组合治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染时具有降低细菌毒力和耐药性的潜力。
附图说明
图1是化合物I-15增敏多粘菌素B对PAO1产生生长抑制作用示意图。
图2是化合物I-15对于DK2、PAO1释放C4-HSL信号水平的示意图。
图3是化合物I-15对感染PAO1线虫的存活时间的示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中，DK2的来源为Rau MH,Environ.Microbiol,2012,14,2200-2211，其余菌株、药物和试剂均为市售品。
实施例1
5-氯-N-(2-氯苯基)-2-羟基苯甲酰胺
合成方法：将173毫克5-氯-2-羟基苯甲酸溶解于10毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，依次加入270毫克1-羟基苯并三唑(HOBT)和384毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温反应，搅拌20分钟后滴加0.331毫升N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，搅拌30分钟后加入128毫克2-氯苯胺，室温反应过夜。薄层色谱层析检测反应完毕后关闭搅拌，转入分液漏斗，乙酸乙酯：石油醚＝1：1萃取三遍，取有机层。有机层再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，粗产品经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)，得化合物I-01。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.41(d,J＝7.1Hz,1H),8.04-7.95(m,1H),7.71-7.65(m,1H),7.58(d,J＝8.0Hz,1H),7.46-7.32(m,2H),7.25-7.16(m,1H).
实施例2
5-氯-N-苯基-2羟基苯甲酰胺
将实施例1中的2-氯苯胺替换为苯胺，其他同实施例1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.89(s,1H),7.83(s,1H),7.58(d,J＝7.9Hz,2H),7.50(s,1H),7.43(d,J＝7.7Hz,2H),7.40(s,1H),7.22(d,J＝7.4Hz,1H),7.00(d,J＝8.9Hz,1H).
实施例3
2-氯-N-(5-氯-2-羟苯基)-4-硝基苯甲酰胺
将实施例1中的2-氯苯胺替换为5-氯-2-羟基苯胺，5-氯-2-羟基苯甲酸替换为2-氯-4-硝基苯甲酸，其他同实施例1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(s,1H),10.12(s,1H),8.38(d,J＝1.8Hz,1H),8.33-8.23(m,1H),8.01(d,J＝2.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.21-7.00(m,1H),6.92(d,J＝8.6Hz,1H).
实施例4
5-氯-O-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酸酯
合成方法：称取173毫克5-氯-2-羟基苯甲酸和173毫克2-氯-4-硝基苯酚置于烧瓶中，15毫升二氯亚砜作溶剂，加热至80度回流反应3h，薄层层析检测反应完毕后，关闭加热，冷却至室温。反应后处理准备一烧杯冰水混合物，反向淬灭剩余的二氯亚砜，后处理溶液转移至分液漏斗，乙酸乙酯萃取3遍，取有机层，再用饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后经硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)得化合物I-04。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.45(s,1H),8.46(d,J＝2.7Hz,1H),8.15-8.05(m,1H),7.96(d,J＝2.7Hz,1H),7.83-7.71(m,1H),7.39(d,J＝8.7Hz,1H),6.88(d,J＝9.2Hz,1H).
实施例5
5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯甲酰胺
合成方法：将346毫克5-氯-2-羟基苯甲酸溶解于20毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，依次加入540毫克1-羟基苯并三唑(HOBT)和768毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温反应，搅拌20分钟后滴加0.660毫升的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，搅拌30分钟后加入344毫克2-氯-4-硝基苯胺，室温反应过夜。薄层色谱层析检测反应完毕后关闭搅拌，转入分液漏斗，乙酸乙酯：石油醚＝1：1萃取三遍，取有机层。有机层再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，粗产品经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)，得中间体I-05-1。
将制备的300毫克中间体I-05-1溶于25毫升二氯甲烷中，加入30毫克四丁基溴化铵(TBAB)和0.454毫升N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温搅拌10分钟后，加入377毫克2,3,4,6,-四乙酰氧基-α-D吡喃半乳糖溴化物，室温反应过夜。薄层层析检测反应完毕后，反应液转入分液漏斗乙酸乙酯萃取3遍，取有机层再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到中间体I-05-2。
将480毫克中间体I-05-2溶解于15毫升无水甲醇中，反应液冷却至-20度，200毫克甲醇钠溶解于5毫升无水甲醇中缓慢滴加至反应液中，-20度反应30分钟，薄层层析检测至反应结束，加入Amberlite IR-120plus(H+)调节pH至中性。过滤除去离子交换树脂，收集滤液，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v)得到化合物I-05。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.47(s,1H),8.58(d,J＝9.1Hz,1H),8.46(d,J＝2.7Hz,1H),8.36-8.26(m,1H),8.00(d,J＝2.8Hz,1H),7.78-7.63(m,1H),7.51(d,J＝9.1Hz,1H),5.30(d,J＝5.1Hz,1H),5.17(d,J＝7.8Hz,1H),4.99(d,J＝5.9Hz,1H),4.72(t,J＝5.4Hz,1H),4.66(d,J＝4.1Hz,1H),3.90-3.80(m,1H),3.73(s,1H),3.69(t,J＝5.9Hz,1H),3.62-3.51(m,2H),3.50-3.43(m,1H).
实施例6
(±)5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-脯氨酸苯甲酰胺
合成路线：
合成方法：
将346毫克5-氯-2-羟基苯甲酸溶解于15毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，依次加入540毫克1-羟基苯并三唑(HOBT)和768毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温反应，搅拌20分钟后滴加0.660毫升N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，搅拌30分钟后加入512毫克2-氯-4-硝基苯胺，室温反应过夜。薄层色谱层析检测反应完毕后关闭搅拌，转入分液漏斗，乙酸乙酯：石油醚＝1：1萃取三遍，取有机层。有机层再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，粗产品经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)，得中间体I-06-1。
将制备的300毫克中间体I-06-1和241毫克三苯基膦(PPh3)置于两口烧瓶中，加入超干四氢呋喃25毫升作为溶剂，氮气保护，零度冰浴，注意严格控制无水无氧。上述溶液在零度搅拌20分钟后，缓慢滴加0.142毫升偶氮二甲酸二甲酯(DEAD)，待加料结束后，反应液恢复室温搅拌，反应过夜。薄层层析检测反应完毕，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)后得中间体I-06-2。
将制备的100毫克中间体I-06-2溶解于15毫升三氟乙酸(TFA)：二氯甲烷＝1：1(v/v)的混合溶液中，室温搅拌2h，薄层层析检测反应完毕，二氯甲烷萃取3遍，取有机层，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)后得到化合物I-06，该产物为消旋体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.32(s,1H),10.18(s,1H),9.95(s,1H),9.77(s,1H),8.40(d,J＝2.5Hz,1H),8.34(s,1H),8.31(d,J＝4.3Hz,1H),8.29–8.22(m,1H),8.21–8.15(m,1H),7.84(d,J＝9.1Hz,1H),7.36–7.27(m,1H),7.20(d,J＝2.6Hz,1H),7.18(d,J＝2.6Hz,1H),6.94(s,1H),6.92(s,1H),6.87(d,J＝8.7Hz,1H),4.90–4.81(m,1H),4.60–4.52(m,1H),3.72–3.44(m,2H),3.44–3.35(m,2H),2.33–2.13(m,2H),1.99(s,2H),1.99–1.72(m,4H).
实施例7
5-氯-N-(2-羟基-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
合成方法：
将187毫克5-氯-2-甲氧基苯甲酸和154毫克2-羟基-4-硝基苯胺溶解于10毫升二甲苯溶液中，加热至120度，缓慢滴加1毫升1M三氯化磷二氯甲烷溶液，120度加热回流过夜。薄层层析检测反应完毕后关闭加热，继续搅拌至反应液冷却至室温，有固体析出，抽滤漏斗抽滤得滤饼，得到中间体I-07-1。
制备的200毫克中间体I-07-1溶解于5毫升无水二氯甲烷溶液中，氮气保护，室温搅拌，缓慢加入2毫升1M三溴化硼二氯甲烷溶液，薄层层析检测反应完毕后，缓慢加入适量的水搅拌5分钟，转入分液漏斗乙酸乙酯萃取3遍，取有机层再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)得到化合物I-07。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.24(s,1H),11.35(s,1H),11.24(s,1H),8.65(d,J＝9.0Hz,1H),7.97(d,J＝2.8Hz,1H),7.86-7.78(m,1H),7.73(d,J＝2.5Hz,1H),7.54-7.47(m,1H),7.07(d,J＝8.7Hz,1H).
实施例8
5-氯-N-(2-氯-4-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯基)-2-羟基苯甲酰胺
合成路线：
合成方法：
将300毫克5-氯-2-甲氧基苯甲酸和230毫克2-氯-4-羟基苯胺溶解于10毫升二甲苯溶液中，加热至120度，缓慢滴加1.6毫升1M三氯化磷的二氯甲烷溶液，反应120度回流过夜。薄层层析检测反应完毕后关闭加热，继续搅拌至反应液冷却至室温，有固体析出，抽滤漏斗抽滤得滤饼即中间体I-08-1，无需进一步纯化。
将制备的300毫克中间体I-08-1溶于25毫升二氯甲烷中，加入31毫克四丁基溴化铵(TBAB)和0.476毫升N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温搅拌10分钟，加入400毫克2,3,4,6,-四乙酰氧基-α-D吡喃半乳糖溴化物，室温反应过夜。薄层层析检测反应完毕后，反应液转入分液漏斗，乙酸乙酯萃取3遍，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得到中间体I-08-2。
将制备的385毫克中间体I-08-2全部溶于5毫升无水二氯甲烷溶液中，室温搅拌，氮气保护。1.8毫升1M三溴化硼的二氯甲烷溶液缓慢滴加至前面所述溶液中，室温搅拌，薄层层析检测反应。反应完毕后，缓慢加入适量的水搅拌5分钟，转入分液漏斗，乙酸乙酯萃取3遍，取有机层再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得到中间体I-08-3，无需进一步纯化。
将上述制备的250毫克中间体I-08-3溶解于无水甲醇15毫升中，反应液冷却至-20度，86毫克甲醇钠溶解于3毫升无水甲醇中缓慢滴加至反应液中，-20度反应30分钟，薄层层析检测至反应结束，加入Amberlite IR-120plus(H+)调节pH至中性。过滤除去离子交换树脂，收集滤液，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v)得到化合物I-08。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.42–12.26(m,1H),11.14–10.97(m,1H),8.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.96(s,1H),7.43(s,1H),7.23(d,J＝2.8Hz,1H),7.11–7.05(m,1H),7.00(s,1H),5.20(d,J＝5.1Hz,1H),4.92–4.81(m,2H),4.69(t,J＝5.5Hz,1H),4.53(d,J＝4.6Hz,1H),3.69(s,1H),3.63–3.45(m,4H),3.44–3.39(m,1H).
实施例9
5-氯-N-(2-氯-4-氨基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
称取200毫克5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺(氯硝柳胺)于烧瓶中，20毫升无水甲醇作溶剂，加入20毫克钯碳(10％)(Pd/C(10％))，氢气保护，室温反应3h，薄层层析检测反应完毕，滤除钯碳，反应液减压蒸除溶剂得到化合物I-09。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.24(s,1H),10.39(s,1H),8.01(d,J＝2.5Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.54-7.34(m,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),6.67(t,J＝28.1Hz,1H),6.67-6.38(m,1H),5.39(s,2H).
实施例10
5-氯-N-(2-氯-4-羟基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-羟基苯胺，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.22(s,1H),10.55(s,1H),9.88(s,1H),8.00(d,J＝2.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.53-7.44(m,1H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),6.93(d,J＝2.6Hz,1H),6.83-6.77(m,1H).
实施例11
N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例1中的2-氯苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-羟基苯甲酸替换为2-羟基苯甲酸，其他同实施例1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),11.41(s,1H),8.87(d,J＝9.3Hz,1H),8.45(d,J＝2.5Hz,1H),8.37-8.26(m,1H),8.08-8.03(m,1H),7.53(s,1H),7.09(d,J＝8.2Hz,1H),5.93(s,1H).
实施例12
5-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-溴-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),8.13-8.05(m,2H),7.97-7.88(m,1H),7.77-7.69(m,1H),7.39(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝8.9Hz,1H).
实施例13
4-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为4-溴-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),11.26(s,1H),8.84(d,J＝9.3Hz,1H),8.46(d,J＝2.6Hz,1H),8.36-8.23(m,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.32-7.14(m,2H).
实施例14
3-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为3-溴-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),8.49-8.40(m,2H),8.34-8.28(m,1H),8.09-8.05(m,1H),7.88-7.83(m,1H),7.01(t,J＝7.9Hz,1H).
实施例15
5-氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.27(s,1H),11.43(s,1H),8.83(d,J＝9.2Hz,1H),8.46-8.40(m,1H),8.35-8.26(m,1H),7.78-7.70(m,1H),7.43-7.34(m,1H),7.13-7.06(m,1H).
实施例16
4-氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为4-氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.75(s,1H),11.23(s,1H),8.83(d,J＝9.3Hz,1H),8.44(d,J＝2.6Hz,1H),8.34-8.18(m,1H),8.18-8.06(m,1H),6.93-6.87(m,1H),6.86-6.80(m,1H).
实施例17
3-氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为3-氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(s,1H),11.43(s,1H),8.79(d,J＝9.2Hz,1H),8.45(d,J＝2.6Hz,1H),8.36-8.25(m,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,1H),7.56-7.45(m,1H),7.10-6.96(m,1H).
实施例18
5-三氟甲基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-三氟甲基-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.17(s,1H),11.38(s,1H),8.83(d,J＝9.3Hz,1H),8.46(d,J＝2.5Hz,1H),8.35-8.29(m,2H),7.90-7.81(m,1H),7.25(d,J＝8.6Hz,1H).
实施例19
N-(2-氯-4-硝基苯基)-2,6-二羟基苯甲酰胺
合成方法：将154毫克2,6-二甲氧基苯甲酸和172毫克2-氯-4-硝基苯胺溶解于10毫升二甲苯溶液中，加热至120度，缓慢滴加1毫升1M三氯化磷的二氯甲烷溶液，反应120度回流过夜。薄层层析检测反应完毕后关闭加热，继续搅拌至反应液冷却至室温，有固体析出，抽滤漏斗抽滤得滤饼，得到中间体I-19-1。
将制备的200毫克中间体I-19-1全部溶于15毫升无水二氯甲烷溶液中，室温搅拌，氮气保护。20毫升1M三溴化硼的二氯甲烷溶液缓慢滴加至前面所述溶液中，室温搅拌，薄层层析检测反应。反应完毕后，缓慢加入适量的水搅拌10分钟，转入分液漏斗，乙酸乙酯萃取3遍，取有机层。有机层再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：1，v/v)得到化合物I-19。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.67(d,J＝29.8Hz,2H),11.77(s,1H),8.72(d,J＝9.2Hz,1H),8.47(d,J＝2.6Hz,1H),8.35-8.29(m,1H),7.33(t,J＝8.2Hz,1H),6.50(d,J＝8.2Hz,2H).
实施例20
5-甲基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-甲基-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),9.42-9.35(m,1H),8.81(d,J＝2.6Hz,1H),8.77-8.69(m,1H),8.40(d,J＝1.8Hz,1H),7.82-7.74(m,1H),7.49(d,J＝8.3Hz,1H),2.78(d,J＝9.2Hz,3H).
实施例21
5-甲氧基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为2,5-二甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.75(s,1H),11.50(s,1H),8.86(d,J＝9.3Hz,1H),8.44(d,J＝2.6Hz,1H),8.33-8.26(m,1H),7.54(d,J＝3.2Hz,1H),7.15-7.10(m,1H),7.02(d,J＝8.9Hz,1H),3.76(s,3H).
实施例22
6-甲氧基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为2,6-二甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),11.09(s,1H),8.62(d,J＝9.1Hz,1H),8.47(d,J＝2.6Hz,1H),8.38-8.23(m,1H),7.46(s,1H),6.79-6.59(m,2H),4.04(s,3H).
实施例23
4-溴-N-(2-氯-4-羟基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-羟基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为4-溴-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.40(s,1H),10.46(s,1H),9.86(s,1H),7.93(t,J＝8.7Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.92(d,J＝2.7Hz,1H),6.82-6.74(m,1H).
实施例24
5-氟-N-(2-氯-4-羟基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-羟基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.95(s,1H),10.59(s,1H),9.87(s,1H),7.95(d,J＝8.9Hz,1H),7.82-7.70(m,1H),7.90-7.28(m,1H),7.08-6.96(m,1H),6.93(d,J＝2.5Hz,1H),6.86-6.71(m,1H).
实施例25
4,5-二氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为4,5-二氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.81(s,1H),11.32(s,1H),8.80(d,J＝9.2Hz,1H),8.44(d,J＝2.6Hz,1H),8.35-8.24(m,1H),8.00-7.91(m,1H),7.07-6.98(m,1H).
实施例26
5-氟-N-(4-(3-吗啉酮)苯基)-2-羟基苯甲酰胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为4-(3-吗啉酮)苯胺，5-氯-2-甲氧基苯甲酸替换为5-氟-2-甲氧基苯甲酸，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H),10.45(s,1H),7.74(t,J＝8.8Hz,3H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.33(t,J＝8.6Hz,1H),7.07-6.95(m,1H),4.20(s,2H),4.03-3.93(m,2H),3.82-3.65(m,2H).
实施例27
5-氟-N-(4-(吗啉磺酰基)苯基)-2-羟基苯甲酰胺
合成路线：
合成方法：
将295毫克吗啉和696毫克三乙胺溶解于10毫升无水二氯甲烷溶液中，氮气保护，0度冰浴，将500毫克对硝基苯磺酰氯溶于无水二氯甲烷10毫升中，缓慢滴加到上述反应液中，室温反应4h，薄层层析检测反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3遍，取有机层，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得白色固体中间体I-27-1，无需进一步纯化。
上述制备的300毫克中间体I-27-1溶解于20毫升二氯甲烷：甲醇＝1：1的溶液中，加入30毫克钯碳(10％)(Pd/C(10％))，氢气保护，反应3h，过滤旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体中间体I-27-2。
称量制备的121毫克中间体I-27-2和85毫克5-氟-2-甲氧基苯甲酸溶于10毫升二甲苯溶液中，加热至120度，缓慢滴加0.5毫升1M三氯化磷的二氯甲烷溶液，反应120度回流过夜。薄层层析检测反应完毕后关闭加热，继续搅拌至反应液冷却至室温，有固体析出，抽滤漏斗抽滤得淡黄色滤饼中间体I-27-3，无需进一步纯化。
将上述制备的60毫克淡黄色中间体I-27-3全部溶于10毫升无水二氯甲烷溶液中，室温搅拌，氮气保护。0.5毫升1M三溴化硼的二氯甲烷溶液缓慢滴加至前面所述溶液中，室温搅拌，薄层层析检测反应。反应完毕后，缓慢加入适量的水搅拌5分钟，转入分液漏斗，乙酸乙酯萃取3遍，取有机层。有机层再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，v/v)得到产物I-27。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,1H),10.69(s,1H),7.95(d,J＝8.7Hz,2H),7.84(d,J＝8.7Hz,2H),7.71–7.64(m,1H),7.38–7.28(m,1H),7.07–6.98(m,1H),3.62–3.57(m,2H),3.51(d,J＝4.3Hz,4H),3.20(t,J＝5.9Hz,2H).
实施例28
氯硝柳胺
将实施例7中的2-羟基-4-硝基苯胺替换为2-氯-4-硝基苯胺，其他同实施例7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),11.35(s,1H),8.82(d,J＝9.2Hz,1H),8.45(d,J＝2.6Hz,1H),8.36-8.26(m,1H),7.97(d,J＝2.8Hz,1H),7.58-7.49(m,1H),7.11(d,J＝8.8Hz,1H).
实施例29
本发明实施例1至28制备的化合物体外增敏多粘菌素B(Polymyxin B)对DK2产生生长抑制作用的棋盘实验。
(1)实验材料和方法
DK2接种在灭菌离心管中，37度250rpm摇床培养过夜，第二天用新鲜LB培养基稀释至OD600为0.001的细菌悬液待用。实验使用96孔板进行测试，每孔100μL细菌悬液，化合物I-01～I-28及多粘菌素B按照表1所示的化合物浓度和多粘菌素B浓度进行铺板，DMSO和LB液分别作为阴性对照和空白对照。
表1棋盘实验96孔板中化合物及多粘菌素B的浓度设置a
a.表格中的每格视为96孔板的一个孔，每孔所示浓度格式为(多粘菌素B的浓度+化合物的浓度)，浓度单位均为μg/mL。
铺好板后，放置37℃培养箱孵育18小时，分级抑菌浓度(FIC)通过棋盘确定。抑制率(％)＝[1-(实验孔-空白孔)/(阴性孔-空白孔)]*100％。化合物的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，简记为“MIC”)是肉眼可见无菌生长时的浓度。FIC的计算为(组合使用药剂时的MIC)/(单独使用药剂时的MIC)。FIC指数(FICI)是化合物和多粘菌素B的FIC之和。
(2)实验结果：结果如表2所示，共发现了28个本发明化合物I-01～I-28可以增敏多粘菌素B，使多粘菌素B的MIC相比单独使用时显著降低，其中20个化合物能够将多粘菌素B的MIC降低至耐药点(8μg/mL)以下，8个化合物能够将多粘菌素B的MIC降低至敏感点(2μg/mL)以下，使耐药DK2恢复对多粘菌素B的敏感性。
其中，FICI小于或等于0.5有增敏作用，FICI大于或等于4有拮抗作用，FICI大于0.5小于4表明没有相互作用。对于DK2，单独使用多粘菌素B时的MIC是512μg/mL，说明DK2对多粘菌素B已经严重耐药。
表2本发明化合物增敏多粘菌素B(Polymyxin B，PB)抑制DK2生长的药物组合浓度
a指对于DK2，单独使用化合物的MIC。
b指对于DK2，当化合物与多粘菌素B(PB)联合使用时，多粘菌素B(PB)的MIC为1、2、4、8、16、32μg/mL时化合物的MIC。
c多粘菌素B对铜绿假单胞菌MIC的敏感点≤2μg/mL，耐药点≥8μg/mL。
d单用时化合物MIC>1024μg/mL的化合物，按照1024μg/mL计算FICI，FICI值为化合物与其增敏多粘菌素B所致最小MIC时组合的FICI，例如：I-01的FICI＝(组合使用时I-01的MIC/单独使用时I-01的MIC)+(组合使用时多粘菌素B的MIC/单独使用时多粘菌素B的MIC)＝(4/1024)+(2/512)≈0.01。
e I-07的FICI＝(16/64)+(2/512)≈0.25
由表2可知：化合物I-15表现出对多粘菌素B最优的增敏作用，能将多粘菌素B的MIC降低512倍(512μg/mL至1μg/mL)，其中化合物I-15为4μg/mL时增敏作用最好。
实施例30
优选化合物I-15增敏粘菌素(Colistin)对DK2产生生长抑制作用的实验。
(1)实验材料和方法：同“实施例29”。对于DK2，单独使用粘菌素时的MIC＝1024μg/mL(说明DK2对粘菌素已经严重耐药)。
(2)实验结果：结果如表3所示。
表3不同浓度化合物I-15对粘菌素MIC的影响
a对于DK2，单独使用化合物I-15的MIC>1024μg/mL；
b指对于DK2，相应浓度的I-15与粘菌素联合使用时所对应的粘菌素的MIC。
c粘菌素对铜绿的MIC敏感点≤2μg/mL，耐药点≥4μg/mL。
d未测。
由表3可知，I-15可以增敏粘菌素对DK2产生生长抑制作用，且将粘菌素的MIC降至1μg/mL，减小了1024倍，且低于敏感点2μg/mL。
实施例31
优选化合物I-15增敏多粘菌素B(Polymyxin B，PB)对PAO1产生生长抑制作用的时间杀伤动力学实验。
(1)实验材料和方法
PAO1接种到离心管，37度250rpm摇床培养过夜，第二天用新鲜LB培养基稀释至OD600为0.001的细菌悬液待用。实验在试管中进行，每根试管中加入3mL细菌悬液，优选化合物I-15浓度设置2、4、8μg/mL，多粘菌素B浓度设置0.25、0.5μg/mL，DMSO作为阴性对照。试管在37℃，250rpm摇床中培养，于0，1，2，4，8，10，12和24小时取出等分试样，在PBS中连续稀释并接种在LB琼脂上。将板孵育24小时并测定CFU/mL。
(2)实验结果：结果如图1所示，图1是化合物I-15增敏多粘菌素B对PAO1产生生长抑制作用示意图，图中横坐标为时间，纵坐标为log CFU/mL；从图中可以看出化合物I-15可以增敏多粘菌素B对PAO1产生生长抑制作用。24h时，PB 0.5μg/mL+I-15 2μg/mL的组合表现出明显增敏作用，较单独PB 0.5μg/mL相比，细菌数量减少5.75log CFU/mL(>2log CFU/mL)，有显著增敏作用(Ayerbe-Algaba,Front Cell Infect Microbiol,2018,8,e348)。
实施例32
优选化合物I-15影响DK2和PAO1中C4-HSL的释放。
已知群体感应系统能够产生并释放各种化学信号分子，先前文献报道表明从慢性感染的囊性纤维化(CF)患者痰液中分离出的铜绿假单胞菌株在群体感应方面通常存在缺陷(Stephen P.D.,Current Biology,17,907-910)，DK2是一类在CF患者体内经过35年进化的铜绿假单胞菌株，相比PAO1来说许多表型已经发生显著变化，然而发现在DK2菌株中能够检测到信号分子C4-HSL，因此考察了最优化合物I-15对DK2和PAO1菌株中C4-HSL释放量的影响，评价化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的作用。
(1)实验材料和方法
a.报告菌株构建
将报告质粒pKD-rhlA导入rhlI缺失菌株PDO100中构建报告菌株。
b.C4-HSL的收集
摇过夜的DK2/PAO1稀释至OD600为0.001的细菌悬液，每个锥形瓶中15mL。DK2设组：I-15 4μg/mL，DMSO(阴性对照)，LB(空白对照)。PAO1设组：I-15 2μg/mL，DMSO(阴性对照)，LB(空白对照)。锥形瓶放置37度，250rpm摇床中培养，每隔0、2、4、8、12、24h取500μL菌液，离心取上清，-80度保存待用。
c.外源C4-HSL的检测
将摇过夜的报告菌株用LB液体培养基加卡娜100μg/mL稀释至OD600为0.05的细菌悬液，取50μL上清+100μL细菌悬液混匀后加至96孔板中，50μL LB液+100μL细菌悬液作为空白对照，60μL石蜡封层，酶标仪连续20h监测样品OD600和冷光值(Iuminescence)。
(2)实验结果
结果如图2所示，图2是化合物I-15对于DK2、PAO1释放C4-HSL信号水平的示意图，其中A是化合物I-15对于DK2在0～24h内释放C4-HSL信号水平的示意图，B是化合物I-15对于DK2在12h时释放C4-HSL信号水平的示意图，C是化合物I-15对于DK2在8h时释放C4-HSL信号水平的示意图，D是化合物I-15对于PAO1在0～24h内释放C4-HSL信号水平的示意图，E是化合物I-15对于PAO1在12h时释放C4-HSL信号水平的示意图，F是化合物I-15对于PAO1在8h时释放C4-HSL信号水平的示意图，从图中可以看出，图2中A、D在所取的时间点中，12h时C4-HSL信号水平最高。图2中B表明化合物I-15 4μg/mL能显著降低DK2在12h时释放的C4-HSL信号水平；图2中C表明化合物I-15 4μg/mL能显著降低DK2在8h时释放的C4-HSL信号水平；图2中E、F表明化合物I-15 2μg/mL对PAO1在12h时释放的C4-HSL信号水平有一定影响，与DK2相比影响较弱，在8h时影响较明显。该结果部分验证了优选化合物I-15对铜绿假单胞菌群体感应系统具有抑制作用。
实施例33
优选化合物I-15明显改善感染PAO1线虫的存活时间。
(1)实验材料和方法
a.线虫感染致死实验
同期化处理野生型线虫N2，培养得到L4期，用M9将线虫从平板上洗下，重悬清洗收集虫体。将L4线虫转接到生长有PAO1/OP50的PGS平板上，25度培养并在规定的时间间隔统计线虫的存活数。实验结果见图3中A。
b.感染线虫救治实验
将L4线虫转接到生长有PAO1/OP50的PGS平板上，25度培养16-24h后，用M9将感染的线虫从平板上洗下，重悬清洗收集虫体。实验使用24孔板，每孔2mL M9溶液，0.2mM FUDR，实验设置DMSO组、单药A组(化合物I-15)、单药B组(多粘菌素B)和组合用药组(化合物I-15+多粘菌素B)，每组2个复孔，浓度设置见表4。每孔20条感染线虫，25度静置培养，在规定时间间隔统计线虫存活数。实验结果见图3中B，C。
表4感染线虫救治实验24孔板中化合物I-15和多粘菌素B的浓度设置
a.表格中的每格视为24孔板的一个孔，每孔所示浓度格式为(多粘菌素B的浓度+化合物I-15的浓度)，浓度单位均为μg/mL。
(2)实验结果
结果如图3所示，图3是化合物I-15对感染PAO1线虫的存活时间的示意图，图中A是线虫感染致死实验示意图，图中B，C是感染线虫救治实验示意图。图中横坐标为时间，纵坐标为存活率；A表明在PGS培养基上，用PAO1培养的线虫比正常线虫的存活时间缩短，统计学分析表明有显著性差异(****p<0.0001，Graphpad Prism软件，long-rank(Mantel-Cox)test法分析)，说明病原体PAO1能够感染线虫导致线虫快速死亡。B表明已感染PAO1的线虫，使用化合物I-15 8μg/mL和多粘菌素B(PB)8μg/mL的组合给药治疗相比单独多粘菌素B(PB)8μg/mL治疗表现更有效，能够将感染线虫的存活时间延长到正常组(DMSO(OP50))线虫存活水平，统计学分析表明有显著性差异(****p<0.0001，Graphpad Prism软件，long-rank(Mantel-Cox)test法分析)。C表明已感染PAO1的线虫，使用化合物I-15 4μg/mL和多粘菌素B(PB)16μg/mL的组合给药治疗相比单独多粘菌素B(PB)16μg/mL治疗表现更有效，能够将感染线虫的存活时间延长到正常组(DMSO(OP50))线虫存活水平，统计学分析表明有显著性差异(****p<0.0001，Graphpad Prism软件，long-rank(Mantel-Cox)test法分析)。说明化合物I-15对多粘菌素B的增敏作用在动物水平有效。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种苯甲酰苯胺类化合物，其特征在于，具有以下结构通式：
式I中：Linker为
中的一个；
R1为羟基、2,3,4,6-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷基、脯氨酸基中的一个；
R2为H、卤素、羟基、甲基、甲氧基、三氟甲基中的至少一个；
R3为H、卤素、羟基、氨基、硝基、2,3,4,6-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷基、
中的至少一个，
不包括氯硝柳胺。
2.根据权利要求1所述的苯甲酰苯胺类化合物，其特征在于，所述苯甲酰苯胺类化合物为以下化合物中的一种：5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯甲酰胺，(±)5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-脯氨酸苯甲酰胺，5-氯-N-(2-氯-4-(2,3,4,6,-四羟基-β-D-吡喃半乳糖苷)苯基)-2-羟基苯甲酰胺，4-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，3-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，3-氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-三氟甲基-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，4,5-二氟-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-氟-N-(4-(3-吗啉酮)苯基)-2-羟基苯甲酰胺，5-氟-N-(4-(吗啉磺酰基)苯基)-2-羟基苯甲酰胺。
3.一种权利要求1或2所述的苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述苯甲酰苯胺类化合物不包括氯硝柳胺，为式I所示苯甲酰苯胺类化合物或其药学上可接受的盐或其异构体或其前药：
所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌DK2或铜绿假单胞菌PAO1；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的苯甲酰苯胺类化合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病包括：由铜绿假单胞菌感染引起的囊性纤维化、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎或血流感染；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是铜绿假单胞菌DK2抑制剂；
所述铜绿假单胞菌DK2抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
6.一种氯硝柳胺在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌DK2或铜绿假单胞菌PAO1；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的氯硝柳胺在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病包括：由铜绿假单胞菌感染引起的囊性纤维化、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎或血流感染；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是铜绿假单胞菌DK2抑制剂；
所述铜绿假单胞菌DK2抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
8.一种药物组合物，其特征在于，是由权利要求1或2所述的苯甲酰苯胺类化合物与多粘菌素B或粘菌素以及药学上可接受的载体制成；或是由氯硝柳胺与多粘菌素B或粘菌素以及药学上可接受的载体制成。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述苯甲酰苯胺类化合物与多粘菌素B或粘菌素的质量比为(0.001～32)：1；
所述氯硝柳胺与多粘菌素B或粘菌素的质量比为(0.001～32)：1。
10.一种权利要求8或9所述的药物组合物在制备铜绿假单胞菌抑制剂的增敏剂或制备预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌DK2或铜绿假单胞菌PAO1；
所述铜绿假单胞菌抑制剂是多粘菌素B或粘菌素或其药学上可接受的盐。
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