CN111512156A - 使用边缘电极的dna电化学测序 - Google Patents

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Abstract

对包含氧化还原物类的DNA（108）进行电化学测序的装置包括至少一个边缘电极（102）、至少一个绝缘材料堆叠层（104）和包括DNA移位工作电极（106a）和DNA移位对电极（106b）的DNA移位电极对，其中该至少一个边缘电极（102）的厚度为大约0.5纳米，且该至少一个绝缘材料堆叠层（104）的厚度为大约10纳米。还提供了对DNA链进行电化学测序的方法。

Description

使用边缘电极的DNA电化学测序
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年11月3日提交的美国临时专利申请系列号62/581,366的依35U.S.C. § 119(e)的权益。
发明领域
本发明的方面涉及多核苷酸的测序的方法。
背景
目前，有许多针对DNA实时测序的装置设计。参见例如Goodwin等人, “Coming of age:ten years of next-generation sequencing technologies,” Nature ReviewsGenetics 17, 333-351 (2016)；和Drummond等人, “Electrochemical DNA Sensors,”Nature Biotechnology 21, 1192-1199 (2003)。一些基因测序技术涉及碱基对（bp）的大约100个bp读取的短读取长度，由此需要显著量基因重建后处理来生成最终的序列。
一项引起重要关注的技术是电子检测DNA，因为这能够将DNA直接翻译成数字输出，而无需当前在基于荧光的测序技术中使用的复杂光学器件。电子读出利用了微电子工业中使用的高度可复制的小型化技术。电子检测DNA的主要形式是纳米孔概念，其中作为取决于占据该孔的（一个或多个）DNA碱基的电阻率变化来监控DNA穿过纳米孔的移位。
一些已经引入了氧化还原修饰的核苷酸，并使用电化学作为探测DNA的方法。参见例如Debela等人, Chem Commum 52, 757 (2016)（“Debela”）；Emil Paleček等人,“Electrochemistry of Nucleic Acids,” Institute of Biophysics, Academy ofSciences of the Czech Republic, Chem. Rev., 112(6), 第3427-3481页(2012)（“Paleček”）；和Hocek等人, “Nucleobase modification as redox DNA labelling forelectrochemical detection,” Chem. Soc. Rev., 40, 5802-5814 (2011)。但是，目前还没有技术允许实时单碱基分辨率氧化还原测序。检测氧化还原物类的一个重要问题是电极的规模。如果电极太大，那么该电极将同时与多个氧化还原物类相互作用，阻碍了在单碱基水平上的区分。制造以单碱基分辨率对碱基进行寻址所需的电极规模是一个挑战。
随着诸如原子层沉积（ALD）（参见George, “Atomic Layer Deposition: AnOverview,” Chem. Rev. 110(1), 第111-131页(2010) (“George”)和Langereis等人,“In situ spectroscopic ellipsometry study on the growth of ultrathin TiNfilms by plasma-assisted Atomic Layer Deposition,” J. Appl. Phys. 100, 023534(2006)）和石墨烯化学气相沉积（Kim等人, “Large-scale pattern growth of graphenefilms for stretchable transparent electrodes,” Nature, 457, 706-710 (2009)）的技术的出现，有可能实现亚纳米厚的电极并以与探测物类相同的规模生成电极边缘。参见例如George。氧化还原化学是电化学中的公知性质，并且先前在文献中已经证实了用氧化还原物类修饰核碱基。参见例如Hocek, “Synthesis of Base-Modified 2’-Deoxyribonucleoside Triphosphates and Their Use in Enzymatic Synthesis ofModified DNA for Applications in Bioanalysis and Chemical Biology,” J. Org.Chem., 79 (21), 第9914–9921页(2014)（“Hocek 2014”）。糖、磷酸酯或核碱基本身可以用氧化还原功能物类来修饰。
在碱基之间引入序列的原理描述在美国专利号7,939,259、8,324,360和8,349,565中，其中在与碱基插入相关的DNA碱基之间引入编码区。具体而言，使用Xpandomer序列引入DNA序列的扩展以便利用DNA穿过孔时电阻的变化用纳米孔探测来测量DNA碱基。
概述
下面阐述本发明的特定示例实施方案的概述。应当理解，提出这些方面仅为了向读者提供这些特定实施方案的简要概述，并且这些方面并非意在限制本发明的范围。实际上，本发明可以涵盖下文中可能未阐述的多个方面。
本发明的示例实施方案结合了核苷酸用氧化还原物类的可修饰性原理与纳米级制造技术和DNA线性化技术以便对多核苷酸链，包括DNA链进行电化学测序。
本发明的示例实施方案整合了纳米级边缘电极和线性化且电化学标记的DNA作为使用电化学对DNA进行测序的方法。与其它基因测序技术不同，本发明的示例实施方案能够具有大约1000个碱基对（bp）的长读取长度，提供了DNA链的实时线性序列读出。与纳米孔DNA测序技术不同，该平面制造方法能够在单个读取装置中制造多个边缘电极堆叠体结构。这使得能够在同一读取运行中通过多个电极探测同一DNA链，能够提高读出的冗余度和由此改善测序的准确性。使用间隔物整合DNA的非编码、非氧化还原区域或电化学修饰的DNA之间的其它聚合物材料以便在跨过电极时隔离电化学基团可用于改善单碱基分辨率。
本发明的示例实施方案采用原子层沉积和石墨烯化学气相沉积技术，以在与所探测物类相同的规模上产生电极边缘和/或绝缘层。该方法还与现行的微制造方案相容，并且是准确和可复制的。根据示例实施方案，通过经限定的结构拓扑来控制DNA的轨迹，可以制造装置以确保DNA接近电极移动，以使得可以对碱基进行依序电化学寻址以提供单碱基分辨率。在一个优选实例中，接近度为0 nm至大约10 nm。
根据示例实施方案，对包含氧化还原物类的DNA进行电化学测序的装置包括：（a）至少一个边缘电极；（b）至少一个绝缘材料堆叠层；和（c）DNA移位电极对，该电极包括DNA移位工作电极和DNA移位对电极，其中该至少一个边缘电极的厚度为大约0.5纳米，且该至少一个绝缘材料堆叠层的厚度为大约10纳米。
在一些示例实施方案中，该装置包括1至50个边缘电极和1至50个绝缘材料堆叠层，其中边缘电极与绝缘材料堆叠层交替，并且边缘电极与绝缘材料堆叠层的总厚度为大约20纳米至大约1000纳米。在一些有利的示例实施方案中，该装置更特别包括10至50个边缘电极和10至50个绝缘材料堆叠层，其中边缘电极与绝缘材料堆叠层交替，且边缘电极与绝缘材料堆叠层的总厚度为大约105[FN(1][SYS(2][NRF3]纳米至大约1000纳米。
在一些示例实施方案中，该至少一个边缘电极包含导电材料，并且该绝缘材料包含介电材料。
在一些示例实施方案中，该至少一个边缘电极是氮化钛或铂，并且该绝缘材料选自二氧化硅、氮化硅和氧化铝。
在一些示例实施方案中，该至少一个边缘电极与该绝缘材料通过适当合适的微制造或纳米制造结构化技术，例如通过干法蚀刻、湿法蚀刻、反应离子蚀刻、剥离、化学机械抛光或离子束铣削工艺进行微结构化或纳米结构化。
根据示例实施方案，对包含氧化还原物类的DNA进行电化学测序的装置包括：（a）至少一个边缘电极对，该对包括保持在氧化偏压的第一电极和保持在还原偏压的第二电极；（b）至少一个绝缘材料堆叠层；和（c）DNA移位电极对，该对包括DNA移位工作电极和DNA移位对电极，其中第一电极和第二电极被绝缘层隔开，并且在绝缘层上方是感测区，其中氧化还原物类可以同时被第一电极氧化和被第二电极还原。
在一些示例实施方案中，该装置包括多个边缘电极对，其中至少任何两个边缘电极对被配置为测量或设定DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度。
在一些示例实施方案中，DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度是均匀的。
在一些示例实施方案中，DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度以恒定速率改变。
根据示例实施方案，对DNA链进行电化学测序的方法包括：（a）修饰该DNA链的至少两个核苷酸碱基组的每个核苷酸以引入氧化还原物类；（b）向至少一个边缘电极施加电压；（c）使该DNA链跨过所述至少一个边缘电极；（d）在各自跨过所述至少一个边缘电极时，使用所述至少一个边缘电极氧化或还原每个修饰核苷酸，其中所述氧化或还原产生包括电流变化的电化学信号；（e）基于该电化学信号识别每个修饰核苷酸；和（f）测定DNA链的序列，其中第一核苷酸碱基组的每个核苷酸已被修饰以引入具有第一氧化或还原电位的第一氧化还原物类，并且第二核苷酸碱基组的每个核苷酸已被修饰以引入具有第二氧化或还原电位的第二氧化还原物类。
在一些示例实施方案中，第一和第二核苷酸碱基组是不同的，并且第一和第二核苷酸碱基组彼此不互补。
在一些示例实施方案中，该方法进一步包括采用聚合酶链式反应、多重置换扩增或等温扩增来引入氧化还原修饰的核苷酸。
在一些示例实施方案中，该方法进一步包括在DNA链的相邻核苷酸之间插入间隔物（spacer）。
在一些示例实施方案中，向所述至少一个边缘电极施加电压包括使该电压在氧化电位和还原电位之间循环。
在一些示例实施方案中，每个修饰核苷酸在各自跨过所述至少一个边缘电极时被氧化或还原多次。
在一些示例实施方案中，该方法进一步包括使DNA链跨过平行的以规则距离隔开的多个边缘电极，其中使用每个边缘电极多次测定该DNA链的序列。
根据示例实施方案，对DNA链进行电化学测序的方法包括：（a）修饰扩增的DNA链的每个核苷酸以引入氧化还原物类，其中第一组中的每个修饰核苷酸由第一核苷酸碱基组成，且第二组中的每个修饰核苷酸由第二核苷酸碱基组成；（b）扩增该修饰的DNA链；（c）向至少一个边缘电极施加电压；（d）使扩增的DNA链跨过所述至少一个边缘电极；（e）在各自跨过所述至少一个边缘电极时，使用所述至少一个边缘电极氧化或还原每个修饰的核苷酸，其中所述氧化或还原产生包括电流变化的电化学信号；（f）将由每个扩增的DNA链产生的电化学信号叠加；（g）识别每个修饰核苷酸；和（h）测定DNA链的序列，其中第一组的每个修饰核苷酸已被修饰以引入该氧化还原物类，并且第二组的每个核苷酸已被修饰以引入该氧化还原物类；其中该第一和第二核苷酸碱基不同且不互补。
在一些示例实施方案中，所述方法进一步包括在修饰DNA链的每个核苷酸以引入氧化还原物质之前扩增DNA链。
在一些示例实施方案中，所述方法进一步包括将已知的DNA链与每个扩增的DNA链连接；
在一些示例实施方案中，该方法进一步包括在每个扩增的DNA链的相邻核苷酸之间引入间隔物。
在一些示例实施方案中，第一组中的每个修饰核苷酸是氧化还原修饰的腺嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸（dNTP），并且这些组的第二组中的每个修饰核苷酸是氧化还原修饰的胞嘧啶或鸟嘌呤dNTP。
尽管可以独立地描述本发明的示例实施方案的各个方面，但是示例实施方案的组合应理解为在本文中被提及。此外和相反地，应理解的是，尽管一个特征可以在与其它特征组合的背景下描述，但是不同的特征是可分离的并且对于本发明的功能性或有用的实施方案而言并不一定彼此需要或依赖。
提出前文中描述的方法仅为提供这些示例实施方案的简要概述，并且这些方面并非意在限制本公开的范围。事实上，本发明还可以涵盖许多其它方面。通过结合附图（在附图通篇中相同的字符表示相同的部件）在下文中详细描述某些示例性实施方案，进一步阐释本发明的这些和其它特征、方面和优点。
附图概述
该专利或申请文件含有至少一个彩色执行的图。带有（一个或多个）彩色图的专利或专利申请公开的副本将由专利局根据需要并支付必要的费用来提供。
图1显示了用于电化学引物延伸分析的氧化还原活性双脱氧核苷酸三磷酸的化学结构的Debela的复制（AQ：蒽醌(0.40 V)，MB：亚甲基蓝(0.20 V)，Fc：二茂铁(0.50 V)，和PTZ：吩噻嗪(0.60 V)），所有电位均相对于Ag/AgCl。
图2是从Hocek 2014复制的通过PCR将氧化还原修饰的dNTP（红色）引入DNA链的示意图。
图3示出了根据本发明的一个示例实施方案的装置的截面示意图。
图4A示出了根据本发明的一个替代示例实施方案的装置的截面示意图。
图4B示出了根据本发明的所述替代示例实施方案的电子穿梭的示意图。
图4C示出了获自根据本发明的所述替代示例实施方案的装置的差分信号。
图5A-5I示出了根据本发明的一个示例实施方案来制造装置。
图6A-6G示出了根据本发明的一个替代示例实施方案来制造装置。
图7示出了根据本发明的一个示例实施方案的一锅法DNA测序方法的步骤的示意图。
图8示出了根据本发明的一个示例实施方案的多锅法DNA测序方法的步骤的示意图。
图9A[NRF4]-9D示出了根据本发明的一个示例实施方案将DNA链移位的方法。
详述
本发明的示例实施方案提供了DNA测序平台，该平台可以实时读出任何长度的DNA链的基因序列，同时对数据后处理的需求最小。这可以使用能转化为数字格式的电化学技术（例如采用多次采样来改善数据保真度）和可以放大至制造的方法来实现。本发明的示例实施方案利用氧化还原活性物类对DNA进行修饰——将纳米级平面电极边缘结构图案化的一种新颖的微制造方法，和/或控制DNA跨过纳米级电极边缘结构的移位的方法。
图3显示了装置100，其包括边缘电极102(1)、绝缘材料堆叠层104(1)和包括DNA移位工作电极106(a)与DNA移位对电极106(b)的DNA移位电极对106。在一个示例实施方案中，边缘电极102(1)的厚度x为大约0.5纳米，且绝缘材料堆叠层104(1)的厚度y为大约10纳米（用于适当隔绝和减少电极层之间的串扰）。在一个示例实施方案中，装置100包括参比电极。
如图3中所示，装置100可以包括可以规则的距离制造的多个边缘电极102（102(1)、102(2)、102(3)、102(4)、102(5)……102(x)）以及多个绝缘材料堆叠层104（104(1)、104(2)、104(3)、104(4)、104(5)……104(x)）。如图3中所示，边缘电极102和绝缘材料堆叠层104交替。根据一个示例实施方案，装置100包括2至100个ALD层对、或1至50个边缘电极102和1至50个绝缘材料堆叠层104的序列，并且每个边缘电极102的厚度x为大约0.5纳米、且每个绝缘材料堆叠层104的厚度y为大约10纳米，边缘电极102与绝缘材料堆叠层104的总厚度为大约20纳米至大约1000纳米。在一个示例实施方案中，边缘电极102由导电材料制成，如氮化钛或铂。在一个示例实施方案中，绝缘材料堆叠层104由介电材料制成，如二氧化硅、氮化硅或氧化铝。根据一个示例实施方案，经由ALD通过精确沉积来控制绝缘材料堆叠层104和边缘电极102。
如图3中所示，DNA链108从装置100的顶部移位至装置100的底部，并由此跨越每个边缘电极102移位。此类移位可以通过在该DNA移位电极对106上施加电压偏置，或通过在边缘电极102上施加穿梭偏置（shuttling bias）来实现。在DNA链108的每个氧化还原修饰的核苷酸碱基110均跨过每个边缘电极102时，在氧化还原修饰的核苷酸碱基110与边缘电极102之间发生氧化还原化学反应。根据一个示例实施方案，使用多个以规则距离隔开的电极允许对DNA链108进行多次探测，并且由于充分表征了核苷酸碱基之间的间隔，所得信号可以叠加并取平均值以提高准确性。根据一个示例实施方案，DNA链108跨过边缘电极102的移位速度是均匀的，并设定为足够慢以产生可读信号并且足够快以确保快速DNA测序试验。根据一个示例实施方案，DNA链108的移位速度由至少任何两个边缘电极对，例如至少前两个边缘电极102(1)和102(2)来设定。这两个边缘电极对，在这种情况下所述至少前两个边缘电极102(1)和102(2)，测量或设定DNA链108的移位速度，随后通过反馈机制控制和调节DNA移位电极对106的电压以强化或弱化电场，以便调节DNA链108的移位速度。根据一个示例实施方案，通过将其限定到纳米通道中、通过使用流体动力、通过孔技术以便将DNA链108拉近表面、或通过包括表面修饰或在纳米通道表面上的附加电极的基于电荷的方法，可以将DNA链108线性化。虽然图3示出了垂直结构，但本发明也可以是平面结构。
根据一个示例实施方案，由于氧化还原活性碱基在其越过边缘时与电极102相互作用，边缘电极102运行循环伏安法测量，获得电流尖峰。根据一个示例实施方案，在边缘电极102处发生氧化或还原电位的快速循环，以使得对探测的DNA链108施加多个氧化或还原循环；并且如果存在超过一个要探测的核苷酸碱基，观察电化学信号瞬变将改善碱基序列的去卷积。
根据一个示例实施方案，通过干法蚀刻、湿法蚀刻、反应离子蚀刻、剥离、化学机械抛光、离子束铣削工艺或任何其它微制造或纳米制造结构化技术对边缘电极102和绝缘材料堆叠层104进行微结构化。选择性和非选择性化学都可以使用（例如SF6对TiN具有选择性；离子束铣削对TiN不具有选择性，等等）。此外，分别对TiN（NH4OH、H2O2、H2O）和SiO2（缓冲的HF）存在可用的选择性湿法刻蚀剂。
根据一个示例实施方案，如下进行在硅表面上的多层沉积后的结构化：
•光掩模和穿过整个多层堆叠体的等离子体蚀刻，以便在一端限定狭窄的长舌状物并在另一端限定宽的接触区域（非选择性离子束铣削用于在单次蚀刻中令其穿过多层），用于限定该装置的几何形状和装置的彼此分隔；
•施加液体选择性Ti蚀刻（NH4OH、H2O2、H2O）以使Ti金属由所有侧面凹进（即钻蚀SiO2层距边缘一定距离），以便在任何侧壁处没有电接触向环境开放；
•沉积厚度为大约10至100 nm的最终SiO2 ALD涂层以封闭SiO2层侧面（钝化并密封开放TiN层以便在所有侧壁处与环境隔绝）；
•依次遮蔽并蚀刻接触区域中的SiO2和TiN以便在越来越大的层深度处一个接一个地限定和开放逐个TiN接触垫（选择性等离子体蚀刻：SF6用于TiN且CHF3、CF4、Ar用于SiO2，在TiN上停止蚀刻；或液体蚀刻，NH4OH、H2O2、H2O用于TiN，缓冲HF用于SiO2）（依此遮蔽和蚀刻的几种替代方法在本领域中是公知的），由此，最终所有TiN层均具有一个开放的接触垫，其各自用于在该装置的接触区域中的电连接；
•光掩模和穿过“舌状物”的前端、穿过整个多层堆叠体的离子束铣磨，以重新打开沿着一个特定侧壁的TiN层，从而形成“DNA采样区域”；
•将载体箔胶粘到多层系统顶部（覆盖所有装置），将它们从PorSi分离器上拉下，并将它们逐个装置地复制到芯片实验室；并
•提供与芯片实验室上的Ti接触垫的电连接（例如通过挠性箔互连技术）。
根据示例实施方案，通过沿TiN层的“行进电波”或“行波逻辑中的开关电位”结合电流采样，进行DNA向采样侧壁的电吸引、沿采样侧壁的传输以及在采样侧壁处的读出。
根据示例实施方案，引入氧化还原物类，其与要测序的目标DNA链相关。根据一个示例实施方案，聚合酶用于在扩增过程中以高保真度整合相应的氧化还原修饰的DNA。根据一个示例实施方案，采用聚合酶链式反应（PCR）、多重置换扩增、等温扩增或可以以高保真度引入一个或多个氧化还原修饰的碱基的复制目标DNA链的任何其它方法。例如，可以使用B家族热稳定聚合酶（Vent (exo-)、Pwo、KOD）作为对修饰核苷酸的引入耐受的酶。参见例如Paleček。
图4A显示了装置200，其包括边缘电极对202(1)、绝缘材料堆叠层204(1)和包括DNA移位工作电极206(a)与DNA移位对电极206(b)的DNA移位电极对206。边缘电极对202(1)包括被绝缘层z隔开的第一电极202(1)(1)和第二电极202(1)(2)。在一个示例实施方案中，边缘电极201(1)(a)的厚度x1为大约50纳米，绝缘材料堆叠层204(1)的厚度y1为大于大约10纳米（用于适当绝缘和减少电极对层之间的串扰），并且绝缘层z的厚度为大约0.1纳米至大约10纳米。在一个示例实施方案中，装置200包括参比电极。
如图4A中所示，装置200可以包括以规则距离制造的多个边缘电极对202（202(1)、202(2)、202(3)、202(4)、202(5)……202(x)），其中每个边缘电极对包括被绝缘层z隔开的第一电极202(x)(1)和第二电极202(x)(2)。装置200由此还可以包括多个绝缘材料堆叠层204（204(1)、204(2)、204(3)、204(4)、204(5)……204(x)）。如图4A中所示，边缘电极对202与绝缘材料堆叠层204交替。根据一个示例实施方案，装置200包括20至100个电极、或10至50个边缘电极对202与10至50个绝缘材料堆叠层204的序列，并且电极对202中的每个电极的厚度x1为大约50纳米，绝缘层z的厚度为大约0.1纳米至大约10纳米，且每个绝缘材料堆叠层204的厚度y1为大于大约10纳米，边缘电极对202和绝缘材料堆叠层204的总厚度为大约1200纳米至大约6000纳米。在一个示例实施方案中，边缘电极对202由导电材料如氮化钛或铂制成，且绝缘材料堆叠层204由介电材料如二氧化硅、氮化硅或氧化铝制成。根据一个示例实施方案，经由ALD通过精确沉积来控制绝缘层z的沉积。
如图4A中所示，DNA链208从装置200的顶部移位至装置200的底部，并由此移位跨过每个边缘电极对202。此类移位可以通过在DNA移位电极对206上施加电压偏置或通过在边缘电极对202上施加穿梭偏置来实现。虽然图4A示出了垂直结构，本发明也可以是平面结构。
如图4B中所示，第一电极202(x)(1)可以保持在氧化偏压，并由此可以氧化在附近的引入氧化还原修饰碱基210中的氧化还原物类，并且第二电极202(x)(2)可以保持在还原偏压，并由此可以还原在附近的引入氧化还原修饰碱基210中的氧化还原物类。在隔开第一电极202(x)(1)与第二电极202(x)(2)的绝缘层z上方是感测区Z。在感测区Z中，氧化还原修饰碱基210的氧化还原物类可以被第一电极202(x)(1)氧化并失去电子，以及被第二电极202(x)(2)还原并获得电子，由此成为在第二电极202(x)(2)与第一电极202(x)(1)之间的电子穿梭。如图4C中所示，在感测区Z中氧化还原修饰碱基210的氧化还原物类的同时氧化和还原产生差分信号。根据一个示例实施方案，放大和/或检测该差分信号。根据一个示例实施方案，绝缘层z足够大以防止在电极对202(x)内在不存在氧化还原物类的情况下电子在第一电极202(x)(1)与第二电极202(x)(2)之间穿梭。
在DNA链208的每个氧化还原修饰的核苷酸碱基210跨过每个边缘电极对202时，由于在氧化还原修饰的核苷酸碱基210与边缘电极对202之间发生氧化还原化学反应，生成差分信号。其中提供电极对的实施方案可以提供比其中提供单电极的实施方案更好的传感器信号，部分因为该差分信号是远比单电极提供的非差分信号更强的指示。此外，该差分信号是有益的，因为来自电极对中的两个电极的噪音将相同，并由此在查看差分信号时可以抵消。此外，采用电极对，电极之间的电子穿梭将放大在电极之间传递的电流。根据一个示例实施方案，使用以规则距离隔开的多个电极允许多次探测DNA链208，并且由于充分表征了核苷酸碱基之间的间隔，所得信号可以叠加并取平均值以提高准确性。根据一个示例实施方案，DNA链208跨过边缘电极对202的移位速度是均匀的，并且足够慢以产生可读信号，且足够快以确保快速DNA测序试验。根据一个示例实施方案，DNA链208的移位速度由前两个边缘电极对202(1)和202(2)确定。根据一个示例实施方案，通过将其限定到纳米通道中、通过使用流体动力、通过孔技术以便将DNA链208拉近表面、或通过使用基于电荷的方法将DNA链208吸引至纳米通道壁或排斥离开纳米通道壁以使其在边缘电极对202所处表面附近通过该纳米通道，可以将DNA链208线性化。
在一个示例实施方案中，超过一个氧化还原修饰的碱基210（并由此超过一个氧化还原物类）可以同时在感测区Z中。例如，如图4C中所示，在时间T1处，第一氧化还原修饰碱基进入感测区Z并同时被正性第一电极202(x)(1)氧化（由此生成电流C1）和被负性第二电极202(x)(2)还原（由此生成相应的电流-C1）。在时间T2处，当第一氧化还原修饰碱基仍在感测区Z中时，第二氧化还原修饰碱基进入感测区Z并同时被正性第一电极202(x)(1)氧化（由此生成电流C2和等于C1加C2的总电流）和被负性第二电极202(x)(2)还原（由此生成相应的电流-C2和等于-C1加-C2的总电流）。在时间T3处，当第一和第二氧化还原修饰碱基仍在感测区Z中时，第三氧化还原修饰碱基进入感测区Z并同时被正性第一电极202(x)(1)氧化（由此生成电流C3和等于C1加C2加C3的总电流）和被负性第二电极202(x)(2)还原（由此生成相应的电流-C3和等于-C1加-C2加-C3的总电流）。在时间T4处，第一氧化还原修饰碱基离开感测区Z，同时第二和第三氧化还原修饰碱基保留在感测区Z中，导致生成的总电流降低，以使得来自氧化的总电流现在等于C2加C3，并且来自还原的总电流现在等于-C2加-C3。在时间T5处，第二氧化还原修饰碱基离开感测区Z，同时第三氧化还原修饰碱基保留在感测区Z中，导致总电流的另一降低，以使得来自氧化的总电流现在等于C3，并且来自还原的总电流现在等于-C3。没有更多的氧化还原修饰碱基进入感测区Z，直到时间T6，此时第四修饰碱基进入感测区Z。此后，没有更多的氧化还原修饰碱基进入感测区Z，直到时间T7，此时第五修饰碱基进入感测区Z，并且在时间T8，此时第六修饰碱基进入感测区Z，同时第五修饰碱基保留在感测区Z中。在时间T9，第五修饰碱基离开感测区Z，留下第六修饰碱基在感测区Z中。
根据一个示例实施方案，感测区Z足够小以同时感测仅少数氧化还原修饰碱基，且足够大以校正拉伸DNA产生的非线性效应。
根据一个示例实施方案，如图5A-5I中所示，具有电极对的装置的制造如下：
•在硅衬底上沉积300 nm SiO2层作为掩模层，并通过光刻法图案化，随后用缓冲的HF蚀刻。
•使用KOH刻蚀剂将沟槽湿法蚀刻到硅衬底中以形成图5A中显示的结构。
•在硅衬底上沉积300 nm SiO2的阻挡层。
•旋涂抗蚀剂并光刻图案化，接着在硅衬底上沉积第一电极层，接着剥离以形成图5B中显示的结构。
•任选地，根据电极材料，在硅衬底与第一电极层之间包括粘合层。
•在第一电极层上沉积ALD介电层，其对应于绝缘层z，并可以为大约0.1至大约10纳米厚以形成图5C中显示的结构。
•第二电极层沉积在介电层上以形成图5D中显示的结构，每个电极层包括各自的电极垫，例如如所示那样。
•随后将该衬底平坦化（例如使用玻璃旋涂工艺）以填充沟槽并获得平坦表面，形成图5E中显示的结构。
•蚀刻窗口以便在经蚀刻的窗口的底部暴露电极组（即第一电极、绝缘层和第二电极），但是电极组也在经蚀刻的窗口的侧壁处暴露，形成图5F中显示的结构。
•该衬底随后再次平坦化（例如使用玻璃旋涂工艺）以填充经蚀刻的区域并获得平坦表面，由此形成图5G中显示的结构。
•蚀刻较小的第二窗口以形成通道，DNA链可以穿过该通道进行测序，由此形成图5H中显示的结构。
•窗口还向电极垫或触点开放以便进行电接触和控制电极，由此形成图5I中显示的结构。
根据一个示例实施方案，如图6A-6G中所示，根据一个替代示例实施方案的具有电极对的装置的制造如下：
•从硅衬底块开始，将该块向下蚀刻以便在该块中心形成硅柱，或在硅块顶部生长氧化硅层以便在该块中心形成氧化硅柱，由此形成图6A中显示的结构。该柱的直径可以为大约1-20微米，且高大约1微米。
•在硅衬底上沉积300 nm SiO2的阻挡层。
•旋涂抗蚀剂并光刻图案化，接着在衬底上沉积第一电极层，其中暴露条带横穿该衬底中部，其中该层可以为大约100纳米厚，由此形成图6B中显示的结构。
•随后沉积ALD介电层，其对应于绝缘层z并在一个实例中为大约0.1至大约10纳米厚，其中该条带保持暴露并且下方的第一电极层的一部分暴露以形成电极触点或垫，由此形成图6C中显示的结构。
•随后沉积例如大约100纳米厚度的第二电极层，令该条带暴露并令第一电极层的触点/垫暴露，由此形成图6D中显示的结构。
•随后将该衬底平坦化（例如使用玻璃旋涂工艺）以获得平坦表面，由此形成图6E中显示的结构。
•随后通过蚀刻、抛光或完全研磨旋涂玻璃来暴露该衬底、电极层和ALD层，该蚀刻、抛光或完全研磨在垫/触点位置处，例如在角落处进行至更大程度，以便暴露各自的电极层的电极触点或垫，由此形成图6F中显示的结构。
•通过溅射和蚀刻、通过光刻法、或通过软蚀刻法生成纳米通道，由此形成图6G中显示的结构。
如何复制DNA链以引入氧化还原修饰核苷酸可以取决于读出方法。图7和8示出了通过改变氧化还原物类引入目标DNA链以及如何读出DNA的方式产生相同结果的两种不同的方法。图7示出了一锅法750，根据一个示例实施方案，其中目标DNA链708的每个核苷酸碱基710（腺嘌呤710(a)、胸腺嘧啶710(b)、鸟嘌呤710(c)和胞嘧啶710(d)）均被对该碱基710具有特异性的独特氧化还原物类修饰，获得了氧化还原修饰碱基712（712(a)、712(b)、712(c)和712(d)）。在PCR过程中将氧化还原修饰碱基712引入DNA的复制链中。通过选择具有不同氧化或还原电位的电化学基团（对于独特氧化还原物类），可以使用电极（如边缘电极102）来探测每个氧化还原修饰的核苷酸碱基712以确定在何种电位下发生氧化或还原。
根据一个示例实施方案，所述独特氧化还原物类在电极的稳定窗口内是可逆的，与溶液中的任何生物化学均生物相容，并在标准实验室条件下稳定。如果使用多种氧化还原物类，在电化学响应方面应当存在足够的差异以便能够区分不同的物类。氧化还原物类的实例包括蒽醌（其氧化电位为0.40 V）、亚甲基蓝（其氧化电位为0.20 V）、二茂铁（其氧化电位为0.50 V）和吩噻嗪（其氧化电位为0.60 V）（所有电位均相对于Ag/AgCl）。
在DNA链跨过探测边缘电极时，该核苷酸碱基将依此氧化或还原（取决于引入的氧化还原物类），并且随探测电压而变的电流峰值可用于识别每个通过的核苷酸碱基并将碱基序列分配至DNA链。
根据一个示例实施方案，可以使用单个电极，其快速扫描电极电压（类似于循环伏安法），并且随电压而变的电流尖峰用于指定相关的氧化还原物类，并由此识别通过的核苷酸碱基。多个循环可用于确保采样了足够的信号以便从噪音中检测。
根据另一示例实施方案，可以使用多个电极，其中向堆叠体中的不同电极施加正或负偏压，随着DNA链在电极上沿堆叠体前进，该偏压的大小依此改变。由此，例如，具有低氧化电压的氧化还原物类将被堆叠体中的一个电极激发，而具有更高氧化电位的另一氧化还原物类将仅在堆叠体更下游的具有更高偏压的另一电极处氧化。
根据一个示例实施方案，仅使用三种氧化还原物类，一种用于三种核苷酸碱基中的每一种。根据一个示例实施方案，信号中的任何间隙等同于最后编码的碱基，其中存在足够的DNA移位控制（即每个碱基探测期的一致时间）。文献中用于DNA移位控制的方法包括电压、酶介导、光镊和磁镊。参见例如Carson等人, “Challenges in DNA motion controland sequence readout using nanopore devices,” Nanotechnology, 26(7):074004(2015)。
图8示出了根据一个示例实施方案的四锅法850。不同于每个核苷酸碱基引入独特的氧化还原物类，首先通过传统PCR将目标DNA链808扩增，随后将材料分为4个锅814，每个锅对应一个核苷酸碱基组（例如胸腺嘧啶锅814(a)、腺嘌呤锅814(b)、胞嘧啶锅814(c)和鸟嘌呤锅814(d)）。在每个锅中，采用第二轮PCR以引入对该锅的核苷酸碱基组而言独特的氧化还原物类，获得了一个修饰核苷酸碱基组812（812(a)、812(b)、812(c)和812(d)），而剩余的三个核苷酸碱基组810（810(a)、810(b)、810(c)和810(d)）作为标准dNTP保持未修饰。将已知DNA链与目标/复制DNA链连接以显示用于碱基分类的零点。随后将所述四个锅814引入具有至少一个探测边缘电极（如边缘电极102）的装置（如装置100），并随后基于已知DNA链进行索引。根据一个示例实施方案，该四个锅814可以依此引入具有至少一个探测边缘电极（如边缘电极102）的装置（如装置100）。根据一个示例实施方案，应高度控制跨过探测边缘电极的移位率以确保可以准确索引。
根据一个示例实施方案，由于DNA链的互补性质，图8中所示的多锅法850可以仅使用两个锅。第一锅将对应于胸腺嘧啶锅814(a)或腺嘌呤锅814(b)，且第二锅将对应于胞嘧啶锅814(c)或鸟嘌呤锅814(d)。
在图7和8所示的两种用于电化学探测DNA的方法中，根据一个示例实施方案，可以引入间隔物区域以改善单碱基探测的准确性。如图7所示，在DNA链中的所有核苷酸碱基之间插入间隔物，导致单个碱基被间隔物长度隔开。采用被更大距离隔开的氧化还原物类，降低了边缘电极一次探测超过一个氧化还原物类的可能性。这也降低了对移位精确度的要求，因为每个核苷酸碱基用于数据处理的时间窗口更大。根据一个示例实施方案，该间隔物附着在碱基之间，并随后在碱基之间化学裂解，导致在两个碱基之间的间隔物交联。与在美国专利号7,939,259和8,324,360中的公开相反，根据本发明的示例实施方案，用于扩展DNA区域的间隔物不包括与扩展的碱基相关的任何编码；纳米孔不用于探测DNA底物；不是通过在纳米孔上电阻率的变化，而是通过电极与电化学修饰碱基之间的氧化还原反应来测定DNA序列；并且DNA碱基化学采用一个或多个氧化还原修饰。
该DNA链可以以多种方式跨过边缘电极或边缘电极对移位。如图9A中所示，根据一个示例实施方案，DNA链908可以采用捕集原理来移位。粒子920（如胶乳珠粒或顺磁性珠粒）连接到DNA链908的5’或3’端，或连接到DNA链908的互补引物链上，并且粒子920用作系链以便在镊子（如光镊或磁镊）内移动DNA链908，同时被电场或流体动力流拉入边缘感测装置900。可能的捕集类型包括光学捕集或磁力捕集。
如图9B中所示，根据一个示例实施方案，DNA链908可以使用电泳力来移位。DNA链908具有带负电荷的骨架。通过在含有边缘电极对204(x)的纳米通道930上施加偏压，DNA链908将朝向阳极，即DNA移位对电极206(b)移动。通过将阳极放置在到纳米通道930的出口934处，DNA链908将被拖动穿过纳米通道930，在那里其将被线性化。
如图9B中所示，根据一个示例实施方案，DNA链908可以使用与拓扑/结构化结合的电泳力来移位。纳米结构体922可以放置在纳米通道入口932上游的微通道940中以减慢DNA链908，因为DNA链908与纳米结构体922相互作用（例如通过绕着或贯穿它们包裹）。DNA链908将因此在纳米通道930中快速移动，但是在微通道940中较慢，导致对DNA链908的拖拽，这可以引发线性化（因为DNA链908的一部分将在纳米通道930中，而另一部分仍与微通道940中的纳米结构体922相互作用）。通过控制纳米通道入口932相对于相邻微通道940的位置，该拖拽效应还可用于帮助将DNA链908定位到纳米通道930的底部或顶部，例如图9B显示了DNA链908靠近纳米通道930的底部。在图9B中也示出了电极950，其将DNA链908向下推到纳米通道930中。
如图9C中所示（部分复制自Pud等人, Mechanical trapping of DNA in aDouble-Nanopore System, Nano Lett. 2016, 16, 8021-8028），根据一个示例实施方案，使用与拓扑/结构化结合的电泳力可以将DNA链908移位的另一种方式是使用纳米孔。两个纳米孔924(a)和924(b)可用于拖拽DNA链908跨过边缘电极和边缘电极对的表面936。DNA链908可以被拖拽跨过纳米孔924(a)和924(b，由此使DNA链908线性化并同时保持其靠近表面936。
如图9D中所示（部分复制自Sørensen等人, Automation of a single-DNAmolecule stretching device, Review of Scientific Instruments, 2015 86:6），根据一个示例实施方案，DNA链908可以使用压力驱动流来移位。经由与入口932(a)相邻的微通道940(a)将DNA链908引入第一纳米通道930(a)。第二纳米通道930(b)与第一纳米通道930(a)相交，在第一纳米通道930(a)中心处垂直延伸。当DNA链908到达第一纳米通道930(a)中心时，可以改变通道中的流速以改变通道中的压力。在第一纳米通道930(a)中的压力差导致流体动力剪切，这可以使该DNA链908线性化。
已经通过实施例的方式显示和描述的上述实施方案及其许多优点将由前述描述而理解，并且显而易见的是，可以在组件的形式、构造和布置方面进行各种改变，而不脱离公开的主题或不牺牲其一个或多个优点。实际上，这些实施方案的所述形式仅仅是说明性的。这些实施方案易于进行各种修改和替代形式，并且所附权利要求的清单并非意在排除任何此类改变，并且实施方案不限于所公开的特定形式，而是覆盖落入本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代形式。
也就是说，以上描述意在是说明性的而非限制性的，并且是在特定应用及其要求的背景下提供的。从前面的描述中，本领域技术人员可以理解，本发明可以以各种形式实现，并且各种实施方案可以单独或组合实施。因此，虽然已经结合其特定实施例描述了本发明的实施方案，但是在不脱离所述实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其它实施方案和应用，并且本发明的实施方案和/或方法的真实范围不限于显示和描述的实施方案，因为在研究附图、说明书和所附权利要求后，各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。例如，组件和功能可以以与各种所述实施方案的方式不同的方式分离或组合，并且可以使用不同的术语来描述。这些和其它变型、修改、添加和改进可落在如下面权利要求限定的本公开的范围内。

Claims (21)

1.对包含氧化还原物类的DNA进行电化学测序的装置，所述装置包括：
至少一个边缘电极；
至少一个绝缘材料堆叠层；和
DNA移位电极对，其包括DNA移位工作电极和DNA移位对电极；
其中：
所述至少一个边缘电极的每一个的厚度为大约0.5纳米；且
所述至少一个绝缘材料堆叠层的每一个的厚度为大约10纳米。
2.权利要求1的装置，其中：
该至少一个边缘电极包括1至50个边缘电极，且该至少一个绝缘材料堆叠层包括1至50个绝缘材料堆叠层；
该边缘电极与绝缘材料堆叠层交替；并且
边缘电极与绝缘材料堆叠层的总厚度为大约20纳米至大约1000纳米。
3.权利要求1的装置，其中该至少一个边缘电极包含导电材料，并且该绝缘材料包含介电材料。
4.权利要求3的装置，其中该至少一个边缘电极是氮化钛或铂，并且该绝缘材料选自二氧化硅、氮化硅和氧化铝。
5.权利要求4的装置，其中通过干法蚀刻、湿法蚀刻、反应离子蚀刻、剥离、化学机械抛光或离子束铣削工艺对该至少一个边缘电极与该绝缘材料进行微结构化或纳米结构化。
6.对包含氧化还原物类的DNA进行电化学测序的装置，所述装置包括：
至少一个边缘电极对，该对包括保持在氧化偏压的第一电极和保持在还原偏压的第二电极；
至少一个绝缘材料堆叠层；和
DNA移位电极对，其包括DNA移位工作电极和DNA移位对电极；
其中：
第一电极和第二电极被绝缘层隔开；
在绝缘层上方是感测区；并且
第一电极被配置为氧化感测区内的氧化还原物类，而第二电极还原所述氧化还原物类。
7.权利要求6的装置，其中所述至少一个边缘电极对包括多个边缘电极对，并且至少任何两个边缘电极对被配置为测量或设定DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度。
8.权利要求7的装置，其中 DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度是均匀的。
9.权利要求7的装置，其中 DNA跨过所述多个边缘电极对的移位速度以恒定速率改变。
10.对DNA链进行电化学测序的方法，所述方法包括：
修饰该DNA链的至少两个核苷酸碱基组的每个核苷酸以引入氧化还原物类，这包括（a）修饰第一核苷酸碱基组的每个核苷酸以引入具有第一氧化或还原电位的第一氧化还原物类，和（b）修饰第二核苷酸碱基组的每个核苷酸以引入具有第二氧化或还原电位的第二氧化还原物类；
向至少一个边缘电极施加电压；
使该DNA链跨过所述至少一个边缘电极；
在各自的修饰核苷酸跨过所述至少一个边缘电极时，使用所述至少一个边缘电极氧化或还原每个修饰核苷酸，其中所述氧化或还原产生包括电流变化的电化学信号；
基于该电化学信号识别每个修饰核苷酸；和
测定该DNA链的序列。
11.权利要求10的方法，其中：
该第一和第二核苷酸碱基组彼此不同；并且
该第一和第二核苷酸碱基组彼此不互补。
12.权利要求10的方法，其进一步包括使用聚合酶链式反应、多重置换扩增或等温扩增来引入氧化还原修饰的核苷酸。
13.权利要求10的方法，其进一步包括在所述DNA链的相邻核苷酸之间插入间隔物。
14.权利要求10的方法，其中向所述至少一个边缘电极施加电压包括使该电压在氧化电位和还原电位之间循环。
15.权利要求10的方法，其中每个修饰核苷酸在各自的修饰核苷酸跨过所述至少一个边缘电极时被氧化或还原多次。
16.权利要求10的方法，其进一步包括使DNA链跨过平行的以规则距离隔开的多个边缘电极，其中使用每个边缘电极多次测定该DNA链的序列。
17.对DNA链进行电化学测序的方法，所述方法包括：
修饰DNA链的每个核苷酸以引入氧化还原物类，其中第一组中的每个修饰核苷酸由第一核苷酸碱基组成，且第二组中的每个修饰核苷酸由第二核苷酸碱基组成；
扩增该修饰的DNA链；
向至少一个边缘电极施加电压；
使扩增的修饰DNA链跨过所述至少一个边缘电极；
在各自的修饰核苷酸跨过所述至少一个边缘电极时，使用所述至少一个边缘电极氧化或还原每个修饰核苷酸，其中所述氧化或还原产生包括电流变化的电化学信号；
将由每个扩增的DNA链产生的电化学信号叠加；
识别每个修饰核苷酸；和
测定该DNA链的序列；
其中：
该修饰包括（a）修饰第一组的每个核苷酸以引入该氧化还原物类，（b）修饰第二组的每个核苷酸以引入该氧化还原物类；并且
该第一和第二核苷酸碱基不同且不互补。
18.权利要求17的方法，其进一步包括在修饰DNA链的每个核苷酸以引入氧化还原物类之前扩增DNA链。
19.权利要求18的方法，其进一步包括将已知的DNA链与每个扩增的DNA链连接。
20.权利要求17的方法，其进一步包括在每个扩增的DNA链的相邻核苷酸之间引入间隔物。
21.权利要求17的方法，其中第一组中的每个修饰核苷酸是氧化还原修饰的腺嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸（dNTP），并且第二组中的每个修饰核苷酸是氧化还原修饰的胞嘧啶或鸟嘌呤dNTP。
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