CN111511720A - 用于治疗缺血性中风的芳族磺酰胺衍生物 - Google Patents

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Abstract

用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的式(I)的化合物

Description

用于治疗缺血性中风的芳族磺酰胺衍生物
发明领域
本发明涉及如本文所述和定义的式(I)的取代的芳族磺酰胺，包含所述化合物的药物组合物和组合，以及所述化合物用于制备用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的药物组合物的用途。如本文所述和定义，本发明涉及包含活性成分的药物组合物和组合，所述活性成分为P2X4的拮抗剂或负向变构调节剂，其用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤。此类化合物作为单一药剂或与其他活性成分组合用于制备用于治疗或预防疾病，特别是哺乳动物的疾病的药物组合物的用途，所述疾病例如但不限于与神经元损伤和脑或脊髓发炎有关的疾病，以及脊髓或缺血性脑损伤。
发明背景
三磷酸腺苷ATP被广泛认为是一种重要的神经递质，其通过嘌呤能受体的不同亚型起作用而涉及各种生理和病理生理作用 (Burnstock 1993，Drug Dev Res 28：196-206；Burnstock 2011，Prog Neurobiol 95：229-274)。迄今为止，已经克隆了P2X家族的七个成员，包括P2X1-7(Burnstock 2013，Front Cell Neurosci 7：227)。P2X4受体是配体门控离子通道，其在主要已知参与炎症/免疫过程的多种细胞类型中表达，具体包括单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和小胶质细胞(Wang等人，2004，BMC Immunol 5：16；Brone等人，2007Immunol Lett 113：83-89)。其中，已知细胞外ATP激活P2X4会导致促炎性细胞因子和前列腺素(PGE2)的释放(Bo等人，2003 Cell Tissue Res 313：159-165；Ulmann等人，2010，EMBOJournal 29：2290-2300；de Ribero Vaccari等人，2012，J Neurosci 32：3058-3066)。
已经研究了细胞外ATP的选定P2X受体参与由葡萄糖/氧剥夺引起的神经元细胞死亡的发作。海马器官型培养的体外研究表明，葡萄糖/氧剥夺可上调P2X2和P2X4。此外，已经表明，缺血性条件不仅在海马中引起特定的神经元缺失，而且还在皮层和纹状体器官型培养中引起特定的神经元缺失，并且P2受体拮抗剂汽巴蓝(basilen blue)和苏拉明阻止了这些有害作用。此外，低氧诱导的条件在体内实验中证实了经历双侧颈总动脉闭塞的沙鼠海马中P2X受体的诱导。特别是，P2X2和P2X4蛋白显著上调，尽管程度不同且细胞表型不同。诱导被限制在CA1亚区的锥体细胞层和CA2亚区的过渡区，并且与神经元损伤的区域一致。P2X2在CA1锥体细胞层以及起层和辐射层的神经元细胞体和纤维中表达。强烈的P2X4免疫荧光定位于小胶质细胞。(F. Cavaliere等人，Neuroscience 120 (2003) 85-98)。
在出生后第3天大鼠的早产儿缺氧缺血模型中，已经表征了嘌呤离子型P2X4受体的表达如何在损伤后的大脑中改变。缺氧缺血后，P2X4受体表达显著增加，并与指示小胶质细胞激活的离子钙结合适配分子1蛋白表达的后期增加有关。米诺环素(minocycline)是一种有效的小胶质细胞抑制剂，可减轻缺氧缺血引起的P2X4受体表达增加。(Julie A. Wixey等人，Journal of Neuroimmunology 212 (2009) 35-43)。有关CNS中P2X4表达的已知信息的概述以及在神经炎症和神经性疼痛中病理生理作用的证据综述于“P2X4 ReceptorFunction in the Nervous System and Current Breakthroughs in Pharmacology” (L.Stokes等人, Frontiers in Pharmacology, May 2017 | Volume 8 | Article 291)。
WO2015/088564和WO2015/088565提供了P2X4受体调节化合物，其合成方法，包含所述化合物的药物组合物及其使用方法。所述P2X4受体调节化合物可用于治疗、预防和/或控制各种病症，包括但不限于慢性疼痛、神经病、炎性疾病和中枢神经系统病症。
现有技术中没有关于本文所述和定义的通式(I)的取代的芳族磺酰胺作为单一药剂或与其他活性成分组合用于制备用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤，脊髓损伤的药物组合物的参考文献。
因此，本发明的P2X4抑制剂代表了应作为单一药剂或与其他药物组合来补充治疗选择的有价值的化合物。
发明描述
本发明涉及式(I)的化合物
Figure DEST_PATH_IMAGE002
X是C或N
R1表示
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中*表示所述基团与分子其余部分的连接点且R6、R6a彼此独立地表示氟、氯、甲氧基或氢；
R2表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中 *表示所述基团与分子其余部分的连接点，并且所述基团任选地被彼此独立地相同或不同的R11取代一至两次；
R11彼此独立地表示卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-羟烷基、C1- C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-乙基-、甲氧基-乙基-、C3-C6-环烷基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、水合物、溶剂化物、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，其用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤。
本发明的一个方面是通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐或它们的混合物用于预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的用途。
本发明的另一方面涉及通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐或它们的混合物用于制备预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的药物的用途。
脑缺血可由非获得性脑损伤引起，例如遗传或先天性病症的一部分，例如胎儿酒精综合征，围产期疾病或围产期缺氧；这些类型的脑缺血通常会导致一般性脑缺血，从而通常影响整个大脑。
一般性脑缺血的其他实例是可由以下引起的那些：获得性脑损伤，一种出生后发生的损伤，由不同事件引起，例如新生儿缺氧；例如由于严重的肺部或心脏疾病引起的缺氧；由于事故(例如潜水过程中的氧气流失)引起的缺氧；可引起强烈的脑水肿和强烈的脑内免疫反应的脑部传染病(病毒、细菌、寄生虫)；自身免疫反应；不同原因导致的脑水肿，例如高原反应、阿片类药物滥用、中毒、恶性高血压、间质液通路的局部阻塞，或由脑脊液流动受阻(例如阻塞性脑积水)引起。
脑缺血也可能由获得性脑损伤引起并导致局灶性脑缺血，其中缺血事件位于脑的特定区域；缺血性中风、出血性中风和创伤性脑损伤是获得性脑损伤，通常导致局灶性脑缺 血。
特别地，缺血性中风是大脑的局部缺血，其通常与一个或多个局灶性脑梗塞有关，这是由于动脉粥样硬化病变或栓塞事件而导致的脑动脉血液供应全部或部分中断的结果，导致组织的氧和葡萄糖剥夺(缺血)。根据国际疾病分类(ICD)，将脑缺血性中风定义为由单个或多个大脑部位的局灶性梗塞引起的急性局灶性神经功能障碍。急性梗塞的证据可能来自：a)持续超过24小时的症状持续时间，或b)在大脑临床相关区域的神经影像学或其他技术(WHO-ICD11:https://icd.who.int/browse11/l-m/en#/http%3a%2f%2fid.who.int%2ficd%2fentity%2f636274910)。
出血性中风是由于脑内或蛛网膜下腔破裂的脑动脉瘤或血管渗漏减弱，其突然导致局灶性缺血，干扰了大脑的功能。血液溢出到定义的大脑区域内或周围，并产生肿胀、压力和缺血，损坏细胞和脑组织。
最后，创伤性脑损伤(TBI)是另一种疾病，主要导致在外力伤害大脑时发生的局灶性缺血。TBI可根据严重程度(轻度、中度和重度)和机制(闭合性或穿透性脑损伤)分类。轻度和中度的TBI主要导致不同程度的脑挫伤，引起水肿相关的脑缺血。而中度和重度的TBI(闭合和颅骨穿透)导致多创伤性损伤(例如血管破坏、颅内出血、脑组织破坏)，这些都与受影响脑区域的缺血性状况密切相关。
本发明的一个方面是如实施例所述的式(I)的化合物，其特征为其标题中的名称和其结构以及在实施例化合物中具体公开的所有残基的子组合。
本发明的另一方面特别涉及2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐(特别是其药学上可接受的盐)或它们的混合物用于制备预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的药物的用途。
本发明的另一方面是式(I)的化合物，其以其盐的形式，特别是以药学上可接受的盐的形式存在。
本发明的另一方面涉及通式I化合物或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐(特别是其药学上可接受的盐)或它们的混合物的肠胃外制剂。更特别地，本发明涉及2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐(特别是其药学上可接受的盐)的肠胃外制剂。
根据本发明，通式I化合物且更特别是2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐(特别是其药学上可接受的盐)或它们的混合物的肠胃外制剂是用于静脉内给药的肠胃外制剂。
应当理解，本发明涉及上述本发明的通式(I)的化合物的任何实施方案或方面内的任何子组合。
本发明的另一实施方案是如权利要求书部分所公开的根据权利要求所述的化合物，其中根据如下文公开的优选或更优选的定义或者具体公开的示例性化合物的残基及其子组合来限定定义。
定义
除非另外指明，否则如本文规定的任选取代的组分可以彼此独立地在任何可能的位置被取代一次或多次。当任何变量在任何组分中出现超过一次时，每个定义是独立的。例如，当R1、R2、R6、R6a、R11和/或X在任何式(I)的化合物中出现超过一次时，R1、R2、R6、R6a、R11和X的每个定义是独立的。
当组分由多于一个部分组成时，例如C1-C4-烷氧基-C1-C4-烷基-，可能的取代基的位置可以在这些部分中的任一个的任何合适的位置。在组分开头处的连字符标示与分子其余部分的连接点。当环是取代的时，取代基可以在环的任何合适的位置，如果合适，还可以在环氮原子上。
此外，由多于一个部分组成并且包含多个化学残基的组分(例如C1-C4烷氧基-C1- C4烷基或苯基-C1-C4烷基)应当从左至右读取，与分子其余部分的连接点在最后部分上(在前面提到的实例中在C1-C4烷基残基上)
当用于本说明书时，术语“包含”包括“由...组成”。
如果说明书中提到了“如上所述”或“上述”，则指的是说明书中的任何前页所提到的任何公开内容。
本发明意义内的术语“合适”是指在化学上可通过技术人员知识范畴内的方法制备。
本文本中提及的术语优选具有如下含义：
术语“卤素”、“卤素原子”、“卤代-”或“Hal-”应理解为表示氟、氯、溴或碘原子，优选氟或氯原子。
术语“C1-C4-烷基”应理解为优选表示具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链的饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，特别是具有1、2或3个碳原子(“C1-C3-烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“C1-C4-卤代烷基”应理解为优选表示直链或支链的饱和一价烃基，其中术语“C1-C4-烷基”如上定义，并且其中一或多个氢原子以相同或不同的方式被卤素原子替代，即卤素原子之间彼此独立。特别地，所述卤素原子是F。所述C1-C4-卤代烷基是，例如，-CF3、-CHF2、-CH2F、-CF2CF3或-CH2CF3。
术语“C1-C4-烷氧基”应理解为优选表示式-O-烷基的直链或支链的饱和一价烃基，其中术语“烷基”如上定义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基或仲丁氧基，或它们的异构体。
术语“C1-C4-卤代烷氧基”应理解为优选表示其中一或多个氢原子以相同或不同的方式被卤素原子替代的如上定义的直链或支链的饱和一价C1-C4-烷氧基。特别地，所述卤素原子为F。所述C1-C4-卤代烷氧基为例如-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF2CF3或-OCH2CF3。
术语“C1-C4-羟基烷基”应被理解为表示直链或支链的饱和一价烃基，其中术语“C1-C4-烷基”如上定义，并且其中一个或多个氢原子被羟基替代，例如，羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、1,2-二羟基乙基、3-羟基丙基、2-羟基丙基、2,3-二羟基丙基、1,3-二羟基丙-2-基、3-羟基-2-甲基-丙基、2-羟基-2-甲基-丙基、1-羟基-2-甲基-丙基。
术语“C3-C6-环烷基”应理解为表示含有3、4、5或6个碳原子的饱和一价单环或双环烃环(“C3-C6-环烷基”)。所述C3-C6-环烷基是例如单环烃环，如环丙基、环丁基、环戊基或环己基，或者是双环烃环。
如本文通篇例如在“C1-C4-烷基”、“C1-C4-卤代烷基”、“C1-C4-烷氧基”或“C1-C4-卤代烷氧基”的定义的上下文中使用的术语“C1-C4”应理解为表示具有1-4的有限碳原子数，即1、2、3或4个碳原子的烷基。还应理解，所述术语“C1-C4”应解释为其中包含的任何子范围，例如 C1-C4、C2-C4、C3-C4、C1-C2、C1-C3，特别是C1-C2、C1-C3、C1-C4，在“C1-C6-卤代烷基”或“C1-C4-卤代烷氧基”的情况中甚至更特别是C1-C2。
此外，如本文所用，如本文通篇例如在“C3-C6-环烷基”的定义的上下文中使用的术语“C3-C6”应理解为表示具有3-6的有限碳原子数，即3、4、5或6个碳原子的环烷基。还应理解，所述术语“C3-C6”应解释为其中包含的任何子范围，例如 C3-C6、C4-C5、C3-C5、C3-C4、C4-C6、C5-C6；特别是C3-C6。
术语“取代的”是指指定原子上的一个或多个氢被来自所示基团的选择替代，条件是不超过在现有情况下指定原子的正常化合价，并且取代导致了稳定的化合物。取代基和/或变量的组合只有在此类组合导致稳定化合物时才允许。
术语“任选取代的”是指被指定的基团(group)、基(radical)或部分任选取代。
环系统的取代基是指与芳族或非芳族环系统连接的取代基，所述取代基例如代替环系统上可用的氢。
如本文所用，术语“一次或多次”，例如在本发明的通式化合物的取代基的定义中，应理解为表示“一、二、三、四或五次，特别是一、二、三或四次，更特别是一、二或三次，甚至更特别是一或二次”。
本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为：其中至少一个原子被原子序数相同但原子量不同于自然界中通常或主要发现的原子量的原子替代的本发明的化合物。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，例如分别为2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、125I、129I和131I。本发明化合物的某些同位素变体，例如，其中掺入一个或多个放射性同位素(例如3H或14C)的那些变体，可用于药物和/或底物组织分布研究。特别优选氚代和碳-14(即，14C)同位素，这是由于它们容易制备和可检测性。进一步，用同位素如氘取代可以提供由更好的代谢稳定性导致的某些治疗优点，例如增加的体内半衰期或减小的剂量需求，并且因此在一些情况下可能是优选的。通常可以使用合适试剂的合适的同位素变体通过本领域技术人员已知的常规程序，例如通过示例性方法或下文实施例所描述的制备来制备本发明化合物的同位素变体。
当本文中使用词语化合物、盐、多晶型物、水合物、溶剂化物等的复数形式时，应理解为还表示单数的化合物、盐、多晶型物、异构体、水合物、溶剂化物等。
“稳定的化合物”或“稳定的结构”是指一个化合物是足够稳固的，可以经受从反应混合物中分离至有用的纯度和配制为有效的治疗剂。
根据期望的各种取代基的位置和性质，本发明的化合物可含有一个或多个不对称中心。不对称碳原子可以以(R)或(S)构型存在，在单个不对称中心的情况下得到外消旋混合物，并且在多个不对称中心的情况下得到非对映异构体混合物。在某些情况下，由于围绕给定键(例如连接特定化合物的两个取代芳环的中心键)的旋转受阻还可能存在不对称性。
环上的取代基还可以以顺式或反式形式存在。意图所有的此类构型(包括对映异构体和非对映异构体)均包括在本发明的范围内。
优选的化合物是产生更期望的生物活性的那些化合物。本发明化合物的分离的、纯净的或部分纯化的异构体和立体异构体、或者外消旋混合物或非对映异构体混合物均包括在本发明的范围内。此类物质的纯化和分离可通过本领域已知的标准技术实现。
根据常规方法通过拆分外消旋混合物可获得光学异构体，例如通过使用旋光酸或碱形成非对映异构体盐或者形成共价非对映异构体。适当的酸的实例为酒石酸、二乙酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。非对映异构体的混合物可基于它们的物理和/或化学差异，通过本领域已知的方法例如通过色谱法或分级结晶而分离成它们的单一的非对映异构体。然后，从分离的非对映异构体盐中释放旋光碱或酸。一种不同的分离光学异构体的方法涉及在进行或不进行常规衍生化的情况下使用手性色谱法(例如手性HPLC柱)，其经最佳选择以将对映异构体的分离最大化。适合的手性HPLC柱是由Daicel生产的，例如Chiracel OD和Chiracel OJ等，所有均可常规选择。在进行或不进行衍生化的情况下的酶法分离也是有用的。同样地，可使用旋光起始物质通过手性合成来获得本发明的旋光化合物。
为了将不同类型的异构体相互之间区分开来，参考了IUPAC Rules Section E(Pure Appl Chem 45, 11-30, 1976)。
本发明包括本发明化合物的所有可能的立体异构体，其是单一立体异构体或所述立体异构体(例如R-或S-异构体或者E-或Z-异构体)的任意比率的任意混合物的形式。例如，可通过任意适合的现有技术方法例如色谱法，尤其是手性色谱法实现本发明化合物的单一立体异构体例如单一对映异构体或单一非对映异构体的分离。
另外，本发明化合物可以互变异构体的形式存在。例如，含有吡唑部分作为杂芳基的任何本发明化合物例如可以1H互变异构体或2H互变异构体或甚至以任意量的所述两种互变异构体的混合物的形式存在，或者含有三唑部分作为杂芳基的任何本发明化合物例如可以1H互变异构体、2H互变异构体或4H互变异构体或甚至以任意量的所述1H、2H和4H互变异构体的混合物的形式存在，即：
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。
本发明包括本发明化合物的所有可能的互变异构体，其是单一互变异构体或所述互变异构体的任意比率的任意混合物的形式。
另外，本发明的化合物可以N-氧化物的形式存在，其定义为本发明化合物中的至少一个氮被氧化。本发明包括所有此类可能的N-氧化物。
本发明还涉及如本文公开的化合物的有用形式，例如代谢物、水合物、溶剂化物、前药、盐，特别是药学上可接受的盐，以及共沉淀物。
本发明的化合物可以水合物或溶剂化物的形式存在，其中本发明的化合物含有极性溶剂，特别是水、甲醇或乙醇，例如作为所述化合物晶格的结构要素。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。在化学计量的溶剂化物例如水合物的情况下，可以分别是半-、(半-)、一-、倍半-、二-、三-、四-、五-等溶剂化物或水合物。本发明包括所有此类水合物或溶剂化物。
另外，本发明的化合物可以游离形式存在，例如以游离碱或游离酸或两性离子的形式，或者可以盐的形式存在。所述盐可为任何盐，其可为有机或无机加成盐，特别是药学中常用的任何药学上可接受的有机或无机加成盐。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机或有机酸加成盐。例如，参见S. M. Berge等人 “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19。
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐可以是，例如，在链或环中携带氮原子的例如足够碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如，与无机酸的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、重硫酸(bisulfuric)、磷酸或硝酸，或与有机酸的酸加成盐，所述有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘酸、烟酸、双羟萘酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。
另外，足够酸性的本发明化合物的另一种合适的药学上可接受的盐是碱金属盐例如钠盐或钾盐，碱土金属盐例如钙盐或镁盐，铵盐，或与提供生理学上可接受的阳离子的有机碱的盐，例如与如下物质的盐：N-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、sovak碱、1-氨基-2,3,4-丁三醇。此外，含碱性氮的基团可以用例如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基或丁基的氯化物、溴化物和碘化物)；硫酸二烷基酯(如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯)、长链卤化物(例如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如苄基溴化物和苯乙基溴化物)等试剂季铵化。
本领域技术人员还会认识到，所要求保护的化合物的酸加成盐可通过多种已知方法中的任意一种使所述化合物与适当的无机酸或有机酸反应来制备。或者，本发明的酸性化合物的碱金属和碱土金属盐经由各种已知方法使本发明化合物与适当的碱反应来制备。
本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，其为单一盐或所述盐的任意比率的任意混合物的形式。
在本文本中，特别是在实验部分中，对于合成本发明的中间体和实施例，当化合物作为与对应的碱或酸的盐形式提及时，如各制备和/或纯化法所获得的所述盐形式的确切化学计量组成在大多数情况下是未知的。
除非另外指出，否则化学名称或结构式的后缀例如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“x HCl”、“x CF3COOH”、“x Na+”不应理解为化学计量规格，而仅仅是盐形式。
这类似适用于其中已通过所述的制备和/或纯化法获得具有(如果限定)未知化学计量组成的溶剂化物例如水合物形式的合成中间体或实施例化合物或其盐的情况。
所述盐包括水不溶性盐和特别是水溶性盐。
此外，本发明涵盖在生物体系中转化为式(I)的化合物或其盐的式(I)的化合物及其盐的衍生物 (生物前体或前药)。所述生物体系是例如哺乳动物生物体，特别是人类对象。生物前体例如通过代谢过程转化为式(I)的化合物或其盐。
另外，本发明包括本发明化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比率的混合物的形式。
在本发明化合物的特性的上下文中，术语“药代动力学特征”是指如在合适的实验中测量的一个单一参数或其组合，包括渗透性、生物利用度、暴露，以及药效学参数如持续时间，或者药理作用的大小。具有改善的药代动力学特征的化合物可以例如以较低剂量使用以实现相同效果，可以实现较长的作用持续时间，或者可以实现两种效果的组合。
现已发现所述本发明的化合物具有令人惊讶且有利的特性，这构成了本发明的基础。
特别地，令人惊讶地发现，根据本发明的化合物在缺血性中风的治疗中作为P2X4的拮抗剂或负向变构调节剂有效地起作用。
变构调节剂是间接影响(调节)激动剂或反向激动剂对靶蛋白例如受体的作用的物质。变构调节剂结合至不同于正构激动剂结合位点的位点。通常它们会诱导蛋白质结构内的构象变化。负调节剂(NAM)会降低正构配体的作用，但在不存在正构配体的情况下不起作用。
商业用途和医学适应症
• 如上文所述，令人惊讶地发现本发明的化合物作为P2X4的拮抗剂或负向变构调节剂有效地起作用。
如本文所描述和定义的通式(I)的化合物，或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物，适用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤。
本发明进一步涉及使用通式(I)的化合物或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物治疗与疼痛和炎症相关的哺乳动物病症和疾病的方法。
本文件通篇所述的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是常规地使用的，例如以抵抗、减轻、减少、缓解、改善疾病或病症的状况等为目的来管理或护理对象。
优选地，上述疾病的治疗方法不限于所述疾病的治疗，还包括涉及所述疾病或与之相关的疼痛和炎症的治疗。
本发明的化合物的药物组合物
本发明还涉及包含一种或多种本发明的化合物的药物组合物。可以通过对有需要的患者给药来利用这些组合物从而实现所需的药理作用。为本发明的目的，患者是需要针对特定病况或疾病进行治疗的哺乳动物，包括人。
因此，本发明包括这样的药物组合物，其包含药学上可接受的载体或助剂以及药学上有效量的本发明的化合物或其盐。
本发明的另一方面是用于治疗上述疾病的药物组合物，其包含药学上有效量的式(I)的化合物和药学上可接受的助剂。
药学上可接受的载体或助剂优选是这样的载体，其在与活性成分的有效活性一致的浓度下对患者无毒且无害，从而由所述载体引起的任何副作用不会破坏所述活性成分的有益作用。载体和助剂是辅助组合物以适合给药的所有种类的添加剂。
化合物的药学有效量优选是对正在治疗的特定病况产生结果或者发挥预期影响的量。
可以使用包括立即、缓慢和定时释放制剂在内的任何有效的常规剂量单位形式，将本发明的化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体或助剂一起以口服、肠胃外、局部、经鼻、舌下、直肠等方式给药。
对于口服给药，可以将化合物配制成固体或液体制剂，例如胶囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂(troche)、锭剂(lozenge)、熔剂(melt)、粉剂、溶液剂、混悬剂或乳剂，并且可根据本领域已知的用于制备药物组合物的方法来制备。固体单位剂型可以是胶囊剂，其可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，含有助剂，例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。
在另一个实施方案中，可以将本发明的化合物与常规片剂基质(例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)以与下述物质结合的方式制成片剂：粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)、用于辅助给药后片剂的分解和溶出的崩解剂(例如土豆淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜尔胶、黄蓍胶、阿拉伯胶)、用于改善片剂制粒的流动性并且防止片剂材料粘附至片剂模具和冲头的表面的润滑剂(例如滑石、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌)、染料、着色剂，以及用于增强片剂的美学品质并使它们对患者而言更容易接受的调味剂(例如薄荷、冬青油或樱桃香精)。用于口服液体剂型的合适的赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂，例如水和醇(例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇类)，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、助悬剂或乳化剂。各种其它材料可以以包衣的方式存在或者以其它方式改变剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或二者将片剂、丸剂或胶囊剂进行包衣。
可分散的粉末和颗粒适合用于制备水性混悬剂。它们以与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的方式提供活性成分。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂可列举上述已提及的那些物质。还可以存在另外的赋形剂，例如上述的那些甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以呈水包油乳剂的形式。油相可为植物油，例如液体石蜡或者植物油的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天然存在的树胶，例如阿拉伯胶和黄蓍胶，(2)天然存在的磷脂类，例如大豆和卵磷脂，(3)衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，(4)所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。该乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。
可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或者悬浮在矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性混悬剂。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。混悬剂也可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
可以用甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖)来配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可以含有缓和剂和防腐剂(例如尼泊金甲酯和尼泊金丙酯)以及调味剂和着色剂。
本发明的化合物也可以肠胃外给药，即例如皮下、静脉内、眼内、滑膜内、肌内或腹膜间，作为优选在生理学上可接受的稀释剂与药物载体中的化合物的可注射剂量给药，所述药物载体可以是无菌液体或液体的混合物，例如水、盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液，醇例如乙醇、异丙醇或十六醇，二醇类例如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮类例如2,2-二甲基-1,1-二氧杂环戊烷-4-甲醇，醚类例如聚(乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯或乙酰化的脂肪酸甘油酯，加入或不加入药学上可接受的表面活性剂例如皂或洗涤剂，助悬剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药物助剂。
可以在本发明的肠胃外制剂中使用的油的示例是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合适的皂包括脂肪酸碱金属、铵和三乙醇胺盐且合适的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵、烷基吡啶鎓卤化物和烷基胺乙酸盐；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃的磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯的硫酸盐，和磺基琥珀酸盐；非离子型洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚(氧乙烯-氧丙烯)或环氧乙烷或环氧丙烷共聚物；和两性洗涤剂，例如，烷基-β-氨基丙酸盐，和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及混合物。
本发明的肠胃外组合物典型地在溶液中含有约0.5重量%至约25重量%的活性成分。更特别地，根据本发明的式(I)的化合物的肠胃外组合物典型地在溶液中含有约0.5重量%至约20重量%，或约0.5重量%至约15重量%，或约1重量%至约12重量%，或约3重量%至约12重量%，或约5重量%至约10重量%的活性成分，所述化合物特别是 2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基)-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐。
还可以有利地使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位处的刺激，此类组合物可以含有具有优选约12至约17的亲水-亲油平衡(HLB)的非离子表面活性剂。表面活性剂在此类制剂中的量优选为约5重量%至约15重量%。表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分，或者可以是两种或更多种具有所需HLB的组分的混合物。
在肠胃外制剂中使用的表面活性剂的示例是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物，所述疏水性基质通过缩合环氧丙烷和丙二醇而形成。
药物组合物可以呈无菌的可注射水性混悬剂的形式。此类混悬剂可以根据已知的方法使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂(例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶)；分散剂或润湿剂，其可为天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙基氧基鲸蜡醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)配制。
无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，任何温和的固定油都可以使用，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射制剂。
本发明的组合物还可以以用于药物直肠给药的栓剂的形式给药。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在平常温度下为固体、但在直肠温度下为液体，因此会在直肠中熔化以释放药物。此类材料例如为可可脂和聚乙二醇。
用于肠胃外给药的控制释放制剂包括本领域已知的脂质体、聚合微球和聚合凝胶制剂。
经由机械递送装置将药物组合物引入患者可能是期望的或必要的。用于递送药剂的机械递送装置的构建和使用在本领域中是公知的。用于例如直接向脑给药药物的直接给药技术通常涉及将药物递送导管放置到患者的心室系统中以绕过血脑屏障。在1991年4月30日授权的美国专利号5,011,472中描述了一种此类可植入递送系统，其用于将药剂运输到身体的特定解剖学区域。
在必要时或期望时，本发明的组合物还可以含有其它常规药学上可接受的混配成分，通常被称作载体或稀释剂。可以利用用于将此类组合物制成适当剂型的常规程序。
此类成分和程序包括在下列参考文献中所描述的那些，其中的每一个通过引用并入本文：Powell, M.F. 等人, "Compendium of Excipients for ParenteralFormulations" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1998, 52(5),238-311 ; Strickley, R.G "Parenteral Formulations of Small MoleculeTherapeutics Marketed in the United States (1999)-Part-1" PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 1999, 53(6), 324-349 ; 和Nema, S.等人, "Excipients and Their Use in Injectable Products" PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 1997, 51(4), 166-171。
可以适当时使用以针对其预期的给药途径而配制组合物的常用药物成分包括：
酸化剂(实例包括但不限于乙酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、硝酸)；
碱化剂(实例包括但不限于氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺(triethanolamine)、三乙醇胺(trolamine))；
吸附剂(实例包括但不限于粉状纤维素和活性炭)；
气雾剂抛射剂(实例包括但不限于二氧化碳、CCl2F2、F2ClC-CClF2和CClF3)；
空气置换剂(实例包括但不限于氮气和氩气)；
抗真菌防腐剂(实例包括但不限于苯甲酸、尼泊金丁酯、尼泊金乙酯、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯甲酸钠)；
抗微生物防腐剂(实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；
抗氧化剂(实例包括但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠)；
粘合材料(实例包括但不限于嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅酮、聚硅氧烷以及苯乙烯-丁二烯共聚物)；
缓冲剂(实例包括但不限于偏磷酸钾、磷酸氢二钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和二水柠檬酸钠)；
载体(实例包括但不限于阿拉伯胶糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、橙皮糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌的氯化钠注射液和抑菌的注射用水)；
螯合剂(实例包括但不限于依地酸二钠和依地酸)；
着色剂(实例包括但不限于FD&C Red No. 3、FD&C Red No. 20、FD&C Yellow No. 6、FD&C Blue No. 2、D&C Green No. 5、D&C Orange No. 5、D&C Red No. 8、焦糖以及氧化铁红)；
澄清剂(实例包括但不限于膨润土)；
乳化剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、聚西托醇、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯50单硬脂酸酯)；
包囊剂(实例包括但不限于明胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素)；
香料(实例包括但不限于茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、橙油、薄荷油和香草醛)；
保湿剂(实例包括但不限于甘油、丙二醇和山梨糖醇)；
研磨剂(实例包括但不限于矿物油和甘油)；
油(实例包括但不限于花生油(arachis oil)、矿物油、橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油和植物油)；
软膏基质(实例包括但不限于羊毛脂、亲水软膏、聚乙二醇软膏、凡士林、亲水凡士林、白色软膏、黄色软膏以及玫瑰水软膏)；
渗透增强剂(透皮递送) (实例包括但不限于单羟基或多羟基醇类、一价或多价醇类、饱和或不饱和脂肪醇类、饱和或不饱和脂肪酯类、饱和或不饱和二羧酸类、精油类、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜类、酰胺类、醚类、酮类和脲类)；
增塑剂(实例包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；
溶剂(实例包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯化水、注射用水、无菌注射用水和无菌冲洗用水)；
硬化剂(实例包括但不限于鲸蜡醇、鲸蜡基酯蜡、微晶蜡、石蜡、硬脂醇、白蜡和黄蜡)；
栓剂基质(实例包括但不限于可可脂和聚乙二醇(混合物))；
表面活性剂(实例包括但不限于苯扎氯铵、壬基酚聚醚10、辛基酚聚醚9、聚山梨酯80、月桂基硫酸钠和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)；
助悬剂(实例包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄蓍胶和硅酸镁铝(veegum))；
甜味剂(实例包括但不限于阿斯巴甜、右旋糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖)；
片剂抗粘附剂(实例包括但不限于硬脂酸镁和滑石)；
片剂粘合剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、非交联聚乙烯吡咯烷酮和预胶化淀粉)；
片剂和胶囊剂稀释剂(实例包括但不限于二碱式磷酸钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨糖醇和淀粉)；
片剂包衣剂(实例包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素和虫胶)；
片剂直接压制赋形剂(实例包括但不限于二碱式磷酸钙)；
片剂崩解剂(实例包括但不限于藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、波拉克林钾(polacrillin potassium)、交联聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠、淀粉乙醇酸钠和淀粉)；
片剂助流剂(实例包括但不限于胶体二氧化硅、玉米淀粉和滑石)；
片剂润滑剂(实例包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；
片剂/胶囊剂遮光剂(实例包括但不限于二氧化钛)；
片剂抛光剂(实例包括但不限于巴西棕榈蜡和白蜡)；
增稠剂(实例包括但不限于蜂蜡、鲸蜡醇和石蜡)；
张度剂(实例包括但不限于右旋糖和氯化钠)；
增粘剂(实例包括但不限于藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠和黄蓍胶)；和
润湿剂(实例包括但不限于十七亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。
根据本发明的药物组合物可以举例如下：
无菌i.v.溶液剂：可以使用无菌的注射用水来制备本发明期望化合物的5 mg/ml溶液，如有必要，调节pH。用无菌5%右旋糖将所述溶液稀释至1-2 mg/mL用于给药，并且在约60min内以静脉内输注给药。
用于i.v.给药的冻干粉：可以用(i) 100-1000 mg冻干粉形式的本发明的期望化合物，(ii) 32-327 mg/mL柠檬酸钠，以及(iii) 300-3000 mg右旋糖酐40制备无菌制剂。用无菌注射用盐水或5%右旋糖将该制剂复溶至10-20 mg/mL的浓度，用盐水或5%右旋糖进一步稀释至0.2-0.4 mg/mL，并且静脉内推注或静脉内输注经15-60分钟给药。
肌内混悬剂：可以为肌内注射制备以下溶液或混悬液：
50 mg/ml的本发明的期望的水不溶性化合物
5 mg/ml 羧甲基纤维素钠
4 mg/ml 吐温80
9 mg/ml 氯化钠
9 mg/ml 苯甲醇。
硬壳胶囊剂：通过各自用100 mg粉状活性成分、150 mg乳糖、50 mg纤维素和6 mg硬脂酸镁填充标准的两片式硬明胶胶囊来制备大量的单位胶囊。
软明胶胶囊剂：制备活性成分在易消化的油例如大豆油、棉籽油或橄榄油中的混合物，并利用正排量泵注射到熔融凝胶中以形成含有100 mg活性成分的软明胶胶囊。清洗并干燥胶囊。可以将活性成分溶解于聚乙二醇、甘油和山梨糖醇的混合物中以制备水混溶性药物混合物。
片剂：通过常规程序制备大量片剂，使得剂量单位为100 mg活性成分、0.2 mg 胶体二氧化硅、5 mg 硬脂酸镁、275 mg 微晶纤维素、11 mg 淀粉和98.8 mg 乳糖。可施用适当的水性和非水性包衣以增加适口性、改善雅观和稳定性或延迟吸收。
立即释放片剂/胶囊剂：这些是通过常规方法和新方法制备的固体口服剂型。为了药物的即刻溶出和递送，以不用水的方式口服这些单位。将活性成分混合在含有成分例如糖、明胶、果胶和甜味剂的液体中。通过冷冻干燥和固态提取技术使这些液体固化成固体片剂或囊片。可以将药物化合物与粘弹性和热弹性的糖以及聚合物或泡腾组分一起压制以生产多孔基质，所述多孔基质意图用于立即释放而不需要水。
剂量和给药
基于已知用于评价可用于治疗受P2X4影响的病症和/或疾病的化合物的标准实验室技术，通过标准毒性测试和通过用于确定上面鉴定的哺乳动物病况的治疗的标准药理学测定，以及通过将这些结果与用于治疗这些病况的已知药物的结果进行比较，可以容易地确定用于治疗每种期望的适应症的本发明化合物的有效剂量。要在这些病况之一的治疗中给药的活性成分的量可根据例如下述的考量而发生很大变化：所使用的特定化合物和剂量单位、给药方式、治疗时段、受治疗患者的年龄和性别，以及被治疗的病况的性质和程度。
式I化合物的给药总量通常为每天约0.1 mg/kg至约50 mg/kg体重，更特别地为每天约0.2 mg/kg至约30 mg/kg体重，更特别是每天约0.5 mg/kg体重至约15 mg/kg体重。
临床上有用的给药方案是每日一次至三次给药至每四周一次给药。此外，其中在某一时间段内不向患者给药的“药物假期”对于药理学效应和耐受性之间的整体平衡而言可能是有利的。单位剂量可以含有约5 mg至约500 mg的活性成分，特别是约25 mg至约150mg，并且可每日一次或多次或者少于每日一次给药。
根据本发明实施方案的特定形式，用于给药本发明化合物的口服单位剂量包括但不限于0.5 mg/kg至约10 mg/kg体重，每天1-3次至每周一次。
根据本发明实施方案的特定形式，用于通过注射(包括静脉内、肌内、皮下和肠胃外注射)和使用输注技术给药的平均日剂量为0.5至50 mg/kg总体重。
平均每日直肠给药方案优选为0.5至50 mg/kg总体重。
平均每日局部给药方案优选为每日一次至四次给药0.5至50 mg/kg。
平均每日吸入给药方案优选为0.5至30 mg/kg总体重。
当然，对每个患者而言，具体的起始剂量和持续剂量方案将根据下述因素而变化：主治诊断医生所确定的病况的性质和严重程度、所使用的具体化合物的活性、患者的年龄和整体状况、给药时间、给药途径、药物的排泄速率、药物组合等。本发明的化合物或其药学上可接受的盐或酯或组合物的期望的治疗方式和剂量数量可由本领域技术人员利用常规的治疗测试来确定。
血脑屏障(BBB)是由脑毛细血管内皮形成的，并且充当过滤器，将意图用作神经治疗剂的约 100%的大分子和超过98%的所有小分子从大脑中排除。在脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤的急性期期间，BBB受损，其执行排除功能的接合处减弱。在从上面鉴定的病症发作，从IS发作到BBB闭塞的时间窗口内，特别有利的是将治疗剂递送到大脑的特定区域。
如本文所述和定义的通式(I)的化合物，或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物，有利地从缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤，特别是IS的发作，从疾病的发作直至重新建立BBB给药，以使化合物以足够的量穿过BBB。
更特别地，通式(I)的化合物，例如2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺，有利地从疾病(例如IS)发作直至约一个月，更特别地直至约三周，更特别地直至约两周，更特别地直至约十天给药。
更特别地，通式(I)的化合物，例如2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺有利地在疾病发作的6小时内，更特别在3小时内给药。
作为疾病的发作，不仅可以考虑发生缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤的确切时间，还可以考虑已识别出此类疾病的症状或例如已通过计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)确认此类疾病的时间。
组合疗法
本发明中的术语“组合”以本领域技术人员已知的方式使用，并且可以作为固定组合、非固定组合或套装药盒(kit-of-parts)存在。
本发明中的“固定组合”以本领域技术人员已知的方式使用，并且被定义为其中所述第一活性成分和所述第二活性成分共同存在于一个单位剂量或单一实体中的组合。“固定组合”的一个实例是药物组合物，其中所述第一活性成分和所述第二活性成分存在于用于同时给药的混合物中，例如在制剂中。“固定组合”的另一个实例是药物组合，其中所述第一活性成分和所述第二活性成分存在于一个单位中，但不是以混合物的形式。
本发明中的非固定组合或“套装药盒”以本领域技术人员已知的方式使用，并且被定义为其中所述第一活性成分和所述第二活性成分存在于多于一个单位中的组合。非固定组合或套装药盒的一个实例是其中所述第一活性成分和所述第二活性成分单独地存在的组合。非固定组合或套装药盒的组分可以分开、依序、同时(simultaneously)、同时(concurrently)或按时间顺序交错给药。
可以将本发明的化合物作为单一药剂给药或者与一种或多种其它药剂组合给药，其中所述组合不会引起不可接受的不良反应。本发明还涉及这样的组合。
此外，本发明的化合物可以与已经被批准或仍在开发中的用于治疗和/或预防与P2X4有关或由P2X4介导的疾病的治疗剂或活性成分组合。
为了治疗和/或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤，本发明的化合物可以与下列组合或作为与下列的联合药物给药：相应的护理标准(SOC)=基本重症监护室疗法，包括稳定血压(通常会降低BP)；再通(使用例如rtPA进行药理静脉内溶解和/或通过动脉内血栓抽出进行机械性再通)；通过用例如甘油、甘露醇或高渗盐溶液进行渗透疗法和/或用糖皮质激素治疗来治疗脑水肿。
为了治疗和/或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤，本发明的化合物可以与任何一种物质组合给药或作为与任何一种物质的联合药物给药，所述物质可用作抗血栓形成剂，特别是抗凝剂，例如糖胺聚糖，例如肝素，低分子量肝素或达那肝素；直接凝血酶抑制剂，如例如阿加曲班、抗凝血酶或蛋白C；抗血小板剂阿司匹林或氯吡格雷；糖蛋白IIb/IIIa受体阻滞剂例如阿昔单抗或依替巴肽(Integrilin)，纤溶药物例如链激酶、阿尼普酶或阿替普酶。一个非常特别的实例是本发明化合物与阿司匹林一起的给药或共同给药。
本发明的化合物可以与旨在治疗炎性疾病、炎性疼痛或一般性疼痛状况的其他药理学药剂和化合物组合。
特定的药理学或药物特性的测试方法是本领域技术人员众所周知的。
在本文中描述的实施例测试实验用于说明本发明，并且本发明不限于所给出的实施例。
本领域技术人员会理解，本发明不限于本文所述的具体实施方案，而是覆盖如所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所述实施方案的所有修改。
以下实施例更详细地说明本发明，但不限制本发明。其制备未明确描述的本发明的其他化合物可以以类似的方式制备。
在实施例中提到的化合物及其盐代表本发明以及覆盖如具体实施例公开的式(I)的化合物的残基的所有亚组合的权利要求的优选实施方案。
实验部分中的术语“根据”以所提及的程序“类似于”使用的意义使用。
化合物的合成
下列方案和一般程序说明本发明的通式(I)的化合物的一般合成路线，并不意图是限制性的。本领域技术人员显而易见，可以用多种方式来修改如方案1至5中示例的转化顺序。因此，方案1至5中示例的转化顺序不意图是限制性的。另外，可以在示例性转化之前和/或之后实现取代基例如残基R1、R2或R11的相互转化。这些修改可以是例如保护基的引入、保护基的裂解、官能团的还原或氧化、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步相互转化的官能团的那些转化。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员众所周知的(参见例如T.W. Greene和P.G.M. Wuts, ProtectiveGroups in Organic Synthesis, 第3版, Wiley 1999)。
用于制备本发明化合物的所有试剂是可商购的、在文献中已知的，或者可以如所述制备。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
方案1：制备对应于式6的通式(I)和(Ia)的化合物的一般程序；R 1 如本发明的说明书和 权利要求书所定义；W对应于具有氢和/或保护基PG(例如，(二甲基氨基)亚甲基，2,4-二甲 氧基苄基)的胺；V对应于LG、氯或溴；LG对应于离去基团(例如氯、氟、甲苯磺酰基)；R 2 是具 有亲核氮的杂芳族体系(例如吡唑、咪唑、三唑)并且在该氮原子上经历亲核芳族取代。
通式6的化合物可以如方案1所示合成。本领域技术人员能够将磺酰氯1转化为受保护的磺酰胺2，并且能够选择适合于以下步骤的保护基PG。合适的保护基PG的实例是2,4-二甲氧基苄基或(二甲基氨基)亚甲基。如果V对应于离去基团LG(例如氟、氯、甲苯磺酰基)，则化合物 2可以在亲核芳族取代反应中在合适的溶剂(例如乙腈)中和在合适的碱(例如碳酸钾、碳酸铯、…)的存在下用含有亲核氮的杂芳族体系R2H(例如吡唑、咪唑、三唑、…)转化为化合物3，同时形成新的C-N键。如果V对应于氯或溴，则化合物3可以在与含氮杂芳族体系(例如1,2,3-三唑)的金属催化的C-N偶联反应中并且在合适的催化体系(例如三(二亚苄基丙酮)二钯/二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3,4,5,6-四甲基-[1,1'-联苯]-2-基)膦/磷酸钾/甲苯)的存在下形成。在下一步中，可以在氢化条件下，在极性溶剂(例如乙醇、甲醇、二噁烷或四氢呋喃)中，在例如Pd-、Pt-、Fe-或Sn-基催化剂的存在下，通过还原将硝基化合物3转化为相应的苯胺4。苯胺4可例如通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成(例如在偶联剂例如HATU存在下相应羧酸的反应)而转化为相应的酰胺5。在最后的步骤中，将酰胺5脱保护为所需的磺酰胺6。脱保护条件取决于所用的保护基(例如，在2,4-二甲氧基苄基的情况下为TFA/二氯甲烷，或者在(二甲基氨基)亚甲基的情况下为氨水/甲醇)。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
方案2：制备对应于式13的通式(I)和(Ib)的化合物的一般程序；R 1 如本发明的说明书 和权利要求书所定义；W对应于具有氢和/或保护基PG(例如(二甲基氨基)亚甲基)的胺；Ar 是芳基；R 2 是具有亲核氮的杂芳族体系(例如吡唑、咪唑、三唑)并且在该氮原子上经历亲核 芳族取代。
通式13的化合物可以如方案2所示合成。本领域技术人员能够将磺酰氯7转化成受保护的磺酰胺8，并且能够选择适合于以下步骤的保护基PG。合适的保护基PG的实例是(二甲基氨基)亚甲基(磺酰氯7与氨反应，然后在DMF中与1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺反应)。使用保护和脱保护策略，在合适的催化剂(参见例如WO2011120026A1)的存在下，8的Buchwald胺化产生中间体9。在合适的溶剂(例如乙腈)中和在合适的碱(例如碳酸钾，…)存在下，与含有亲核氮的杂芳族体系R2H(例如吡唑、咪唑、三唑、…)的亲核芳族取代反应产生吡啶10。将10脱保护(如果Y = -N=CAr2，则在酸性条件下)，随后例如通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成(例如在偶联剂例如HATU存在下相应羧酸的反应)将所得苯胺11转化为酰胺12。在最后一步中，将酰胺12脱保护为所需的磺酰胺13。脱保护条件取决于所用的保护基(例如在(二甲基氨基)亚甲基的情况下为氨水/甲醇)。
Figure DEST_PATH_IMAGE014
方案4：制备对应于式28的通式(I)和(Ia)的化合物的一般程序；R 1 和R 2 如本发明说明 书和权利要求书所定义，B(OZ) 2 对应于B(OH) 2 或B(O 2 C 6 H 12 )，或两者的混合物，和W对应于具 有氢和/或保护基PG(例如(二甲基氨基)亚甲基、2,4-二甲氧基苄基)的胺。
通式28的化合物可以如方案4所示合成。从相应的磺酰氯23(其中V为溴或氯)开始，可以通过例如本领域技术人员已知的Suzuki交叉偶联反应制备C连接的芳基和杂芳基衍生物。受保护的磺酰胺24向通式25的芳基/杂芳基化合物的转化可通过在质子(例如异丙醇)或非质子溶剂中在钯催化下与相应的硼酸(或酯或二者的混合物)反应来实现。相应的胺26可以在例如Pd-、Pt-、Fe-或Sn-基催化剂的存在下在极性溶剂如乙醇或四氢呋喃中在氢化条件下通过还原从中间体25获得。随后例如通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成(例如在偶联剂例如HATU存在下相应羧酸的反应)可以实现酰化为相应的酰胺27。对于W等于保护基，随后用例如三氟乙酸(TFA)脱保护，得到通式28的化合物。
可替代地，从V = Br的中间体24开始，在氢化条件下，在极性溶剂例如乙醇或四氢呋喃中，在例如Pt-、Fe-或Sn-基催化剂的存在下还原，得到胺29。可以通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成来获得相应的酰胺30a。随后使用例如钯催化的交叉偶联进行的芳基化/杂芳基化可得到中间体27。可替代地，可以将溴化物30a转化为相应的硼酸/酯中间体31 (B(OZ)2=B(OH)2或B(O2C6H12))，并使用例如本领域技术人员已知的钯催化使其进一步反应以获得中间体27，其在脱保护后产生具有通式28的终产物。
Figure DEST_PATH_IMAGE016
方案5：制备对应于式35的通式(I)和(Ib)的化合物的一般程序；R 1 和R 2 如本发明的说 明书和权利要求书所定义，W对应于具有氢和/或保护基PG(例如，(二甲基氨基)亚甲基、2, 4-二甲氧基苄基)的胺；Ar是芳基。
通式35的化合物可以如方案5所示合成。从中间体9开始，可以通过例如本领域技术人员已知的钯交叉偶联，例如Suzuki反应(参见例如US 20110281865)来制备C-偶联的芳基和杂芳基衍生物32。在例如酸性条件下脱保护产生胺33。随后可例如通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成(例如在偶联剂例如HATU存在下相应羧酸的反应)实现酰化为相应的酰胺。对于W等于受保护的氨基官能团，随后脱保护(例如在(二甲基氨基)亚甲基作为保护基的情况下用氨水进行脱保护)，得到通式35的化合物。
Figure DEST_PATH_IMAGE018
方案6：制备式30a的化合物的一般程序；R 1 如本发明的说明书和权利要求书中所定义， W对应于具有氢和/或保护基PG(例如(二甲基氨基)亚甲基、2,4-二甲氧基苄基)的胺。
通式30a的化合物可以如方案6所示合成。从相应的苯胺36开始，溴化(例如在DMF中用NBS进行溴化)产生溴苯胺37。随后可例如通过与酰氯反应或使用所有已知程序通过标准肽键形成(例如在偶联剂例如HATU存在下相应羧酸的反应)实现酰化为相应的酰胺38。随后保护磺酰胺部分(例如在DMF中用1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺保护)得到受保护的酰胺30a，然后可以例如如方案4所述使用Suzuki化学将其进一步转化。
以本身已知的方式分离并纯化根据本发明的化合物，例如通过在真空中蒸馏去除溶剂并重结晶获自合适的溶剂的残余物，或者使其经受通常的纯化方法之一，例如在合适的载体材料上的色谱法。此外，具有足够碱性或酸性官能团的本发明化合物的反相制备型HPLC可以导致形成盐，例如，在本发明的化合物足够碱性的情况下，例如形成三氟乙酸盐或甲酸盐，或在本发明的化合物足够酸性的情况下，例如形成铵盐。这种类型的盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法分别转化为其游离碱或游离酸形式，或者作为盐用于随后的生物学测定。另外，在分离本发明化合物期间的干燥过程可能不能完全除去痕量的共溶剂，尤其是例如甲酸或三氟乙酸，以得到溶剂化物或包合配合物。本领域技术人员会认识到哪种溶剂化物或包合配合物对用于随后的生物学测定是可接受的。应该理解，如本文所述分离的本发明化合物的具体形式(例如，盐、游离碱、溶剂化物、包合配合物)不一定是其中所述化合物可以用于生物学测定以定量具体生物活性的唯一形式。
根据本发明的式(I)、(Ia)和(Ib)的化合物的盐可以通过将游离化合物溶于合适的溶剂(例如酮如丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮，醚如乙醚、四氢呋喃或二噁烷，氯化烃如二氯甲烷或氯仿，或者低分子量脂族醇如甲醇、乙醇或异丙醇)来获得，所述溶剂含有期望的酸或碱，或者然后向其添加期望的酸或碱。可以根据所涉及的是单元还是多元酸或碱和根据所需要的是哪种盐，以等摩尔定量比率或与此不同的比率将酸或碱用于盐的制备。通过过滤、再沉淀、用盐的非溶剂沉淀或通过蒸发溶剂来获得盐。所获得的盐可以转变为游离化合物，游离化合物又可以转化为盐。通过这种方式，可例如作为过程产物在工业规模的制备中获得的药学上不可接受的盐可以通过本领域技术人员已知的方法转化为药学上可接受的盐。尤其优选盐酸盐以及实施例部分所用的方法。
根据本发明的化合物和盐的纯的非对映异构体和纯的对映异构体可以如下获得：例如，通过不对称合成，通过在合成中使用手性起始化合物，以及通过分离合成中所获得的对映异构体混合物和非对映异构体混合物。
可以通过本领域技术人员已知的方法，将对映异构体混合物和非对映异构体混合物分离成纯的对映异构体和纯的非对映异构体。优选地，通过结晶(特别是分级结晶)或色谱法分离非对映异构体混合物。对映异构体混合物可以例如通过与手性辅助剂形成非对映异构体，拆分获得的非对映异构体并去除手性辅助剂来分离。作为手性辅助剂，例如，手性酸可以用来分离对映异构体碱，如例如扁桃酸，并且手性碱可以用来通过形成非对映异构体盐来分离对映异构体酸。此外，非对映异构体衍生物如非对映异构体酯可以分别利用手性酸或手性醇作为手性辅助剂分别从醇的对映异构体混合物或酸的对映异构体混合物形成。此外，非对映异构体配合物或非对映异构体包合物可以用于分离对映异构体混合物。可替代地，可以利用色谱法中的手性分离柱分离对映异构体混合物。分离对映异构体的另一合适的方法为酶促分离。
本发明的一个优选方面是根据实施例的通式(I)、(Ia)或(Ib)的化合物或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐的制备方法，以及用于其制备的中间体。
任选地，可以将式(I)、(Ia)和(Ib)的化合物转化成它们的盐，或者任选地，可以将式(I)、(Ia)和(Ib)的化合物的盐转化成游离化合物。相应的方法对于技术人员而言是常规的。
实验部分
缩写
下表列出本段以及中间体实施例和实施例部分中所用的缩写，只要它们不在正文中解释。
缩写 含义
AcOH 乙酸(醋酸)
aq. 水性的
boc 叔丁氧羰基
br 宽峰
CI 化学电离
d 二重峰
DAD 二极管阵列检测器
DBU 1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯
DCM 二氯甲烷
dd 双二重峰
DIPEA 二异丙基乙胺
DMF <i>N,N</i>-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
ELSD 蒸发光散射检测器
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
eq. 当量
ESI 电喷雾(ES)电离
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓 3-氧化物六氟磷酸盐
HPLC 高效液相色谱法
LC-MS 液相色谱法-质谱法
m 多重峰
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
MS 质谱法
MTBE 甲基叔丁基醚
NMR 核磁共振光谱法：化学位移(δ)以ppm给出。除非另有说明，否则通过将DMSO信号设置为2.50 ppm来校正化学位移。
PDA 光电二极管阵列
PoraPak<sup>TM</sup>； 可从Waters获得的HPLC柱
q 四重峰
r.t.或rt 室温
Rt 保留时间(用HPLC或UPLC测量)，以分钟计
s 单峰
SM 起始物质
SQD 单四极杆检测器
t 三重峰
td 三二重峰
dt 双三重峰
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
UPLC 超高效液相色谱法
对于技术人员来说，其它缩写具有它们本身的常规含义。
通过下列实施例说明本申请所描述的本发明的各个方面，所述实施例不意图以任何方式限制本发明。
具体实验描述
当它们出现在光谱中时，说明以下具体实验描述中的NMR峰形式，尚未考虑可能的更高阶的效应。采用微波辐照的反应可以用任选地配有机器人单元的Biotage Initator®微波炉进行。报道的采用微波加热的反应时间旨在理解为达到所示反应温度之后的固定反应时间。根据本发明的方法生产的化合物和中间体可能需要纯化。有机化合物的纯化是本领域技术人员众所周知的，并且可以存在纯化同一化合物的若干途径。在某些情况下，可能不需要纯化。在某些情况下，可以通过结晶来纯化化合物。在某些情况下，可以使用合适的溶剂来搅拌除去杂质。在某些情况下，所述化合物可以通过色谱法，特别是快速柱色谱法，使用例如预填充的硅胶小柱，例如来自Separtis的如Isolute®Flash硅胶或Isolute® FlashNH2硅胶以及Isolera®自动纯化仪(Biotage)和洗脱剂例如梯度的例如己烷/乙酸乙酯或DCM/甲醇来纯化。在某些情况下，可以通过制备型HPLC，例如使用配备有二极管阵列检测器和/或在线电喷雾电离质谱仪的Waters自动纯化仪以及合适的预填充的反相柱和洗脱剂例如梯度的水和乙腈(可含有添加剂如三氟乙酸、甲酸或氨水)来纯化化合物。在某些情况下，上述纯化方法可以提供具有足够碱性或酸性官能团的盐形式的本发明的那些化合物，例如，在本发明的化合物足够碱性的情况下，提供例如三氟乙酸盐或甲酸盐，或在本发明的化合物足够酸性的情况下，提供例如铵盐。这种类型的盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法分别转化为其游离碱或游离酸形式，或者作为盐用于随后的生物学测定。应该理解，如本文所述分离的本发明化合物的具体形式(例如，盐、游离碱等)不一定是其中所述化合物可以用于生物学测定以定量具体生物活性的唯一形式。
以下实施例中报道的收率百分比是基于以最低摩尔量使用的起始组分。大多数反应条件并未针对收率进行优化。通过注射器或导管转移空气和湿度敏感的液体和溶液，并且通过橡胶隔片将其引入反应容器。使用商业级试剂和溶剂而不进一步纯化。术语“真空浓缩”指在约15 mm Hg的最小压力下使用Buchi旋转蒸发仪。所有温度均以摄氏度(℃)报道，未校正。
为了可以更好地理解本发明，陈述以下实施例。这些实施例仅为了说明的目的，并不应解释为以任何方式限制本发明的范围。本文所提到的所有出版物均整体通过引用并入。
分析型LC-MS和UPLC-MS条件
在随后的具体实验描述中给出的LC-MS和UPLC-MS数据涉及(除非另外指出)下列条件：
方法A
仪器：Waters Acquity UPLC-MS SingleQuad；柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm，50x2.1mm；洗脱剂A：水+0.1体积%的甲酸(99%)，洗脱剂B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1-99% B，1.6-2.0 min 99%B；流速0.8 ml/min；温度：60℃；DAD扫描：210-400 nm。
方法B
仪器：Waters Acquity UPLC-MS SingleQuad；柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm，50x2.1mm；洗脱剂A：水+0.2体积%氨水(32%)，洗脱剂B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1-99% B，1.6-2.0 min 99%B；流速0.8 ml/min；温度：60℃；DAD扫描：210-400 nm。
快速柱色谱法条件
在随后的具体实验描述中所述的“通过(快速)柱色谱法纯化”是指使用BiotageIsolera纯化系统。关于技术规格，参见www.biotage.com上的“Biotage产品目录”。
一般实验程序
Figure DEST_PATH_IMAGE020
一般程序GP1.2
将磺酰胺A(例如1.29 mmol)溶于乙腈(在1.29 mmol规模的情况下为15 mL)中，并加入细粉状的碳酸钾(3.0 eq)和相应的唑(1.5 eq)。在100-110℃下继续搅拌直到TLC显示起始物质消耗。减压除去溶剂，然后加入水和二氯甲烷。之后，分离相，将有机相干燥并将其真空浓缩。粗物质不经进一步纯化即使用或如实施例所示纯化。
Figure DEST_PATH_IMAGE022
一般程序GP2.1
将粗制的硝基化合物B(例如1.29 mmol)溶于二噁烷(在1.29 mmol规模的情况下为15mL)中，并加入氯化锡(II)二水合物(3.0 eq)，并将反应混合物在70℃搅拌2h。冷却至室温后，将反应混合物过滤并真空浓缩。滤液不经进一步纯化即使用或如实施例所示纯化。
一般程序GP2.2
将粗制的硝基化合物B(例如1.29 mmol)溶于二噁烷(在1.29 mmol规模的情况下为15mL)中，并加入氯化锡(II)二水合物 (5.0 eq)，并将反应混合物在70℃搅拌2h。冷却至室温后，将反应混合物过滤并真空浓缩。滤液不经进一步纯化即使用或如实施例所示纯化。
Figure DEST_PATH_IMAGE024
一般程序GP3.4
将粗制的取代苯胺C (1.29 mmol)溶于二甲基甲酰胺(在1.29 mmol规模的情况下为10mL)中，然后加入相应的酸(如实施例所示的量)、N,N-二异丙基乙胺(2.0 eq，基于酸)和HATU(1.0 eq，基于酸)。将反应混合物在室温搅拌过夜或在50℃加热直至TLC显示起始物质消耗。冷却至室温后，将反应混合物真空浓缩。加入乙酸乙酯和水，将有机相干燥并真空浓缩。粗物质不经进一步纯化即使用。
一般程序GP3.5
将粗制的取代苯胺C (1.29 mmol)溶于二甲基甲酰胺(在1.29 mmol规模的情况下为10mL)中，然后加入相应的酸(如实施例所示的量)、N,N-二异丙基乙胺(4.0 eq，基于酸)和HATU(1.3 eq，基于酸)。将反应混合物在室温搅拌过夜或在50℃加热直至TLC显示起始物质消耗。冷却至室温后，将反应混合物真空浓缩。加入乙酸乙酯和水，将有机相干燥并真空浓缩。粗物质不经进一步纯化即使用。
Figure DEST_PATH_IMAGE026
一般程序GP4.1
将粗制的酰胺D (例如1.29 mmol)溶于二氯甲烷(在1.29 mmol规模的情况下为5-10mL)中，加入三氟乙酸(50 eq)，并将反应混合物在室温搅拌直至TLC显示起始物质消耗。将反应混合物真空浓缩，将乙酸乙酯和水加入到粗物质中，并将有机相干燥，并将溶剂减压除去。如实施例所示纯化所得残余物。也可以不进行水性萃取而纯化，但是使得HPLC纯化更加困难。
一般程序GP4.2
将粗制的酰胺D (例如1.29 mmol)溶于二氯甲烷/三氟乙酸2/1(在1.29 mmol规模的情况下为6mL)中，并将反应混合物在室温搅拌直至TLC显示起始物质消耗。将反应混合物真空浓缩，将乙酸乙酯和水加入到粗物质中，并将有机相干燥，并将溶剂减压除去。如实施例所示纯化所得残余物。也可以不进行水性萃取而纯化，但是使得HPLC纯化更加困难。
Figure DEST_PATH_IMAGE028
一般程序GP5.1
加入取代苯胺C (0.20 mmol，在0.4 mL 1-甲基-2-吡咯烷酮中)、相应的酸(0.40mmol，在0.8 mL 1-甲基-2-吡咯烷酮中)、HATU(0.40 mmol，在0.8 mL 1-甲基-2-吡咯烷酮中)、N-甲基吗啉(0.80 mmol，在0.267 mL 1-甲基-2-吡咯烷酮中，含有2.5%的4-二甲基氨基吡啶)的溶液并摇动过夜。然后，将其真空浓缩并将残余物重新溶于三氟乙酸/二氯甲烷3/1 (2mL，含有5%的水)。将反应混合物再次摇动过夜，然后真空浓缩并通过HPLC纯化。
Figure DEST_PATH_IMAGE030
一般程序GP6.1
将粗制的取代苯胺F (0.137 mmol)溶于二甲基甲酰胺(在0.137 mmol规模的情况下为2 mL)中，然后加入相应的酸(如实施例所示的量)、N,N-二异丙基乙胺(2.7 eq，基于酸)和HATU (1.0 eq，基于酸)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后真空浓缩。加入乙酸乙酯和水，将有机相干燥并真空浓缩。
将粗物质重新溶于甲醇(1 mL)中，用浓氨水(70μL)处理并搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，并如实施例所示纯化。
中间体的合成
2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE032
向2-氯-5-硝基苯磺酰氯(10.8 g，42.2 mmol)在二氯甲烷(108 mL)中的溶液中加入碳酸氢钠(7.09 g，84.4 mmol)和1-(2,4-二甲氧基苯基)甲胺(7.05 g，42.2 mmol)。将混合物搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，然后加入水(75 mL)和乙酸乙酯(75 mL)。搅拌10 min后，将所得沉淀物通过过滤分离，并将其在40℃真空干燥过夜，得到标题化合物(14.1 g，36.5 mmol，收率86%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.17 min; MS (ESIneg): m/z = 385 [M-H]-
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.56 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 4.08 (s,2H), 6.10 (d, 1H), 6.26 (dd, 1H), 7.04 (d, 1H), 7.79 (d, 1H), 8.19 (d, 1H),8.28 (dd, 1H), 8.45 (s, 1H)。
N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE034
向2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(5.69 g，14.7 mmol)在乙腈(170mL)中的溶液中加入4-(三氟甲基)-1 H-吡唑(3.00 g，22.1mmol)和粉状碳酸钾(6.09 g，44.1 mmol)，并将其在100℃搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用二氯甲烷和水萃取。有机相用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。减压浓缩得到粗制标题化合物(7.50 g，定量，纯度约95%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法B): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 487 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.52 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 4.15 (d,2H), 6.18 (d, 1H), 6.29 (dd, 1H), 7.08 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 8.03 - 8.09 (m,1H), 8.25 (d, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.49 (dd, 1H), 8.94 (s, 1H)。
2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE036
向2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(5.03 g，13.0 mmol)在乙腈(150mL)中的溶液中加入4-氯-1 H-吡唑(2.00 g，19.5 mmol))和粉状碳酸钾(5.39 g，39.0mmol)，并将其在100℃搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用二氯甲烷和水萃取。有机相用盐水洗涤并干燥。真空浓缩得到粗制标题化合物(6.27 g，定量，纯度约95%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 453 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.48 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 4.15 (s,2H), 6.14 (d, 1H), 6.27 (dd, 1H), 7.08 (d, 1H), 7.84 (d, 1H), 8.05 (s, 1H),8.09 (d, 1H), 8.21 (d, 1H), 8.45 (dd, 1H), 8.57 (s, 1H)。
N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(4-氟-1 H-吡唑-1-基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE038
向2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(5.00 g，11.6 mmol)在乙腈(135mL)中的溶液中加入4-氟-1H-吡唑(1.50 g，17.4 mmol))和粉状碳酸钾(4.82 g，34.9mmol)，并将其在100℃搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用二氯甲烷和水萃取。有机相用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。真空浓缩得到粗制标题化合物(5.54 g，定量，纯度约85%)，不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 437 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.48 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 4.13 (s,2H), 6.15 (d, 1H), 6.28 (dd, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 8.00 - 8.10 (m,2H), 8.23 (d, 1H), 8.43 (dd, 1H), 8.59 (s, 1H)。
2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE040
向2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(1.75 g，4.54 mmol)在乙腈(53 mL)中的溶液中加入4-溴-1H-吡唑(1.00 g，6.80 mmol)和粉状碳酸钾(1.88 g，13.6 mmol)，并将其在100℃搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用二氯甲烷和水萃取。有机相用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。真空浓缩得到粗制标题化合物(2.38 g，定量，纯度约95%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 497 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.48 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 4.13 (s,2H), 6.15 (d, 1H), 6.28 (dd, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.84 (d, 1H), 8.00 - 8.10 (m,2H), 8.23 (s, 1H), 8.43 (dd, 1H), 8.65 (s, 1H)。
2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE042
向2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(15.0 g，38.8 mmol)在乙腈(450mL)中的溶液中加入1H-吡唑-4-甲腈(5.41 g，93.1 mmol)和粉状碳酸钾(16.1 g，116mmol)，并将其在100℃搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用乙酸乙酯和水萃取。沉淀出纯的标题化合物，并将其滤出(9.09 g 20.5 mmol，收率53%，纯度97%)。有机相用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。真空浓缩得到另外的粗制标题化合物(9.11 g，纯度约60 %)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.17 min; MS (ESIneg): m/z = 442 [M-H]-
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.53 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 4.08 (s,2H), 6.20 (d, 1H), 6.29 (dd, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.89 (d, 1H), 8.12 (br s,1H), 8.30 (br s, 1H), 8.41 - 8.54 (m, 2H), 9.17 (br s, 1H)。
5-氨基-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE044
将Pd/C(10%负载，750 mg)加入到N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺(7.50 g，14.7 mmol)在甲醇(120 mL)中的溶液中，并在氢气气氛下于室温搅拌4h。加入一些乙酸乙酯以溶解沉淀的产物，然后过滤、洗涤并真空浓缩以得到粗制标题化合物(6.50 g，定量，纯度约95%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.20 min; MS (ESIpos): m/z = 457 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.70 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.94 (d,2H), 6.01 (s, 2H), 6.41 - 6.48 (m, 2H), 6.78 (dd, 1H), 7.09 - 7.14 (m, 2H),7.18 - 7.27 (m, 2H), 8.12 (s, 1H), 8.56 (s, 1H)。
5-氨基-2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE046
将Pt/C(10%负载，600 mg)加入到粗制2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(6.27 g，13.9 mmol)在乙醇(100 mL)中的溶液中并在氢气气氛下于室温搅拌24h。将催化剂滤出，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空浓缩，得到粗制标题化合物(5.99 g，定量，纯度约90%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 423 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.69 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.92 (d,2H), 5.95 (s, 2H), 6.41 - 6.47 (m, 2H), 6.76 (dd, 1H), 7.08 - 7.12 (m, 2H),7.15 (d, 1H), 7.19 (t, 1H), 7.78 (d, 1H), 8.15 (d, 1H)。
5-氨基-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(4-氟-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE048
将Pt/C(10%负载，1.76 g)加入到粗制N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-5-硝基苯磺酰胺(5.50 g，12.6 mmol)在乙醇(125 mL)和二噁烷(200 mL)的混合物中的溶液中，并在氢气气氛下于室温搅拌8h。将催化剂滤出，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空浓缩，得到粗制标题化合物(5.07 g，定量，纯度约90%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.10 min
MS (ESIpos): m/z = 407 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.69 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.92 (d,2H), 5.93 (s, 2H), 6.42 - 6.47 (m, 2H), 6.78 (dd, 1H), 7.08 - 7.19 (m, 4H),7.74 (dd, 1H), 8.07 (dd, 1H)。
5-氨基-2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE050
将Pt/C(10%负载，1.76 g)加入到粗制2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(5.60 g，12.8mmol)在乙醇(140 mL)中的溶液中，并在氢气气氛下于室温搅拌14h。将催化剂滤出，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空浓缩，得到粗制标题化合物(1.87 g，定量，纯度约90%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 467 (M+H)+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.69 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.92 (d,2H), 5.95 (s, 2H), 6.39 - 6.48 (m, 2H), 6.77 (dd, 1H), 7.08 - 7.23 (m, 4H),7.79 (d, 1H), 8.15 (d, 1H)。
2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE052
将1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(3.02 g，25.4 mmol)加入到2-氯-5-硝基苯磺酰胺(3.00 g，12.7 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(43 mL)中的溶液中并在室温搅拌2天。将反应混合物真空浓缩并将残余物用二氯甲烷/水萃取。有机相用盐水洗涤并干燥。真空浓缩得到粗制标题化合物(4.18 g，定量，纯度约90%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 292 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 2.94 - 2.96 (m, 3H), 3.20 (s, 3H), 7.91(d, 1H), 8.31 - 8.33 (m, 1H), 8.39 (dd, 1H), 8.69 (d, 1H)。
N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基-2-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE054
将2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(1.10 g，3.77 mmol)溶于脱气的正丙醇(33 mL)中，并用[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]硼酸(1.08 g，5.68 mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(132 mg，0.189 mmol)和三苯基膦(49.5 mg，0.189 mmol)处理。加入脱气的2M碳酸钾水溶液(5.65 mL)，将小瓶密封并在100℃搅拌16小时。冷却至室温后，加入水，并将其用乙酸乙酯萃取3次，然后真空浓缩。
如先前所述，通过在室温下在NDMF中与1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺一起搅拌，将部分脱保护的靶分子再次保护。将反应混合物真空浓缩并将残余物通过制备型HPLC(Chromatorex C-18 10µm，125x30mm，乙腈/水+0.1%氨水(32%))纯化，得到标题化合物(174mg，0.432 mmol，收率11%，纯度95%)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 403 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 2.76 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 7.76 (s,1H), 7.81 (d, 1H), 8.33 - 8.36 (m, 1H), 8.52 (dd, 1H), 8.76 (d, 1H), 8.88 (d,1H), 9.09 (dd, 1H)。
5-氨基-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-2-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE056
将Pd/C(10%负载，21 mg)加入到N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基-2-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯磺酰胺(174 mg，0.39 mmol)在甲醇(10 mL)和二噁烷(10 mL)的混合物中的溶液中，并在氢气气氛下于室温搅拌过夜。将催化剂滤出，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空浓缩，得到标题化合物(140 mg，定量，纯度95%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]+。
2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE058
将2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(1.00 g，3.43 mmol)溶于脱气的正丙醇(30 mL)中，并用1-(二氟甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(1.25 g，5.14 mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(121 mg，0.171 mmol)和三苯基膦(45.0 mg，0.171 mmol)处理。加入脱气的2M碳酸钾水溶液(5.14 mL)，将小瓶密封并在100℃搅拌16小时。冷却至室温后，加入水，并将其用乙酸乙酯萃取3次，然后真空浓缩。
将残余物再次溶于甲醇(25 mL)和正丙醇(25 mL)的混合物中并加入浓氨水(50mL)以完全脱保护靶分子以便更容易纯化。反应混合物用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取。将有机相干燥，然后真空浓缩，并通过制备型HPLC(Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.1%氨水(32%))纯化，得到2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-5-硝基苯磺酰胺(383 mg)。
接下来，如先前所述，通过在室温下在DMF中与 1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺一起搅拌，将脱保护的靶分子再次保护。真空浓缩得到标题化合物(418 mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法B): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 374 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 2.76 (d, 3H), 3.02 (s, 3H), 7.85 (d,1H), 7.91 - 7.93 (m, 2H), 7.95 (t, 1H), 8.19 - 8.21 (m, 1H), 8.43 (dd, 1H),8.72 (d, 1H), 8.77 (d, 1H)。
5-氨基-2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE060
将Pd/C(10%负载，54 mg)加入到2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(418 mg，1.01mmol)在甲醇(10 mL)和二噁烷(10 mL)的混合物中的溶液中，并在氢气气氛下于室温搅拌过夜。将催化剂滤出，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空浓缩，得到粗制标题化合物(370 mg，定量，纯度90%)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS(方法A)：Rt = 0.74 min；m/z(MH+)。MS(ESIpos)：m/z=344 [M+H]+。
2-溴-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE062
将2-溴-5-硝基苯磺酰氯(20.0 g，66.6 mmol)溶于1,4-二噁烷(100 ml)中并冷却至0℃。缓慢加入氨水(400 ml，0.50 M，200 mmol)，并在室温下继续搅拌直至反应完成。减压除去溶剂，并加入二氯甲烷。用水洗涤有机相3次。过滤悬浮液(固体为产物)，并将有机相用盐水洗涤。合并的有机相经硫酸钠干燥，并减压除去溶剂。将粗物质从乙醚中重结晶，得到16.4 g(纯度93%，收率88%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.45 min; MS (ESIpos): m/z = 281 [M+H]+ 。
2-溴-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE064
在室温下将2-溴-5-硝基苯磺酰胺(16.4 g，58.3 mmol)溶于DMF (200 ml)中，并加入1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(15 ml，120 mmol)。继续搅拌直至反应完成。减压除去溶剂，并将粗物质在二氯甲烷和盐水之间分配。有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(19.2 g，纯度78%，收率98%)。
LC-MS (方法A): Rt = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 336 [M+H]+ 。
5-氨基-2-溴-N-[(二甲基氨基)亚甲基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE066
将2-溴-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(12.7 g，37.8 mmol)溶于甲醇(170 ml)中，并将烧瓶用氮气冲洗。加入铂/炭(5%负载，1.61 g，8.26 mmol)，并将烧瓶抽空，并且随后用氢气(1巴)冲洗。在室温下继续搅拌直至反应完成。经硅藻土过滤反应混合物，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(5.5 g，纯度76%，收率59%)。
LC-MS (方法A): Rt = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 306 [M+H]+ 。
N-(4-溴-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)-2-(2-氯苯基)乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE068
将5-氨基-2-溴-N-[(二甲基氨基)亚甲基]苯磺酰胺(4.85 g，15.8 mmol)溶于DMF(100 ml)中，并加入(2-氯苯基)乙酸(3.24 g，19.0 mmol)，然后加入N,N-二异丙基乙胺(13ml，79 mmol)和HATU (9.64 g，25.3 mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌3h。减压除去溶剂，并加入乙酸乙酯和水。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。将粗物质悬浮于二氯甲烷中并过滤，除去溶剂，并且粗物质不经进一步纯化即用于下一步(15.7 g)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 458 [M+H]+ 。
该中间体也可以以HCl盐的形式使用。
5-氨基-2-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE070
将2-氯-5-硝基苯磺酰胺(674 mg，2.85 mmol)和1-环丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(1.00 g，4.27 mmol)溶于正丙醇(34 ml)并加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(CAS 13965-03-2)(100 mg，142μmol)和三苯基膦(37.3 mg，142μmol)。将反应用氩气吹扫5分钟，并加入碳酸钾水溶液(5.7 ml，1.0 M，5.7 mmol)。反应在100℃加热3h。之后，将混合物经硅藻土过滤，并减压除去溶剂。加入乙酸乙酯和水。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步。
将2-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-5-硝基苯磺酰胺(1.17 g，3.79 mmol)和1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(1.0 ml，7.6 mmol)溶于DMF (25 ml)中并在室温下搅拌反应直至反应完成。减压除去溶剂，并且粗物质不经进一步纯化即用于下一步。
将2-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(1.84 g，5.06 mmol)溶于THF(30 ml)中，并用氮气冲洗烧瓶。加入钯/炭(10%负载，53.9 g，506 µmol)，并抽空烧瓶，并且随后用氢气(1巴)冲洗。在室温下继续搅拌直至反应完成。经硅藻土过滤反应混合物，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(1.3 g，纯度53%，3步收率75%)。
LC-MS (方法A): Rt = 0.70 min; MS (ESIpos): m/z = 334 [M+H]+ 。
5-氨基-2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE072
将2-溴-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(800 mg，2.3 mmol)和1-(二氟甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(700 mg，2.87 mmol)溶于正丙醇(15 ml)中并加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(CAS 13965-03-2)(84 mg，119 µmol)和三苯基膦(31 mg，119 µmol)。将溶液用氩气吹扫5分钟，并加入碳酸钾水溶液(3.6ml，2.0 M，7.2 mmol)。将反应在100℃加热16h。加入水和乙酸乙酯。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步。
将2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-硝基苯磺酰胺(2.16 g，5.79 mmol)溶于四氢呋喃(50 ml)中并加入铂/炭(5%负载，307 mg，1.57 mmol)。将烧瓶抽空3次并用氢气(1巴)冲洗。将反应在室温下搅拌4h。根据UPLC-MS，反应未完成，并加入相同量的铂/炭，并将反应在氢气气氛下再搅拌16h。之后，将混合物经硅藻土过滤，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步。
将5-氨基-2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]苯磺酰胺(670 mg，1.95 mmol)溶于甲醇(25 ml)中并在室温下用25%氨水溶液(25 ml)处理直至反应完成。减压除去溶剂，并将粗物质通过硅胶色谱法(Biotage，梯度二氯甲烷/乙酸乙酯)和随后的HPLC纯化 (Waters XBrigde C18 5μ100x30mm，乙腈/水+0.1%甲酸)纯化，得到53 mg(纯度99%，3步收率9%)。重复反应，并将粗物质用于使用该中间体的下一步骤。
LC-MS (方法B): Rt = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 289 [M+H]+ 。
5-溴-2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE074
将5-溴-2-氯吡啶-3-磺酰胺(3.86 g，14.2 mmol)和1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(3.8 ml，28 mmol)溶于DMF(40 ml)中并在室温搅拌2h。减压除去溶剂，并加入二氯甲烷和盐水。分离相，并且用水洗涤有机相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(5.12 g)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 326 [M+H]+ 。
2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE076
将5-溴-2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺(5.00 g，15.3 mmol)、1,1-二苯基甲亚胺(3.9 ml，23 mmol)、XantPhos (886 mg，1.53 mmol)和乙酸钯(II)(172 mg，765μmol)溶于二噁烷(150 ml)中。将溶液用氩气吹扫5分钟，并加入碳酸铯(15.0 g，45.9mmol)。将反应在100℃加热1h。之后，减压除去溶剂，并加入水和乙酸乙酯。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。一半的粗物质不经进一步纯化即使用，并将3 g粗物质通过在氨涂覆的硅胶上的色谱法(Biotage，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到1.00 g(纯度78%，收率15%，基于起始物质的总量)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 427 [M+H]+ 。
2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE078
将2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺(1.50 g，3.51 mmol，粗物质)和1-(二氟甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(1.71 g，7.03 mmol)溶于正丙醇(30 ml)/DMF(15 ml)中，并加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(CAS 13965-03-2)(371 mg，527μmol)、三苯基膦(225 mg，0.85 mmol)、氟化钾(408 mg，7.03 mmol)和磷酸钾水溶液(1.8 ml，2.0 M，3.5 mmol)。将溶液用氩气吹扫5分钟，并将反应在微波(1巴/30W)中于100℃加热1h。减压除去溶剂，并加入水和乙酸乙酯。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质通过在氨涂覆的硅胶上的色谱法(Biotage，己烷/乙酸乙酯)纯化(1.54 g，纯度65%，收率86%)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 509 [M+H]+ 。
5-氨基-2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE080
将2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺(1.54 g，3.03 mmol)溶于二噁烷(15 ml)中并加入HCl水溶液(2.0ml，3.0 M，6.1 mmol)。将反应在室温下搅拌1h。减压除去溶剂，并且粗物质不经进一步纯化即用于下一步(2.45 g)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.66 min; MS (ESIpos): m/z = 345 [M+H]+ 。
5-氨基-2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE082
将2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺(1.00 g，2.34 mmol)溶于DMSO(18 mL)中。加入4-氯-1H-吡唑(480 mg，4.69 mmol)、碘化钾(389 mg，2.34 mmol)和磷酸钾(746 mg，3.51 mmol)，并将反应混合物在100℃搅拌过夜。之后将其真空浓缩，用二氯甲烷/水萃取，并且有机相用盐水洗涤，并经硫酸钠干燥，然后真空浓缩。
由于部分脱保护，将物质重新溶于DMF(2 mL)中，并与1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(0.5 mL)一起搅拌过夜。搅拌过夜得到沉淀物，将其通过过滤除去(229 mg纯的2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺)。将滤液真空浓缩，用二氯甲烷/水萃取，并且有机相用盐水洗涤，并经硫酸钠干燥，然后真空浓缩，得到粗制的2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺(549 mg)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.31 min, MS (ESIpos): m/z = 493 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 2.80 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 7.27 - 7.33(m, 2H), 7.38 - 7.44 (m, 3H), 7.49 - 7.56 (m, 2H), 7.58 - 7.64 (m, 1H), 7.67(s, 1H), 7.69 - 7.76 (m, 2H), 7.79 - 7.83 (m, 2H), 8.17 (d, 1H), 8.32 (d,1H)。
将来自先前步骤的纯物质(229 mg)溶于二噁烷(2.0 mL)，并加入2M HCl/二噁烷(1.00 mL，2.00 mmol)，然后搅拌过夜。将其真空浓缩并用乙酸乙酯/水萃取。有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩，得到粗制标题化合物(200 mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法A): Rt = 0.71 min, MS (ESIpos): m/z = 329 [M+H]+。
5-氨基-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE084
反应以1g规模进行3次。将2-氯-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-5-[(二苯基亚甲基)氨基]吡啶-3-磺酰胺(3.00 g，7.03 mmol)和4-(三氟甲基)-1H-吡唑(1.43 g，10.5 mmol)溶于DMSO(110 ml，1.6 mol)，并加入碘化钾(583 mg，3.51 mmol)和磷酸钾(2.24 g，10.5mmol)。将反应在微波中于100℃加热5h。之后，将固体滤出，并向滤液中加入乙酸乙酯和水。有机相用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并将粗物质通过硅胶色谱法(Biotage，乙酸乙酯/己烷)纯化，得到15.7 g(收率424%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 472 [M+H]+ 。
将5-[(二苯基亚甲基)氨基]-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-磺酰胺(3.50 g，7.42 mmol)溶于1,4-二噁烷(100 ml)中并加入HCl(4.9 ml，3.0 M，15 mmol)。将反应在室温下搅拌2h。减压除去溶剂，并将粗物质在乙酸乙酯和水之间分配。之后，将有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。将粗物质溶于乙腈和水，并冻干过夜。
LC-MS (方法B): Rt = 0.56 min; MS (ESIpos): m/z = 307 [M+H]+ 。
2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-5-硝基苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE086
将2-氯-5-硝基苯磺酰胺(250 mg，1.06 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，然后加入1H-吡唑-4-甲腈(148 mg，1.59 mmol)和细粉状碳酸钾(438 mg，3.17 mmol)。将反应混合物在100℃搅拌过夜。冷却至室温后，加入二氯甲烷和水，并且有机相用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩。通过制备型HPLC (Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.1%甲酸)纯化，得到标题化合物(128 mg，0.436 mmol，收率41%，纯度70%)。
LC-MS (方法A): Rt = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 294 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 7.94 (br d, 2H), 7.98 (d, 1H), 8.42 (d,1H), 8.61 (dd, 1H), 8.83 (d, 1H), 9.04 (d, 1H)。
5-氨基-2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE088
将2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-5-硝基苯磺酰胺(128 mg，0.44 mmol)溶于甲醇(17 mL)和二噁烷(3 mL)中。将烧瓶抽空并用氮气冲洗，然后加入钯/炭(13 mg，10%负载)。再次将其抽空，此时用氢气冲洗，然后在氢气气氛下于室温搅拌5h。除去氢气，将催化剂滤出，并将滤液真空浓缩。将其重新溶于二氯甲烷中，并再次真空浓缩，得到标题化合物(81 mg，0.308mmol，收率70%，纯度79%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.46 min; MS (ESIpos): m/z = 264 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 6.06 (s, 2H), 6.77 (dd, 1H), 7.17 -7.23 (m, 4H), 8.23 (d, 1H), 8.71 (d, 1H)。
实施例的合成
实施例19
2-(2-氯苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE090
将5-氨基-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺(22.3g，48.9 mmol)溶于DMF(460 mL)中，然后加入(2-氯苯基)乙酸(12.5 g，73.3 mmol)、N,N-二异丙基乙胺(25.3 g，195 mmol)和HATU(27.9 g，73.3 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其真空浓缩，并用二氯甲烷和水萃取。有机相用碳酸氢钠溶液、盐水和氯化铵溶液洗涤，经硫酸钠干燥并再次真空浓缩。受保护的产物在用氯化铵洗涤期间已经部分沉淀，并且在用硫酸钠干燥之前将其除去。
将残余物和沉淀物都溶于二氯甲烷(150 mL)中，并用三氟乙酸(75 mL)处理，然后在室温下搅拌过夜。
同样，产物已经部分沉淀并被除去。真空浓缩剩余溶液，并用二氯甲烷和水萃取。有机相用碳酸氢盐溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并且最后真空浓缩。在水性后处理期间，产物再次部分沉淀。将合并的沉淀级分与有机相的浓缩级分合并，并通过从回流的乙酸乙酯中结晶而纯化，得到标题化合物(12.3 g，26.8 mmol，2步收率55%，纯度98%)。
LC-MS (方法B): Rt = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 3.92 (s, 2H), 7.30 - 7.37 (m, 2H), 7.42- 7.48 (m, 4H), 7.60 (d, 1H), 7.98 (dd, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.39 (d, 1H), 8.74(s, 1H), 10.83 (s, 1H)。
实施例20
2-(2-氟苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE092
将5-氨基-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺(350mg，0.767 mmol)溶于DMF(15 mL)中，然后加入(2-氟苯基)乙酸(130 mg，0.843 mmol)、N,N-二异丙基乙胺(496 mg，3.83 mmol)和HATU(466 mg，1.23 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其真空浓缩，并用二氯甲烷和水萃取。用盐水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，并再次真空浓缩。
将残余物溶于二氯甲烷(10 mL)中，并用三氟乙酸(4.37 g，38.3 mmol)处理，然后在室温下搅拌过夜。将其真空浓缩并通过制备型HPLC(Chromatorex C-18 10µm，125x30mm，乙腈/水+0.1%甲酸)%))纯化，得到标题化合物(60.5 mg，0.137 mmol，2步收率18%，纯度98%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 443 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm] 3.82 (s, 2H), 7.17 - 7.23 (m, 2H), 7.31- 7.49 (m, 4H), 7.60 (d, 1H), 7.98 (dd, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.39 (d, 1H), 8.74(s, 1H), 10.82 (s, 1H)。
实施例24
2-(2-氯苯基)-N-[4-(3-氯-1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE094
根据一般程序GP1.2、GP2.1、GP3.4和GP4.2，将2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(500 mg，1.29 mmol)、3-氯-1H-1,2,4-三唑(201 mg，1.94 mmol)和(2-氯苯基)乙酸(203 mg，1.19 mmol)转化为标题化合物而不纯化中间体，并且最后通过制备型HPLC(Waters XBridge C18 5µ 100x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化(9 mg，0.0211 mmol，4步收率2%，纯度97%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.70 min; MS (ESIpos): m/z = 426 [M+H]+
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.92 (s, 2H), 7.31 - 7.35 (m, 2H), 7.43- 7.49 (m, 2H), 7.60 (s, 2H), 7.62 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 8.42 (d, 1H), 8.81(s, 1H), 10.87 (s, 1H)。
实施例25
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE096
根据一般程序GP1.2、GP2.1、GP3.4和GP4.2，将2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(500 mg，1.29 mmol)、4-氯-1H-吡唑(199 mg，1.94 mmol)和(2-氯苯基)乙酸(313mg，1.83 mmol)转化为标题化合物而不纯化中间体，并且最后通过制备型HPLC(WatersXBridge C18 5µ 100x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化(55 mg，0.129 mmol，4步收率10%，纯度99%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 425 [M+H]+
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.91 (s, 2H), 7.31 - 7.37 (m, 2H), 7.41(s, 2H), 7.44 - 7.49 (m, 2H), 7.55 (d, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.97 (dd, 1H), 8.35(d, 1H), 8.38 (d, 1H), 10.81 (s, 1H)。
实施例26
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE098
根据一般程序GP1.2、GP2.1、GP3.4和GP4.2，将2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(500 mg，1.29 mmol)、4-氟-1H-吡唑(167 mg，1.94 mmol)和(2-氯苯基)乙酸(151mg，1.89 mmol)转化为标题化合物而不纯化中间体，并且最后通过制备型HPLC(WatersXBridge C18 5µ 100x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化(43 mg，0.105 mmol，4步收率8%，纯度97%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 409 [M+H]+
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.91 (s, 2H), 7.30 - 7.37 (m, 2H), 7.39(s, 2H), 7.43 - 7.50 (m, 2H), 7.53 (d, 1H), 7.84 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 8.26(d, 1H), 8.37 (d, 1H), 10.79 (s, 1H)。
实施例28
N-[4-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]-2-(2-氯苯基)乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE100
根据一般程序GP1.2、GP2.2、GP3.5和GP4.1，将2-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(400 mg，1.03 mmol)、4-溴-1H-吡唑(228 mg，1.55 mmol)和(2-氯苯基)乙酸(264mg，1.55 mmol)转化为标题化合物而不纯化中间体，并且最后通过制备型HPLC(WatersXBridge C18 5µ 100x30mm，乙腈/水+0.1%甲酸)纯化(27 mg，0.0575 mmol，4步收率6%，纯度95%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 469/471 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.90 (s, 2H), 7.29 - 7.36 (m, 2H), 7.41(s, 2H), 7.42 - 7.48 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.87 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 8.34(d, 1H), 8.37 (d, 1H), 10.80 (s, 1H)。
实施例39
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE102
方法1：将 Pd/C(10%负载，350 mg)加入到2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-5-硝基苯磺酰胺(9.09 g，20.5 mmol)在甲醇(120 mL)和四氢呋喃(250 mL)的混合物中的溶液中，并在室温下在氢气流下搅拌3h。过滤除去催化剂，然后用四氢呋喃洗涤并真空浓缩滤液。将其用乙酸乙酯/水萃取。加入碳酸钠溶液，并将其搅拌过夜。通过过滤除去所得沉淀物并丢弃。分离有机相，经硫酸钠干燥并真空浓缩，得到粗制5-氨基-2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)苯磺酰胺(6.37 g)，将其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法B): Rt = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 414 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.69 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.92 (br d,2H), 6.04 (s, 2H), 6.40 - 6.48 (m, 2H), 6.78 (dd, 1H), 7.08 - 7.14 (m, 2H),7.19 (d, 1H), 7.27 (br t, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.70 (s, 1H)。
将来自先前步骤的粗物质(6.37 g)溶于DMF(87 mL)中，然后加入(2-氯苯基)乙酸(3.94 g，23.1 mmol)、N,N-二异丙基乙胺(5.97 g，46.2 mmol)和HATU(8.78 g，23.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌整个周末。然后将其真空浓缩并用乙酸乙酯和水萃取。有机相用氯化铵、碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并再次真空浓缩，得到粗制的2-(2-氯苯基)-N-{4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-[(2,4-二甲氧基苄基)-氨磺酰基]苯基}乙酰胺(9.77 g)，其不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS (方法B): Rt = 1.27 min; MS (ESIpos): m/z = 566 [M+H]+。
将来自先前步骤的粗物质(9.77 g)溶于二氯甲烷(30 mL)和三氟乙酸(15 mL)的混合物中，并在室温下搅拌过夜。将其真空浓缩，溶于二氯甲烷，并再次真空浓缩以除去残留的三氟乙酸。然后将其在二氯甲烷/水的混合物中搅拌整个周末。通过过滤除去所得沉淀物，并得到纯的标题化合物(5.40 g，13.0 mmol，3步收率63%，纯度97%)。通过从乙酸乙酯/己烷中重结晶可进一步提高纯度。
LC-MS (方法B): Rt = 0.84 min, MS (ESIpos): m/z = 416 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.91 (s, 2H), 7.29 - 7.36 (m, 2H), 7.42- 7.49 (m, 4H), 7.58 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.39 (d, 1H), 8.86(d, 1H), 10.84 (br s, 1H)。
方法2：将 5-氨基-2-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺(81 mg，0.31 mmol)溶于二甲基甲酰胺(1 mL)中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(119 mg，0.92 mmol)、(2-氯苯基)乙酸(63 mg，0.37 mmol)和HATU(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(140 mg，0.37 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其真空浓缩，加入乙酸乙酯和水，并且有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩。通过制备型HPLC (Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.1%氨水(32%))纯化，得到标题化合物(33 mg，0.0794 mmol，收率26%，纯度50%)。
实施例170
N-[4-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE104
根据一般程序GP5.1，将5-氨基-2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(2,4-二甲氧基苄基)苯磺酰胺(0.20 mmol)和(4-甲氧基苯基)乙酸(0.40 mmol)转化为标题化合物(12.2 mg，0.0290mmol，收率14%，纯度100%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 421 [M+H]+。
实施例321
N-{6-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-5-氨磺酰基吡啶-3-基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE106
将5-氨基-2-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺(400 mg，1.16 mmol)溶于DMF(10 ml)中，并加入(2-氟苯基)乙酸(179 mg，1.16 mmol)，然后加入N,N-二异丙基乙胺(1.0 ml，5.8 mmol)和HATU(530 mg，1.39 mmol)。将反应在室温下搅拌2h。减压除去溶剂，并加入乙酸乙酯和水。分离相，并且用乙酸乙酯洗涤水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。通过HPLC(Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化粗物质，得到30.0 mg(收率5%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 481 [M+H]+。
将N-(6-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-5-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}吡啶-3-基)-2-(2-氟苯基)乙酰胺(30.0 mg，62.4 μmol)溶于氨/甲醇(10 ml，7 M)并在室温下搅拌。之后减压除去溶剂，并通过HPLC(Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化粗物质，得到标题化合物(10.1 mg，纯度99%，收率38%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.66 min; MS (ESIpos): m/z = 426 [M+H]+
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.83 (s, 2H), 7.15 - 7.24 (m, 2H),7.31 - 7.38 (m, 1H), 7.42 (td, 1H), 7.71 - 8.07 (m, 3H), 8.29 (s, 1H), 8.70(s, 1H), 8.78 (d, 1H), 8.93 (d, 1H), 10.86 (s, 1H)。
实施例326
2-(2-氯苯基)-N-{4-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-3-氨磺酰基苯基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE108
将N-(4-溴-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)-2-(2-氯苯基)乙酰胺(1.50g，3.27 mmol)、1-(二氟甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷环戊烷-2-基)-1H-吡唑(958 mg，3.92 mmol)和氟化钾(418 mg，7.19 mmol)溶于DMF(36 ml)中。混合物用氩气吹扫5分钟，然后加入双(三叔丁基膦)钯(0)(CAS 53199-31-8)(83.5 mg，163 μmol)。将反应在100℃加热1h，经玻璃纤维过滤器过滤，并重复该程序。之后，减压除去溶剂，并加入乙酸乙酯和水。分离相，并且用乙酸乙酯洗涤水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(2.78 g)。
将2-(2-氯苯基)-N-(4-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)乙酰胺(2.78 g，5.61 mmol)溶于甲醇(90 ml)中，并在室温下用25%氨水溶液(90 ml)处理直至反应完成。减压除去溶剂，并将粗物质通过硅胶色谱法(Biotage，8%乙醇/二氯甲烷)纯化，并且随后通过HPLC(Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化，得到标题化合物(1.09 g，纯度99%，2步34%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 441 [M+H]+
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.89 (s, 2H), 7.31 - 7.35 (m, 2H),7.41 (s, 2H), 7.43 - 7.50 (m, 3H), 7.69 - 8.00 (m, 2H), 8.02 (m, 1H), 8.36(d, 1H), 8.43 (m, 1H), 10.65 (s, 1H)。
实施例331
2-(2-氯苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE110
将N-(4-溴-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)-2-(2-氯苯基)乙酰胺(500mg，1.09 mmol)和[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]硼酸(520 mg，2.72 mmol)溶于正丙醇(15 ml)中，并加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(CAS 13965-03-2)(38.4 mg，54.5 µmol)、三苯基膦(14.3 mg，54.5μmol)、氟化钾(23.1 mg，270μmol)和碳酸钾水溶液(1.4 ml，2.0 M，2.7mmol)。将反应在微波(1巴/15W)中于100℃加热1h。之后，将混合物经硅藻土过滤，减压除去溶剂，并将粗物质与THF共同蒸馏，并且不经进一步纯化即用于下一步。
将2-(2-氯苯基)-N-(3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}-4-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯基)乙酰胺(1.50 g，2.86 mmol)溶于甲醇(29 ml)中，并在80℃下用32%氢氧化钠水溶液(1.6 ml)处理直至反应完成。减压除去溶剂，将粗物质溶于二氯甲烷中并用水洗涤。分离相，并且合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质通过硅胶色谱法(Biotage，40%乙酸乙酯/己烷)纯化，并且随后通过HPLC(Chromatorex C-18 10µm，125x30mm，乙腈/水+0.1%甲酸)纯化，得到标题化合物(562 mg，纯度95%，两步收率40%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.13 min; MS (ESIneg): m/z = 468 [M-H]-
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.91 (s, 2H), 7.28 - 7.37 (m, 2H),7.39 (d, 1H), 7.42 - 7.51 (m, 4H), 7.88 (dd, 1H), 8.10 - 8.16 (m, 1H), 8.40(d, 1H), 8.81 (d, 1H), 8.96 (d, 1H), 10.73 (s, 1H)。
实施例349
2-(2-氯苯基)-N-[4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE112
将N-(4-溴-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)-2-(2-氯苯基)乙酰胺(500mg，1.09 mmol)、1-环丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(510 mg，2.18 mmol)和氟化钾(139 mg，2.4 mmol)溶于干燥和脱气的DMF(30 ml)中，并且溶液用氩气再吹扫5分钟，然后加入双(三叔丁基膦)钯(0)(CAS 53199-31-8)(28 mg，54 μmol)。将反应在100℃加热2h。之后，将混合物经硅藻土过滤，减压除去溶剂，并且粗物质不经进一步纯化即用于下一步。
将2-(2-氯苯基)-N-[4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基]乙酰胺(560 mg，1.15 mmol)溶于甲醇(54 ml)中，并在80℃下用32%氢氧化钠水溶液(560μl)处理直至反应完成。减压除去溶剂，并通过硅胶色谱法(Biotage，乙酸乙酯/己烷)纯化，并且随后通过HPLC(Waters XBrigde C18 5μ100x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化，得到标题化合物(192 mg，纯度95%，两步收率37%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.96 min; MS (ESIneg): m/z = 429 [M-H]-
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 0.94 - 1.01 (m, 2H), 1.05 - 1.10 (m,2H), 3.67 - 3.80 (m, 1H), 3.88 (s, 2H), 7.19 (s, 2H), 7.30 - 7.35 (m, 2H),7.40 - 7.48 (m, 3H), 7.67 (d, 1H), 7.81 (dd, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.31 (d, 1H),10.57 (s, 1H)。
实施例360
2-(2-氯苯基)-N-[4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE114
将N-(4-溴-3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}苯基)-2-(2-氯苯基)乙酰胺(900mg，1.96 mmol)和1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(490 mg，2.35 mmol)溶于DMF(25 ml)中，然后加入氟化钾(251 mg，4.32 mmol)。将溶液用氩气吹扫5分钟并加入双(三-叔丁基膦)钯(0)(CAS 53199-31-8)(50.1 mg，98.1 μmol)。将反应在100℃加热1h。经由玻璃纤维过滤器过滤混合物，并减压除去溶剂。使粗物质再次经受上述反应程序。之后，减压除去溶剂，并加入乙酸乙酯和水。分离相，并且用乙酸乙酯萃取水相。合并的有机相经Whatmanfilter干燥，并减压除去溶剂。粗物质不经进一步纯化即用于下一步(2.39 g)。
将2-(2-氯苯基)-N-[3-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基]乙酰胺(2.39 g，5.20 mmol)溶于甲醇(80 ml)中，并在室温下用25%氨水溶液(80 ml)处理。UPLC表明反应不完全，加入25%氨水溶液(80 ml)并继续搅拌直到反应完成。减压除去溶剂，并将粗物质通过硅胶色谱法(Biotage，10%乙醇/二氯甲烷)纯化，然后通过HPLC(Waters XBrigde C18 5μ100x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化，得到标题化合物(327 mg，纯度98%，2步收率15%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.86 min; MS (ESIneg): m/z = 403 [M-H]-
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.78 - 3.96 (m, 5H), 7.17 (s, 2H),7.28 - 7.37 (m, 2H), 7.38 - 7.52 (m, 3H), 7.66 (d, 1H), 7.82 (dd, 1H), 7.96(s, 1H), 8.32 (d, 1H), 10.57 (s, 1H)。
实施例380
2-(2-氯苯基)-N-{5-氨磺酰基-6-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE116
将5-氨基-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-磺酰胺(250 mg，690μmol)和(2-氯苯基)乙酸(177 mg，1.03 mmol)溶于DMF(10 ml)中，并依次加入N,N-二异丙基乙胺(600 µl，3.4 mmol)和2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物(310μl，1.0 mmol)。反应在室温搅拌过夜。之后，减压除去溶剂，并加入乙酸乙酯和水。分离相，并且经Whatmanfilter干燥有机相。减压除去溶剂，并且将粗物质不经进一步纯化即用于下一步(400 mg)。
将2-(2-氯苯基)-N-(5-{[(二甲基氨基)亚甲基]氨磺酰基}-6-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-基)乙酰胺(400 mg，777μmol)溶于甲醇(37 ml)中，并在50℃下用40%氢氧化钠水溶液(24μl，1.9 mmol)处理1h。之后，减压除去溶剂，并将粗物质通过HPLC色谱法(Chromatorex C-18 10μm，125x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))纯化，得到3.8 mg标题化合物(纯度95%，2步收率1%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 460 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.95 (s, 2H), 7.29 - 7.39 (m, 2H),7.43 - 7.52 (m, 2H), 7.61 (s, 2H), 8.24 (s, 1H), 8.86 (d, 1H), 8.91 (d, 1H),8.97 (d, 1H), 11.06 (s, 1H)。
实施例381
2-(2-氟苯基)-N-{5-氨磺酰基-6-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-基}乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE118
与实施例380类似，从5-氨基-N-[(二甲基氨基)亚甲基]-2-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-磺酰胺(250 mg， 690 μmol)开始，分两步在HPLC纯化(Chromatorex C-18 10µm，125x30mm，乙腈/水+0.2%氨水(32%))后，得到标题化合物(12.8 mg，纯度90%，收率4%)。
LC-MS (方法B): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 444 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.85 (s, 2H), 7.13 - 7.26 (m, 2H),7.29 - 7.47 (m, 2H), 7.61 (s, 2H), 8.23 (s, 1H), 8.86 (d, 1H), 8.91 (d, 1H),8.97 (s, 1H), 11.04 (s, 1H)。
实施例387
2-(2-氯苯基)-N-[6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-5-氨磺酰基吡啶-3-基]乙酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE120
根据一般程序GP6.1，将粗制5-氨基-2-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-[(二甲基氨基)亚甲基]吡啶-3-磺酰胺(100 mg)和(2-氯苯基)乙酸(77.8 mg，0.46 mmol)转化为标题化合物而不纯化中间体。标题化合物在反应期间沉淀并通过过滤获得，无需进一步纯化(38 mg，0.0891 mmol，5步收率27%，纯度99%)。
LC-MS (方法A): Rt = 1.13 min, MS (ESIpos): m/z = 426 [M+H]+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 3.94 (s, 2H), 7.30 - 7.37 (m, 2H),7.43 - 7.49 (m, 2H), 7.60 (s, 2H), 7.94 (d, 1H), 8.58 (d, 1H), 8.84 (d, 1H),8.89 (d, 1H), 11.01 (s, 1H)。
生物学测定
以下测定可用来说明根据本发明化合物的商业用途。
在所选的生物学测定中测试实施例一次或多次。当测试多于一次时，数据被报告为平均值(avg)或中位值，其中：
• 平均值，也称为算术平均值，其表示所获得的值的总和除以所获得的值的数目，并且
• 中位值表示当以升序或降序排列时所获得的值的组的中间数。如果在数据集中的值的数目为奇数，则中位值为中间的值。如果在数据集中的值的数目为偶数，则中位值为两个中间的值的算术平均值。
当由于存在超出测定的检测范围的测量值而无法进行有意义的平均值或中位值的计算时(在下表中用<或>表示)，将显示所有单个测量值。
实施例被合成了一次或多次。当合成多于一次时，来自生物学测定的数据表示利用由测试一个或多个合成批次所获得的数据集计算的平均值或中位值。
体外研究
人P2X4 HEK细胞FLIPR测定
将稳定表达人P2X4的HEK293细胞以30000个细胞/孔的接种密度铺板在聚D-赖氨酸包被的384孔板中，并孵育过夜。通过使用钙螯合染料Fluo8-AM(Molecular Devices)在荧光成像板读数器(FLEX/FLIPR站；Molecular Devices)上测量细胞内钙的变化来评估P2X4功能。在测定当天，移出培养基，并将细胞在37℃和5%CO2下在30μL染料缓冲液(Hank's 平衡盐溶液，10 mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2 mM丙磺舒，5mM D-葡萄糖一水合物，5μMFluo8-AM，pH=7.4)中孵育30 min。以10μL体积加入在丙磺舒缓冲液(Hank's平衡盐溶液，10mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2 mM 丙磺舒，5 mM D-葡萄糖一水合物，pH=7.4)中稀释的化合物，并允许其在室温下孵育30 min。最终测定DMSO浓度为0.5%。以10μL体积以代表EC80值的浓度加入激动剂Bz-ATP(Tocris)。在化合物分析前的每个测定日测定Bz-ATP的EC80值。以2秒的间隔测量荧光，持续120秒的间隔。用于监测荧光的激发和发射波长分别为470-495 nm和515-575 nm。基于与基础荧光相比的峰值相对荧光单位(RFU)的增加来分析数据，并将数据归一化为激动剂对照。每板一式三份测试化合物，并在Excel XLFit中绘制平均值，以确定IC50值、最大抑制百分比和Hill系数。
实施例编号 人P2X4 HEK细胞 (FLIPR测定) 平均IC<sub>50</sub> [nM] 人P2X4 HEK细胞 (FLIPR测定) 平均功效[%]
19 47 71
20 140 67
24 45 92
25 26 93
26 27 85
28 31 90
39 32 96
170 126 70
321 87 84
326 17 95
331 25 66
349 37 99
360 132 93
380 299 69
381 1241 77
387 34 73
h/m/rP2X4 1321N1星形细胞瘤细胞的FLIPR方法
将稳定表达人P2X4或大鼠P2X4或小鼠P2X4的1321N1星形细胞瘤细胞以10000个细胞/孔的接种密度铺板于胶原I TC处理的微孔板中，并孵育过夜。通过使用钙螯合染料Fluo8-AM(Molecular Devices)在荧光成像板读数器(FLEX/FLIPR站；Molecular Devices)上测量细胞内钙的变化来评估P2X4功能。在测定当天，移出培养基，并将细胞在37℃和5%CO2下在30μL染料缓冲液(Hank's 平衡盐溶液，10 mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2 mM丙磺舒，5mM D-葡萄糖一水合物，5μM Fluo8-AM，pH=7.4)中孵育30 min。以10μL体积加入在丙磺舒缓冲液(Hank's平衡盐溶液，10 mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2 mM 丙磺舒，5 mMD-葡萄糖一水合物，pH=7.4)中稀释的化合物，并允许其在室温下孵育30 min。最终测定DMSO浓度为0.25%。以10μL体积以代表EC80值的浓度加入激动剂Mg-ATP(Sigma)。确定人和小鼠P2X4的EC80为0.5 µM，大鼠P2X4的EC80为5 µM。以2秒的间隔测量荧光，持续120秒的间隔。用于监测荧光的激发和发射波长分别为470-495 nm和515-575 nm。基于与基础荧光相比的峰值相对荧光单位(RFU)的增加来分析数据，并将数据归一化为激动剂对照。每板一式三份测试化合物，并在Excel XLFit中绘制平均值，以确定IC50值、最大抑制百分比和Hill系数。
实施例编号 人P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均IC<sub>50</sub>[nM] 人P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均功效[%]
19 57 nM 60 %
39 64 nM 83 %
326 46 nM 80 %
实施例编号 小鼠P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均IC<sub>50</sub>[nM] 小鼠P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均功效[%]
19 43 nM 69 %
39 37 nM 87 %
326 26 nM 87 %
实施例编号 大鼠P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均IC<sub>50</sub>[nM] 大鼠P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞(FLIPR测定)平均功效[%]
19 71 nM 57 %
39 308 nM 87 %
326 325 nM 99 %
人P2X4 HEK细胞电生理学测定
电生理学测定A
将稳定表达人P2X4的HEK293细胞以7*106个细胞的密度接种在T75细胞培养瓶中，并孵育过夜。使用自动膜片钳平台PatchLiner(Nanion)以单孔模式测定P2X4功能。细胞外缓冲液的组成为(以mM计)NaCl 145、KCl 4、HEPES 10、CaCl2 1、MgCl2 0.5、D-葡萄糖一水合物10，pH=7.4。细胞内缓冲液含有(以mM计)：CsF 135、EGTA 1、HEPES 10、NaCl 10，pH 7.2。在测定当天，使用Accumax(Sigma)收获细胞，并重新悬浮于细胞外缓冲液中。以5 µL体积加入配体激动剂5'-三磷酸腺苷(ATP，5 µM)，直接用细胞外缓冲液(40 µL)冲洗掉。将细胞电压钳制在-80 mV，并每5 min施加一次配体，持续20 min。在此期间，激动剂反应稳定，并且每孔模式以单一浓度测量化合物。以40μL体积加入在细胞外缓冲液中稀释的化合物(最终测定DMSO浓度为0.3%)，并允许其在室温下孵育8 min。基于峰值电流幅度的降低来分析数据，并归一化为激动剂对照。在Excel XLFit中绘制平均值，以确定IC50值、最大抑制百分比和Hill系数。
实施例编号 人P2X4 HEK细胞(PatchLiner电生理学)平均IC<sub>50</sub>[nM]
19 111
39 138
326 57
380 320
电生理学测定B
细胞培养条件：将 HEK-293 mito-Photina pcDNA3(neo-)/pPURO N/pcDNA3_P2RX4,克隆2a/4 (HEK-293 mito-Photina/hP2RX4) 细胞在EMEM最低必需培养基Eagle中培养，该培养基含有 Earl's盐平衡盐溶液(BioWhittaker cat. BE12-125F)，补充有5 mL的200 mMUltraglutamine 1 (BioWhittaker cat. BE17-605E/U1)、5 mL的100X青霉素/链霉素(BioWhittaker cat. DE17-602E；最终浓度为1%)、4 mL的50 mg/mL G418(Sigma cat.G8168-100mL；最终浓度为400μg/mL)、10μL的10 mg/mL嘌呤霉素(InvivoGen cat. ant-pr-1；最终浓度为0.2μg/mL)和50 mL的胎牛血清(Sigma cat. F7524；最终浓度为10%)。
实验方案：在实验前72或96小时将HEK-293细胞系分别以500或250万个细胞的浓度接种到T225烧瓶上。恰好在实验之前，将细胞用D-PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Euroclone cat.ECB4004L)洗涤两次，并用胰蛋白酶-EDTA(Sigma， cat. T4174，1/10稀释)从烧瓶分离。然后将细胞重新悬浮于悬浮液：25 mL EX-CELL ACF CHO培养基(Sigma， cat. C5467)；0.625mL HEPES(BioWhittaker， cat. BE17-737E)；0.25 mL的100x青霉素/链霉素(BioWhittaker， cat. DE17-602E)，0.1 mL的大豆胰蛋白酶抑制剂10 mg/mL(Sigma， cat.T6522)，并放在QPatch 16X上。
化合物制备和储存：使用化合物储备溶液(10 mM；100%DMSO；在-20℃储存)。恰好在实验之前制备来自储液的新鲜溶液(1或3 mM，100%DMSO)(0.1%最终DMSO浓度)。
DMSO溶液获自SIGMA( cat. ＃D-5879)并在室温下储存。
使用QPatch16X进行膜片钳分析(图1)：使用多孔技术在室温下进行标准全细胞电压钳实验。
对于在hP2X4上的电压钳实验，数据以2 KHz采样。建立密封并在整个细胞结构中通过后，将细胞保持在-90 mV，并在不存在研究化合物(媒介物时段，即0.1%DMSO)或在存在递增浓度的研究化合物的情况下，由激动剂引起hP2X4电流；参见图1中的应用方案。
输出：激动剂诱导的最大内向电流(ATP 5 μM)。
细胞内溶液含有(mM)135 CsF、10 NaCl、1 EGTA、10 HEPES (pH 7.2、含CsOH)，而细胞外溶液含有(mM)145 NaCl、4 KCl、0.5 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES、10葡萄糖(pH 7.4、含有NaOH)。
为了收集数据，使用Sophion软件，并使用Excel和GraphPad Prism离线进行分析。
在可能的情况下，即当所测试的最高浓度的抑制百分比大于50%时，用以下公式拟合剂量反应曲线数据：
Y=100/(1+10 ^((LogIC50-X)* Hill斜率))
[X是浓度的对数；Y是标准化反应(100%降低到0%，随着X的增加而降低)；LogIC50与X是相同的对数单位；Hill斜率是无单位的斜率因子或hill斜率]
实施例编号 人P2X4 HEK细胞(QPatch电生理学)平均IC<sub>50</sub>[nM] 实验数
19 278 4
20 195 4
25 222 5
26 222 5
321 227 4
326 51 6
331 155 5
349 117 3
360 205 3
380 157 4
381 2583 3
离体研究
人单核细胞P2X4测定
该测定的原理是在被2',3'-O-(4-苯甲酰基-苯甲酰基)-ATP(Bz-ATP)激活后，测量通过内源性P2X4通道进入人类原代单核细胞的钙流入。使用钙敏感染料(Fluo-8)，用FliprTM(Molecular Devices)装置测量细胞内钙浓度的变化。在原代单核细胞中，P2X4位于溶酶体膜上，因此必须触发胞吐作用以使P2X4暴露在细胞膜上。
通过密度梯度离心从抗凝血液(血细胞，BC)中分离出人外周血单核细胞(PBMC)。用PBS将全血以1：3稀释。将30 mL样品在50 mL离心管(Falcon)中的15 mL Biocoll(BIOCHROM)顶部上小心地成层。在不制动的情况下，将管在室温以914 xg离心25 min。用10mL移液器取出PBMC层，并将其转移到含有冰冷的PBS的管中，总体积为50 mL。通过在4℃下以300xg分别沉淀10 min和5 min而将细胞洗涤两次。将PBMC重新悬浮在10 mL培养基(X-vivo，Biozym Scientific)中，并在Neubauer室中计数。
根据说明，使用来自Miltenyi(＃130-091-153)的单核细胞分离试剂盒II，通过负选择分离单核细胞。分离应迅速进行，并且细胞和溶液应随时保持在冰上。将10exp8细胞批次的PBMC沉淀(300 xg，10 min)，并用300 µL MACS缓冲液重新悬浮在50 mL Falcon管中。加入FcR封闭剂(100µl)和生物素-Ab(100µl)，混合并在冰上孵育10 min。加入MACS缓冲液(300 µL)和抗生物素微珠(100 µL)，混合并在冰上孵育15 min。通过沉淀(300 xg，10 min)洗涤细胞，并重新悬浮于500 µL MACS缓冲液中。对于每个批次，将一个分离柱放在MACS分离器中，并用3 mL MACS缓冲液冲洗。将细胞悬浮液加入柱中，然后加入3 x 3 mL MACS缓冲液进行洗涤，并收集含有单核细胞的洗脱剂。沉淀细胞(300 xg，10 min)，重新悬浮于X-vivo培养基中并计数。将单核细胞以30,000个细胞/孔的密度以50 µL接种到纤连蛋白包被的微孔板(384孔，黑色，平的透明底部；Corning＃3848)中，并培养过夜(37℃，5%CO2)。
将测试物质以10 mM的储备浓度溶于100% DMSO中，并以等分试样储存在-20℃下。在DMSO中制备系列稀释液(2x)，并用测定缓冲液稀释500x以产生拮抗剂板。在Flipr测量中，每孔转移10 µL(4x稀释)，并在测定中获得最终的最高浓度5 µM和0.05% DMSO。激动剂BzATP以等分试样以10 mM储存，并稀释至15 µM的中间浓度以产生激动剂板。在Flipr测量中，每孔转移10 µL(5x稀释)，以便获得最终测定浓度3 µM。
对于实验，手动丢弃细胞板的培养基，并加入70 µL/孔的上样缓冲液并孵育1h(37℃，5%CO2)。上样缓冲液含有HBSS(w/o钙/镁)，10 mM Hepes pH 7.4，5 µM Fluo-8(AM)(Tebu-bio)和50 mM甲胺(Sigma)以触发胞吐作用。手动丢弃上样缓冲液并加入30μL/孔的低钙测定缓冲液(5mM KCl，145 mM NaCl，0.5mM CaCl2, 13 mM葡萄糖，10 mM Hepes pH7.4)。转移拮抗剂板(10 µL/孔)，并在室温下15 min后，转移激动剂板(10 µL/孔)。
在基线10秒后记录激动剂加入240秒。为了进行分析，应用基线校正，并提取曲线的最大值。针对0%抑制(在3 µM BzATP处的信号)和100%抑制(不存在BzATP刺激)将数据标准化，并使用Prism GraphPad用四参数S形抑制曲线拟合以获得IC50值。
实施例编号 不同供体的人P2X4单核细胞　　　(FLIPR测定)　　　IC<sub>50</sub> (功效)
19 59 nM (57%), 21 nM (74%), 76 nM (48%), 59 nM (46%), 45 nM (93%)
24 141 nM (79%), 34 nM (77%), 91 nM (88%)
25 27 nM (87%), 5 nM (82%), 127 nM (70%), 87 nM (70%), 118 nM (70%), 59 nM (53%),63 nM (68%), 39 nM (111%)
26 290 nM (71%), 182 nM (88%)
28 78 nM (64%), 164 nM (90%)
39 105 nM (88%), 32 nM (81%), 71 nM (78%)
170 303 nM (60%), 183 nM (69%), 110 nM (54%)
321 158 nM (49%), 94 nM (49%), 157 nM (60%), 537 nM (60%), 173 nM (34%), 331 nM (46%),39 nM (95%)
326 407 nM (86%), 167 nM (89%), 149 nM (82%), 45 nM (91%), 49 nM (70%)
380 263 nM (70%), 251 nM (70%), 434 nM (70%), 93 nM (43%), 50 nM (32%), 207 nM (107%)
387 122 nM (35%), 104 nM (51%)
人全血P2X4测定
在这种离体测定中，健康女性志愿者的血液首先用脂多糖(LPS)致敏，并且然后用ATP刺激以触发白介素1β(IL-1β)的释放。在该系统中，测试了P2X4拮抗剂对全血中IL-1β产生的功效。首先用100 ng/ml LPS处理细胞2h，并且然后用3mM ATP刺激，并用不同浓度的实施例19、28、39、321、326和380一式三份处理。孵育1h后，取上清液，并在离心后，使用标准ELISA试剂盒测定上清液中的IL-1β。用来自三个不同供体的血液进行测定(参见图2a和2b)。
图2a和2b作为根据本发明化合物的非结合说明性实施例，代表了根据实施例19、28、39、321、326和380的化合物对用脂多糖引发细胞2小时后在ATP刺激和所示处理后人全血中IL-1β产生的影响。数据在y轴上显示了来自三个供体的血液上清液中以pg/ml计的IL-1β的绝对量，并在x轴上显示了对照处理和用不同浓度的实施例进行的处理。对于每个条棒，均显示三个技术重复的平均值和SD。数据显示了几个但不是全部测试实施例对IL-1β释放的抑制。
体内研究
大鼠tMCAO诱导的缺血性中风模型–化合物实施例39
根据Schmid-Elsaesser等人描述的方法[Stroke. 1998; 29(10):2162-2170]，在大约3月龄的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠中进行了短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)。特别是，通过中线颈部切口暴露右颈总动脉(CCA)，并小心地从其分叉处到颅底解剖，与周围的神经和筋膜分开。分离出颈外动脉(ECA)的枕骨和甲状腺上动脉支，并将这些分支凝结。进一步向远侧解剖ECA，并恰好在其分叉之前与末端舌和上颌动脉分支一起凝结。分离颈内动脉(ICA)，并小心地将其与相邻的迷走神经分开，并用5-0尼龙缝线将翼腭动脉靠近其源头结扎。之后，将4-0丝缝线松散地绑在活动的ECA残端周围，将4 cm长的Doccol 4-0单丝缝线(涂有硅酮)通过近端ECA插入ICA并由此进入Willis环，有效地闭塞MCA。闭合手术伤口，并将动物放回它们的笼中以从麻醉中恢复。闭塞后两小时，将大鼠重新麻醉，并抽出单丝以允许再灌注。再次闭合伤口，并将大鼠放回它们的笼中。
四组大鼠(每组12-15只大鼠)被纳入研究。两组经受tMCAO和两组经受假手术动物(第1组=未经处理的假手术，第2组=使用媒介物处理的假手术，第3组=使用媒介物处理的tMCAO，第4组=使用P2X4-拮抗剂处理的tMCAO)。在手术前一小时开始，第2、3和4组通过每天两次口服给药媒介物或P2X4拮抗剂处理7天。改良神经损伤严重程度评分(mNSS)用于对神经功能进行分级和评价[Li等人, Neurology 2001, 56: 1666–1672]。mNSS是运动、感觉、反射和平衡测试的组合，并按0到18的等级分级(正常评分为0，并且最大缺陷评分由18表示)。手术前所有大鼠均经受了mNSS测试，以便只包括mNSS正常的动物。tMCAO后两小时，仅将mNSS等于或大于10的大鼠纳入研究。手术后第1、2、8、15、22和29天也进行了mNSS测试。
从第8天起，P2X4拮抗剂处理的tMCAO组导致比媒介物处理的tMCAO组显著更小的mNSS(p <5%；双向ANOVA统计分析，然后进行Bonferroni事后比较)。两个假手术组在每个时间点的mNSS均显示为0(参见图3)。
小鼠tMCAO诱导的缺血性中风模型
根据Hata 等人描述的方法[J Cereb Blood Flow Metab. 2000; 20(6):937-946]，在8-10周龄的雄性C57BL/6N小鼠中进行短暂大脑中动脉闭塞(tMCAO)。特别是，在麻醉小鼠中，通过中线颈部切口暴露左颈总动脉(CCA)，并小心地解剖，与周围的神经和筋膜分开并结扎。然后，将同一侧的左颈外动脉(ECA)分离并也结扎。获得对解剖的颈内动脉(ICA)和翼腭动脉(PA)的良好视野后，将两条动脉都夹住。之后，通过小切口将涂有硅树脂(Xantopren; Bayer Dental, Osaka, Japan)的8-0尼龙单丝(Ethilon；Ethicon，Norderstedt，Germany)引入颈总动脉，并向颈动脉分叉远端前进9 mm以闭塞MCA。选择线的尖端直径(0.15至0.20 mm)以匹配动物的体重。闭合手术伤口，并将动物放回它们的笼中以从麻醉中恢复。闭塞后四十五分钟，将小鼠重新麻醉并抽出单丝以允许再灌注。闭合伤口，并将小鼠放回它们的笼中。
四组小鼠(每组10-15只小鼠)被纳入研究。三组经受tMCAO和1组经受假手术动物(第1组=未经处理的假手术，第2组=使用参考化合物MK-801的tMCAO，第3组=使用媒介物处理的tMCAO，第4组=使用P2X4-拮抗剂处理的tMCAO)。在中风手术前15分钟，第2组的每只动物仅用参考化合物MK-801腹膜内处理一次，剂量为3mg/kg体重，剂量体积为5ml/kg体重。从手术前一小时开始，第3组和第4组通过每天两次口服给药媒介物或P2X4拮抗剂(60mg/kg体重)处理14天，剂量体积均为5 ml/kg体重。
包括四种不同的感觉运动测试[改良神经损伤严重程度评分(mNSS)、除胶测试(ART)、角落测试(CoT)和圆筒测试(CT)]，作为测量药物处理效果的读出参数。
改良神经损伤严重程度评分(mNSS)在手术前以及在tMCAO或假手术后的第1、7、14、21和28天进行。根据Orsini等人[Circulation. 2012; 126(12):1484-1494]和DeSimoni等人[J Cereb Blood Flow Metab. 2003; 23(2):232-239]发表的神经评分对本研究中使用的mNSS进行了修改。mNSS用于评价tMCAO后的一般状态和局灶性神经功能障碍。评分范围从0(无缺陷)到39(代表所有项目中最差的表现)，并作为一般缺陷和局灶性缺陷的总和计算得出。mNSS结果表示为综合神经系统评分，其包括以下一般缺陷(评分)：头发(0至2)，耳朵(0至2)，眼睛(0至3)，姿势(0至3)，自发性活动(0至3)，以及以下局灶性缺陷(评分)：身体对称性(0至2)，步态(0至4)，在倾斜45°的表面上攀爬(0至3)，转圈行为(0至3)，前肢对称性(0至4)，转圈行为(0至3)，触须对轻触的响应(0至4)和前爪的抓力测试(0至3)。
手术前所有小鼠均经受了mNSS测试，以便仅包括mNSS正常的动物。tMCAO后二十四小时，仅将mNSS等于或大于8的小鼠纳入研究。
除胶测试(ART)用于测量体感缺陷。通过将一块背胶纸点(约2 mm Ø)固定在右前肢的足底区域上，将其用作触觉刺激。在tMCAO手术前一周，每只动物在两天内每天接受3次ART试验。如果动物在调节的第二天在≥60秒的平均时间内未能去除刺激，则加入另外的调节日。如果动物甚至在另外增加的试验日后在60秒内仍未能去除刺激，则将该动物排除在研究之外。ART在手术前以及在手术后的第7、14、21和28天进行。在每个测试日，每只动物进行3次测试。记录并评价三项试验中检测和去除右前肢的粘性刺激所需的时间。
角落测试(CoT)用于测量与中风相关的前肢运动不能。角落测试系统通过使用4块板产生，这四块板粘合在一起以形成具有30°角的两个相对的角，由此这些角中的一个含有一个小的间隙，以鼓励小鼠找到这个相应的角。将该角落测试系统放置在带有标准寝具的笼子中。为了进行CoT，启动相机，将小鼠放在矩形的中间并记录10 min。小鼠试图到达具有间隙的角落。然而，中风的小鼠不能向前直行。因此，它们或多或少地向左侧或向右侧转弯，并从记录中计数向左和向右转弯的次数，以进行评价。CoT在手术前以及在手术后的第14天和第28天进行。
通过计数自发的前肢使用，使用圆筒测试(CT)来研究探索行为。为了进行该测试，将小鼠放在透明圆筒(直径12 cm，和高度20 cm)中5 min。将一面镜子以一定角度放置在圆筒的后面，以允许每当动物将离开观察者时都记录前肢的运动。圆筒的高度足以防止动物通过后腿直立达到顶部边缘。观察前不允许习惯于圆筒。在每个期间对每只小鼠计数用左和右前爪独立进行的壁接触的数目以及用两个前爪进行的平行接触的数目。仅计数支撑接触，即足趾张开的爪与圆筒壁完全并置。手术后第14天和第28天进行CT。

Claims (11)

1.用于治疗或预防脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的式(I)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
X是C或N
R1表示：
Figure 780972DEST_PATH_IMAGE002
其中*表示所述基团与分子其余部分的连接点且R6、R6a彼此独立地表示氟、氯、甲氧基或氢；
R2表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中 *表示所述基团与分子其余部分的连接点，并且所述基团任选地被彼此独立地相同或不同的R11取代一至两次；
R11彼此独立地表示卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-羟烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-乙基-、甲氧基-乙基-、C3-C6-环烷基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、水合物、溶剂化物、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
2.根据权利要求1所述的通式I的化合物用于预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的用途。
3.根据权利要求1所述的通式I的化合物用于制备用于预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的药物的用途。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述化合物为
2-(2-氯苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}乙酰胺；
2-(2-氟苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[4-(3-氯-1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺；
N-[4-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]-2-(2-氯苯基)乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺；
N-[4-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺；
N-{6-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-5-氨磺酰基吡啶-3-基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-{4-[1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-3-氨磺酰基苯基}乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-{3-氨磺酰基-4-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]苯基}乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-{5-氨磺酰基-6-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-基}乙酰胺；
2-(2-氟苯基)-N-{5-氨磺酰基-6-[4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]吡啶-3-基}乙酰胺；
2-(2-氯苯基)-N-[6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-5-氨磺酰基吡啶-3-基]乙酰胺；
或所述化合物的N-氧化物、盐、水合物、溶剂化物、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述化合物是2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐，或它们的混合物，用于制备用于预防或治疗脑缺血、缺血性脑损伤、缺血性中风(IS)、出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤的药物。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中从疾病发作直至约一个月，或直至约三周，或直至约两周，或直至约十天给药所述化合物。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述化合物与抗血栓形成剂组合给药或作为与抗血栓形成剂的联合药物给药。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述化合物与肝素或低分子量肝素或达那肝素；或阿加曲班，或抗凝血酶或蛋白C；或阿司匹林，或氯吡格雷，或阿昔单抗，或依替巴肽(Integrilin)组合给药或作为与肝素或低分子量肝素或达那肝素；或阿加曲班，或抗凝血酶或蛋白C；或阿司匹林，或氯吡格雷，或阿昔单抗，或依替巴肽(Integrilin)的联合药物给药。
9.如权利要求1所定义的通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物的肠胃外制剂。
10.2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰基苯基]乙酰胺或其立体异构体、互变异构体、N氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐的肠胃外制剂。
11.根据权利要求6或7所述的肠胃外制剂，其特征在于是用于静脉内给药的肠胃外制剂。
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