CN111511409A - 用于快速表面消毒的异步间歇性光照 - Google Patents

用于快速表面消毒的异步间歇性光照 Download PDF

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Abstract

使用一个或多个窄波长光源的异步、间歇性光照进行微生物杀菌。光源具有窄波长特性。间歇性光照为快速微生物消毒过程提供了足够高的光照强度，同时通过不同的灭活途径靶向到多个细胞位点，降低在微生物消毒过程中用于微生物消毒的平均能耗。

Description

用于快速表面消毒的异步间歇性光照
相关专利申请
本专利申请要求于2017年10月11日提交的临时专利申请No.62/606,850的优先权，该临时专利申请已经转让给本受让人并且由本发明人提交，并且该临时专利申通过引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于灭活微生物的光消毒技术。更具体而言，本公开涉及提供使用高强度、窄波长光源的异步、间歇性光照的光消毒，从而以低能耗实现快速微生物消毒。
背景技术
与受污染表面的直接接触是传染性疾病最常见的传播途径。环境表面在院内感染(HAI)的传播中起到重要作用，院内感染为在医疗机构中获得的感染。患者护理区域中被微生物污染的表面可以作为HAI的潜在致病菌的储存库。这些致病菌包括耐甲氧西林金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus,MRSA)、多重耐药性绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,MRPA)和耐万古霉素球肠菌(Enterococci,VRE)等。已有若干公开指导方案用于防止患者之间的传染性传播。美国疾病控制与预防中心建议将通过清洁和消毒对患者区域的表面进行常规环境消毒作为防止传染性病原体在医疗机构中传播的标准预防措施的一部分。
手部不洁净是表面污染的主要原因，并且是疾病爆发的重要危险因素。在院内环境中，医院致病菌将很大概率污染手部碰触的表面，并且手部碰触的表面可能作为交叉传播的媒介。手部与受污染表面的单次接触导致了不同程度的致病菌传播。研究表明，大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)最能成功的传播到手部。受污染的手部可以将病毒传播到五个以上表面或者14个其他对象上，并且也可能是表面再污染的来源。此外，通过浸有液体消毒剂(例如，乙醇、次氯酸盐)的抹布对表面进行擦拭的清洁通常不是最佳的。已经证实使用抗菌型金属和H2O2蒸汽消毒的更严苛的方法是有效的，但是这种更严苛的方法会导致表面粗糙并且留下有害残留物。
在大多数国家，使用经审批的消毒剂进行人工清洁是当前的消毒标准，并且这需要不断加强对环境管理服务人员进行监管和培训，以保持高效性。发展更有效的表面消毒方法已经引起了广泛关注。已经开发了过氧化氢蒸汽消毒法、臭氧消毒法、水蒸汽清洁法以及使用超细纤维布料和诸如铜等抗菌型金属作为可替代的消毒方法。这些技术也带来了一些隐患，例如材料的兼容性(即，表面损伤和腐蚀)、微生物的耐受性和抗性的出现以及潜在有害残留物的持久性。因此，开发可替代的表面消毒技术迫在眉睫，该项技术不仅能安全并且高效的广谱杀灭包括抗药型传染性微生物的微生物，而且还能避免促使在目标微生物中产生耐药性。
较早的光消毒技术使用单个光源(UV或蓝光)或使用多个光源以输出白光。对于使用紫外线(UV，100nm至400nm)辐射的基于光的消毒技术进行了广泛研究。在包括真空UV(100nm至200nm)、UVC(200nm至280nm)、UVB(280nm至315nm)和UVA(315nm至400nm)的UV光的四个光谱区域中，对于微生物的灭活，UVC是最有效的。微生物细胞的核酸高效地吸收波长为250nm至270nm的UVC，从而损坏了RNA和DNA分子。这涉及核酸链中嘧啶残基的二聚化，产生环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，使RNA和DNA分子变形，导致细胞复制缺陷，最终导致细胞死亡。UVC消毒在食品工业中很普遍，并且已经证实其对食源性致病菌有效。已经研究了UVC消毒对多种食品的影响，所述食品包括果汁、果浆、葡萄酒和豆浆。在当前的世界卫生组织(WHO)结核(TB)感染控制计划中采用UVC以室内上层空间紫外线杀菌辐射(UVGI)的形式。UVGI可以以相对较低的成本快速处理大量室内空气，但是由于当前的灯具设计，其部署可能很困难。发射254nm UV光的低压汞蒸气放电灯(杀菌灯)安装在上部分墙壁或悬挂在房间的天花板上。为了使可能导致室内居住者的眼睛或皮肤不适的UV辐射最小化，使用紧密的、深色百叶窗来校准UV光路，使其几乎与天花板平行。已经证实，湿度不利于UVGI的有效性，并且在潮湿地点中会使用较高的灯强度。
近期研究表明，蓝光(400nm至500nm)对多种耐药型细菌具有固有的抗菌活性。虽然蓝光的抗菌机制目前仍知之甚少，但普遍认为蓝光激发了许多细菌的内源性细胞内卟啉，并且在真菌细胞中发现了黄素蛋白和黄素。由此产生的光子吸收导致了能量转移的级联，最终导致产生具有高细胞毒性的活性氧(ROS)，尤其是单态氧(1O2)。蓝光对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有活性。研究表明，波长为402nm至420nm、455nm或470nm的蓝光具有最高的杀菌活性。在一项临床研究中，志愿者暴露于高剂量的蓝光中，示出了蓝光的安全性。在对哺乳动物细胞的实验室研究中得出了相似的结论。暴露于蓝光似乎并未造成材料(即，塑料)的损坏，而损坏这一情况通常与UV光暴露相关。
一系列的研究表明，波长在600nm至900nm的毫微微秒(fs)的脉冲光源可有效抵抗诸如M13噬菌体、烟草花叶病毒、HPV和人类免疫缺陷病毒(HIV)之类的病毒。该技术可在很短的时间内(100fs)传送大量的光子能量(10mW)，以产生100GW的脉冲能量，足以产生有效的双光子吸收。这项技术是非侵入性的、安全的，并且对致病菌的消毒具有高度选择性。暴露于近红外双波长光源中可以使许多细菌和真菌灭活，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌(C.albicans)和风疹杆菌(T.rubrum)。另一项研究还表明，该技术还可以使耐药型微生物对普通抗生素重新敏感，并且认为这一过程是由光介导的细胞膜中微生物呼吸过程的变化引起的，该变化也干扰了细菌的耐药机制。这些研究毫无疑问地证实了许多微生物是光敏的，并且可以以不同的方式与光相互作用并做出响应。虽然尚不清楚确切的机制，但很明显，在医疗机构中，有充分的机会使用光以缓解微生物污染。
发明内容
通过使用一个或多个窄波长光源的异步、间歇性光照的系统进行微生物消毒。光源中的至少一者具有与单色LED的光谱宽度一致的窄波长特性。间歇性光照为快速微生物消毒过程提供了足够高的光照强度，同时通过不同的灭活途径靶向到多个细胞位点，降低微生物消毒过程中用于微生物消毒的平均能耗。
附图说明
图1A至1D为示出了UV(280nm)LED(图1A)和UVC荧光(图1B至1D)的发射光谱的图示。
图2A至2D为呈现出单个UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率的图示。图2A样品为绿脓杆菌(P.aeruginosa)。图2B样品为大肠杆菌。图2C样品为金黄色葡萄球菌。图2D样品为粪肠球菌(E.faecalis)。
图3A和图3B为示出了对金黄葡萄球菌的杀菌效率的图示。图3A示出了UV(280nm)LED照明的效率。图3B示出了UVC荧光照明的效率。
图4为示出了不同光照(即，波长)对104CFU/ml的大肠杆菌的效率的杀菌活性的图示。
图5A和图5B为示出了波长为405nm(图5A)和470nm(图5A)的可见LED光的发射光谱的图示。
图6A至6E为示出了连续性和间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光之间的差异，以及它们对样品细菌的杀菌效率的图示。图6A示出了对绿脓杆菌的效率。图6B示出了对大肠杆菌的效率。图6C示出了对金黄色葡萄球菌的效率。图6D示出了对粪肠球菌的效率。图6E示出了施加连续性(100％)和脉冲(50％)的波形图。
图7为示出了波长为405nm和470nm的连续性和间歇性(脉冲)蓝LED光对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀菌效率的差异的图示。
图8A和图8B为示出了连续性和间歇性(脉冲)光对A431细胞(人上皮鳞状癌细胞)的细胞毒性的图表。图8A示出了不同剂量UV(280nm)光的细胞毒性。图8B示出了405nm和470nm蓝光的细胞毒性。
图9为示出了A431细胞通过不同频率的脉冲和连续性光辐射后，人体白介素8(IL-8)的水平的图示。左侧示出了脉冲光的效果，而右侧示出了连续性光的效果。
图10A至10E为示出了不同比率的间歇性(脉冲)光照的UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率之间的比较的图示。图10A样品为绿脓杆菌。图10A样品为大肠杆菌。图10A样品为金黄色葡萄球菌。图10A样品为粪肠球菌。图10E示出了施加的波形图。
图11A至11E为示出了不同占空比的UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率之间的比较的图示。图10A样品为绿脓杆菌。图10B样品为大肠杆菌。图10C样品为金黄色葡萄球菌。图10D样品为粪肠球菌。图10E示出了施加的波形图。
图12为比较同步光照和异步光照的组图。
图13为培养皿的照片的比较分组排列，示出了同步和异步光照的杀菌效率。从左到右的描述为对照样品；运行20％占空比的样品；进行同步曝光的3个样品；以及进行异步曝光的样品。
图14为用于微生物消毒暴露的一组不同光照组合的波形图的描述。
图15A和图15B为示出了相比于UV LED，不同光照组合的杀菌性能之间的比较的图示。图15A样品为金黄色葡萄球菌；图15B样品为绿脓杆菌。
图16A和16B为示出了相比于单个部件光照(UV(280nm)LED、405nm和470nm LED)，优化的异步间歇性消毒光照方案及其杀菌效率。图16A样品为绿脓杆菌。图16B样品为金黄色葡萄球菌。图16C示出了施加的波形图。
图17为示出了A431细胞通过脉冲和异步连续性光照辐射后的人体IL-8水平的图示。
图18A和图18B为示出了优化的异步间歇性消毒光照方案用于病毒的灭活，以及该方案的病毒灭活活性。图18A示出了对大肠杆菌噬菌体T3施加的波形图。图18B示出了对大肠杆菌噬菌体T3的病毒灭活活性。
图19为用于提供光消毒的示例配置的示意图。
具体实施方式
概述
本公开技术描述了基于异步、间歇性光照的新的光消毒技术，该技术采用高强度、窄波长光源，以低能耗和改进的安全性用于快速微生物消毒。公开的技术教导了光照和曝光程序的最佳组合的使用，从而通过不同的灭活途径靶向到多个细胞位点来快速灭活微生物。
就本公开技术的目的而言，“窄波长光”是指具有与单色LED光的光输出一致的用于目标杀菌目的的光频率范围的光照。更进一步而言，“窄波长光”可以指光谱宽度为＜100nm的光。窄波长光的非限制性实例是为253.7nm低压汞蒸气放电杀菌灯；然而，单色LED光的光谱也足够窄，适用于此处所述的目的。单色LED光的发射模式是窄波长的非限制性实例。作为非限制性实例，LED在24nm至27nm的范围内通常可获得-3dB的光谱宽度，在50nm至180nm或40nm至190nm可获得比-3dB更宽的光谱宽度。这些光谱宽度较窄，但不如253.7nm的杀菌灯的光谱宽度窄。在非限制性实例中，光谱宽度窄于100nm。
在一个非限制性实例中，窄光谱宽度光可以是光谱宽度为<100nm、照明频率为0.1Hz至1000Hz并且占空比为1％至99％的光。更进一步而言，光可以具有较窄的操作范围，例如照明频率为0.1Hz至100Hz，和/或占空比为10％至99％。在一个非限制性实例中，可以使用由以下组成的光照：约280nm的紫外线和约405nm以及约470nm的光，由光谱宽度为<100nm的LED灯珠产生，照明频率为0.1Hz至100Hz，并且占空比为10％至99％。
本公开技术结合了具有不同波长的多个光源，并且调节不同光源的曝光时间、频率、占空比和光照模式以实现快速表面消毒。本公开涉及基于异步、间歇性光照的光消毒技术，该技术使用高强度、窄波长光源，以低能耗和改进的安全性用于快速微生物消毒。在一个实施方案中，包括一个405nm LED、一个470nm LED和四个UV LED的光照系统用于产生同步和异步光照模式。高效杀菌系统由三节4V可充电电池供电，并由带有可编程微控制器(Arduino)的电路板和显示屏控制，以调节曝光时间、频率、占空比和光照模式。
与其他形式的光照相比，LED光具有快速响应电源供电的优势，使得更容易地控制占空比。LED提供了通常为15％至50％的高光照效率，在具有磷光的情况下理论范围为38.1％至43.9％，并且在没有磷光色混合的情况下光照效率更高。相反，金属卤化物灯和高低压钠气体放电灯以及汞蒸气放电灯的效率范围为9.5％至29％。与其他某些形式的光照相比，LED更易于控制且占空比更短。如在本公开技术中使用的，LED可以是直接发光或者使用磷光以实现所需波长发射这两者中的一者。
在另一个实施方案中，本公开技术展示了光源和曝光程序的最佳组合的使用，从而通过不同的灭活途径靶向到多个细胞位点来快速灭活微生物。
也需要提供用于固体表面消毒的安全方法。一方面，与同步光相比，间歇性光照暴露可以显著降低人表皮的炎症反应。另一方面，表皮的新陈代谢可以维持在稳定的水平。
与常规的表面消毒技术相比，本公开技术开发了异步间歇性光照系统，从而实现了对包括多重耐药型细菌的微生物的快速灭活。多种波长和光照模式的组合有助于通过不同的灭活途径靶向到微生物的多个细胞位点以避免微生物耐受性和耐药性的可能性。本公开的表面消毒技术既不使用化学药品也不损坏材料表面。对于动物和人类也是安全的。该技术为节能的，并且具有可以由低压电池驱动的优点。
本公开技术可以用于在实验室设施、公共基础设施和家庭中使用的许多物品的表面消毒，包括以下非限制实例，生物安全柜、医疗器械、扶手、触摸板和浴室用品。
操作和实施
图1A至1D为示出了UV(280nm)LED(图1A)和UVC荧光(图1B至1D)的发射光谱的图示。这组图示出了波长范围在277±4nm内的UV LED(SETi，UVTOP270T039FW)的发射光谱，并且紫外荧光灯(Phillips，63872427)的发射光谱示出了范围为200nm至270nm的较宽的光谱发射，最大值在253.7nm。就本公开的目的而言，尽管这些是较宽的发射范围，但仍认为是窄波长光照。
图2A至2D为呈现出单个UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率的图示。图2A样品为绿脓杆菌。图2B样品为大肠杆菌。图2C样品为金黄色葡萄球菌。图2D样品为粪肠球菌。这组数据示出了革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的对数减少曲线，并且绿脓杆菌对UVLED消毒最为敏感，随后为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>粪肠球菌。可以看出，2.5mJ/cm2的极低曝光量可以使粪肠球菌的减少大于90％，使金黄色葡萄球菌的减少达到97％，并且使大肠杆菌和绿脓杆菌的减少达到大于99.9％。
图3A和3B为示出了对金黄色葡萄球菌的杀菌效率的图示。图3A示出了UV(280nm)LED照明的效率。图3B示出了UVC荧光照明的效率(图3B)。如表3中的曲线所示，表1总结了UV(280nm)LED对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀菌效率。该表列出了绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的1个对数和2个对数减少量所需的曝光剂量。绿脓杆菌的2个对数减少量需要0.062mJ/cm-2的曝光剂量，而大肠杆菌需要1.86mJ/cm-2。革兰氏阳性菌对紫外线耐性较高，对于1个对数减少量，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌需要2.45mJ/cm-2的曝光剂量。表中还列出了Chick方程的k值，并且提供了UV LED对不同种细菌的相对消毒效率的定量比较。
表1.UV LED对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀菌活性
Figure BDA0002444410540000091
图3A和3B比较了荧光UV和UV LED在104CFU.ml-1金黄色葡萄球菌的消毒方面的杀菌性能。从存活的金黄色葡萄球菌的对数减少量曲线中可以看出，与荧光UV灯(约215mJ/cm2)相比，UV LED以小部分能量(3.2mJ/cm2)实现了2个对数(99％)的减少量，尽管荧光UV灯发射出更多紫外线(254nm)。
图4为示出了不同光照(即，波长)对104CFU/ml的大肠杆菌的效率的杀菌活性的图示。表2总结了用于灭活金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的UV(280nm)LED和UVC荧光的性能。
表2陈述了两种类型的紫外线对革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)的灭活的性能。据观察，相对于荧光UV，UV LED需要更少的曝光剂量(例如，1/10)以达到相同水平的细菌灭活。这种差异也反映在Chick方程的k值上，其中UV LED光的k值高80倍。
表2.UV LED和荧光UV对革兰氏阴性菌的杀菌活性
Figure BDA0002444410540000101
在图4中示出了不同光照(即，波长)对104CFU/ml的大肠杆菌的效率的杀菌活性。该图示出了可见光和近红外光的不同波长的杀菌性能的曲线。以一式三份的104CFU/ml大肠杆菌进行杀菌实验。在可比较的曝光量情况下，405nm和470nm的光照提供了最一致的杀菌性能。405nm的光可以实现使存活的大肠杆菌减少80％至85％，而470nm使存活的大肠杆菌减少75％至80％。尽管410nm的光也具有良好的性能，但与405nm和470nm的光相比，结果的一致性较差。其他光照只能实现使大肠杆菌的减少50％。可以推测，其他微生物可能对不同波长的光表现出不同的敏感性。
图5A和5B为示出了波长为405nm(图5A)和470nm(图5A)的可见LED光的发射光谱的图示。这组图示出了单个405nm LED(Bivar,UV5TZ-405015,来自Irvine,California的Bivar,Inc.)和单个470nm LED(Broadcom,HLMP-CB1B-XY0DD,来自Irvine,California的Broadcom Inc.)的发射光谱。
表3总结了单个405nm LED和高强度405nm LED对金黄色葡萄球菌的杀菌效率。与低强度405nm LED(k值＝0.0015)相比，高强度405nm LED在灭活金黄色葡萄球菌方面更为有效，Chick方程的k值为0.0031。
表3.低强度和高强度405nm LED对金黄色葡萄球菌的杀菌效率
Figure BDA0002444410540000111
图6A至6E为示出了连续性和间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光之间的差异，以及它们对样品细菌的杀菌效率的图示。图6A示出了对绿脓杆菌的杀菌效率。图6B示出了对大肠杆菌的杀菌效率。图6C示出了对金黄色葡萄球菌的杀菌效率。图6D示出了对粪肠球菌的杀菌效率。图6E示出了施加连续性(100％)和脉冲(50％)的波形图。这组图示出了间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光照通常具有更好的杀菌效率。如图6a、6b和6d所示，对于绿脓杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌，间歇性(脉冲)照明实现了比连续性辐射更高的微生物灭活。因为t检验的p值大于0.05，所以金黄色葡萄球菌无显著性差异(图6c)。图6a示出了以0.027mJ/cm2的曝光剂量，对绿脓杆菌进行间歇性(脉冲)辐射获得了2.5个对数的减少量，这仅是当使用连续光照时所需剂量的三分之一。以低曝光剂量(<0.054mJ/cm2(p<0.01))的效果尤为明显。在图6b可以看出，对于大肠杆菌，间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光在曝光剂量为0.16mJ/cm2的一分钟内实现了大于1.5个对数的减少量，为当使用连续性UV(280nm)LED辐射时需要的时间(即，5分钟、1.62mJ/cm2)的一小部分。从金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的测试结果中可以看到类似的观察结果，但效果不太明显(图6c和6d)。
图7为示出了波长为405nm和470nm的连续性和间歇性(脉冲)蓝LED光对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀菌效率的差异的图示。该图示出了间歇性(脉冲)光照具有增强405nm和470nm LED光的杀菌活性的作用。间歇性脉冲405nm LED在对存活绿脓杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌的对数减少量方面示出了显著提高，同时，间歇性脉冲470nm LED对所有四种细菌示出了更高的减少量。图8A和8B为示出了连续性和间歇性(脉冲)光对A431细胞(人表皮鳞状细胞癌)的细胞毒性的图表。图8A示出了UV(280nm)光在不同剂量的细胞毒性。图8B示出了405nm和470nm蓝光的细胞毒性。这组图示出了在暴露于间歇性(脉冲)和连续性光照后的A431人表皮细胞的MTT分析。从图8a中明显看出，在低曝光剂量(0.3mJ/cm2)和高曝光剂量(3.6mJ/cm2)，间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光照比连续性辐射具有更低的抑制率(例如，更安全)。在0.3mJ/cm2，通过连续光照抑制了超过一半的细胞，但通过间歇性(脉冲)光照仅抑制了10％。通过在3.6mJ/cm2的UV(280nm)LED曝光剂量的连续光抑制了大部分的细胞(80％)，与之相比，间歇性(脉冲)光照的抑制率小于30％。结果表明，在相同的曝光剂量时，间歇性(脉冲)UV(280nm)LED比连续性辐射更安全。对405nm和470nmLED光(图8b)进行了类似的观察(图8b)，间歇性(脉冲)光照引起了更少的细胞抑制。与连续性光照相比，间歇性405nm和470nm LED光将细胞抑制率降低了50％和90％。此外，结果示出了间歇性(脉冲)照明更安全。
图9所示为示出了A431细胞通过不同频率的脉冲和连续性光辐射后，人IL-8水平的图示。左侧示出了脉冲光的效果，并且右侧示出了连续光的效果。该图显示了在暴露于间歇性(脉冲)和连续性光照后，A431人表皮细胞(鳞状上皮细胞)的人IL-8ELISA分析。IL-8是与炎症相关的关键介质，并通过聚集和激活中性粒细胞在急性炎症中发挥致病作用。因此，IL-8的水平是炎症反应的指标。图9示出了与连续性光照相比，间歇性(脉冲)光照通常具有较低水平的IL-8。405nm LED光的差异非常明显。图10A至10E为示出了不同比率的间歇性(脉冲)光照的UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率之间的比较的图示。图10A样品为绿脓杆菌。图10A样品为大肠杆菌。图10A样品为金黄色葡萄球菌。图10A样品为粪肠球菌。图10E示出了施加的波形图。这组图比较了UV(280nm)LED在1Hz、10Hz、20Hz、30Hz、40Hz和50Hz的间歇性(脉冲)光照的杀菌效率。结果示出了对于所有四种待测试细菌，在1Hz获得了最佳性能。在1Hz的间歇性(脉冲)光照中存活的绿脓杆菌具有比10Hz、30Hz、40Hz和50Hz显著更高的减少量(p<0.001)。对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌而言也有相同趋势，其中1Hz的间歇性(脉冲)光照也产生了比所有其他频率显著更高的杀菌效率(p<0.001)。粪肠球菌对UV(280nm)LED光的脉冲频率较不敏感。
图11A至11E为示出了不同占空比的UV(280nm)LED对样品细菌的杀菌效率之间比较的图示。图10A样品为绿脓杆菌。图10B样品为大肠杆菌。图10C样品为金黄色葡萄球菌。图10D样品为粪肠球菌。图10E示出了施加的波形图。这组图示出了脉冲光在各种占空比(0％，20％，40％，60％，80％和100％)的杀菌效果。与间歇性(脉冲)光照的频率相比，存活的绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的减少量对占空比并不敏感，p>0.05。
图12为比较同步和异步光照的组图。这些图示出了同步和异步光照模式的波形图。如图所示，当在相同的占空比内同时照射不同波长的光时，出现同步光照模式。异步光照模式为当一组或多组光以如图中的实施例所示的它们彼此不重叠的方式照射。如图中所示的同步光的实施例为具有1Hz脉冲UV的连续性蓝光(405nm和470nm)，并且图中的异步光的实例为UV(280nm)、405nm和470nm LED光的交替脉冲。在连续性和异步实施例中，使用10WLED。
在施加同步波形时，如图12的左侧图所示，施加了405nm和470nm的连续性光照。施加来自四个280nm LED的脉冲UV光，以1Hz和20％占空比运行。如右侧图所示施加异步光，脉冲405nm和470nm光照以1Hz和10％占空比运行。施加来自四个280nm LED的脉冲UV光，以1Hz和20％占空比运行。在异步施加中，光为交替脉冲。
图13为培养皿的照片的比较列阵，示出了同步和异步光照的杀菌效率。从左到右的描述为对照样品；运行20％占空比的样品；进行同步曝光的三个样品；以及进行异步曝光的样品。培养皿示出了间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光、同步(并发405nm和UV，以及并发470nm和UV)和异步光照模式的杀菌效率。暴露于间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光的在培养皿上的细菌作为含有UV成分的光照系统的杀菌效率的参考。培养皿上清晰的轨迹表明了杀菌效率。一方面，尽管存在相同的UV(280nm)LED光，但从同步光照不能观察到清晰的轨迹表明了杀菌效率很差。另一方面，与UV(280nm)LED光相比，异步光照产生了更宽的净空轨迹，表明了更高的杀菌效率。同步光照的较差性能是由于405nm的光对受损的DNA/RNA的修复作用。
图14为用于微生物消毒暴露的一组不同光照组合的波形图的描述。这组波形图示出了光照方案研究，从而为最佳杀菌效率确定优化光照。这包括仅UV暴露，蓝光(405nm或470nm)对UV的先暴露和后暴露，以及用UV替代蓝光(405nm或470nm)的暴露。
图15A和15B为示出了与UV LED相比，不同光照组合的杀菌性能之间的比较的图示。图15A样品为金黄色葡萄球菌。图15B样品为绿脓杆菌。这组图示出了图14所示的光照方案的杀菌效率。杀菌效率通过以下进行量化：
Figure BDA0002444410540000141
值为1将表明与UV光类似的杀菌效率。与单独的UV光相比，更大的值将表示改善，而更小的值表示杀菌效率降低。
表4总结了在图14和15中不同光照组合的杀菌效果的比较。结果示出了为实现杀菌效率的增强，必须按特定的顺序施加异步光。先暴露于405nm并且在470nm交替暴露可提高杀菌效率。
表4.与单独的间歇性(脉冲)紫外线(280nm)光相比，不同光照方案的杀菌性能。
Figure BDA0002444410540000151
*除了当暴露时间为120秒时没有观察到减少
图16A至16C示出了优化的异步间歇性消毒光照的效果。图16A和16B为示出了相比于单个部件光照(UV(280nm)LED、405nm和470nm LED)，优化的异步间歇性消毒光照方案及其对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果。值得注意的是，当在所示的计量范围内将单个405nm或470nm LED用于绿脓杆菌或金黄色葡萄球菌这两者中的一者时，没有观察到可测定的抑制区域。图16C示出了施加的波形图。这组图示出了用于优化的异步间歇性光消毒系统的光照方案，包括两个不重叠占空比的1Hz的间歇性(脉冲)405nm LED光照(10％占空比)，然后是1Hz的间歇性(脉冲)紫外线(280nm)LED光照(90％占空比)和1Hz的间歇性(脉冲)470nm的LED光照(10％占空比)。
图16A和16B表明在相同的间歇性(脉冲)速率和占空比时，优化的异步间歇性消毒光对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌培养皿上抑制区域的面积，以及单个部件光(UV(280nm)LED、405nm和470nm LED)对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌培养皿上抑制区域的面积。优化的异步间歇性光消毒系统的较高的杀菌效率证明了光消毒系统的协同作用。对蓝光LED本身的杀菌试验具有较低的细菌减少量，但在异步光照系统中发挥了显著更高的杀菌效果。
图17为示出了A431细胞通过脉冲和异步连续性光照辐射后的人IL-8水平的图示。该图示出了在脉冲和连续性光照这两者下，混合光照系统的IL-8与UV LED相比显著减少。这表明由混合光照消毒系统引起的炎性反应比UV光少。
图18A和18B为示出了优化的异步间歇性消毒光照方案用于病毒的灭活，以及该方案的病毒灭活活性。图18A示出了对大肠杆菌噬菌体T3施加的波形图。图18B示出了对大肠杆菌噬菌体T3的病毒灭活活性。这组图示出了用于优化的异步间歇性光消毒系统的光照方案，包括在10min暴露时间中的前2min期间，为两个不重叠的占空比为1Hz的间歇性(脉冲)405nm LED光照(10％占空比)，随后在剩余8min期间，为1Hz间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光照(80％占空比)和1Hz间歇性(脉冲)470nm LED光照(10％占空比)。与单独的间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光暴露相比，观察到UV(280nm)LED和470nm LED光之间的黑暗期增强了病毒灭活的活性。
配置
图19为用于提供光消毒的示例配置的示意图。描述了电源1901、驱动器1902、控制器1906和光源1911-1916。控制器1906使驱动器1902为光源1911-1916供电，该光源利用可用功率(电源1901)提供所需的光输出。
实施例
实施例1.将由四个UV LED(UVTOP270T039FW,SETi Ltd)的排列组建在用于测试的试验array of light板上。各UV LED都能输出通过分光光度计(ILT900-R,InternationalLight)测定的峰值波长为280nm并且光强度为5.4μW/cm2的UV光。光的阵列由具有5V和0.7A输出的直流电源(GW，GPC-1850D)供电。随后，通过各种剂量的UV LED排列连续照射5μL的细菌悬液(107CFU/mL，绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或粪肠球菌)。取无光照的样品作为对照。对于各数据点做至少三个样品。照明后，从各孔中回收细菌，并且将细菌在TSA板上培养，以37℃孵育24小时。从形成的菌落数量中对活菌进行计数。(图2)
实施例2.将5μL(107CFU/mL)的大肠杆菌悬液接种到96孔微孔板的孔中。随后，由具有一系列波长的LED阵列照射，波长例如为：390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、470nm、850nm和950nm(UV5TZ-390-15、UV5TZ-395-15、UV5TZ-400-15、UV5TZ-405-15、UV5TZ-410-15、HLMP-CB1B-XYODD、TSHG6400和SFH4811，RS Components公司)。将单个LED组安装到板上，并且按96孔板排列。由设置为5V和20mA输出的直流电源(GW,GPC-1850D)对该LED阵列供电。照明60分钟后，从各孔中回收细菌。此外，将回收的细菌涂布在胰蛋白胨琼脂(TSA)板上，以37℃孵育24小时。从形成的菌落数量中对活菌进行计数。(图4)
实施例3.通过脉冲发生器(HP HEWLETT，8114A)控制在实施例1中提及的UV LED，以产生具有50％占空比和1Hz频率的脉冲光照。随后，通过各种剂量的UV LED阵列照射细菌悬液(107CFU/mL，绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或粪肠球菌)。取无光照的样品作为对照。对于各数据点做至少三个样品。照明后，从各孔中回收细菌，按照实施例1所述进行培养和计数。(图6)
实施例4.通过具有5V和0.7A输出的直流电源控制在实施例1中所述的UV LED，以产生连续性光。随后，通过各种剂量的UV LED阵列照射细菌悬液(107CFU/mL，绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或粪肠球菌)。取无光照的样品作为对照。对于各数据点做至少三个样品。照明后，从各孔中回收细菌，按照实施例1所述进行培养和计数。(图6)
实施例5.通过脉冲发生器(HP HEWLETT，8114A)控制波长为405nm和470nm的蓝光矩阵，以产生具有50％占空比和1Hz频率的脉冲光。同时，通过直流电源控制另一组LED矩阵以产生连续性光。随后，分别通过连续和脉冲光照对5μL的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌或绿脓杆菌(107CFU/mL)进行照射。(图7)
实施例6.将200μL的细胞(A431，皮肤/表皮)接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例1中设置的脉冲单个UVLED以0.3mJ/cm2和3.6mJ/cm2对A431进行照射。进行MTT分析以确定细胞的抑制率。(图8)
实施例7.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例1中设置的连续单个UV LED以0.3mJ/cm2和3.6mJ/cm2对A431进行照射。进行MTT分析以确定细胞的抑制率。(图8)
实施例8.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例5中设置的脉冲和连续性405nm单个LED以57.6mJ/cm2对A431进行照射。进行MTT分析以确定细胞的抑制率。(图8)
实施例9.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例5中设置的脉冲和连续性470nm单个LED以45mJ/cm2对A431进行照射。进行MTT分析以确定细胞的抑制率。(图8)
实施例10.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例5中设置的脉冲和连续性405nm单个LED以57.6mJ/cm2对A431进行照射。通过市售人IL-8ELISA试剂盒(R&D
Figure BDA0002444410540000181
ELISA)对A431的IL-8水平进行估测和试验。(图9)
实施例11.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例5中设置的脉冲和连续性470nm单个LED以45mJ/cm2对A431进行照射。通过市售人IL-8ELISA试剂盒(R&D
Figure BDA0002444410540000182
ELISA)对A431的IL-8水平进行估测和试验。(图9)
实施例12.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，通过在实施例1中设置的脉冲和连续性单个UV LED光照以0.3mJ/cm2对A431进行照射。通过市售人IL-8ELISA试剂盒(R&D
Figure BDA0002444410540000183
ELISA)对A431的IL-8水平进行估测和试验。(图9)
实施例13.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，将A431放置在黑暗条件中。通过市售人IL-8ELISA试剂盒(R&D
Figure BDA0002444410540000191
ELISA)对A431的IL-8水平进行估测和试验。(图9)
实施例14.通过脉冲发生器(HP HEWLETT，8114A)控制在实施例1中提及的UV LED，以产生具有50％占空比和一系列的间歇性(脉冲)频率(1Hz、10Hz、20Hz、30Hz、40Hz、50Hz)的脉冲光。同时，通过直流电源控制UV LED以产生连续性光。随后，通过剂量为0.027mJ/cm2的连续和脉冲光照射5μL的绿脓杆菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各频率，实验至少进行三次。经过照明后，从各孔中回收细菌。将细菌在接种在TSA板上，以37℃孵育24小时。从形成的菌落数量中对活菌进行计数。(图10)
实施例15.以0.65mJ/cm2的剂量，通过在实施例14中提及的UV LED装置，通过各种频率的连续和脉冲光照射5μL的大肠杆菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各频率，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例1所述对细菌进行回收、培养和计数。(图10)
实施例16.以1.62mJ/cm2的剂量，通过在实施例14中提及的UV LED装置，通过各种频率的连续和脉冲光照射5μL的金黄色葡萄球菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各频率，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例1所述对细菌进行回收、培养和计数。(图10)
实施例17.以2.59mJ/cm2的剂量，通过在实施例14中提及的UV LED装置，通过各种频率的连续和脉冲光照射5μL的粪肠球菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各频率，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例1所述对细菌进行回收、培养和计数。(图10)
实施例18.通过脉冲发生器(HP HEWLETT，8114A)控制在实施例1中提及的UV LED，以产生具有1Hz和一系列占空比(20％、40％、60％、80％)的脉冲光。同时，通过直流电源控制UV LED以产生连续光。随后，通过剂量为0.027mJ/cm2的连续和脉冲光照射5μL的绿脓杆菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各占空比，实验至少进行三次。经过照明后，从各孔中回收细菌并且将细菌在TSA板上培养，以37℃孵育24小时。从形成的菌落数量中对活菌进行计数。(图11)
实施例19.以0.65mJ/cm2的剂量，通过在实施例18中提及的UV LED装置，通过各种占空比的连续和脉冲光照射5μL的大肠杆菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各占空比，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例2所述对细菌进行回收、培养和计数。(图11)
实施例20.以1.62mJ/cm2的剂量，通过在实施例18中提及的UV LED装置，通过各种占空比的连续和脉冲光照射5μL的金黄色葡萄球菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各占空比，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例2所述对细菌进行回收、培养和计数。(图11)
实施例21.以2.59mJ/cm2的剂量，通过在实施例18中提及的UV LED装置，通过各种占空比的连续和脉冲光照射5μL的粪肠球菌(107CFU/mL)。对照为不进行照明。对于各占空比，实验至少进行三次。经过照明后，如实施例2所述对细菌进行回收、培养和计数。(图11)
实施例22.由10W 405nm LED(CL-P10WB34RSH10100，中国，9-11V，1000mA)、10W470nm LED(CL-P10WU64RSH1030，中国，9-11V，1000mA)和4个UV LED组成的光系统用于产生同步和异步光模式的光源。将LED安装在具有冷却风扇的散热器上。通过蓝光辐射计(HANDY,FL-1D)测定的10W 405nm LED发射光的强度为105.5mW/cm2，而10W 470nm LED发射光的强度为2200mW/cm2。该系统由三节4V充电电池供电，并且由具有可编程微控制器(Arduino)和显示屏的电路控制。曝光时间、频率、占空比和光模式为可调节的。覆盖该装置以防止到达样品的背景白光。(图12)
实施例23.通过在实施例22中提及的系统照射接种有200μL的绿脓杆菌(105CFU/mL)的直径为14cm的琼脂平板10分钟，其中同步光模式的UV剂量为0.976mJ/cm2。通过同时施加1Hz和20％占空比的来自10W LED和脉冲LED的连续性405nm和470nm光来产生同步光模式。将未暴露于光中的样品作为对照。覆盖该装置以防止到达样品的背景白光。(图13)
实施例24.通过在实施例22中提及的系统照射接种有200μL的绿脓杆菌(105CFU/mL)的直径为14cm的琼脂平板10分钟，但是其中异步光模式的UV剂量为0.976mJ/cm2。通过施加1Hz和10％占空比的来自10W LED的交替脉冲405nm和470nm光以及1Hz和20％占空比的来自UV LED的脉冲UV来产生异步光模式。将未暴露于光中的样品作为对照。覆盖该装置以防止到达样品的背景白光。(图13)
实施例25.观察到异步光对杀菌效率的增强取决于曝光的顺序。光照方案1为1Hz脉冲率和90％占空比的间歇性(脉冲)UV(280nm)LED光照。绿脓杆菌的曝光剂量为0.12mJ/cm2、0.16mJ/cm2、0.24mJ/cm2、0.36mJ/cm2和0.48mJ/cm2，并且金黄色葡萄球菌的曝光剂量为0.32mJ/cm2、0.48mJ/cm2、0.64mJ/cm2、0.80mJ/cm2、0.96mJ/cm2。对于各数据点，至少进行了三次实验。通过图像分析软件Image J(Image J1.5 1a，NIH)分析所得平板的照片，该图像分析软件测量间隙的面积。UV(280nm)LED的间隙面积作为对比光照方案2至7的参考(图14和图15)。
实施例26.图14示出的光照方案2至7是异步光的实施例。根据以下公式，与UV(280)LED光相比，光照方案2和7示出了对金黄色葡萄球菌的杀菌效率增强：
Figure BDA0002444410540000211
对各数据点，至少进行三次实验。通过图像分析软件Image J(Image J1.5 1a，NIH)分析所得平板的照片，该图像分析软件测定抑制区的面积百分比。单独的UV光和蓝光的效果充当基准。(图15)
实施例27.图14示出的光照方案2至7是异步光的实施例。根据以下公式，与UV(280)LED光相比，光照方案2和7示出了对绿脓杆菌的杀菌效果增强：
Figure BDA0002444410540000221
对各数据点，至少进行三次实验。通过图像分析软件Image J(Image J1.5 1a，NIH)分析所得平板的照片，该图像分析软件测定抑制区域的面积百分比。单独的UV光和蓝光的效果充当基准。(图15)
实施例28.异步光照系统包括一个10W 405nm(CL-P10WU64RSH1030，中国)、一个10W 470nm(CL-P10WB34RSH10100，中国)和四个UV LED。(图16和18)
实施例29.实施例28所述的异步照明系统对细菌和病毒灭活的性能建议采用不同的最佳光照方案。(图16和18)
实施例30.将200μL的A431细胞接种到96孔板中。经过24小时的生长后，根据图16a的光程序，将A431在实施例28所述的异步光照系统中暴露。通过市售人IL-8ELISA试剂盒(R&D
Figure BDA0002444410540000222
Figure BDA0002444410540000223
ELISA)对A431的IL-8水平进行测定。
结论
综上所述，可以看出可以使用各种波长循环次数和照明的能量。作为非限制性实例，光可以360nm至950nm之间的不同波长提供，并且紫外线波长小于360nm。更窄的范围将提供360nm至530nm之间的波长的光，紫外线波长在100nm至360nm之间。更窄的一组波长集将为360nm至470nm，紫外线波长为大于240nm并且小于360nm。在各波长处的光能量范围可为0.005mJ/cm2至1000mJ/cm2，范围也可以为0.02mJ/cm2至60mJ/cm2。脉冲持续时间受可用于消毒的时间和可用功率的限制，典型占空比的范围为5％至80％。
虽然描述了光源的同时运行，但是也可以驱动光源使得不同光源的占空比引起光源彼此异步运行。
可以理解，在本文中描述和说明的细节、材料、步骤和部件的布置上的许多其他变化，可以由本领域技术人员在所附权利要求中表述的发明的原则和范围内进行描述和说明，以解释主题的本质。

Claims (19)

1.一种用于微生物消毒的方法，包括：
提供使用一个或多个窄波长光源的异步、间歇性光照，所述光源中的至少一者具有与单色LED的光谱宽度一致的窄波长特性，其中所述间歇性光照为快速微生物消毒过程提供了足够高的强度，同时通过不同的灭活途径靶向到多个细胞位点，从而降低在所述微生物消毒过程中用于微生物消毒的平均能耗。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用LED光源作为所述窄波长光源中的至少一者。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用光谱宽度窄于100nm的单波长LED光源作为所述窄波长光源中的至少一者。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用波长范围在200nm至2000nm并且光谱宽度窄于100nm的单波长LED光源作为所述窄波长光源中的至少一者。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用包括360nm至470nm的不同波长的多个LED光以及在大于240nm小于360nm的波长的多个紫外线频率范围LED的光照作为所述窄波长光源。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用包括在360nm至470nm的不同波长的多个LED光以及在大于254nm小于360nm的波长的多个紫外线频率范围LED的光照作为所述窄波长光源。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施加曝光剂量范围为0.005mJ/cm2至1000mJ/cm2的所述异步、间歇性光照。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施加照明频率为0.1Hz至1000Hz并且占空比为1％至99％的所述异步、间歇性光照。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施加照明率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
施加照明率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照；以及
对于光照，选择在约280nm处的紫外线以及在约405nm处和约470nm处的光，光源中的至少两者用作LED光照。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
施加照明率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照；以及
对于光照，选择在约280nm处的紫外线以及约405nm处和约470nm处的光，各光源均用作LED光照。
12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施加照明频率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照作为LED光照。
13.用于提供微生物消毒的设备，该设备包括：
提供异步、间歇性功率的电源；
一种或多种窄波长光源，所述窄波长光源具有与单色LED的光谱宽度一致的窄波长特性，由所述电源驱动并且以与所述异步、间歇性功率一致的占空比运行；以及
与所述电源有效相连的控制器，用于提供所述异步、间歇性功率，并且驱动所述一个或多个光源从而以一个或多个窄波长提供异步、间歇性光照，从而为快速微生物消毒过程提供了足够高的强度，同时通过不同灭活途径靶向到多个细胞位点，降低在所述微生物消毒过程中微生物消毒所需的平均能耗。
14.根据权利要求13所述的设备，其中所述窄波长光源中的至少一者包括光谱宽度窄于100nm的LED光源。
15.根据权利要求13所述的设备，其中控制器提供了所述异步、间歇性功率，从而提供了照明频率为0.1Hz至1000Hz并且占空比为1％至99％的所述异步、间歇性光照。
16.根据权利要求13所述的设备，其中控制器提供了所述异步、间歇性功率，从而提供了照明频率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照。
17.根据权利要求13所述的设备，进一步包括：
所述控制器提供了所述异步、间歇性功率，从而提供了照明频率为0.1Hz至100Hz以及占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照；以及
所述光照包括在约280nm处的紫外线，以及约405nm处和约470nm处的光，光源中的至少两者用于LED光照。
18.根据权利要求13所述的设备，进一步包括：
所述控制器提供了所述异步、间歇性功率，从而施加照明频率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照；以及
所述光源中的至少一者包括光谱宽度窄于100nm的LED光照。
19.根据权利要求13所述的设备，进一步包括：
所述控制器提供了所述异步、间歇性功率，从而施加照明频率为0.1Hz至100Hz并且占空比为10％至99％的所述异步、间歇性光照；以及
所述光源包括LED光照。
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