CN111500673B - 一种血管紧张素转化酶测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2，试剂R1包含以下组分：N‑三(羟甲基)甲基‑3‑氨基丙磺酸、氯化钠、离子激活剂、聚甘油脂肪酸酯、4‑羟基2,2,6,6‑四甲基‑1‑氧‑哌啶(AAQ‑2)、防腐剂；试剂R2包含以下组分：N‑三(羟甲基)甲基‑3‑氨基丙磺酸、FAPGG、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒是一种抗干扰能力强、稳定性强、重复性好的液体试剂盒。

Description

一种血管紧张素转化酶测定试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种血管紧张素转化酶测定试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE，EC3.4.15.1)是一种哺乳动物组织中普遍存在的Zn2+依赖型羧二肽酶，为膜整合的单链糖蛋白，主要存在于肺血管内皮细胞，也可见于子宫、胎盘、心脏、肾、大脑、肾上腺皮质等大多数组织中。通过肾素-血管紧张素系统RAS(rennin-angiotensin system)和激肽释放酶-激肽系统,ACE对血压、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要调节作用。在Zn2+存在的条件下，ACE能水解十肽血管紧张素I(angiotensin I,Ang I)中Phe8-His9之间的肽键，产生八肽血管紧张素 II(Ang II)和羧基端的二肽His-Leu。血管紧张素II是目前研究发现最强的收缩血管物质之一，作用于血管紧张素受体1，收缩血管平滑肌，刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，从而导致血压升高，对于心脏具有正性肌力作用和变时作用；同时，ACE还水解血管舒张剂-缓激肽羧基末端两个氨基酸，钝化其扩张血管的生物活性，被称为激肽水解酶2。除了底物血管紧张素I和缓激肽外,ACE还可以水解多种血管活性肽，如脑啡呔、P物质、神经降压素等，体外实验证明其能水解Alzheimer症中过量表达的β淀粉样蛋白。
血清中ACE含量的水平，取决于组织细胞对ACE的合成与释放能力。如果细胞这种功能失调，则影响组织与血液之间ACE含量的动态平衡，引起血清中的ACE含量改变，在临床上对肺部疾病、肝脏疾病、糖尿病、冠心病、心肌梗死等疾病具有诊断意义，血清ACE 可作为临床相关诊断的指标。
早期关于ACE测定多采用荧光光度法、生物学放射层析法、分光光度法，随着对ACE研究的深入，相继建立了高效液相色谱法、放射免疫法、酶偶联法及ACE基因测定法等。
酶偶联法:血清中的ACE作用于底物马尿酸双苷肽，生成马尿酸和双苷肽，再由γ-谷氨酰基转移酶作指示酶催化酶偶联反应，在410nm处测定其吸光度，ACE活性与生成物量呈正比。偶联反应如下：
Figure RE-GDA0002547961740000011
Figure RE-GDA0002547961740000012
放免法：此法使用蛋白酶抑制剂Lisinopril、Aprotinin及EDTA结合的放射免疫分析法，但需要特殊仪器，应用不广泛。
分光光度法：利用马尿酸-组氨酸-亮氨酸作为ACE的反应底物，被分解成马尿酸和组氨酸-亮氨酸，马尿酸和氰尿酰氯结合呈淡黄色，通过比色法可计算ACE的活性。
连续监测法：使用呋喃丙烯基丙氨酰甘氨酰甘氨酸(furylacryloyl-phe-Gly-Gly,FAPGG)作为底物测ACE的特异活性。FAPGG被ACE催化水解时，产生吸光度变化，在340nm处测定。此法灵敏度明显改善，参考值范围也被确定。近期国内外资料测定血清(浆)或组织液 ACE活性大多采用FAPGG作底物的试剂，且此法可用于全自动生化分析仪，适合于临床常规检验。但是由于血管紧张素转化酶活性容易受胆红素等因素的抑制，普通的血管紧张素转化酶检测试剂存在重复性不好、抗干扰性能差等缺点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种血管紧张素转化酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强、抗干扰能力强、重复性好的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2:
试剂R1包含以下组分：
Figure RE-GDA0002547961740000021
试剂R2中含有以下成分：
Figure RE-GDA0002547961740000022
优选地，试剂R1的pH值为7.0-9.0；试剂R2的pH值为7.0-8.5。
优选地，试剂R1中所述的离子激活剂为氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、磷酸锌的一种或多种。
优选地，试剂R2中所述的稳定剂为壳寡糖、甘油、Surfynol-465的混合物，壳寡糖、甘油、Surfynol-465的质量比为2:3-5:4-8。
优选地，试剂R1中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种；试剂R2中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
上述所述的血管紧张素转化酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
(1)试剂R1的配制：取适量水，分别依次加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值7.0-9.0，定容到所需体积。
(2)试剂R2的配制：取适量水，分别依次加入R2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值7.0-8.5，定容到所需体积。
上述所述的血管紧张素转化酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中血管紧张素转化酶的浓度。
本发明血管紧张素转化酶测定试剂盒原理为FAPGG被ACE催化水解时，产生吸光度变化，在340nm处测定，FAPGG最大吸收峰在340nm。
本发明有益效果
1)本发明血管紧张素转化酶测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用，试剂R1对样本进行孵育，去除干扰，试剂R2最大限度保持FAPGG的稳定性。
2)本发明血管紧张素转化酶试剂R1和R2中的缓冲液为TAPS缓冲液，能够促进血管紧张素转化酶的催化作用，在添加氯化钠的基础上，同时添加锌金属盐，两者都作为反应的离子激活剂，彻底激活酶催化底物的能力，保证反应的特异性、准确性。
3)本发明血管紧张素转化酶试剂R1中聚甘油脂肪酸酯去除血清中的的胆红素对血管紧张素转化酶活性的抑制作用，添加4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶(AAQ-2)可去除抗坏血酸对试剂的干扰作用，提高试剂的抗干扰性能。
4)本发明通过试剂中添加壳寡糖、甘油、Surfynol-465，可以协同保护试剂中的FAPGG， Surfynol-465作为表面活性剂使反应体系均一稳定，更有利于试剂稳定性和重复性的提高。
附图说明
图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；
图2为对比例1和对比例2试剂的相关性曲线；
图3为实施例1和对比例1、2、5、6、7提供的唾液酸测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明试剂盒测定血清中血管紧张素转化酶的测试条件为：方法：速率法；主波长： 340nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向下。
操作步骤
表1血管紧张素转化酶测定试剂操作步骤
Figure RE-GDA0002547961740000041
计算方法
Figure RE-GDA0002547961740000042
样本要求：
1.新鲜血清。
2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定30天，-20℃保存可稳定6个月。
实施例1
一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000043
试剂R2的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000044
Figure RE-GDA0002547961740000051
试剂R1的pH值为7.5；试剂R2的pH为8.2；
(1)试剂R1的配制：取适量水，分别依次加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需pH值，定容到所需体积。
(2)试剂R2的配制：取适量水，分别依次加入R2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到pH值，定容到所需体积。
实施例2
试剂R1的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000052
试剂R2的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000053
试剂R的pH值为7.8；试剂R2的pH为8.2。
制备方法同实施例1。
实施例3
试剂R1的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000054
Figure RE-GDA0002547961740000061
试剂R2的组分为：
Figure RE-GDA0002547961740000062
试剂R的pH值为8.3，试剂R2的pH为8.5。
制备方法同实施例1。
对比例1
进口血管紧张素转化酶测定试剂盒。
对比例2
本对比例采用市场上获得认可的血管紧张素转化酶试剂盒。
其中试剂R包括如下含量的组分：
Figure RE-GDA0002547961740000063
对比例3
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含聚甘油脂肪酸酯，其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶(AAQ-2)，其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂不含壳寡糖，其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂不含甘油，其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂不含Surfynol-465，其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1中血管紧张素转化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含聚甘油脂肪酸酯，而含有等量的曲拉通X-100，其它与实施例1相同。
性能验证
试验一 相关性试验
试验方案为：实施例1、对比例1和对比例2，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为靶值，分别计算40 对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。
表2相关性对比实验结果
Figure RE-GDA0002547961740000071
Figure RE-GDA0002547961740000081
Figure RE-GDA0002547961740000091
表3对比例1分别与实施例1和对比例2的相关系数
相关系数r
实施例1和对比例1 0.9994
对比例2和对比例1 0.9783
由表2和图1的可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清样本测试偏差最大值为-1.9％，两种试剂的相关系数为0.9994，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂准确度较高；由表2和图2可以看出，对比例2和对比例1 检验结果偏差较大，相关系数为0.9783，说明本发明试剂盒通过优化反应体系，准确度优于对比例2。
试验二 干扰性试验
对实施例1和对比例3、4、8提供的血管紧张素转化酶测定试剂盒进行抗干扰性试验，试验方案为：取靶值为93±3.5U/L的血管紧张素转化酶质控品，分成5等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表3的要求，然后分别采用实施例1和对比例3、4、8所得的试剂，测定质控品中血管紧张素转化酶的含量，其中相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％。
表4抗干扰性能试验结果比较
Figure RE-GDA0002547961740000092
由表4可以看出，在上述浓度干扰物质存在时，本发明试剂盒的检测结果相对偏差小，没有受到明显干扰，而对比例试剂相对偏差较大，干扰效果明显，说明本发明的试剂盒抗干扰能力优于对比例试剂，说明聚甘油脂肪酸和4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶(AAQ-2)和的添加有效增强了试剂盒的抗干扰性能。
试验三 稳定性实验
对实施例1和对比例1、2、5、6、7提供的血管紧张素转化酶测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、5、6、7提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为93±3.5U/L的质控品，并监测质控品测定值的变化。
表5试剂热稳定性验证结果
时间(天) 实施例1 对比例1 对比例2 对比例5 对比例6 对比例7
1 93.5 93.5 93.9 93.6 92.7 93
2 93.3 94.3 93.4 93.9 94.1 93.1
3 93.1 92.9 94.3 93.6 94.2 93.4
4 94.2 93 86.5 93.4 92.7 92.6
5 93.5 94.1 81.6 92.6 94.1 92.8
6 94.3 94.4 76.8 94.5 89.5 93.7
7 93.2 93.4 70.8 88.8 87.8 89
8 93.5 93 63.5 84.3 85.5 87.8
9 93.3 93.2 58.2 82.2 82.3 83.5
10 93 93.8 55.2 80.5 78.5 83.2
由表5和图3可以看出，与对比例1相似，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例1、2、5、6、7试剂在37℃水浴条件下 10天内变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比例1、2、5、6、7试剂盒的稳定性，说明本发明壳寡糖，甘油，Surfynol-465的同时加入，可以协同提高血管紧张素转化酶的稳定性。
试验四 重复性试验
分别选取高值、中值、低值三个质控，分别用实施例1和对比例1、2进行对照检测，对每份质控进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。
表6试剂重复性验证结果
Figure RE-GDA0002547961740000101
Figure RE-GDA0002547961740000111
由检测结果可知，实施例1检测数值接近靶值，标准偏差小，变异系数小，重复性较好。这说明本发明通过调整优化反应体系，优化了反应过程，抑制了副反应，极大的提高了试剂的重复性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (3)

1.一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2:
试剂R1包含以下组分：
N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸 150mmol/L
氯化钠 350 mmol/L
氯化锌 0.5mmol/L
聚甘油脂肪酸酯 5mg/L
4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶 5mg/L
叠氮钠 1g/L
试剂R2的组分为：
N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸 120mmol/L
FAPGG 1mmol/L
壳寡糖 2g/L
甘油 5g/L
Surfynol-465 6g/L
叠氮钠 1g/L
试剂R1的pH值为7.5；试剂R2的pH为8.2；所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
2.一种权利要求1所述的血管紧张素转化酶测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂R1的配制：取适量水，分别依次加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值7.5 ，定容到所需体积；
(2)试剂R2的配制：取适量水，分别依次加入R2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值8.2，定容到所需体积。
3.一种权利要求1所述的血管紧张素转化酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中血管紧张素转化酶的浓度。
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Denomination of invention: The invention relates to an angiotensin converting enzyme determination kit and a preparation method and application thereof

Effective date of registration: 20211209

Granted publication date: 20210330

Pledgee: Zhongkai Medical Technology Co.,Ltd.

Pledgor: China kemeo (Shandong) medical laboratory Co.,Ltd.

Registration number: Y2021980014403

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