CN111494351B - 碱性品红在抗肿瘤中的应用以及药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了碱性品红在抗肿瘤中的应用以及药物,涉及肿瘤治疗技术领域。本发明公开了碱性品红在制备用于抗肿瘤的药物中的应用,该肿瘤为EGFR表达呈阳性的肿瘤。本发明研究首次发现碱性品红可以显著改善晚期肺腺癌病人的生活质量,延长生存期,同时能够抑制人肺腺癌细胞的增殖,降低PI3K、Akt和mTOR的mRNA表达,减弱p‑PI3K、p‑Akt和p‑mTOR的蛋白表达,提示碱性品红可用于肿瘤治疗列如EGFR表达呈阳性的肿瘤治疗中。本发明为防治EGFR表达呈阳性的肿瘤尤其是经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的肿瘤提供了新的治疗方法、新的策略和新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域,具体而言,涉及碱性品红在抗肿瘤中的应用以及药物。
背景技术
肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,85%的肺癌为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)。非小细胞肺癌包括腺癌、鱗状细胞癌和大细胞肺癌等分型,而肺腺癌是最主要和常见的亚型。大部分肺腺癌患者表现为手术和/或放疗难以治愈的局部晚期或远处转移性疾病,因此全身化疗和/或靶向治疗是主要治疗手段。但由于各种原因导致部分患者产生耐药,从而降低了化疗效果,致使病情进展,出现复发或远处转移,几乎所有的肺腺癌病人都会在治疗的2-3年内产生耐药,而导致肺腺癌病人死亡的另外一个主要原因是肺癌出现转移。
随着肿瘤分子生物学研究的进展,随着人们对肺癌发病机制的深入研究,人们开始针对肺癌的驱动基因、肿瘤细胞生长的关键调控因子进行靶向治疗,取得了较好的临床效果。在这其中针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向治疗成为靶向治疗的典范。吉非替尼(Gefitinib Tablets)和厄洛替尼(ErlotinibHydrochloride Tablets)是最早应用的第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TK1)药物,两者均可以通过与ATP竞争性结合EGFR酪氨酸激酶位点,抑制EGFR磷酸化并阻断向下传递的生存信号,从而阻止携带EGFR敏感突变的肺癌细胞生长。目前,多项临床试验证实,EGFR-TK1较化疗明显延长晚期EGFR敏感突变肺腺癌患者的生存时间,因此EGFR-TK1已经成为EGFR敏感突变的晚期肺腺癌患者的一线治疗选择。然而,与其他抗肿瘤药物一样,长期使用EGFR-TK1后仍不可避免的出现疾病进展和耐药,大部分患者在用药8-10个月后发生耐药。因此,EGFR-TK1耐药后的治疗策略是目前晚期肺腺癌研究的热点。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供碱性品红在治疗肺腺癌中的应用。
本发明的目的在于提供一种用于治疗肺腺癌的药物。
在我国,恶性肿瘤已成为我国居民的主要死因,占死亡原因20%以上。非小细胞肺癌(NSCLC)是我国高发肿瘤,其发病率居男性肿瘤患者的第一位、女性肿瘤患者的第二位。大多数病人诊断时分期较晚,失去手术机会,因而,目前放化疗是非小细胞肺癌患者的主要治疗手段。尽管目前世界各国学者对NSCLC进行了大量的基础与临床研究,但的临床治疗仍未获得突破性进展,其5年生存率无明显提高,仍低于15%。近年来,随着对肿瘤发病机制研究的深入,表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在NSCLC的发生、发展中的作用逐渐被发现,基于此而发展起来的靶向治疗已成为恶性肿瘤的一种全新的治疗手段。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TK1)如吉非替尼、厄洛替尼等,已广泛应用于NSCLC的临床治疗。国内外已有多个大规模随机对照研究证实,在EGFR突变阳性的患者中,EGFR-TK1靶向疗的疗效与化疗相当,但较化疗的副作用明显减少,病人耐受性好。然而,接受靶向治疗的患者几乎无可避免的出现靶向治疗耐药,患者发生耐药的中位时间约为10个月。因此,研究延缓或逆转EGFR-TK1耐药的方法已成为临床医生和科研工作者目前需要解决的问题。
EGFR是一种广泛表达于正常细胞及肿瘤细胞表面的受体蛋白,属于ErbB家族的酪氨酸激酶受体,由胞外结构域,跨膜区,胞内结构域三部分组成。ErbB家族共有4个成员,分别是EGFR(ErbB1),HER2/Neu(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。EGFR是第一个被发现的ErbB家族成员。在头颈部麟癌、NSCLC、结肠癌等多种肿瘤中,均存在EGFR的表达,在NSCLC病人中,约93%的病人存在EGFR表达,45%的病人存在EGFR过表达。EGFR过表达的病人预后较差,生存期较短。EGFR的配体主要有EGF和TGF-α。配体与受体胞外结构域结合后,引起受体二聚化,进而激活胞内段的酪氨酸激酶活性,并依次激活下游的有关信号分子。胞内段的受体酪氨酸激酶激活后,主要通过MAPK通路、PI3K/AKt/mTOR通路以及STAT通路传递信号。其中,PI3K/AKt/mTOR信号转导通路是最重要的信号转导通路,并且,PI3K/AKt/mTOR信号转导通路也是多种生长因子受体共同的下游信号通路。PI3K是细胞内一种重要的蛋白激酶,PI3K活化后,可磷酸化激活AKt并进一步调控下游的mTOR、caspase、P27/P21等多条信号通路的活性,从而影响影响肿瘤细胞的增殖、调亡等多种生物学行为。
具有EGFR突变的细胞,其信号转导主要通过突变的EGFR信号通路进行,这是针对EGFR信号通路的靶向治疗的理论基础。目前,抑制EGFR受体信号通路主要通过两种方式:小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼、厄洛替尼)和EGFR受体单抗(如西妥昔单抗)。EGFR-TK1是一种喹唑啉类小分子物质,可分为可逆性和不可逆性TK1。可逆性TK1进入细胞后,可以通过与ATP竞争EGFR受体胞内段酪氨酸激酶结构域的结合位点,从而抑制EGFR的磷酸化,及其下游的信号转导。在具有EGFR活化突变的NSCLC病人中,EGFR-TK1已应用于各线治疗,并显示出较好的疗效。已有大规模临床试验证实,在具有EGFR活化突变的局部晚期及晚期(Ⅲb和Ⅳ期)NSCLC病人中,EGFR-TK1在各线治疗中均可取得较好的疗效,并且具有更小的副作用,更高的生活质量。
虽然靶向治疗在患者的临床治疗中取得了良好的疗效,但病人服用EGFR-TK1—段时间后,几乎不可避免地出现耐药,其出现耐药的中位时间约为10个月。目前对EGFR-TK1耐药的机制尚不完全清楚,现有研究提示,多种机制导致了NSCLC的EGFR-TK1耐药。其中,受体酪氨酸激酶的旁路激活是导致EGFR-TK1耐药的重要机制,如c-Met、IGF-1R、PDGFR等这些受体的激活,可通过相互重叠的信号转导通路,引起共同的下游信号转导通路,主要是PI3K/AKt/mTOR。实验研究已证实PI3K/AKt/mTOR信号通路在EGFR-TK1的耐药过程中发挥重要作用。在EGFR-TK1耐药的NSCLC细胞株中,普遍存在着mTOR信号通路的过度激活,因此,mTOR可能是逆转耐药的重要靶点。
碱性品红又称盐基品红、碱性新品红、玫瑰苯胺盐酸盐,俗称“鬼子红”,主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物,分子量为337.85,是一种绿色金属光泽结晶。其结构式如下:
鬼子红在东北民间被用作治疗胃病、口腔溃疡和口疮的特效偏方,在萧红所著的《呼兰河传》中就有记载。临床实践中主要用于治疗胃粘膜脱落引起的急性胃痛。临床医生也曾用鬼子红治疗晚期颈淋巴结结核,收到的疗效显著。
但碱性品红对肺腺癌,尤其是晚期肺腺癌,更尤其是对经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的晚期肺腺癌是否有治疗效果或其治疗机理,目前,罕有相关报道。
基于此,本发明提出如下:
第一方面,碱性品红在制备用于抗肿瘤的药物中的应用,所述肿瘤为EGFR表达呈阳性的肿瘤;
优选的,所述EGFR表达呈阳性的肿瘤为非小细胞肺癌、头颈部鳞癌或结肠癌;优选的,所述非小细胞肺癌为肺腺癌、鱗状细胞癌、胚胎型腺癌、腺泡型腺癌、乳头型腺癌、实性型腺癌、浸润性黏液腺癌、黏液/非黏液混合性腺癌、胶样腺癌、胎儿型腺癌、肠型腺癌、微浸润性腺癌、腺鳞癌、肉瘤样癌或大细胞肺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述肺腺癌为晚期肺腺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述晚期肺腺癌为经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的晚期肺腺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼和/或厄洛替尼。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述碱性品红通过调控PI3K/Akt信号通路使mTOR活性减弱或表达降低,逆转EGFR-TK1的耐药性,发挥了对肺腺癌的治疗作用。
本发明研究中,发明人发现碱性品红可以显著改善晚期肺腺癌病人的生活质量,延长生存期,同时能够抑制人肺腺癌细胞PC9的增殖和降低mTOR的mRNA表达,提示调控mTOR的表达可能涉及碱性品红的抗肿瘤作用。其可能涉及的机理是:PI3K/AKt/mTOR信号通路异常在肺腺癌EGFR-TK1耐药机制中扮演重要角色,具有临床抗肿瘤疗效的碱性品红通过调控PI3K/Akt使mTOR活性减弱,进而逆转EGFR-TK1的耐药性,发挥了对肺腺癌的治疗作用。
基于本发明的内容,本领域技术人员应该理解到,对于涉及EGFR表达呈阳性的肿瘤且这些肿瘤的治疗使用了表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性,根据本发明的结果,碱性品红用于治疗这些肿瘤都应取得与本发明实施例类似的治疗效果。因此,将碱性品红用于到治疗EGFR表达呈阳性的肿瘤,或用于制备治疗EGFR表达呈阳性的肿瘤的药物,一些含有作为活性成分的碱性品红的抗EGFR表达呈阳性的肿瘤的药物均属于本发明的保护范围。
本发明的研究为碱性品红抗EGFR表达呈阳性的肿瘤例如肺腺癌的临床应用提供实验依据和理论支持,同时为防治EGFR表达呈阳性的肿瘤尤其是经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的肿瘤提供了一种新方法、新策略和新思路。
另一方面,本发明提供了一种用于抗肿瘤的药物,其含有作为活性成分的碱性品红以及药学上可接受的辅料。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述肺腺癌为晚期肺腺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述所述晚期肺腺癌为经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的晚期肺腺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼和/或厄洛替尼。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述碱性品红通过调控PI3K/Akt信号通路使mTOR活性减弱或表达降低,逆转EGFR-TK1的耐药性,发挥了对肺腺癌的治疗作用。
再一方面,本发明提供了一种治疗肿瘤的方法,其包括:向患有肿瘤的患者施用含有作为活性成分的碱性品红的药物;
所述肿瘤为EGFR表达呈阳性的肿瘤;
优选的,所述EGFR表达呈阳性的肿瘤为非小细胞肺癌、头颈部鳞癌或结肠癌;
优选的,所述非小细胞肺癌为肺腺癌、鱗状细胞癌或大细胞肺癌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述患者为晚期肺腺癌患者。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述患者为经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的晚期肺腺癌患者。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼和/或厄洛替尼。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述碱性品红通过调控患者体内PI3K/Akt信号通路使mTOR活性减弱或表达降低,逆转EGFR-TK1的耐药性,进而实现对肺腺癌的治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中的对照组和实验组的PFS比较。
图2为实施例1中的对照组和实验组的OS比较。
图3为实施例2中的碱性品红对人肺腺癌细胞A549增殖抑制率的影响。
图4为实施例2中的碱性品红对人肺腺癌细胞PC9/GR增殖抑制率的影响。
图5为实施例3中的碱性品红对PC9/GR细胞吉非替尼敏感性的影响。
图6为实施例3中各组细胞凋亡流式细胞仪检测图,A:空白对照组;B:吉非替尼组;C:碱性品红组;D:碱性品红+吉非替尼组。
图7为实施例3中各组细胞凋亡率比较,与空白对照组比较,*P<0.05。
图8为实施例4中碱性品红对p-PI3K、p-Akt和pmTOR蛋白表达影响的Western blot分析,A:空白对照组,B:模型组,C:药物组(0.5umol/L),D:药物组(1.5umol/L),E:药物组(2.5umol/L)。
图9为实施例4中碱性品红对人肺腺癌细胞PC9/GR的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达影响的统计结果。
图10为实施例5中的碱性品红对人肺腺癌细胞PC9/GR的PI3K、Akt和mTOR基因表达影响的mRNA表达水平统计结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
收集来自齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心2013年1月至2018年12月的经组织学或细胞学诊断为肺腺癌的病人,从中选取符合课题组研究计划纳入标准的61例病人。病人的临床信息主要包括:年龄、性别、吸烟史、ECOG评分、肿瘤TNM分期、EGFR突变情况、EGFR-TKI使用情况、治疗过程中出现的毒副反应,以及治疗后疗效评价等。
病例纳入标准:EGFR敏感突变主要是指Exon19缺失或Exon21L858R突变;病理诊断为肺腺癌;临床分期为III b及Ⅳ期;符合Jackman临床标准,曾接受一线EGFR-TKI治疗失败的继发性耐药患者;耐药者基因检测为EGFRT790M野生型,ECOG评分0-2分;肿瘤病灶可测量,例如CT扫描病灶直径≥1cm;肝肾功能、心脑血管系统无大碍;预计生存期大于12周。
病例排除标准:原发性EGFRT 790M突变或少见突变的肺癌患者;心、脑、肝、肾、骨髓等器官功能不全;存在智力障碍,无法行驶自主权的患者;急性感染期患者;正在接受其他抗肿瘤药物或生物制剂。
随机分为对照组和实验组,对照组给予吉非替尼250mg/d,实验组在对照组给药基础上给予碱性品红,碱性品红用100℃热水溶解,浓度控制在0.4mg/mL,常温避光保存,15-20mL/次,2次/d,餐后服用,28d为一个周期。随访时间从化疗结束开始到死亡、失访或随访结束,比较两组疾病无进展生存期(Progression-Free-Survival,PFS)和总生存(overallsurvival,OS),研究结果见图1-图2。利用Kaplan—Meier生存曲线分析比较对照组和实验组两组病人的PFS和OS,研究结果显示,见图1和图2,采用碱性品红干预的实验组的PFS和OS均有延长趋势,提示碱性品红对晚期肺腺癌病人确实具有较显著疗效。
两组患者近期疗效评价标准主要参照RECIST实体瘤评价标准:完全缓解(complete response,CR):所有靶病灶消失,全部病理淋巴结短直径必须<10mm;部分缓解(partialresponse,PR):靶病灶直径之和比基线水平减少≧30%;疾病稳定(stabledisease,SD):靶病灶减小的程度没达到PR,增加的程度也没达到疾病进展(progressivdeisease,PD)水平,介于两者之间,将直径之和的最小值作为参考;PD:靶病灶直径之和的最小值作为参照,直径和相对增加≧20%(如果基线测量值最小就以基线值作为参照);除此之外,必须满足直径和的绝对值增加≧5mm(出新病灶也视为疾病进展)。客观缓解率(objective remission rate,ORR)=(CR+PR)/总例数×100%。疾病控制率(diseasecontrolrate,DCR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。两组患者治疗后进行疗效评估,结果显示(见表1),对照组和实验组患者的ORR比较无统计学差异(P>0.05),且两组患者的DCR比较亦无统计学差异(P>0.05)。
表1两组患者的近期疗效比较
组别 | n | CR | PR | SD | PD | ORR(%) | DCR(%) |
对照组 | 31 | 0 | 12 | 13 | 6 | 38.71 | 80.65 |
实验组 | 30 | 0 | 11 | 14 | 5 | 36.67 | 83.33 |
两组患者毒副反应按照NCI-CTC4.0标准进行评价,分级为I-Ⅳ级。毒副反应监测的指标包括:骨髓功能(白细胞减少、血小板减少、贫血)、消化道(恶心呕吐、腹泻)、肝毒性(转氨酶升高、胆红素升高)、肾毒性(尿素氮升高、肌酐升高)、周围神经毒性(四肢麻木无力)、皮疹情况和疲乏情况等,结果见表2。两组患者治疗过程中主要毒副反应如表2所示,两组患者在治疗过程中均无药物相关性死亡。两组最常见的毒副反应均为骨髓功能受抑制,主要表现为白细胞减少、血小板减少和贫血,但两组患者的表现无显著差异(P>0.05);两组患者的消化系统反应亦无显著差异(P>0.05);两组患者的肝功能、肾功能、周围神经毒性和皮疹的表现无显著差异(P>0.05)。
表2两组患者毒副反应发生情况比较
实施例2
碱性品红对人肺腺癌细胞增殖抑制率的影响
方法:
(1)碱性品红的配制
称取适量标准品碱性品红,溶于浓度0.1%乙醇溶液,配制成适宜浓度的母液,于4℃保存备用。实验时用完全培养基稀释至所需浓度。
(2)吉非替尼的配制
取片状吉非替尼,于研钵中研磨,溶于二甲基亚砜(DMSO)中,0.22μm除菌过滤器过滤后,制成浓度适宜的吉非替尼母液,于-20℃保存备用。使用时解冻后用完全培养基配成所需浓度。
(3)完全培养基的配制
胎牛血清于-20℃保存,使用前于4℃冰箱中过夜解冻。配制完全培养基时,将胎牛血清和1640培养基按的1:9比例混合,即配成含10%胎牛血清的细胞培养基。于4℃冰箱保存备用。实验时,将其置于37℃恒温水浴箱中预热。
(4)MTT法检测碱性品红对A549、PC9/GR细胞的增殖抑制作用
(a)细胞种板
取对数生长期的A549、PC9/GR细胞,经胰酶消化后加入3mL完全培养基终止消化,离心后,弃去上清液,加入完全培养基制成细胞悬液,进行细胞计数后,调整细胞浓度至1×104个/mL,以200μl/孔(即每孔2000个细胞)接种至96孔板中,其周边孔均用200μlPBS缓冲液填充,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞贴壁后即可进行药物干预。
(b)药物干预
待96孔板中各孔内细胞贴壁后,换新培养液处理,分别加入碱性品红浓度分别为0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L的200μl培养基,同时设对照组(培养液细胞)及调零组(只含培养基,不含细胞)。另设24h、48h、72h、三个时间梯度。各组均设6个复孔,置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
(c)MTT测定
A549、PC9/GR细胞在药物干预20、44、68小时后,每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,然后继续放入培养箱中培养。4小时后终止培养,小心吸尽上清,每孔加入DMSO 150μL,在振荡器上避光震荡10分钟,使结晶物充分溶解。在酶标仪上,于492nm波长下测定各孔吸光度(OD值),记录实验结果。同时选择0.1%的DMSO为阴性对照组,而只加细胞悬液的为空白对照组,用Graphpad5.0软件进行数据处理,计算半数抑制浓度(IC50),抑制率=1-(OD阴性对照-OD空白对照)×100%/(OD实验-OD空白对照)。
(d)结果见表3-4与图3和图4。
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与24h比较,#P<0.05,与48h比较,ΔP<0.05。
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与24h比较,#P<0.05,与48h比较,ΔP<0.05。
MTT检测结果显示,当干预时间为24h,碱性品红对人肺腺癌A549和PC9/GR细胞株的增殖抑制作用不很显著,随着作用时间的延长,各实验浓度碱性品红对A549和PC9/GR细胞的抑制作用均增强。当干预时间为48h、72h,随着碱性品红浓度的增加,A549和PC9/GR细胞的增殖抑制率亦升高。在相同的碱性品红浓度下,碱性品红对A549和PC9/GR细胞的增殖抑制作用随着作用时间的延长而增强,其差异均具有统计学意义(P<0.05),可见碱性品红对A549和PC9/GR细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。
实施例3
碱性品红对PC9/GR细胞吉非替尼敏感性的影响
(1)以吉非替尼(10μM)联合不同浓度碱性品红作用于细胞48小时,以MTT法检测细胞增殖抑制率,判断不同浓度碱性品红对PC9/GR细胞吉非替尼敏感性的影响(见表5和图5)。
选择对数生长期细胞,控制浓度为5×104个/mL,200μL/孔接种于96孔板中,置于设置为37℃和5%的CO2的培养箱中12h。待细胞贴壁后,进行换液,分别加入浓度为0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L的碱性品红,同时加入20μm吉非替尼的200μL培养基。每个浓度设计4个平行孔,同时选择0.1%的DMSO为阴性对照组,而只加细胞悬液的为空白对照组,用Graphpad5.0软件进行数据处理,计算半数抑制浓度(IC50),抑制率=1-(OD阴性对照-OD空白对照)×100%/(OD实验-OD空白),结果见表5。
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与24h比较,#P<0.05,与48h比较,ΔP<0.05。
(2)流式细胞术分析碱性品红(2.5μmol/L)、吉非替尼(20μM)、碱性品红+吉非替尼干预细胞48h后,细胞凋亡率的变化。主要借助Annexin V-FITC/PI检测各组细胞的细胞凋亡率,选取对数生长期的细胞,接种于6孔板后,进行相应的实验组别处理,首先于6孔板内加入Annexin V进行共孵育,PBS冲洗后重悬细胞,再加入FITC/PI,流式细胞仪检测细胞凋亡,结果见图6和图7。
检测结果显示,碱性品红(2.5μmol/L)、吉非替尼(10μM)、碱性品红+吉非替尼干预细胞48h后,均可导致细胞调亡率增加,与无药物干预的空白对照组比较,均具有统计学差异(P<0.05),且碱性品红协同吉非替尼增高细胞调亡率要显著于单独使用碱性品红/吉非替尼(P<0.05)。
实施例4
碱性品红对PI3K/AKt/mTOR信号转导通路关键信号分子的影响。
采用Western blot检测p-PI3K、p-Akt和pm TOR蛋白表达,实时定量RT-PCR检测PI3K、Akt和mTOR等mRNA表达。
Western blot分析蛋白表达
采用蛋白提取试剂盒分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白。将提取蛋白加200μL上样缓冲液,煮沸10min,室温放置20min溶解沉淀,置-80℃保存备用。用BCA法检测样品蛋白质浓度后,取50μg蛋白质经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2h分离。胶中蛋白质在70mA恒流状态下4℃过夜电泳转移至硝酸纤维素膜。膜在5%脱脂奶粉37℃封闭2h。将兔抗小鼠一抗与硝酸纤维素膜4℃培育过夜。与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG37℃温预1h。用Western印迹荧光发光检测试剂盒发光、压片,应用凝胶成像分析系统分析测定各组条带的积分光密度,结果见图8-图9和表6。
注:与模型组比较,*P<0.05;与(1.5μmol/L)组比较,#P<0.05
Western blotting检测结果显示,与模型组比较,碱性品红(1.5、2.5μmol/L)组的p-PI3K、p-Akt和pmTOR蛋白表达明显降低,有较显著的统计学差异(P<0.05),且随着浓度增加,这个下降的趋势亦更加明显(P<0.05),具有浓度剂量依赖性。
实施例5
实时定量RT-PCR检测目的基因
采用经典Trizol-氯仿法提取细胞总RNA,琼脂糖电泳检测RNA完整性,紫外分光光度法测定RNA的浓度及纯度。取1μg总RNA,在20μL反应体系中用oligo(d)T引物和SuperScriptⅡ逆转录酶进行逆转录反应,获得cDNA产物。根据NCBI数据库提供的相应基因cDNA序列,用Primer Express Software v2.0设计特异SYBR Green Real-time PCR引物。以cDNA作为模板,在ABI 7000荧光定量PCR仪上的96孔板中用SYBR Green嵌合荧光法进行实时定量PCR反应。mRNA相对表达水平计算公式为2-ΔΔCT,其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT看家基因)实验组-(CT目的基因-CT看家基因)对照组(结果见表7和图10)。
所用引物序列如下:
PI3K内参引物序列:
上游:5’-GTATGAACAGAAGGCCCTAATA-3’,
下游:5’-TTGCAGTTCCAACCAT-3’;
PI3K基因引物序列:上游:5’-GCACTTTACCCTTTCTGCT-A-3’,
下游:5’-GTCCAACTACGCACTGACC-3’;
Akt内参引物序列:上游5’-ACTAGCGATTAGCGATACGACTA-3’,
下游5’-ACGCAATAGCGATCGAGCTAGCT-3’;
Akt基因引物序列:上游5’-ACGCTATATCGGGCTACGCTGAT-3’,下游5’-ATCGATGCGCGTGATCGATGCCG-3’;
mTOR内参引物序列:
上游5’-ATGCGCTAGCTTCGAACCATCGA-3’,下游5’-CTAGCT-TCGATCGATCGGTCAC-3’;
m TOR:上游5’-AAACGTAGCTAGCTTGGCTAGCT-3’,下游5’-TTTGCTATGCGCTTAGGCATAGC-3’。
注:与模型组比较,*P<0.05,与(1.5μmol/L)组比较,#P<0.05
PCR检测结果显示,与模型组比较,碱性品红(1.5、2.5μmol/L)组的PI3K、Akt和mTOR的mRNA表达明显降低,有较显著的统计学差异(P<0.05),且随着浓度增加,这个下降的趋势亦更加明显(P<0.05)。
综合上述结果,临床实验研究结果显示,对照组和实验组在近期疗效方面无显著统计学差异(P>0.05)。实验组的PFS和OS显著长于对照组(P<0.05),提示肺腺癌患者应用碱性品红可以带来远期临床获益。并且两组患者在治疗过程中毒副反应均较轻,最常见的副反应即是骨髓造血系统的功能减退,以及消化道的反应,但两组之间的毒副反应发生率无统计学差异(P>0.05),提示实验组用药并未增加额外的毒性,且临床耐受性较好。该研究为回顾性研究,虽然纳入的病例数量有限,但此实验研究结果可为后续的临床大规模试验提供有益的参考与借鉴。
上述结果显示,碱性品红具有抑制A549细胞和PC9/GR细胞增殖的作用,这种抑制强度呈时间和浓度依赖性;碱性品红可以增强PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性,且经碱性品红协同吉非替尼干预后,PC9/GR细胞的凋亡率要显著于单独使用碱性品红或者吉非替尼;碱性品红具有降低人肺腺癌细胞PC9的PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达,以及p-PI3K、p-Akt和pmTOR的蛋白表达。上述还提示碱性品红可能通过调控PI3K/AKT/mTOR通路关键分子表达,进而实现抑制肿瘤细胞增殖的作用。由PI3K激活,Akt、mTOR核心组件构成的PI3K/Akt/mTOR信号通路是恶性肿瘤常见活化信号通路,主要调节肿瘤细胞的生存、增殖和新陈代谢。作为起始因子PI3K激活促使PDK1与Akt结合进而磷酸化Akt蛋白位点使Akt活化,活化的Akt进一步激活下游的mTOR,随后作用于底物,调控肿瘤的发生。该通路的激活与NSCLC发病密切相关,对该信号通路的调控已成为NSCLC治疗的主要靶点。课题组前期的临床实验研究结果显示,碱性品红可以延长携带EGFR敏感突变(Exon19缺失或Exon21L858R突变)肺腺癌患者的PFS和OS。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.碱性品红在制备用于抗肿瘤的药物中的应用,其特征在于,所述肿瘤为EGFR表达呈阳性的肿瘤;所述肿瘤为晚期肺腺癌,所述晚期肺腺癌为经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的晚期肺腺癌,所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼和/或厄洛替尼。
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