CN111484413A - 丹参素与h2s/no供体结合物及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents

丹参素与h2s/no供体结合物及其制备方法和在制药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属化学制药领域，涉及中草药丹参中有效成分丹参素与H2S/NO供体的结合物及其制备方法和在制药中的应用，尤其是在制备防治心脑血管和炎症相关疾病药物中的用途。本发明通过体外氧化应激损伤和炎症模型实验，结果显示所述的结合物能显著抑制H2O2诱导的SH‑SY5Y细胞氧化应激损伤，对损伤细胞具有明显的保护作用；能显著抑制内毒素(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎性介质，减少炎症诱导的一氧化氮和炎性细胞因子的释放；体内活性实验结果显示，所述的结合物对LPS诱导的小鼠腹膜炎能改善小鼠的凝血时间，明显抑制小鼠腹腔的炎性细胞因子的释放，结果表明所述化合物可用于制备防治心脑血管疾病和炎症性疾病的药物。

Description

丹参素与H2S/NO供体结合物及其制备方法和在制药中的应用
技术领域
本发明属药物合成领域，具体涉及丹参素与H2S/NO供体结合物及其制备方法和在制药中的应用，尤其是在制备防治心脑血管和炎症相关疾病药物中的应用。
背景技术
现有技术公开了心脑血管常见疾病包括冠心病、高血压、脑卒中、心律失常、心力衰竭、急性心肌梗死、高血脂和动脉粥样硬化等。根据《中国心血管病报告2015》的相关介绍，目前心脑血管疾病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为44.60％，城市为42.51％。心脑血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，对人类健康造成巨大的威胁，严重影响了人民的生活质量。
研究表明，炎症反应是心脑血管疾病的首要发病因素之一，并在其发生发展过程及愈后始终扮演重要角色。缺血性心脏病心肌中的炎症反应是巨噬细胞和心肌细胞功能紊乱的诱因，同时又是心肌内氧化应激的诱因。氧化应激引起进一步的心脑血管损伤，严重危害人体健康。研究认为，干预其免疫相关炎症反应将能有效地预防心肌缺血损伤的发生和发展，通过干预缺血心肌中的炎症反应将可有效地防止缺血引起的心肌功能紊乱。
研究显示，炎症(inflammation)可以由病原微生物感染引发，也可以是非感染性因素诱发，是机体对于内外源刺激的一种防御反应。在临床实践中炎症反应是常见的一个病理过程，可以由包括生物性因子、物理性因子、化学性因子、异物、坏死组织和变态反应等各种因素诱发，可出现在机体各部位的组织和各器官。急性炎症具有红、肿、热、痛、机能改变等变化，同时常伴有发热、白细胞增多和炎性介质的大量释放等全身反应，适度的急性炎症反应可诱导机体抗病机能增加，以益于清除致炎因素，使受损组织得到修复，从而使机体的内环境以及内环境和外环境之间达到新的均衡；若长期或过度的急性炎症控制不良转为慢性，炎症迁延不愈，会导致全身炎症水平持续过度升高，引发组织细胞的反复损伤，使局部组织细胞显现变性、坏死和不良修复，瘢痕组织形成和机体组织功能不可逆受损；急性炎症控制不良也可导致炎症全身扩散甚至会危及患者生命，例如，有理论认为当炎症细胞在血管中停留时间过长时，会促使血小板凝结，根据美国心脏协会(American HeartAssociation，AHA)的研究，机体会视这种斑块为异物并且试图在动脉血流中去除它们。一旦斑块变得不稳定、破裂，会形成堵塞流向心脏或大脑的凝块，进而引发心脏病或中风。
中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)具有扩张冠状动脉、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循环、降低心肌耗氧量等作用，被广泛用于冠心病、高血压、高血脂、脑卒中、动脉粥样硬化等各种心脑血管疾病的临床治疗。丹参素(Danshensu)是丹参的主要水溶性活性成分，化学名为(R)-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸，具有抗心肌缺血缺氧、抗心肌缺血再灌注损伤、舒张冠脉、抗心律失常和抗血栓等多种药理作用，对心脑血管系统具有广泛而显著的保护作用。还有研究表明，丹参素具有抗炎与增强免疫、抗肿瘤、保护神经细胞以及防治肝纤维化等作用。目前，丹参素的主要来源是从中药丹参中提取，但是中药的提取工艺复杂，而且丹参素的儿茶酚结构不稳定、易被氧化，极大地限制了丹参素的应用，因此，改善其理化性质和药理活性，开展对丹参素及其衍生物的化学修饰、结构改造以及生物活性研究，对寻求活性更好的化合物并研究其分子作用机制具有重要意义。
Figure BDA0002291672220000021
有研究证明，内源性H2S参与调节心脑血管、呼吸、胃肠道和中枢神经系统的稳态和炎症过程；内源性H2S在心脑血管系统内稳态的调节方面发挥着关键作用，它可以通过激活ATP敏感性钾通道(KATP)或血管Kv7电压门控钾通道而促进血管平滑肌的舒张；可以抑制多种刺激导致的血小板聚集和粘附；可以有效减缓动脉粥样硬化病变的进程；可以缓解血管炎症；H2S显示轻度的负性肌力作用，对缺血再灌注损伤或缺氧损伤发挥保护作用。还有研究表明，内源性H2S具有神经保护、抗炎和抗肿瘤等活性。内源性NO是一种无色无味的脂溶性分子，化学性质活泼，可以自由穿越生物膜，在细胞间传递信息，迅速与靶分子反应并代谢为非活性物质，发挥着广泛的生理效应，在心脑血管系统中起着重要的调节功能，包括调节血压、舒张血管、抑制血小板的粘附和聚集、抑制白细胞的粘附和激活、抑制血管平滑肌细胞的增殖等，在防治心脑血管疾病的发生发展的过程中起重要作用。
基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供新型丹参素与H2S/NO供体的结合物，探究其对H2O2诱导的人神经母瘤细胞的保护作用、对LPS诱导的腹膜巨噬细胞炎症反应的抑制作用以及对LPS诱导的小鼠腹膜炎和肺炎的保护作用，进一步制备新型防治心脑血管和炎症相关疾病的药物。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状和基础，提供一类丹参素与H2S/NO供体结合物及其制备方法。
本发明的进一步目的是提供制得的丹参素与H2S/NO供体结合物在制备药物组合物中的新用途，尤其是制得的丹参素与H2S/NO供体结合物在制备防治心脑血管和炎症相关疾病的药物组合物中的用途。
本发明对丹参素进行结构改造，合成了其与H2S/NO供体通过酯键或酰胺键结合的结合物。本发明的丹参素与H2S/NO供体结合物能提高丹参素结构的稳定性和脂溶性，和能分别释放药物活性成分，通过协同作用增强药理活性。
本发明的丹参素与H2S/NO供体结合物或其药学上可接受的盐，具有式I的结构：
Figure BDA0002291672220000031
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；R2是NO供体基团、H2S供体基团或H2S/NO双供体基团。
通式I所述的化合物，其中R2为NO供体基团，亦即化合物具有式II的结构：
Figure BDA0002291672220000032
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；L为连接NO供体基团的直链或支链碳链，L上可以取代有杂原子、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为2-10；n为1-6的整数。
通式II的优选化合物是具有下述结构式的化合物1、2、3，但不限于此。
Figure BDA0002291672220000033
通式I所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为氮原子，R2为半胱氨酸及其衍生物，亦即化合物具有通式III的结构：
Figure BDA0002291672220000041
其中：R1是烃基或酰基；R3是H、烃基或酰基；R4是H或烃基。
通式III的优选化合物是具有下述结构式的化合物4-9，但不限于此。
Figure BDA0002291672220000042
通式I所述的化合物，其中R2为不包括半胱氨酸及其衍生物在内的H2S供体，亦即具有式IV结构的化合物：
Figure BDA0002291672220000043
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；L为连接H2S供体基团的直链或支链碳链，L上可以取代有杂原子、烷基、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为0-6的整数；R5为H2S供体基团，选自以下基团；n＝1或2。
Figure BDA0002291672220000051
通式IV的优选化合物是具有下述结构式的化合物10和11，但不限于此。
Figure BDA0002291672220000052
通式I所述的化合物，其中A为氮原子，R2为半胱氨酸及其衍生物与NO供体的结合物，亦即化合物具有通式V的结构：
Figure BDA0002291672220000053
其中：R1是烃基或酰基；R4是H、烃基或酰基；L为连接所述R2中半胱氨酸及其衍生物与NO供体的直链或支链碳链，L上可以取代有杂原子、烷基、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为2-10；n为1-6的整数。
通式V的优选化合物是具有下述结构式的化合物12-14，但不限于此。
Figure BDA0002291672220000054
本发明还包含半胱氨酸衍生物与其它H2S供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征是具有式VI的结构：
Figure BDA0002291672220000061
其中：R4、R6和R7独立取自于H、取代或未取代的烃基或酰基。
通式VI的优选化合物是下述结构式的化合物15，但不限于此。
Figure BDA0002291672220000062
本发明提供了所制得的目标化合物1-15的抗氧化应激损伤活性和抗炎活性。
本发明通过H2O2诱导的人神经母瘤细胞(SH-SY5Y)氧化应激模型观察了目标化合物对由氧化应激引起的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。通过MTT等方法检测目标化合物对细胞存活率和凋亡的影响，通过Western blot检测目标化合物对凋亡相关蛋白cPARP和p53表达的影响，实验结果表明，多个目标化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有明显的抑制作用，对氧化应激损伤细胞具有显著的保护作用，可用于制备防治心脑血管疾病相关疾病的药物。
本发明采用革兰氏阴性菌内毒素主要成分脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹膜巨噬细胞炎症模型进行丹参素与H2S/NO供体结合物1-14和半胱氨酸衍生物15对炎症反应抑制作用的研究，以NO的产生量表征炎性反应程度，并用MTT比色法检测细胞活力。在机体炎症状态下，NO的过度释放，会启动机体其他炎性细胞因子释放，导致炎症的扩大；而过高水平的NO，还导致相关组织细胞的氧化应激性损伤；
结果表明，丹参素与H2S/NO供体的结合物1-14和半胱氨酸衍生物15显著降低LPS诱导的NO释放量，且对细胞活力不产生影响；其中目标化合物6、7、8、12和15对LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子TNF-α有明显的抑制作用。
本发明进一步通过LPS诱导的小鼠腹膜炎症模型研究了化合物5、6和15的体内抗炎作用，结果表明，三者均能不同程度地抑制小鼠腹膜液中NO的释放和促炎细胞因子白细胞介素-1(IL-1β)的分泌，改善凝血时间异常；本发明进一步通过LPS诱发小鼠急性肺损伤炎症模型，研究目标化合物15对小鼠肺损伤的保护作用；结果表明，目标化合物15具有改善小鼠炎性肺损伤作用，作用机制与其抗炎抗氧化作用相关。
本发明通过体内和体外药理活性实验研究，结果均表明所述的目标化合物对炎症相关疾病具有显著的抗炎作用，可作为药物活性成分制备防治炎症相关疾病的药物。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
附图说明
图1，MTT法检测丹参素与H2S/NO供体的结合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，其中，Control表示空白对照组，数据用100％表示；其余各组数据表示与空白对照组相比的相对存活率；设NAC(N-乙酰半胱氨酸)阳性药物组，H2O2损伤组，以及6.25、12.5、25、50、100、200、400μM浓度组，*：与空白对照组相比p<0.05，**：与空白对照组相比p<0.01。
图2，用Western blot检测目标化合物1、2和3对凋亡相关蛋白表达的影响结果，其中，Control表示空白对照组，H2O2表示H2O2诱导缺氧组，NAC(N-乙酰半胱氨酸)和DSC表示阳性药物组，1、2和3为H2O2氧化应激细胞加药组所加目标化合物，**：与H2O2组相比p<0.01；#：与Control组相比p<0.05，##：与Control组相比p<0.01，###：与Control组相比p<0.001。
图3，用Griess法检测目标化合物(1-8、11-15)对LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌NO的影响；MTT方法检测目标化合物对腹腔巨噬细胞的细胞活性的影响，n＝3；其中#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常对照组,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图4，用ELISA法检测目标化合物(6、7、8、12、15)对LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子TNF-α的影响，n＝3；其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图5，用ELISA法检测目标化合物15对LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子IL-6的影响，其中#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常对照组，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图6，用硝酸还原酶法和ELISA法分别检测目标化合物5、6和15对LPS诱导的腹膜炎小鼠腹腔灌洗液中NO(n＝3)和IL-1β(n＝6)水平的影响，其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图7检测目标化合物5、6和15对LPS诱导的腹膜炎小鼠的血液凝结时间的影响。其中*P<0.05,**P<0.01vs LPS刺激组(n＝4)。
图8通过肺的湿干重比来分析化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺水肿的影响，其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组，n＝6。
图9，通过小鼠肺泡灌洗液的白细胞计数来分析化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺部血管通透性增高和白细胞浸润的影响；n＝6，其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图10通过肺泡灌洗液中总蛋白浓度来分析化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺部炎症导致蛋白渗出的影响；n＝6，其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。
图11，用ELISA法检测化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞因子TNF-α水平的影响，。其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组，n＝6。
图12用ELISA法检测化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞因子IL-1β水平的影响。其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组。n＝6。
图13，用ELISA法检测化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞因子IL-6的影响。其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组，n＝6。
图14，通过肺泡灌洗液中MPO的含量检测来分析化合物15对LPS诱导的ALI小鼠肺部中性粒细胞增多导致髓质过氧化物酶释放过多的影响，其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs LPS刺激组，n＝3。
图15，伪手术(sham)组小鼠肺病理切片HE染色图(×200)。
图16LPS组小鼠肺病理切片HE染色图(×200)。
图17，30mg/kg化合物15给药组小鼠肺病理切片HE染色图(×200)。
图18，60mg/kg化合物15给药组小鼠肺病理切片HE染色图(×200)。
图19，4mg/kg地塞米松磷酸钠注射液阳性对照组小鼠肺病理切片HE染色图(×200)。
具体实施方式
实施例1 制备目标化合物
本发明中目标化合物1-15通过合成路线1～4制备：
Figure BDA0002291672220000091
合成路线1.试剂和条件：(i)I2,AgNO3,CH3CN,0℃；then AgNO3,CH3CN,reflux；(ii)N-acetylglycine,acetic anhydride,NaOAc,120℃；then pour into cold water；(iii)9％HCl,reflux；(iv)acetic anhydride,NaOAc,rt；(v)10％Pd-C,H2(5atm),MeOH；(vi)1b,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(vii)1,4-phenylenedimethanol,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(viii)1H-imidazole,I2,PPh3,CH2Cl2；(ix)AgNO3,CH3CN；(x)butane-1,4-diol,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(xi)CBr4,PPh3,CH2Cl2.
Figure BDA0002291672220000101
合成路线2.试剂和条件：(i)BnBr,2N NaOH,EtOH,1h；then HCl(conc.)；(ii)tert-butyl acetate,HClO4；(iii)30％H2O2,AcOH；(iv)4a,NaHCO3,H2O；(v)4c,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(vi)15,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(vii)6d,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(viii)CF3COOH,CH2Cl2.
Figure BDA0002291672220000102
合成路线3.试剂和条件：(i)pyridine hydrochloride,220℃；(ii)10b,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(iii)4-hydroxythiobenzamide,HATU,DIPEA,CH2Cl2.
Figure BDA0002291672220000111
合成路线4.试剂和条件：(i)1b,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(ii)CF3COOH,CH2Cl2；(iii)16e,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(iv)1,4-phenylenedimethanol,HATU,DIPEA,CH2Cl2；(v)I2,1H-imidazole,PPh3,CH2Cl2；(vi)AgNO3,CH3CN；(vii)butane-1,4-diol,HATU,DIPEA,CH2Cl2.
实施例2 4-羟基丁烷-1,2-二硝酸酯(1b)的合成
Figure BDA0002291672220000121
在250mL茄形瓶中，加入3-丁烯-1-醇(1a,686mg,9.51mmol)，加50mL乙腈溶解，在冰浴条件下，依次加入AgNO3(1.65g,9.71mmol)和I2(2.42g,9.53mmol)，搅拌至I2完全溶解；在避光条件下，加入AgNO3(3.22g,19.0mmol)，回流搅拌12h。以石油醚/乙酸乙酯＝3:1为展开剂，TLC展开后，高锰酸钾溶液显色，结果显示原料点(Rf＝0.6)消失，产生新点，停止搅拌；过滤，乙酸乙酯洗涤固体，滤液用30mL乙酸乙酯稀释，水洗有机相(2×30mL)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝4:1，得浅黄色液体(1b)226mg，收率12％。
实施例3 (Z)-2-乙酰氨基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(16b)的合成
Figure BDA0002291672220000122
在500mL茄形瓶中，依次加入3,4-二羟基苯甲醛(16a,21.6g,0.156mol)、无水醋酸钠(12.8g,0.156mol)、N-乙酰甘氨酸(18.4g,0.156mol)和无水醋酐(60mL,0.638mol)，120℃搅拌2h，以石油醚/乙酸乙酯＝2:1为展开剂，TLC显示原料点(Rf＝0.2)消失，产生新点(Rf＝0.45)。停止搅拌，趁热向反应液中加400mL冷水，静置过夜，有黄褐色沉淀产生。过滤，水洗，乙酸乙酯洗涤，得黄色固体(16b)37.5g，收率75％，mp 183-184℃。
实施例4 (Z)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙烯酸(16c)的合成
Figure BDA0002291672220000123
在250mL茄形瓶中，加入化合物16b(10.0g,0.0311mol)，加入9％盐酸40mL。回流条件下搅拌3h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝30:10:1为展开剂，TLC显示原料点(Rf＝0.85)消失，产生严重拖尾的新点(Rf＝0.5)，停止搅拌；反应液冷却至室温，静置过夜，有红色固体析出，过滤，用少量水洗涤，得浅黄色固体(16c)4.15g，收率68％，mp 228-229℃。
实施例5 (Z)-2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(16d)的合成
Figure BDA0002291672220000131
在100mL茄形瓶中，加入化合物16c(3.40g,17.2mmol)、无水醋酸钠(1.80g,22.0mmol)和无水醋酐(20mL,21.4mmol)。室温搅拌6h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料消失，产生新点(Rf＝0.3)。停止搅拌，反应液用50mL水稀释，乙酸乙酯萃取(3×40mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(40mL)，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，得浅黄色固体(16d)5.40g，收率96％，mp 189-191℃。
实施例6 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(16e)的合成
Figure BDA0002291672220000132
将10％Pd-C(75.0mg)加入氢化釜中，加入甲醇(15mL)，然后加入浅黄色固体16d(1.50g，4.62mmol)。在5bar的氢气压力下，室温搅拌24h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示与原料同等高度(Rf＝0.3)处有紫外显色较弱的点，拖尾。硅藻土过滤除去Pd/C，浓缩滤液。硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(二氯甲烷)/V(甲醇)/V(乙酸)＝100:1:1，得浅黄色油状液体(16e)1.10g,收率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.10-7.13(m,3H),5.18-5.21(dd,J＝8.7,3.9Hz,1H),3.06-3.22(m,2H),2.26(s,6H),δ2.08(s,3H).ESI-MS(m/z):347.0[M+Na+].
实施例7 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(3,4-二硝基氧基)丁酯(1)的合成
Figure BDA0002291672220000133
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(97mg,0.300mmol)和4mL干燥的二氯甲烷溶解，在冰浴、氮气保护条件下，依次加入DIPEA(0.16mL,0.930mmol)、HATU(168mg,0.442mmol)和化合物1b(86mg,0.439mmol)。室温搅拌1.5h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点；加5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝2:1，得无色液体(1)107mg，收率71％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.11-7.04(d,3H),5.17(m,1H),5.10(m,1H),4.69-4.04(m,4H),3.19-3.04(m,2H),2.26(s,6H),2.10(s,3H),1.93-1.78(m,2H).ESI-MS(m/z):524.8(M+Na+).ESI-HRMS(m/z):calcd for C19H22N2O14+NH4 +[M+NH4 +],520.1415；found,520.1404.
实施例8 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(4-羟甲基)苄酯(2a)的合成
Figure BDA0002291672220000141
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(131mg,0.404mmol)和5mL干燥DMF溶解，在冰浴、氮气保护条件下，依次加入DIPEA(205μL,1.19mmol)、HATU(188mg,0.494mmol)和1,4-苯二甲醇(228mg,1.65mmol)。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点；向反应液中加入20mL水，混合均匀，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，水洗(15mL)，饱和食盐水洗涤(2×15mL)，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(二氯甲烷)/V(甲醇)＝40:40:1，得浅黄色液体(2a)107mg，收率59％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.34(d,J＝7.5Hz,2H),7.27(d,J＝7.2Hz,2H),7.06(m,3H),5.25-5.19(m,1H),5.18-5.08(m,2H),4.68(s,2H),3.13-3.05(qd,J＝14.4,6.2Hz,2H),2.28(s,6H),2.09(s,3H).ESI-MS(m/z):467.1[M+Na+].
实施例9 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(4-碘甲基)苄酯(2b)的合成
Figure BDA0002291672220000142
在50mL茄形瓶中，加入化合物2a(117mg,0.263mmol)和6mL干燥二氯甲烷溶解，在冰浴、氮气保护条件下，依次加入咪唑(82mg,1.20mmol)、PPh3(106mg,0.404mmol)和I2(96mg,0.378mmol)。室温搅拌0.33h，以石油醚/乙酸乙酯＝2:1为展开剂，TLC显示原料2a(Rf＝0.25)消失，产生新点。减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝5:1，得黄色固体(2b)64mg，收率44％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.35(d,J＝8.0Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),7.09-1.01(m,3H),5.20(dd,J＝8.5,4.7Hz,1H),5.09(s,2H),4.43(s,2H),3.15-3.06(qd,J＝13.6,6.6Hz,2H),2.27(m,6H),2.08(s,3H).ESI-MS(m/z):577.1[M+H+].
实施例10 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(4-硝氧甲基)苄酯(2)的合成
Figure BDA0002291672220000151
在25mL茄形瓶中，加入化合物2b(60mg,0.108mmol)和4mL乙腈溶解，在避光条件下，加入AgNO3(29mg,0.171mmol)。室温避光搅拌5h，以石油醚/乙酸乙酯＝2:1为展开剂，TLC显示原料2b(Rf＝0.6)消失，产生新点(Rf＝0.5)，停止搅拌。硅藻土过滤，浓缩滤液。硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝5:1，得无色液体(2)43mg，收率81％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.38(d,J＝7.7Hz,2H),7.30(d,J＝7.8Hz,2H),7.06(s,3H),5.42(s,2H),5.25-5.19(m,1H),5.14(s,2H),3.19-3.05(m,2H),2.28(s,6H),2.10(s,3H).ESI-MS(m/z):511.9[M+Na+].ESI-HRMS(m/z):calcd for C23H23NO11+NH4 +[M+NH4 +],507.1615；found,507.1605.
实施例11 2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸(4-羟基)丁酯(3a)的合成
Figure BDA0002291672220000152
在25mL茄形瓶中加入化合物16e(109mg,0.336mmol)和5mL干燥二氯甲烷溶解，在冰浴、氮气保护条件下，依次加入DIPEA(0.2mL,1.16mmol)、HATU(170mg,0.447mmol)和1,4-丁二醇(0.1mL,1.13mmol)。室温搅拌1.5h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析分离，洗脱剂为V(石油醚)/V(二氯甲烷)/V(甲醇)＝20:60:1，得无色液体(3a)120mg，收率90％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.13-7.04(m,3H),5.15(t,J＝6.5Hz,1H),4.17-4.02(m,2H),3.57(t,J＝6.3Hz,2H),3.11(d,J＝5.6Hz,2H),2.27(s,6H),2.10(s,3H),1.61(m,2H),1.53-1.43(m,2H).ESI-MS(m/z):397.0[M+H+].
实施例12 (4-溴代丁基)-2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸酯(3b)的合成
Figure BDA0002291672220000161
在25mL茄形瓶中，加入化合物3a(60mg,0.151mmol)，加1mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气氛围，加入CBr4(75mg,0.226mmol)，随后将PPh3(51mg,0.194mmol)溶解在0.5mL干燥的二氯甲烷中，并加入以上体系中。室温搅拌1.5h，以石油醚/二氯甲烷/甲醇＝20:60:2为展开剂，TLC显示原料3a(Rf＝0.25)消失，产生新点(Rf＝0.75)；减压蒸馏除去二氯甲烷，硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝4:1，得无色液体(3b)42mg，收率60％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.14-7.05(m,3H,3Ar-H),5.16(dd,J＝8.0,5.2Hz,1H,CH),4.19-4.08(m,2H,CH2),3.40(t,J＝6.4Hz,2H,CH2),3.18-3.06(m,2H,CH2),2.29(s,6H,2CH3),2.11(s,3H,CH3),1.88-1.80(m,2H,CH2),1.79-1.71(m,2H,CH2)；ESI-MS(m/z):480.8(M+Na+).
实施例13 (4-硝氧基丁基)-2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酸酯(3)的合成
Figure BDA0002291672220000162
在25mL茄形瓶中，加入化合物3b(68mg,0.148mmol)，加2mL乙腈溶解，在避光条件下，加入AgNO3(45mg,0.265mmol)。室温搅拌24h，以石油醚/乙酸乙酯/二乙胺＝40:10:1为展开剂，TLC显示原料3b(Rf＝0.6)消失，产生新点(Rf＝0.5)，停止搅拌；硅藻土过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)/V(二乙胺)＝40:10:1，得无色液体(3)26mg，收率40％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11-7.06(m,3H,3Ar-H),5.16-5.13(t,J＝6.6Hz,1H,CH),4.40(m,2H,CH2),4.10(m,2H,CH2),3.13-3.11(d,J＝6.6Hz,2H,CH2),2.27(s,6H,2CH3),2.11(s,3H,CH3),1.68-1.60(m,4H,2CH2)；ESI-MS(m/z):463.9(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C19H23NO11+NH4 +[M+NH4]+,459.1615；found,459.1606.
实施例14 (R)-2-氨基-3-苄硫基丙酸叔丁酯(4c)的合成
Figure BDA0002291672220000171
在250mL圆底烧瓶中，将L-半胱氨酸盐酸盐(4a,12.9g，82.2mmol)溶于2N NaOH水溶液(125mL)和乙醇(96mL)组成的混合溶液中，室温快速搅拌至澄清。然后，在冰浴条件下，向溶液中缓慢加入9.8mL(82.5mmol)BnBr,室温搅拌1h。向反应液中滴加浓HCl调pH至7，有大量白色固体析出。过滤，滤饼依次用水，乙醇和乙醚洗涤，得白色固体(4b)14.0g，收率81％。在50mL茄形瓶中，加入化合物4b(506mg,2.40mmol)和醋酸叔丁酯(5mL,37.2mmol)，冰浴条件下，边搅拌边缓慢滴加高氯酸(210μL,3.68mmol)，然后，在室温条件下搅拌12h，以石油醚/乙酸乙酯＝15:1为展开剂，TLC显示原料4b消失，产生稍拖尾的新点(Rf＝0.5)，用10％Na2CO3溶液调节反应液pH至9，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(2×20mL)，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。硅胶柱层析，流动相为二氯甲烷，得无色液体(4c)520mg，收率81％；1H NMR(400MHz,CDCl3):7.23-7.31(m,5H,5Ar-H),3.73(s,2H,CH2),3.46(dd,J＝7.6,4.5Hz,1H,CH),2.57-2.80(m,2H,CH2),1.44(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):212.0(M-tBu+H+).
实施例15 (R)-2-氨基-3-烯丙二硫基丙酸(6c)的合成
Figure BDA0002291672220000181
在50mL茄型瓶中，加入化合物二烯丙基二硫醚(6a,973g,6.65mmol)和乙酸(4mL)，搅拌均匀。在冰浴条件下，将30％H2O2(1.0mL)和乙酸(3mL)的混合溶液缓慢滴加入茄型瓶中，该过程持续0.2h。维持冰浴条件搅拌2h，然后在25℃条件下继续搅拌4h，以石油醚/乙酸乙酯＝20:1为展开剂，TLC显示原料(Rf＝0.9)几乎消失，生成新点(Rf＝0.2)，停止搅拌。将反应液倒入50mL冰水中，用二氯甲烷萃取(4×50mL)，合并有机相，饱和碳酸钠溶液洗涤(3×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，得粗产物(6b)1.08g。在100mL茄型瓶中，加入450mg化合物6b的粗品和水(40mL)，加入半胱氨酸盐酸盐，剧烈搅拌。向混合体系中加碳酸氢钠固体，调节反应液pH至6，伴随有白色固体产生，静置0.33h。过滤，水洗，乙醚洗涤，得白色固体。将固体溶于9％HCl中，有黄色液滴悬浮，加乙醚萃取，分液，水相中加碳酸氢钠固体调pH至6，有白色固体析出，过滤，固体用水和乙醚洗涤，干燥，得白色固体(6c)480mg，收率90％。
实施例16 (R)-2-氨基-3-烯丙二硫基丙酸叔丁酯(15)和(R)-2-氨基-3-叔丁基硫基丙酸叔丁酯(6d)的合成
Figure BDA0002291672220000182
在50mL茄形瓶中，加入化合物6c(122mg,0.631mmol)和醋酸叔丁酯(2mL,14.9mmol)，冰浴条件下，边搅拌边缓慢滴加高氯酸(90μL,1.58mmol)，25℃搅拌12h.用10％Na2CO3溶液调节反应液pH至9，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。硅胶柱层析，流动相为二氯甲烷，得到浅黄色液体产物1.10g(15)，收率为24％；1HNMR(400MHz,CDCl3):5.85(m,1H,＝CH),3.73(s,2H,CH2),5.18(dd,J＝24.4,13.4Hz,2H,＝CH2),3.65(dd,J＝7.9,4.5Hz,1H,CH),3.35(d,J＝7.3Hz,2H,CH2),3.08(dd,J＝13.4,4.5Hz,1H,CH),2.82(dd,J＝13.4,8.0Hz,1H,CH),1.47(s,9H,3CH3)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ172.3,133.2,118.1,53.8,43.7,41.6,27.4；ESI-MS(m/z):250.1(M+H+)；HRMScalcd mass for C10H19NO2S2[M+H+]250.0935,found250.0930.浅黄色液体产物(6d)0.50g，收率为12％；1H NMR(400MHz,CDCl3):3.54(dd,J＝7.4,4.5Hz,1H,CH),2.83(ddd,J＝19.7,12.3,5.9Hz,2H,CH2),1.48(s,9H,3CH3),1.33(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):234.2(M+H+).
实施例17 (2R)-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸叔丁酯(4)的合成
Figure BDA0002291672220000191
在100mL茄形瓶中，加入化合物16e(658mg,2.03mmol)，加18mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(1.3mL,7.55mmol)，HATU(857mg,2.25mmol)和化合物4c(548mg,2.05mmol)。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点，加15mL水淬灭反应；用二氯甲烷萃取(3×15mL)，合并有机相，水洗(15mL)，饱和食盐水洗涤(2×15mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；所得黄色油状液体1.13g，取100mg经柱层析纯化用作测试活性，其他不经进一步纯化，直接投入下一步反应:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.22(m,5H,5Ar-H),7.08–7.04(m,3H,3Ar-H),6.79-6.75(t,J＝6.9Hz,1H,NH),5.39-5.34(td,J＝8.0,4.5Hz,1H,CH),4.65-4.58(m,1H,CH),3.66(d,J＝3.8Hz,2H,CH2),3.27-3.03(m,2H,CH2),2.91-2.68(m,2H,CH2),2.25(m,6H,2CH3),2.09(m,3H,CH3),1.43(d,J＝2.8Hz,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):595.9(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C29H35NO9S+NH4 +[M+NH4]+,591.2376；found,591.2365.
实施例18 (2R)-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸(5)的合成
Figure BDA0002291672220000192
在100mL茄形瓶中，加入上一步反应的粗产品(1.13g)，加入50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液40mL。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料4(Rf＝0.9)消失，产生新点(Rf＝0.3)；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，硅胶柱层析，洗脱剂为V(二氯甲烷)/V(甲醇)/V(乙酸)＝100:1:1，得浅黄色油状液体(5)957mg，两步反应收率91％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27-7.14(m,5H,5Ar-H),7.06–7.02(m,3H,3Ar-H),5.40(m,1H,CH),4.73(m,1H,CH),3.66(s,2H,CH2),3.21-3.13(m,2H,CH2),2.85-2.80(m,2H,CH2),2.23(s,6H,2CH3),2.12(m,3H,CH3)；ESI-MS(m/z):517.8(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd forC21H25NO9S2+NH4 +[M+NH4]+,535.1750；found,535.1746.
实施例19 (2R)-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸叔丁酯(6)和(2R)-3-叔丁基硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸叔丁酯(8)的合成
Figure BDA0002291672220000201
在100mL茄形瓶中，加入化合物16e(754mg,2.32mmol)，加16mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(1.2mL,6.97mmol)、HATU(1064mg,2.80mmol)、化合物6d和6e的混合物(6f,580mg)。室温搅拌0.67h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点，加10mL水淬灭反应；用二氯甲烷萃取(3×15mL)，合并有机相，水洗(15mL)，饱和食盐水洗涤(2×15mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(丙酮)＝6:1，得无色液体(6)398mg，收率为31％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10-7.05(m,3H,3Ar-H),6.92(t,J＝8.1Hz,1H,NH),5.89-5.73(m,1H,＝CH),5.40(m,1H,CH),5.21(m,1H,＝CH),5.20–5.07(m,1H,NH),4.72(m,1H,＝CH),3.34-2.78(m,6H,3CH2),2.27(s,6H,2CH3),2.11(m,3H,CH3),1.53-1.43(m,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):578.2(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C21H25NO9S2+NH4 +[M+NH4]+,573.1940；found,573.1929；无色液体(8)648mg，收率为52％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.09-7.01(m,3H,3Ar-H),6.85–6.79(m,1H,NH),5.37(dd,J＝7.8,4.3Hz,1H,CH),4.66(m,1H,CH),3.26–2.84(m,4H,2CH2),2.25(s,6H,2CH3),2.08(m,3H,CH3),1.45(m,9H,3CH3),1.24(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):562.0(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C25H33NO9S2+NH4 +[M+NH4]+,557.2533；found,557.2529.
实施例20 (2R)-3-烯丙二硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸(7)的合成
Figure BDA0002291672220000211
在25mL茄形瓶中，加入化合物6(48mg,0.0864mmol)，加入50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液4mL。室温搅拌1h,以石油醚/丙酮＝4:1为展开剂，TLC显示原料6(Rf＝0.3)消失，产生新点；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，硅胶柱层析，洗脱剂为V(二氯甲烷)/V(甲醇)/V(乙酸)＝100:1:1，得无色油状液体(7)20mg，收率为46％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07-7.03(m,3H,3Ar-H),5.79(m,1H,＝CH),5.30(m,1H,CH),5.19(m,1H,＝CH),5.17-5.03(m,1H,CH),4.66(d,J＝28.8Hz,1H,＝CH),3.25-2.75(m,6H,3CH2),2.25(m,6H,2CH3),2.07(s,3H,CH3)；ESI-MS(m/z):500.2(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C21H25NO9S2+NH4 +[M+NH4]+,517.1314；found,517.1313.
实施例21 (2R)-3-叔丁基硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸(9)的合成
Figure BDA0002291672220000212
在50mL茄形瓶中，加入化合物8(300mg,0.500mmol)，加入50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液18mL。室温搅拌2h,以CH2Cl2/MeOH＝30:1为展开剂，TLC显示原料8(Rf＝0.3)消失，产生新点；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，硅胶柱层析，洗脱剂为V(二氯甲烷)/V(甲醇)/V(乙酸)＝100:1:1，得无色油状液体(9)250mg，收率为93％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10-7.04(m,3H,3Ar-H),6.71(d,J＝8.3Hz,1H,NH),5.55-5.47(m,1H,CH),4.85-4.73(m,1H,CH),3.22-3.09(m,2H,CH2),3.01-2.86(ddd,J＝34.8,12.9,5.5Hz,2H,CH2),3.32-2.28(m,6H,2CH3),2.20-2.17(m,3H,CH3),1.32-1.27(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):484.2(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C22H29NO9S+NH4 +[M+NH4]+,501.1907；found,501.1903.
实施例22 5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(10b)的合成
Figure BDA0002291672220000221
ADT-OMe(10a,1.03g,4.28mmol)和干燥的吡啶盐酸盐(3.04g,26.3mmol)加入烘箱干燥过的封管里，氮气保护，密封，220℃加热，混合固体呈熔融状。搅拌1.5h后，将反应液冷却至室温，液体凝固，将固体溶于甲醇并转移至100mL茄型瓶中；除去甲醇，将混合物溶解在0.5N HCl和EtOAc的50:50混合溶剂中，加水至80mL，用乙酸乙酯萃取(2×50mL)，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝4:1，得橙红色固体(10b)744mg，收率76％:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.49(s,1H,OH),7.75(d,J＝8.6Hz,2H,2Ar-H),7.67(s,1H,＝CH),6.86(d,J＝8.7Hz,2H,2Ar-H)；
实施例23 4-(3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮-5-基)-苯基-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)]丙酸酯(10)的合成
Figure BDA0002291672220000222
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(83mg,0.256mmol)，加4mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(130μL,0.755mmol)、HATU(107mg,0.281mmol)和化合物10b(36mg,0.159mmol)。室温搅拌0.67h，以石油醚/乙酸乙酯＝3:1为展开剂，TLC显示原料10b(Rf＝0.6)消失，产生新点，加5mL水淬灭反应；用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(丙酮)＝3:1，得橙红色固体(10)50mg，收率59％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.63(s,2H,2Ar-H),7.39(s,1H,＝CH),7.17(m,3H,3Ar-H),7.04(s,2H,2Ar-H),5.36(s,1H,CH),3.29(s,2H,CH2),2.31(s,6H,2CH3),2.19(s,3H,CH3)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ214.9,171.0,169.8,167.6,167.5,167.1,152.1,141.6,140.9,135.5,133.2,129.0,127.7,127.0,124.0,123.1,122.2,72.0,36.0,20.0,19.9；ESI-MS(m/z):532.8(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C24H20O8S3+H+[M+H]+,533.0399；found,533.0393.
实施例24 (4-硫代氨甲酰基苯基)-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)]丙酸酯(11)的合成
Figure BDA0002291672220000231
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(82mg,0.253mmol)，加4mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(130μL,0.755mmol)、HATU(105mg,0.276mmol)和4-羟基硫代苯甲酰胺(11a,38mg,0.248mmol)。室温搅拌0.5h，以石油醚/乙酸乙酯＝1:1为展开剂，TLC显示原料11a(Rf＝0.4)消失，产生新点；加5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝2:1，得橙色液体(11)64mg，收率55％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝8.3Hz,2H,2Ar-H),7.72(bs,1H,NH),7.35(bs,1H,NH),7.20-7.11(m,3H,3Ar-H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H,2Ar-H),5.34(t,J＝6.5Hz,1H,CH),3.25(d,J＝6.5Hz,2H,CH2),2.28(m,6H,2CH3),2.15(s,3H,CH3)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ201.2,170.3,168.2,168.1,167.7,152.5,141.9,141.2,137.0,133.9,128.4,127.5,124.5,123.5,121.2,72.5,36.4,16.1,20.5,20.4；ESI-MS(m/z):459.9(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C22H21NO8S+NH4 +[M+NH4]+,477.1332；found,477.1322.
实施例25 (R)-3,4-二(硝基氧基)丁基-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(12b)的合成
Figure BDA0002291672220000232
在25mL茄形瓶中，加入化合物12a(185mg,0.594mmol)，加5mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(0.3mL,1.74mmol)、HATU(271mg,0.713mmol)和化合物1b(139mg,0.709mmol)。室温搅拌2h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料12a(Rf＝0.4)消失，产生新点；加5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(2×5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝8:1，得无色液体(12b)116mg，收率40％:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.21(m,5H,5Ar-H),5.40(m,1H,CH),5.19(m,1H,NH),4.83-4.75(m,1H,CH),4.51-4.42(m,2H,CH2),4.32-4.24(m,2H,CH2),3.73(s,2H,CH2),2.80(m,2H,CH2),2.11-2.03(m,2H,CH2),1.44(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):511.9(M+Na+).
实施例26 (R)-3,4-二(硝基氧基)丁基-2-氨基-3-苄硫基丙酸酯(12c)的合成
Figure BDA0002291672220000241
在25mL茄形瓶中，加入化合物12b(87mg,0.178mmol)，加20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液5mL溶解。室温搅拌1h，以石油醚/乙酸乙酯＝3:1为展开剂，TLC显示原料12b(Rf＝0.8)消失，产生新点(Rf＝0.2)；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，加10％的氨水5mL稀释，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥0.5h，过滤，浓缩滤液，得黄色液体(12c)63mg，不经进一步纯化，直接投下一步反应。
实施例27 (2R)-(3,4-二硝氧基丁基)-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸酯(12)的合成
Figure BDA0002291672220000242
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(53mg,0.164mmol)，加4mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(0.1mL,0.581mmol)、HATU(82mg,0.216mmol)和化合物12c(63mg,0.162mmol)。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点；加5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(2×5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥0.5h，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝2:1，得无色液体(12)64mg，两步反应收率为57％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10-7.02(m,3H,3Ar-H),6.68(m,1H,NH),5.40-5.35(m,2H,2CH),4.78(m,1H,CH),4.59-4.45(m,2H,CH2),4.33-4.11(m,2H,CH2),3.68(m,2H,CH2),3.15(m,2H,CH2),2.85-2.70(m,2H,CH2),2.25(s,6H,2CH3),2.15(s,3H,CH3),2.07-1.98(m,2H,CH2)；ESI-MS(m/z):717.8(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C29H33N3O15S+NH4 +[M+NH4]+,713.1976；found,713.1962.
实施例28 (R)-(4-羟甲基)苄基-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(13a)的合成
Figure BDA0002291672220000251
在50mL茄形瓶中，加入化合物12a(673mg,2.16mmol)，加12mL DMF溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(1.1mL,6.39mmol)、HATU(995mg,2.62mmol)和1,4-苯二甲醇(899mg,6.51mmol)。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料12a(Rf＝0.4)消失，产生新点；向反应液中加入60mL水，混合均匀，用乙酸乙酯萃取(3×30mL)，合并有机相，水洗(30mL)，饱和食盐水洗涤(2×30mL)，无水硫酸钠干燥0.5h，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝5:1，得白色固体(13a)747mg，收率80％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.30(m,4H,4Ar-H),7.28-7.23(m,5H,5Ar-H),5.33(d,J＝7.7Hz,1H,NH),5.21-5.08(m,2H,CH2),4.66(s,2H,CH2),4.55(d,J＝6.4Hz,1H,CH),3.65(s,2H,CH2),2.89-2.77(qd,J＝13.9,5.1Hz,2H,CH2),1.44(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):454.2(M+Na+).
实施例29 (R)-(4-碘代甲基)苄基-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(13b)的合成
Figure BDA0002291672220000252
在50mL茄形瓶中，加入化合物13a(183mg,0.424mmol)，加6mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入咪唑(119mg,1.75mmol)、PPh3(172mg,0.656mmol)和I2(153mg,0.603mmol)。室温搅拌0.5h，以石油醚/乙酸乙酯＝3:1为展开剂，TLC显示原料13a(Rf＝0.25)消失，产生新点(Rf＝0.8)；饱和碳酸钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，饱和氯化铵溶液洗涤(5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝15:1，得黄色液体(13b)117mg，收率51％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(m,2H,2Ar-H),7.30-7.22(m,7H,7Ar-H),5.29(d,J＝7.7Hz,1H,NH),5.12(d,J＝5.0Hz 2H,CH2),4.56(d,J＝7.3Hz,1H,CH),4.43(s,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),2.90-2.78(qd,J＝13.9,5.1Hz,2H,CH2),1.45(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):564.1(M+Na+).
实施例30 (R)-(4-硝基氧基亚甲基)苄基-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(13c)的合成
Figure BDA0002291672220000261
在25mL茄形瓶中，加入化合物13b(155mg,0.286mmol)，加6mL乙腈溶解，在避光条件下加入AgNO3(94mg,0.553mmol)。室温搅拌16h，以石油醚/乙酸乙酯＝10:1为展开剂，TLC显示原料13b(Rf＝0.6)消失，产生新点(Rf＝0.5)；停止搅拌，硅藻土过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝12:1，得白色固体(13c)65mg，收率48％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(m,2H,2Ar-H),7.30-7.22(m,7H,7Ar-H),5.29(d,J＝7.7Hz,1H,NH),5.12(d,J＝5.0Hz 2H,CH2),4.56(d,J＝7.3Hz,1H,CH),4.43(s,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),2.90-2.78(qd,J＝13.9,5.1Hz,2H,CH2),1.45(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):499.2(M+Na+).
实施例31 (R)-(4-硝基氧基亚甲基)苄基-2-氨基-3-苄硫基丙酸酯(13d)的合成
Figure BDA0002291672220000262
在50mL茄形瓶中，加入化合物13c(484mg,1.0mmol)，加20％三氟醋酸的二氯甲烷溶液15mL溶解。室温搅拌1h，以石油醚/乙酸乙酯＝2:1为展开剂，TLC显示原料13c(Rf＝0.95)消失，产生新点(Rf＝0.25)；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，加10％的氨水10mL稀释，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(2×10mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，得黄色液体(13d)362mg，收率95％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41-7.32(m,4H,4Ar-H),7.31-7.20(m,5H,5Ar-H),5.41(s,2H,CH2),5.28(d,J＝7.8Hz,1H,NH),5.12(m,2H,CH2),4.56(d,J＝6.7Hz,1H,CH),3.68(s,2H,CH2),2.91-2.77(m,2H,CH2),1.44(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):377.0(M+H+).
实施例32 (2R)-(4-硝基氧基亚甲基)苄基-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸酯(13)的合成
Figure BDA0002291672220000271
在50mL茄形瓶中，加入化合物16e(121mg,0.37mmol)，加6mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)、HATU(183mg,0.48mmol)和化合物13d(166mg,0.44mmol)。室温搅拌0.5h，以二氯甲烷/甲醇/乙酸＝60:1:1为展开剂，TLC显示原料16e(Rf＝0.3)消失，产生新点；加5mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×6mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝3:1，得无色液体(13)120mg，收率47％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.28(m,4H,4Ar-H),7.28-7.22(m,5H,5Ar-H),7.07-7.02(m,3H,3Ar-H),6.79-6.74(m,1H,NH),5.40(s,2H,CH2),5.36-5.33(m,1H,NH),5.15(m,2H,CH2),4.80-4.73(m,1H,CH),3.60(s,2H,CH2),3.31-3.05(m,2H,CH2),2.89-2.73(m,2H,CH2),2.25(m,6H,2CH3),2.08(m,3H,CH3)；ESI-MS(m/z):704.8(M+Na+)；ESI-HRMS(m/z):calcd forC33H34N2O12S+NH4 +[M+NH4]+,700.2176；found,700.2163.
实施例33 (R)-(4-羟基丁基)-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(14a)的合成
Figure BDA0002291672220000272
在50mL茄形瓶中，加入化合物12a(555mg,1.78mmol)，加13mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(0.8mL,4.65mmol)，HATU(824mg,2.17mmol)和1,4-丁二醇(475μL,5.36mmol)。室温搅拌1h，以二氯甲烷/甲醇＝80:1为展开剂，TLC显示原料12a(Rf＝0.25)消失，产生新点；向反应液中加入10mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，水洗(10mL)，饱和食盐水洗涤(2×10mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝4:1，得无色液体(14a)634mg，收率93％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.21(m,5H,5Ar-H),5.33(d,J＝7.5Hz,1H,NH),4.50(m,1H,CH),4.18(t,J＝6.4Hz,2H,CH2),3.73(s,2H,CH2),3.65(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.91-2.81(m,2H,CH2),1.78-1.69(m,2H,CH2),1.65-1.56(m,2H,CH2),1.46(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):406.0(M+Na+).
实施例34 (R)-(4-碘代丁基)-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(14b)的合成
Figure BDA0002291672220000281
在50mL茄形瓶中，加入化合物14a(434mg,1.13mmol)，加14mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入咪唑(308mg,4.52mmol)，PPh3(599mg,2.28mmol)和I2(577mg,2.27mmol)。维持冰浴条件搅拌0.5h，以石油醚/乙酸乙酯＝2:1为展开剂，TLC显示原料14a(Rf＝0.4)消失，产生新点；减压蒸馏除去二氯甲烷，硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝15:1，得无色液体(14b)409mg，收率73％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.17(m,5H,5Ar-H),5.27(d,J＝7.9Hz,1H,NH),4.50(m,1H,CH),4.15(t,J＝6.2Hz,2H,CH2),3.73(s,2H,CH2),3.18(t,J＝6.7Hz,2H,CH2),2.90-2.78(qd,J＝13.8,5.2Hz,2H,CH2),1.87(dt,J＝13.7Hz,2H,CH2),1.75(dt,J＝13.0Hz,2H,CH2),1.45(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):516.1(M+Na+).
实施例35 (R)-(4-硝氧基丁基)-2-叔丁氧酰氨基-3-苄硫基丙酸酯(14c)的合成
Figure BDA0002291672220000282
在50mL茄形瓶中，加入化合物14b(363mg,0.736mmol)，加8mL乙腈溶解，避光条件下加入AgNO3(161mg,0.948mmol)。室温搅拌12h，以石油醚/乙酸乙酯/二乙胺＝50:5:1为展开剂，TLC显示原料14b(Rf＝0.45)消失，产生新点(Rf＝0.3)；停止搅拌，硅藻土过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)/V(二乙胺)＝60:4:1，得无色液体(14c)303mg，收率96％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.22(m,5H,5Ar-H),5.25(d,J＝7.7Hz,1H,NH),4.50(dd,J＝12.2,4.8Hz,1H,CH),4.45(t,J＝6.0Hz,2H,CH2),4.19-4.14(m,2H,CH2),3.73(s,2H,CH2),2.90-2.78(qd,J＝13.8,5.4Hz,2H,CH2),1.83-1.70(m,4H,2CH2),1.45(s,9H,3CH3)；ESI-MS(m/z):451.2(M+Na+).
实施例36 (R)-(4-硝氧基丁基)-2-氨基-3-苄硫基丙酸酯(14d)的合成
Figure BDA0002291672220000291
在50mL茄形瓶中，加入化合物14c(260mg,0.607mmol)，加入20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液15mL。室温搅拌1h，以石油醚/乙酸乙酯/二乙胺＝60:8:1为展开剂，TLC显示原料14c(Rf＝0.4)消失，产生新点(Rf＝0.1)；减压蒸馏除去三氟乙酸和二氯甲烷，加10％氨水14mL稀释，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(2×10mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)/V(二乙胺)＝50:10:1，得浅黄色液体(14d)160mg，收率80％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.22(m,5H,5Ar-H),4.45(t,J＝6.0Hz,2H,CH2),4.14(t,J＝5.7Hz,2H,CH2),3.73(s,2H,CH2),3.61(dd,J＝7.3,4.9Hz,1H,CH),2.83-2.64(ddd,J＝20.9,13.5,6.1Hz,2H,CH2),1.85-1.70(m,4H,2CH2)；ESI-MS(m/z):329.1(M+H+)..
实施例37 (2R)-(4-硝氧基丁基)-3-苄硫基-2-[2-乙酰氧基-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基]丙酸酯(14)的合成
Figure BDA0002291672220000292
在25mL茄形瓶中，加入化合物16e(130mg,0.401mmol)，加7mL干燥的二氯甲烷溶解，冰浴条件下，氮气保护，依次加入DIPEA(0.2mL,1.16mmol)、HATU(180mg,0.473mmol)和化合物14d(132mg,0.402mmol)。室温搅拌1h，以石油醚/乙酸乙酯/二乙胺＝40:10:1为展开剂，TLC显示原料14d(Rf＝0.25)消失，产生新点(Rf＝0.7)；向反应液中加入10mL水淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×5mL)，合并有机相，水洗(5mL)，饱和食盐水洗涤(2×5mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液；硅胶柱层析，洗脱剂为V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝3:1，得无色液体(14)172mg，收率70％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.22(m,5H,5Ar-H),7.12-7.02(m,3H,3Ar-H),6.79(m,1H,NH),5.40-5.32(m,1H,CH),4.68(m,1H,CH),4.46-4.45(m,2H,CH2),4.16-4.15(m,2H,CH2),3.67(m,2H,CH2),3.22-3.11(m,2H,CH2),2.89-2.77(m,2H,CH2),2.27(s,6H,2CH3),2.12(s,3H,CH3),2.07-1.98(s,4H,2CH2)；ESI-MS(m/z):634.9(M+H+)；ESI-HRMS(m/z):calcd for C29H34N2O12S+NH4 +[M+NH4]+,652.2176；found,652.2163.
实施例38 丹参素与H2S/NO供体的结合物对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
分组：将培养的SH-SY5Y悬液以7000个/孔的密度接种于96孔板中，随机分为空白对照组、H2O2损伤组、阳性对照NAC(N-乙酰半胱氨酸)组(5mM)以及给药组(设6.25、12.5、25、50、100、200、400μM七组或25、50、100、200、400μM五组)。给药：当细胞长满至80％时，除空白对照组外，各组先以含相应浓度各待测目标化合物无血清的培养基培养4h，然后加200μMH2O2，置于孵箱中培养12h。用MTT法测定SH-SY5Y细胞的存活率(如图1所示)；
实验结果表明，目标化合物1、2、3、4和6能使H2O2诱导SH-SY5Y细胞的存活率提高，对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤具有显著的保护作用。
实施例39 用Western blot检测目标化合物1、2和3对凋亡相关蛋白表达的影响
基于前期工作的报道，化合物DSC(N-((R)-3-(苄硫基)-1-甲氧基-1-氧代-2-丙基)-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)-2-乙酰氧基丙酰胺)具有强抗氧化性和抗凋亡能力，能够明显减轻HUVEC和SH-SY5Y的细胞氧化应激损伤，具有显著的剂量依赖性的细胞保护活性；它还可以通过抑制细胞凋亡和调节内源性抗氧化酶，发挥显著的血管保护作用(Eur.J.Med.Chem.2012,55,176-187；Biochimica et Biophysica Acta-GeneralSubjects 2013,1830,2861-2871；European Journal of Pharmacology 2013,708,8-13；Bioscience Reports 2013,33,677-688；Int.J.Mol.Sci.2015,16,628-644；Frontiers inImmunology 2018,9,2513)；
本发明将培养的SH-SY5Y悬液以7000个/孔的密度接种于96孔板中，随机分为空白对照组、H2O2损伤组、阳性对照NAC组(5mM)和DSC组以及给药组(100μM)。当细胞长满至80％时，除空白对照组外，各组先以含相应浓度各待测目标化合物无血清的培养基培养4h，然后加200μM H2O2，置于孵箱中培养12h。收集细胞并使用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液加入漂洗后的细胞后，提取蛋白并确定蛋白浓度，使用Western blot方法对各目标蛋白浓度进行检测(如图2所示)；
实验结果证明，目标化合物1、2和3能显著增加抗凋亡因子PARP蛋白的表达，抑制促凋亡因子p53蛋白的表达。
实施例40 丹参素与H2S/NO供体结合物对内毒素(LPS)诱导的腹腔巨噬细胞炎症反应的抑制作用(离体给药研究)
小鼠腹腔注射5％流体硫乙醇酸盐培养基，活化腹腔巨噬细胞，5天后取细胞，用10％FBS-RPMI.1640培养基调节细胞浓度为1×106cell/mL。
将巨噬细胞以200μL/孔接种于96孔细胞培养板，2h后洗去非贴壁细胞。巨噬细胞分为5大组，正常对照组(对照组不加待测化合物，浓度为0μM)、待测化合物(不同浓度)单独处理组、内毒素(Lipopolysacharide,LPS)刺激组、待测化合物(不同浓度)与LPS(1μg/mL)联合处理组以及阳性药物地塞米松(DEX)与LPS联合处理组。巨噬细胞给予化合物作用24h。培养24h后收集细胞上清液，用于后续实验，再向细胞孔中加入180μL 10％FBS-1640和20μL5mg/mL MTT，培养4h后，弃去上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解甲瓒结晶，570nm处测吸光值。MTT法检测吸光度值以反映化合物对细胞活性的影响。重复批次实验显示结果有相同的趋势，以其中有代表性的实验结果展示(三复孔)(图3)。
收集的细胞培养上清液测定炎性介质：Griess法和酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)分别检测巨噬细胞在未受刺激及受LPS刺激下，待测化合物对巨噬细胞分泌一氧化氮(Nitric oxide,NO)以及部分药物对肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的影响。
用Griess试剂测定细胞培养上清液中NO的分泌量，即将50μL细胞培养上清液与50μL Griess试剂混合加入酶标板，避光震荡10min，检测其在540nm波长处的光吸收值(OD值)，以亚硝酸钠溶液为标准溶液建立标准曲线，以亚硝酸离子浓度反映各组细胞培养上清液中的NO水平(图3)；
实验结果表明，目标化合物1、2、3、5、11和12以单剂量(20μM)给药均能显著性地抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞释放炎性介质NO，并且这些化合物对细胞的生物活性没有明显的抑制作用。目标化合物6、7、8、12和15以多剂量(5、10、20μM)给药均能显著性地抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞释放NO，并且存在浓度相关性，即化合物的浓度越高，对炎症细胞分泌NO的抑制作用越明显，并且这些目标化合物对细胞的生物活性也没有明显抑制作用。
依据ELISA试剂盒中实验操作手册，测定细胞培养上清液中TNF-α(图4)和IL-6的含量(图5)。TNF-α的检测所用细胞培养上清液以试剂盒内样品稀释液稀释，稀释度为：正常对照组和阳性药物DEX与LPS联合处理组1:9稀释、LPS刺激组1:49稀释、其他组1:19稀释；IL-6的检测用细胞培养上清液；
实验结果表明，目标化合物6、7、8、12和15以多剂量(5、10、20μM)给药，均能显著地抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌炎性因子TNF-α。其中目标化合物6和15对炎症细胞的TNF-α分泌的抑制作用较强，抑制率约为55％，但是没有剂量相关性；目标化合物7在5μM和20μM浓度时对炎症细胞的TNF-α分泌有显著的抑制作用；目标化合物8和12在10μM和20μM浓度时对炎症细胞的TNF-α分泌有显著抑制作用，且化合物浓度越高，抑制作用越明显；
与正常组相比，LPS组IL-6分泌水平明显升高；目标化合物15以多剂量(5、10、20μM)给药，与LPS组相比，中剂量和高剂量组均能显著抑制炎性细胞因子IL-6的释放。
实施例41 丹参素与H2S/NO供体结合物对内毒素(LPS)诱导的小鼠腹膜炎的保护作用
腹膜炎是腹膜透析最常见的并发症之一。在小鼠腹腔注射无菌内毒素(LPS)，可诱导小鼠腹腔炎症，4h后腹膜液中有高水平的炎症因子产生，可用于观察抗炎药物的药效。
雄性的ICR小鼠(16g)，适应性饲养3天后随机分为6组：正常对照组(A组)，LPS模型组(B组)，5号化合物组(C组，200mg/kg)，6号化合物组(D组，60mg/kg)，15号化合物组(E组，60mg/kg)，阳性药强的松组(Prednisone，F组，5mg/kg)。Day 0，分组、称重、灌胃给药(目标化合物以1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配合PEG400配制；无菌LPS以无菌生理盐水配制)。
A和B组连续7天灌胃1％CMC-Na-5％PEG400，C、D、E和F组连续7天分别灌胃给药化合物5、6、15和Prednisone，灌胃体积为0.1mL/10g鼠。Day6，A组腹腔注射无菌生理盐水，其他组腹腔注射无菌LPS(1mg/kg)，注射体积为0.1mL/10g鼠，建立小鼠腹膜炎模型；4h后尾静脉注射10mg/mL的丙泊酚麻醉，注射体积为0.05mL/只；小鼠麻醉后，取血以测定凝血时间；脱颈椎处死小鼠，腹腔注射1mL 0.01M的磷酸缓冲液并回收，离心后取上清液作为腹腔灌洗液；采用相关试剂盒，测定各组小鼠的腹腔灌洗液中炎症介质/细胞因子水平的改变。
收集的腹腔灌洗液的测定：硝酸还原酶法检测小鼠腹腔内炎性介质NO(n＝3)分泌水平，ELISA法检测小鼠腹腔内白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)(n＝6)水平。分别依据NO和IL-1β检测试剂盒中实验操作手册，测定腹腔灌洗液中NO和IL-1β的含量(图6)。
实验结果表明，与正常组相比，LPS组NO分泌水平明显升高；与LPS组相比，各给药组腹腔灌洗液中NO分泌水平均有所降低，其中目标化合物6和15能显著抑制NO分泌。与正常组相比，LPS组IL-1β分泌水平明显升高；与LPS组相比，目标化合物5、6和15均能显著抑制IL-1β的分泌；
凝血时间的统计：尾静脉注射10mg/mL的丙泊酚麻醉小鼠(n＝4)，注射体积为0.05mL/只，然后剪须、摘眼球放血，待血流速度较缓时(第9滴)滴一滴血在干净的载玻片上，每隔30s用1mL注射器的针头挑一次，待出现细丝状物质，记录所用时间，即为此血样的凝血时间(图7)；
实验结果表明，与正常组相比，LPS组凝血时间明显延长；与LPS组相比，各给药组凝血时间均有所改善，其中目标化合物15能显著减少凝血时间的延长。
实施例42 H2S供体结合物15在治疗急性肺损伤药物中的用途
急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性加重的呼吸困难、难治性低氧血症和肺水肿；在临床上是一种以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤为病理特征的常见非特异性免疫反应疾病，即全身炎症导致系统性功能障碍综合征在肺部的表现(中草药,2008,39,1196-1199)。诱发ALI的因素可分为细菌性的和非细菌性的。严重感染、败血症、创伤、中毒、大量输血、体外循环和弥漫性血管内凝血(DIC)等均可导致ALI，其中以严重感染最为常见，严重阶段的ALI病死率高达40％(Crit Care Med,2000,28,3314-3331)。内毒素(LPS)是经典的诱发ALI模型的细菌性诱因之一，LPS进入体内后很容易被免疫防御系统识别，通过传递炎症反应的一些细胞介质来引起肺部组织损伤。ALI主要症状表现在炎性细胞浸润、多种细胞因子及黏附分子的过度表达等引发的肺毛细血管通透性增高和肺水肿；本发明通过观察以上指标的变化确认化合物15对小鼠急性肺损伤的治疗作用；
分组：雄性的Balb/c小鼠(18g)30只，适应性饲养3天后随机分为5组，每组n＝6，A组为伪手术组(Sham组)，B组为给予LPS刺激的ALI模型组(LPS组)，其余各组分别为：化合物15小剂量给药组(C组，30mg/kg)、化合物15大剂量给药组(D组，60mg/kg)、阳性药地塞米松磷酸钠注射液组(E组，DEX，4mg/kg)。化合物15以1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配合PEG400配制溶液。灭菌环境下以灭菌生理盐水(NS)配制LPS溶液(1.2mg/mL)。阳性药以灭菌NS稀释至所需浓度；
小鼠体重达到21g开始实验。小鼠腹腔注射1g/kg 20％乌拉糖麻醉，A组气管滴注灭菌NS(0.05mL/20g)，B、C、D和E组气管滴注3mg/kg灭菌LPS(0.05mL/20g)，建立小鼠ALI模型。2小时后开始给药，A和B组灌胃药物赋形剂(1％CMC-Na-5％PEG400,0.1mL/10g)，C和D组分别灌胃化合物15(30和60mg/kg)，E组尾静脉注射4mg/kg的地塞米松磷酸钠注射液(0.1mL/10g)，气管滴注24小时后，腹腔注射1g/kg 20％乌拉糖麻醉，脱颈椎处死小鼠，对小鼠左肺进行灌洗并回收灌洗液离心，收集上清液后，下层细胞沉淀用100μL 0.01M磷酸缓冲液(PBS)重悬并计数；将小鼠右肺上叶浸泡于4％福尔马林；称取小鼠右肺下叶称得湿重并记录；取左肺小叶和右肺中叶，-80℃冰箱冻存；
(1)小鼠肺组织湿干重比的测定
小鼠滴注LPS 24h后，取出小鼠右肺下叶，用滤纸吸干表面水分后称得湿重；上述肺叶放入50℃烘箱烘烤72h以上，称量肺的恒重为干重；计算肺组织的湿重与干重的比值(图8)；
实验结果表明，与正常组相比，模型组肺湿干重比明显升高，肺水肿明显；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺湿干重比均明显降低；
(2)小鼠肺泡灌洗液的细胞计数
小鼠左肺用1.7mL灭菌NS分4次(第1次为0.5mL，另3次均为0.4mL)进行灌洗并回收灌洗液，共得4管灌洗液，约1mL。4管灌洗液于1300g×10min离心。收集第一、二管上清液合并，-80℃冻存。加100μL0.01M磷酸缓冲液(PBS)重悬4管沉积的细胞并合并，移液器吹打均匀后，用0.05％龙胆紫染液稀释，于光学显微镜下进行细胞计数(图9)；
实验结果表明，与正常组相比，模型组肺部炎症明显，白细胞数量明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺泡灌洗液中白细胞数量均明显降低；
(3)小鼠肺泡灌洗液中总蛋白的测定
BCA(bicinchoninic acid)法测定BALF中总蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白，制作标准曲线。小鼠肺泡灌洗液离心后，取上清液，用NS 1:2稀释。将BCA工作液与标准液或待测样品充分混匀后于自动酶标仪570nm处读取吸光度(A)值，用标准曲线计算蛋白水平(图10)；
实验结果表明，与正常组相比，模型组肺部炎症明显，肺泡灌洗液中总蛋白浓度明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺泡灌洗液中总蛋白浓度均明显降低；
(4)小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MPO的测定
小鼠肺泡灌洗液离心后，取上清液，分别依据肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒中实验操作手册，用ELISA法以原液测定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6的释放水平；依据髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)测试盒的实验操作手册，以原液测定肺泡灌洗液中MPO的含量；
实验结果表明，与正常组相比，模型组肺部炎症明显，肺泡灌洗液中TNF-α水平明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺泡灌洗液中TNF-α水平均明显降低(图11)；
与正常组相比，模型组肺部炎症明显，肺泡灌洗液中IL-1β分泌水平明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺泡灌洗液中IL-1β水平均有所下降，其中化合物15高剂量给药组IL-1β分泌水平明显下降(图12)；
与正常组相比，模型组肺部炎症明显，肺泡灌洗液中IL-6水平明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组的肺泡灌洗液中IL-6分泌水平明显降低(图13)；
与正常组相比，模型组肺部炎症细胞浸润和氧化应激损伤很明显，肺泡灌洗液中MPO水平明显升高；与LPS组相比，化合物15各给药组和阳性药组肺泡灌洗液中MPO水平均明显降低(图14)；
(5)小鼠肺部组织病理损伤
分离取出小鼠右肺上叶放入4％福尔马林中固定。用纱布覆盖将肺完全浸入福尔马林中。固定后，按照常规方法石蜡固定切片，切成5μm切片进行HE染色，显微镜下观察病理改变；
小鼠肺病理切片HE染色显示，正常组肺泡结构清晰完整，由于该组有少量生理盐水注入，少量肺泡有渗出和肺泡壁轻度增厚(图15)，LPS刺激的模型组，存在肺泡壁增厚，有出血和炎性渗出以及肺泡塌陷(图16)，给药各组病理损伤均明显减轻，有炎症表现，但肺泡结构基本维持正常(图17-19)。

Claims (12)

1.丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征是具有式I的结构：
Figure FDA0002291672210000011
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；R2是NO供体基团、H2S供体基团或H2S/NO双供体基团。
2.根据权利要求1所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，其中的丹参素与NO供体结合物具有式II的结构，其中R2为NO供体基团，
Figure FDA0002291672210000012
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；L为连接NO供体基团的直链或支链碳链，L上可以取代有杂原子、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为2-10；n为1-6的整数。
3.根据权利要求2所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的丹参素与NO供体结合物II，其优选化合物是具有下述结构式的化合物1、2、3，
Figure FDA0002291672210000013
4.根据权利要求1所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I结构的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为氮原子，R2为半胱氨酸及其衍生物，具有通式III的结构：
Figure FDA0002291672210000021
其中：R1是烃基或酰基；R3是H、烃基或酰基；R4是H或烃基。
5.根据权利要求4所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述通式III结构的丹参素与H2S/NO供体结合物，选自具有下述结构式的化合物4-9，
Figure FDA0002291672210000022
6.根据权利要求1所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I结构的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2为不包括半胱氨酸及其衍生物在内的H2S供体，为具有式IV结构的化合物：
Figure FDA0002291672210000023
其中：R1是烃基或酰基；A是O或N；L为连接H2S供体基团的直链或支链碳链，L上取代有杂原子、烷基、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为0-6的整数；R5为H2S供体基团，选自以下基团；n＝1或2；
Figure FDA0002291672210000031
7.根据权利要求6丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述式IV结构的丹参素与H2S供体结合物，选自具有下述结构式的化合物10和11，
Figure FDA0002291672210000032
8.根据权利要求1所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I结构的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为氮原子，R2为半胱氨酸及其衍生物与NO供体的结合物，具有式V的结构：
Figure FDA0002291672210000033
其中：R1是烃基或酰基；R4是H、烃基或酰基；L为连接所述R2中半胱氨酸及其衍生物与NO供体的直链或支链碳链，L上代有杂原子、烷基、芳基或芳杂基，并且L包含的碳原子数为2-10；n为1-6的整数。
9.根据权利要求8所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述式V结构的丹参素与H2S/NO双供体，选自下述结构式的化合物12、13和14，
Figure FDA0002291672210000041
10.根据权利要求1所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，其中半胱氨酸衍生物与其它H2S供体的结合物或其在药学上可接受的盐，具有式VI的结构：
Figure FDA0002291672210000042
其中：R4、R6和R7独立取自于H、取代或未取代的烃基或酰基。
11.根据权利要求10所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的式VI结构的半胱氨酸衍生物，选自具有下述结构式的化合物15，
Figure FDA0002291672210000043
12.权利要求1-11所述的丹参素与H2S/NO供体的结合物或其在药学上可接受的盐在制备防治心脑血管和炎症相关疾病药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112794865A (zh) * 2021-01-19 2021-05-14 广西中医药大学 一种生物活性氧响应的硫化氢供体及其应用

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