CN111481581A - 款冬花萃取物用于提升基因表现量的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物萃取物领域，特别涉及款冬花萃取物用于提升基因表现量的用途。本发明提供一种款冬花萃取物用于提升TGM基因、KRT基因、AQP基因、FLG基因、GBA基因、及HAS基因表现量的用途，能使皮肤形成更多保湿因子，并维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。其中该款冬花萃取物是款冬花以水、醇、或醇水混合物的溶剂所萃取而得。
Description
技术领域
本发明涉及植物萃取物领域，特别涉及款冬花萃取物用于提升基因表现量的用途。
背景技术
表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。
表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。
综合上面所述，为了改善因角质细胞受损及保水能力下降，导致皮肤变得脆弱、易敏的问题，开发一种能有效使角质细胞分泌更多保湿因子，并维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能的医药组成物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种款冬花萃取物用于制备提升转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(Keratin，KRT)基因、聚角蛋白微丝(Filaggrin，FLG)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因、葡萄糖脑苷酯酶(Glucocerebrosidase，GBA)基因、及/或玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase，HAS)基因表现量的组合物的用途，其中该款冬花萃取物是以一溶剂萃取一款冬花所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物；该组合物可进一步包含一医药上可接受的载体。
在本发明的一实施例中，该溶剂与该款冬花的重量比为10-20∶1-5；且该萃取的温度是50-100℃。
在本发明的又一实施例中，该转谷氨酰胺酶基因是转谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1，TGM1)基因；该水通道蛋白是水通道蛋白3(Aquaporin 3，AQP 3)基因。
在本发明的又一实施例中，该角蛋白基因是角蛋白1(Keratin1，KRT1)基因、角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因或其任意组合。
在本发明的又一实施例中，该HAS基因是玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase2，HAS2)基因、玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3，HAS3)基因或其组合。
在本发明的又一实施例中，该款冬花萃取物的浓度为至少0.25mg/mL。
在本发明的另一实施例中，该款冬花萃取物是维持皮肤角质层结构完整、及/或提升皮肤保湿能力。
本发明的款冬花萃取物能有效在6小时内即显着地提升皮肤角质细胞中与保湿相关的TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失；且亦能有效调节皮肤处于保水的状态，并维持皮肤保水的恒定；其亦可使皮肤形成更多保湿因子，使皮肤保水能力上升、以及维持皮肤弹性。因此，本发明的款冬花萃取物可用于制备提升皮肤保湿能力的组合物的用途，其中该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
附图说明
图1是本发明的一实施例的款冬花萃取物作用6小时后提升TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的效果的直方图；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
图2是本发明的一实施例的款冬花萃取物作用24小时后提升TGM1基因、KRT1基因、AQP3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的效果的直方图；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、泡沫(foam)、以及悬浮液(suspension)等。
依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。
依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum，jelly)以及白凡士林(white petrolatum，)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。
依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(extemaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatory agents)、杀菌剂(bactericides)、及紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)等。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)等。
本发明提供一种款冬花萃取物用于制备提升TGM基因、KRT基因、FLG基因、AQP基因、GBA基因、及HAS基因表现量的组合物的用途，本发明的款冬花萃取物是以一溶剂萃取一款冬花所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，其可用于维持皮肤角质层结构完整、及/或提升皮肤保湿。
同时，本发明用于制备提升TGM基因、KRT基因、FLG基因、AQP基因、GBA基因、及HAS基因表现量的组合物，亦可包含一有效量的款冬花萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一食品或一保养品。
以下将详细说明本发明款冬花萃取物的详细萃取方法，与该款冬花萃取物于调控皮肤角质细胞中TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因表现量的测试，以证实该款冬花萃取物能有效使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能，并能有效维持皮肤保水的恒定与形成更多保湿因子，以使皮肤保水能力上升。
实施例1本发明的款冬花萃取物的制备方法
款冬(Tussilago farfara)是菊科(Asteraceae)款冬属(Tussilago)多年生草本植物，又称冬花、款花、看灯花、或艾冬花。茎呈葶状，丛生且直立，彼此间不分枝，表面被有密褐色短柔毛及蛛丝状绵毛；叶分为根生叶及茎生叶，根生叶丛生状，呈心形至肾形，叶缘具有细锯齿状，茎生叶则呈长椭圆状披针形至卵状长椭圆形。其花蕾又名款冬花，是常用中药材的一种，可用于去咳止痰、治疗气喘或气管炎。
在本发明的一实施例中，将款冬花的花蕾清洗，取洗净后的款冬花花蕾与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂，萃取溶剂较佳为水，以1-5∶10-20的重量比混合，均质后在溶剂中以50-100℃进行萃取0.5-3小时后，将粗萃取后冷却至室温，并将该粗萃取物以400目的滤网过滤以获得滤液。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩后，再经5μm孔径的滤心进行过滤，得到的该滤液即为本发明的款冬花萃取物。
实施例2本发明的款冬花萃取物调控角质细胞基因表现量的功效
本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞HPEK-50(Human primary epidermalkeratinocytes，HPEK)进行本发明的款冬花萃取物在短时间作用下调控TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP 3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的功效的测试。该HPEK-50细胞是购自CELLnTEC公司(瑞士)，且培养于无血清的角质细胞培养液(keratinocyte-SFM)(Gibco公司，编号为#17005042，美国)，并于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
首先，将1.5x105个HPEK-50细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下二组：(1)仅含有细胞培养液的控制组、(2)加入0.25mg/mL本发明的款冬花萃取物的实验组，并分别作用6小时；其中该款冬花萃取物是以水为溶剂进行萃取。接着，将HPEK-50细胞以细胞裂解液(购自Geanaid公司，中国台湾，编号RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，编号RBD300)分别收集该二组细胞内的RNA，接着利用
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板并以引子产生mRNA反转录的相应cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该二组反转录后产物分别以表1的组合引子进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-timepolymerase chain reaction)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQPS基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-ΔCt，其中ΔCt＝Ct目标基因-CtTBP(TATA结合蛋白，TATA-binding protein)，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显着差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
表1、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引子
先前研究指出TGM会使角质化细胞的细胞膜与结构蛋白间形成强力键结，并能增加表皮层的强度与稳定性；KRT会形成角蛋微丝，而FLG会帮助角蛋白微丝组装成坚固的网络，为皮肤提供强度和弹性。因此，角质细胞的结构基因-TGM1基因、KRT1基因、及KRT14基因的表现量上升，能够维持角质细胞排列，使皮肤角质组织的结构完整，并防止皮肤水分散失。而皮肤细胞的保湿纤维基因-FLG基因的表现量上升，能够促进天然保湿因子(NaturalMoisturizing Factor，NMF)的生成，并持续维持皮肤于保水状态。
AQP会加角质细胞内水的通透性，以提高角质细胞的含水量；GBA则与维持角质结构完整有关。因此，皮肤细胞的水分调节基因-AQP3基因、及GBA基因的表现量上升，能够稳定地调控皮肤的含水状态，以维持皮肤水分的恒定。
HAS会促进角质细胞分泌玻尿酸的能力，能够促进皮肤细胞的内生性玻尿酸生成，玻尿酸可吸附水分以提高皮肤的保水力，并能维持皮肤角质完整以提升皮肤屏障功能，且能支撑皮肤以维持皮肤弹性。因此，皮肤细胞的玻尿酸分泌基因-HAS2基因、及HAS3基因的表现量上升，能使皮肤保水力提升，并维持皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。
本发明的款冬花萃取物作用6小时后提升角质细胞内TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的结果如图1所示。人类初代角质细胞经本发明的款冬花萃取物处理6小时后，TGM1基因表现量为控制组的1.8倍、KRT1基因为2.9倍、KRT14基因为1.3倍、FLG基因为1.3倍、GBA基因为1.2倍、HAS2基因为1.9倍、HAS3基因则为1.2倍，而AQP基因则与控制组差异不大(图中未显示)。此结果显示本发明的款冬花萃取物能在短时间的作用下，有效提高TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的表现量，能有效的维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失；且亦能有效调节皮肤处于保水的状态，并维持皮肤保水的恒定；其亦可使皮肤形成更多保湿因子，使皮肤保水能力上升、以及维持皮肤弹性。
实施例3本发明的款冬花萃取物调控角质细胞中基因表现量的功效
本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞HPEK-50进行本发明的款冬花萃取物在较长时间内调控TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP 3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的功效的测试。首先，将1.5x105个HPEK-50细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下三组：(1)仅含有细胞培养液的控制组、(2)加入0.25mg/mL本发明的款冬花萃取物的实验组，并分别作用24小时；其中该款冬花萃取物是以水为溶剂进行萃取。接着，将HPEK-50细胞以细胞裂解液回收细胞后，以实施例2中所述的步骤收集该三组细胞内的RNA，并进行反转录酶以产生mRNA反转录相应的eDNA产物，再进行定量实时反转录聚合酶连锁反应试验，用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-ΔCt，其中ΔCt＝Ct目标基因-CtGAPDH，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test以决定变异是数与是否在统计上具有显着差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
本发明的款冬花萃取物作用24小时后提升角质细胞内TGM1基因、KRT1基因、AQP 3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的结果如图2所示。人类初代角质细胞经0.25mg/mL本发明的款冬花萃取物处理24小时后，TGM1基因表现量为控制组的1.3倍、KRT1基因为1.4倍、AQP 3基因为2.3倍、GBA基因为1.2倍、HAS2基因为2.4倍、HAS3基因则为2.7倍，而KRT14基因、及FLG基因则与控制组差异不大(图中未显示)。此些结果显示本发明的款冬花萃取物能有效提高TGM1基因、KRT1基因、AQP 3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的表现量，能有效的维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失；且亦能有效调节皮肤处于保水的状态，并维持皮肤保水的恒定；其亦可使皮肤形成更多保湿因子，使皮肤保水能力上升、以及维持皮肤弹性。
综上所述，本发明的款冬花萃取物能有效在6-24小时内即显着地提升皮肤角质细胞中与保湿相关的TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失；且亦能有效调节皮肤处于保水的状态，并维持皮肤保水的恒定；其亦可使皮肤形成更多保湿因子，使皮肤保水能力上升、以及维持皮肤弹性。因此，本发明的款冬花萃取物可用于制备提升皮肤保湿能力的组合物的用途，其中该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
Claims (10)
1.一种款冬花萃取物用于制备提升转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(Keratin，KRT)基因、聚角蛋白微丝(Filaggrin，FLG)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因、葡萄糖脑苷酯酶(Glucocerebrosidase，GBA)基因、及/或玻尿酸合成酶(Hyaluronansynthase，HAS)基因表现量的组合物的用途，其中该款冬花萃取物是以一溶剂萃取一款冬花所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂与该款冬花的重量比为10-20∶1-5。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萃取的温度是50-100℃。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转谷氨酰胺酶基因是转谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1，TGM1)基因；该水通道蛋白是水通道蛋白3(Aquaporin 3，AQP 3)基因。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述角蛋白基因是角蛋白1(Keratin1，KRT1)基因、角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因或其任意组合。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述HAS基因是玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2，HAS2)基因、玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3，HAS3)基因或其组合。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述款冬花萃取物的浓度为至少0.25mg/mL。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述款冬花萃取物是维持皮肤角质层结构完整、及/或提升皮肤保湿能力。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。
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