CN111471595A - 一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法，包括菌株的分离和菌株的进一步筛选。取污水处理厂新鲜的污泥装入玻璃容器中并封口并摇床培养得驯化后的活性污泥；将活性污泥的上清液，进行梯度稀释后涂布于含有污泥的灭菌琼脂平板培养基上，倒置培养后，选取菌落周围有透明圈的菌株进行平板划线纯化得到纯菌；取分离出的纯菌，分别活化到LB培养基上，取同一生长期的菌株，控制投加的量一致，投入到一定浓度的污泥的玻璃容器中，常温下进行摇床实验，每隔固定的时间取样与不投菌株的样品作对比并记录数据，根据数据作图得出优势菌株。利用本发明筛选的优势菌株，在不经过任何优化处理的情况下，最高去污泥除率高于空白样品12.2%。

Description

一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法
技术领域
本发明属于污泥处理技术领域，尤其涉及污水处理厂剩余污泥的处理，通过筛选优势菌株利用内源性消耗，使得污泥在源头达到减量效果。
背景技术
在工业迅速发展的21世纪，城市范围的扩大、人口的增加，使生活用水和工业用水量都不断的在增加，加剧了污水处理的难度，而水处理工艺中，活性污泥法（Activatedsludge process）是市政污水和工业废水处理的主流技术，90%以上的市政污水和50%以上的工业废水处理采用活性污泥法。活性污泥微生物菌胶团的形成是这个“百年工艺”成功的关键，微生物菌胶团可以通过重力沉淀下来，实现泥和水的分离，净化后清水经过消毒处理即可排出，无需过滤。然而随着我国污水处理量的不断增长，如何解决污泥的大量产生是一项关键的任务。
面对严峻的污泥处理形式，传统的污泥的解决方法主要有两个途径：一是把污泥看作放错地方的资源，提高处理处置水平，把污泥的资源化、无害化技术发挥到前沿；二是控制污泥的源头生产，在污水处理过程中减少污泥的输出。污泥源头减量化是在现有的污水处理工艺上，引入新的工艺或者方法，在不改变出水水质的情况下，减少污泥中的有机物、无机物或抑制细菌的生长，使污泥产率减少，主要依靠物理、化学、生物等手段，降低微生物产率，减少污泥向外排放量，从实质上减少污泥量，从源头上减少剩余污泥量，这种绿色工艺将实现污水处理的可持续发展。
污泥中含有大量的有机物，而菌株的生长繁殖能够利用污泥中的成分，一部分用于自身的生长，一部分通过热的形式散失到自然界中，这种纯生物法对自然界无二次污染。然而能够消耗污泥的菌株筛选方法并不成熟，是当前研究的热点问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法，在现有的活性污泥法处理污水的基础上，利用吃泥优势菌株减少污泥的产出，避免产生二次污染、高耗能等问题。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法，包括菌株的分离和菌株的进一步筛选，
菌株的分离包括如下步骤：
1）取污水处理厂新鲜的污泥装入玻璃容器中并封口；
2）将封口后的玻璃容器放入摇床中摇床培养一周，去掉1/2原污泥，加入同体积的新鲜污泥；
3）重复步骤2）6~10次后，再摇床培养一周获得驯化后的活性污泥；
4）选取驯化后的活性污泥的上清液，进行梯度稀释后涂布于含有污泥的灭菌琼脂平板培养基上，37℃倒置培养20~24h后，选取菌落周围有透明圈的菌株进行平板划线纯化，直至得到纯菌；
5）将纯菌转移至固体LB培养基上培养20~24小时，并用甘油冻存法保存菌种于-80℃中；
菌株的进一步筛选包括如下操作：
取分离出的纯菌，分别活化到LB培养基上，取同一生长期的菌株，控制投加的量一致，投入到含有污泥的玻璃容器中，常温下进行摇床实验，每隔固定的时间取样与不投菌株的样品作对比并记录数据，根据数据作图得出优势菌株。
进一步的方案，还包括后续筛选步骤：将进一步筛选后获得的多种优势菌株进行组合来和单菌的投加做比较得出最优菌株；最优菌株投入污泥中优化最佳污泥去率的温度、pH、时间条件，在最佳条件下探讨菌株使得污泥减量的机理，包括酶、抗生素、胞外聚合物的检测。
进一步的，所述玻璃容器为锥形瓶。
进一步的，步骤2）和步骤3)摇床培养条件均为29~31℃、50~70转/分钟。
进一步的，步骤2）和步骤3）中可以调节污泥pH值及摇床温度以定向筛选特殊菌株。
进一步的，步骤4）中进行梯度稀释的梯度为10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12。
步骤4）中所述含有污泥的灭菌琼脂平板培养基的制备方法为：50 g离心污泥，300mL无菌水，4.5 g琼脂混匀后装在500 mL锥形瓶中并置于高压灭菌锅灭菌，灭菌之后在超净台里倒置污泥平板。
进一步的，通过菌株的分离获得纯菌包括芽孢杆菌属纯菌。
本发明的有益效果：
本发明利用吃泥优势菌株减少污泥的产出，避免产生二次污染、高耗能等问题。
本发明的最主要创新在于采用污泥中筛选污泥降解菌的方法，利用污泥平板来初步分离筛选，即菌株吃掉污泥，在污泥平板上产生透明圈。
利用本发明筛选的优势菌株，在不经过任何优化处理的情况下，最高去污泥除率高于空白样品12.2%。
附图说明
图1为菌株分离的流程图；
图2为菌株3-10-2电镜观察图。
具体实施方式
实施例1
一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法，括菌株的分离和菌株的进一步筛选。
菌株的分离如图1所示：取污水处理厂新鲜的污泥装入500mL的锥形瓶中，用铝箔纸封住锥形瓶口防止蒸发，然后放入温度30℃、60转每分钟的摇床中摇一周，然后去掉1/2原污泥，加入同体积的新鲜污泥，同样的步骤进行8次。选取驯化后的活性污泥，进行梯度稀释10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12，涂布于含有污泥的灭菌琼脂平板培养基（制备方法为：50 g离心污泥，300 mL无菌水，4.5 g琼脂混匀后装在500 mL锥形瓶中并置于高压灭菌锅灭菌，灭菌之后在超净台里倒置污泥平板。污泥含量大约为15%。）上，37℃倒置培养，产生可降解的菌株。选取菌落周围有透明圈的菌株进行平板划线纯化，直至得到纯菌，最后转移至固体LB（Luria-Bertani）培养基（1L水，5g酵母膏，10g胰蛋白胴，5g氯化钠）上培养24小时，并用甘油冻存法保存菌种于-80℃冰箱中。
菌株的进一步筛选：取分离出的纯菌，分别活化到LB培养基上，取同一生长期的菌株，控制投加的量一致，投入到一定浓度的污泥（开始筛选菌株是自己调配的污泥浓度3000mg/L，筛选出菌株之后，直接取污水处理厂浓缩池得污泥进行实验，浓度大约30000mg/L）锥形瓶中，常温下进行摇床实验，每隔12小时或者每隔6小时取样与不投菌株的样品作对比，至少取5个点，根据数据作图得出更加具有优势的菌株。
后续筛选：进行组合来和单菌的投加做比较得出最优菌株，最优菌株投入污泥中优化最佳污泥去率的温度、pH、时间条件，在最佳条件下探讨菌株使得污泥减量的机理，包括酶、抗生素、胞外聚合物的检测。
本实施例中：
改变污泥培养基的pH值分离出特殊条件下的菌株，再通过小试试验筛选出功能菌株中的最佳功能菌株，进而优化最佳污泥减量条件，在此条件下研究污泥减量化的机理。最终筛选的菌株可以应用到污水处理厂污水处理过程中。
通过菌株分离和进一步筛选过程，成功选出UT2、3-5-1、3-10-2三株优势菌株，通过16S rRNA基因测序、系统进化树构建以及电镜观察对菌株进行初步鉴定菌株3-5-1和菌株3-10-2鞭毛较为明显（如图2所示），形状为椭圆形，UT2菌株为杆状菌株，鞭毛较易脱落。3-5-1放线菌门（Actinobacteria），UT2和3-10-2菌分属于Firmicutes（厚壁菌门），菌株UT2属于Bacillus（芽孢杆菌属），与JH792383-s相似度最高为99.93%，3-10-2属于Bacillus（芽孢杆菌属）与Novosphingobium tardum相似度最高为96.2%，为一株新菌，菌株3-5-1为Cellulomonas（纤维菌属）与Humibacter ginsengiterrae同源性最高为98.68%。
后续又比较了单株菌株和这三株菌随机组合的污泥减量效果，最终得出单菌3-10-2为最佳优势菌株，最高去除率高于空白样品12.2%。
对菌株3-10-2的反应条件进行优化。利用Box-Behnken设计法进行pH值、温度、时间三个主要影响因素交互作用的响应曲面分析，确定最佳反应条件为pH=10，温度为50℃，时间为48h，在最佳条件下投加菌株，进一步检验响应曲面法的可靠性，在反应过程中污泥的最佳减量效果达到21.2%，高于空白6.6%。
进一步探究菌株3-10-2的性质。利用柠檬酸作为阳离子结合剂，用来去除胞外聚合物，然后投加菌株3-10-2，反应过程中最高去除率达到20.1%，高于空白6.5%。在最优条件下探讨污泥减量的机理，包括胞外聚合物、典型酶和抗生素的变化，最终得出优势菌株能产生胞外酶，菌株投加和空白样品之间酶的含量的有着明显差别，菌株的投加增加了污泥中酶的含量，使得污泥中的有机物得到水解，蛋白酶最高含量为0.428U/mL，高于空白组0.008U/mL，淀粉酶高于空白0.023U/mL。

Claims (8)

1.一种污泥源头减量菌株的分离筛选方法，包括菌株的分离和菌株的进一步筛选，其特征在于：
菌株的分离包括如下步骤：1）取污水处理厂新鲜的污泥装入玻璃容器中并封口；2）将封口后的玻璃容器放入摇床中摇床培养一周，去掉1/2原污泥，加入同体积的新鲜污泥；3）重复步骤2）6~10次后，再摇床培养一周获得驯化后的活性污泥；4）选取驯化后的活性污泥的上清液，进行梯度稀释后涂布于含有污泥的灭菌琼脂平板培养基上，37℃倒置培养20~24h后，选取菌落周围有透明圈的菌株进行平板划线纯化，直至得到纯菌；5）将纯菌转移至固体LB培养基上培养20~24小时，并用甘油冻存法保存菌种于-80℃中；
菌株的进一步筛选包括如下操作：取分离出的纯菌，分别活化到LB培养基上，取同一生长期的菌株，控制投加的量一致，投入到含有污泥的玻璃容器中，常温下进行摇床实验，每隔固定的时间取样与不投菌株的样品作对比并记录数据，根据数据作图得出优势菌株。
2.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：还包括后续筛选步骤：将进一步筛选后获得的多种优势菌株进行组合来和单菌的投加做比较得出最优菌株；最优菌株投入污泥中优化最佳污泥去率的温度、pH、时间条件，在最佳条件下探讨菌株使得污泥减量的机理，包括酶、抗生素、胞外聚合物的检测。
3.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：所述玻璃容器为锥形瓶。
4.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：步骤2）和步骤3)摇床培养条件均为29~31℃、50~70转/分钟。
5.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：步骤2）和步骤3）中可以调节污泥pH值及摇床温度以定向筛选特殊菌株。
6.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：步骤4）中所述含有污泥的灭菌琼脂平板培养基的制备方法为：50 g离心污泥，300 mL无菌水，4.5 g琼脂混匀后装在500 mL锥形瓶中并置于高压灭菌锅灭菌，灭菌之后在超净台里倒置污泥平板。
7.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：
步骤4）中进行梯度稀释的梯度为10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12。
8.根据权利要求1所述的污泥源头减量菌株的分离筛选方法，其特征在于：通过菌株的分离后获得纯菌包括芽孢杆菌属纯菌。
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