CN111467324A - 复合材料及其制备方法、纳米药物、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种复合材料及其制备方法、纳米药物、应用，所述复合材料包括以下的原料：八面体二氧化铈、NHS、EDC、光敏剂和3‑氨基丙基三乙氧基硅烷。本发明实施例提供的复合材料具备优异的抗菌抗炎，通过采用多种原料制备得到的复合材料既可最大化抗菌抗炎的治疗效果，又能减小光动力治疗的副作用。而提供的制备方法简单，制备的复合材料可自调节释放ROS，通过在光照激发下瞬间释放大量的ROS来杀灭细菌，然后序列性的快速清除残余的ROS，以防止其对周围的正常组织产生损伤，解决了现有用于抗菌光动力疗法的纳米药物存在在治疗过程中无法平衡ROS水平的问题，生物安全性高。

Description

复合材料及其制备方法、纳米药物、应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体是一种复合材料及其制备方法、纳米药物、应用。
背景技术
随着科技的不断发展，医药行业也得到快速的进步。其中，抗菌光动力疗法（Antibacterial photodynamic therapy，aPDT）作为一种在光催化过程中通过瞬时产生的大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）来杀灭细菌的方法，因具有良好的治疗效果以及不引起耐药性的特点，受到了人们的广泛关注。
目前市场上，越来越多用于抗菌光动力疗法的纳米药物（例如基于抗菌光动力疗法的商品化光敏剂等）涌入医疗市场，在抗菌抗炎治疗中发挥着重要作用，尤其是在用于牙周炎治疗中，与牙周炎局部抗生素治疗效果相当，具有高经济效益和良好的治疗效果。
在抗菌光动力疗法的抗菌应用中，用于抗菌光动力疗法的纳米药物通常是通过瞬时产生的大量ROS来杀灭细菌。但是，ROS是一把双刃剑，除了具有很高的杀灭细菌功效之外，过量的ROS含量还可能引起炎症反应，导致一定的副作用。因为过量的ROS可诱导氧化应激反应，产生自由基攻击所有主要种类的生物分子，从而对细胞造成破坏，并最终触发细胞死亡和组织损伤，容易引起破坏性的宿主免疫防御反应（即促炎症反应的副作用等）。而对于牙周炎治疗，抗菌光动力后积累的ROS也可能加重牙周袋内氧化应激反应，募集炎性细胞并将巨噬细胞的极化转变为促炎表型，从而在牙周组织中发挥破坏性作用。
因此，现有用于抗菌光动力疗法的纳米药物在实际使用时存在以下不足：现有用于抗菌光动力疗法的纳米药物存在在治疗过程中无法平衡ROS水平的问题，过量的ROS含量易对周围的正常组织产生损伤，从而导致局部免疫反应失衡。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种复合材料，以解决上述背景技术中提出的现有用于抗菌光动力疗法的纳米药物存在在治疗过程中无法平衡ROS水平的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种复合材料，包括以下的原料：八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ethyl-carbodiimidehydrochloride，EDC），以及适量的光敏剂和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES），且所述八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔量之比为1000：0.015-0.019：0.14-0.17。
作为本发明进一步的方案：所述八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔量之比为1000：0.016-0.018：0.15-0.16。
优选的，所述八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔量之比为1000：0.01738：0.1565。
作为本发明再进一步的方案：所述N-羟基丁二酰亚胺的分子量是115.09，所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的分子量是191.7。
作为本发明再进一步的方案：所述光敏剂是现有产品中具有羰基的光敏剂，例如，可以采用二氢卟吩e6（Chlorin e6，Ce6）、血卟啉衍生物（hematoporphyrin deriva-tive，HPD）光敏剂、N-天门冬酰基二氢卟酚等，只要可以提供羰基用于键合即可，具体根据需求进行选择，这里并不作限定。
作为本发明再进一步的方案：所述八面体二氧化铈包括以下的原料：六水硝酸铈（Ce(NO3)3·6H2O）和十二水磷酸三钠（Na3PO4·12H2O），且所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠的质量比是430-440：3-4。
优选的，所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠的质量比是434.3：3.8。
作为本发明再进一步的方案：所述八面体二氧化铈的制备方法是：按照比例称取所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠，并采用水热法在165-175℃下进行反应，得到所述八面体二氧化铈。
作为本发明再进一步的方案：所述八面体二氧化铈的制备方法是：按照比例称取六水硝酸铈和十二水磷酸三钠分别溶解在去离子水中，得到对应的两种溶液，然后将上述两种溶液在聚四氟乙烯瓶中混合0.5-1.5小时，然后将装有混合物的聚四氟乙烯瓶放在水热合成高压反应釜中，再将该高压反应釜转移至温度控制的恒温鼓风干燥箱中，在165-175℃下加热进行反应10-14小时，离心分离得到沉淀物，清洗，干燥，得到所述八面体二氧化铈。
作为本发明再进一步的方案：在所述八面体二氧化铈的制备方法中，所述离心分离是以8000-10000rpm/min的转速进行离心10-20min。
优选的，所述离心分离是以9000rpm/min的转速进行离心15min。
作为本发明再进一步的方案：在所述八面体二氧化铈的制备方法中，所述清洗是用无水乙醇与去离子水分别进行清洗。
优选的，所述清洗是用无水乙醇清洗2次，去离子水清洗1次。
作为本发明再进一步的方案：在所述八面体二氧化铈的制备方法中，所述干燥是在40-60℃恒温烘干箱中干燥过夜。
优选的，所述八面体二氧化铈的制备方法是：将434.3mg的Ce(NO3)3·6H2O与3.8mg的Na3PO4·12H2O分别溶解在10mL和30mL去离子水中，得到对应的两种溶液，然后将上述两种溶液在聚四氟乙烯瓶中混合1小时，然后将装有混合物的聚四氟乙烯瓶放在水热合成高压反应釜中，再将该高压反应釜转移至温度控制的恒温鼓风干燥箱中，在170℃下加热进行反应12小时，离心得到沉淀物，用无水乙醇清洗2次，去离子水清洗1次，在50℃恒温烘干箱中干燥过夜，得到所述八面体二氧化铈。
需要说明的是，当然，所述八面体二氧化铈的制备也可以选用其他的现有的制备方法，例如，采用硝酸铈和草酸利用水热合成方法合成出二氧化铈八面体，或者以六水硝酸铈为原材料、聚乙烯吡咯烷酮作为表面活性剂，不依托任何硬模板水热法一步合成微纳米级规则的八面体形貌二氧化铈晶体。具体制备方法根据需求进行选择，这里并不作限定，这里，优选上述以所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠为原料的制备方法。
本发明实施例的另一目的在于提供一种复合材料的制备方法，所述的复合材料的制备方法，包括以下步骤：
按照比例称取所述八面体二氧化铈并加入分散介质进行分散得到八面体二氧化铈悬浮液，然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行氨基化处理，得到氨基功能化的二氧化铈；
将所述氨基功能化的二氧化铈分散在水中，然后按照比例加入所述N-羟基丁二酰亚胺和所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，混合均匀，再加入光敏剂进行搅拌反应，离心除去上清得到沉淀物，清洗，干燥，得到所述复合材料。
作为本发明再进一步的方案：在所述的复合材料的制备方法中，所述氨基化处理是在加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷后在55-65℃搅拌过夜，然后离心除去上清，在45-55℃干燥过夜；其中，所述离心是以8000-10000rpm/min的转速进行离心10-20min。
优选的，在所述的复合材料的制备方法中，所述氨基化处理是在加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷后使用磁力搅拌器在60℃搅拌过夜，然后离心除去上清，在烘箱中50℃干燥过夜，其中，所述离心是以9000rpm/min的转速进行离心15min。
作为本发明再进一步的方案：所述氨基化处理还包括纯化步骤，所述纯化是在离心除去上清后用去离子水进行清洗。
优选的，在所述的复合材料的制备方法中，所述氨基化处理是在加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷后使用磁力搅拌器在60℃搅拌过夜，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min除去上清，用去离子水进行清洗3次，在烘箱中50℃干燥过夜。
作为本发明再进一步的方案：所述加入光敏剂进行搅拌反应是在室温下搅拌20-30小时，所述室温一般是10-30℃。
优选的，所述加入光敏剂进行搅拌反应是使用磁力搅拌器在室温下搅拌24小时。
作为本发明再进一步的方案：所述八面体二氧化铈悬浮液的浓度为0.4mmol/mL-0.6mmol/mL，即每毫升所述八面体二氧化铈悬浮液中的八面体二氧化铈的含量是0.4-0.6mmol。
作为本发明再进一步的方案：所述八面体二氧化铈悬浮液采用的分散介质可以是无水乙醇、甲苯、甲醇等常用的有机溶剂，具体根据需求进行选择，这里并不作限定。
优选的，所述八面体二氧化铈悬浮液采用的分散介质是无水乙醇，具体是在室温条件下使用超声方法将所述八面体二氧化铈分散在装有无水乙醇的圆底烧瓶中，浓度为0.5mmol/mL。
作为本发明再进一步的方案：所述N-羟基丁二酰亚胺和所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐均可以分别采用N-羟基丁二酰亚胺溶液与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶液的形式进行加入，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液和所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶液均可以采用水进行制备。
作为本发明再进一步的方案：所述水可以是选自纯净水、矿泉水、蒸馏水、去离子水或软水中的任意一种，这里并不作限定，可以根据需要进行选择。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的复合材料的制备方法制备得到的复合材料。
作为本发明再进一步的方案：上述的复合材料在制备抗菌抗炎药物中的应用，具体的，所述的复合材料在制备用于治疗牙周炎药物中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种纳米药物，部分或全部包含上述的复合材料。
本发明实施例的另一目的在于提供一种如上述的纳米药物在制备抗菌抗炎药物中的应用。
作为本发明再进一步的方案：所述的纳米药物在制备用于治疗牙周炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明实施例制备的复合材料具备优异的抗菌抗炎，通过采用八面体二氧化铈、NHS、EDC、光敏剂和3-氨基丙基三乙氧基硅烷等作为原料，制备得到的复合材料既可最大化抗菌抗炎的治疗效果，又能减小光动力治疗的副作用。而提供的制备方法简单，制备的复合材料可自调节释放ROS，通过在光照激发下瞬间释放大量的ROS来杀灭细菌，然后序列性的快速清除残余的ROS，以防止其对周围的正常组织产生损伤，并且调节周围细菌导致的炎症状态，解决了现有用于抗菌光动力疗法的纳米药物存在在治疗过程中无法平衡ROS水平的问题，避免过量ROS水平引起的促炎症反应的副作用，生物安全性高，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的复合材料的制备方法中表面氨基化处理的流程示意图。
图2为本发明实施例提供的复合材料的制备方法中制备CeO2@Ce6的流程示意图。
图3为本发明实施例提供的CeO2@Ce6样品的SEM图。
图4为本发明实施例提供的CeO2样品与CeO2@APTES样品的SEM图。
图5为本发明实施例提供的CeO2@Ce6样品的能谱分析谱图。
图6为本发明实施例提供的复合材料的FTIR谱图。
图7为本发明实施例提供的复合材料的XRD谱图。
图8为本发明实施例提供的复合材料的UV-Vis谱图。
图9为本发明实施例提供的复合材料的Zeta电位图。
图10为本发明实施例提供的复合材料在红光照射检测吸收光谱试验中的结果图。
图11为本发明实施例提供的复合材料在人牙龈成纤维细胞培养的细胞存活率结果图。
图12为本发明实施例提供的复合材料的血液相容性结果图。
图13为本发明实施例提供的复合材料的死/活细菌数统计结果图。
图14为本发明实施例提供的复合材料的CFU值统计结果图。
图15为本发明实施例提供的复合材料的代谢活性结果图。
图16为本发明实施例提供的复合材料在抗炎性能分析中的平均mRNA表达结果图。
图17为本发明实施例提供的复合材料在抗炎性能分析中的阳性细胞计数结果图。
图18为本发明实施例提供的复合材料在成骨因子分析中的相对mRNA表达结果图。
图19为本发明实施例提供的复合材料的免疫荧光染色统计结果图。
图20为本发明实施例提供的复合材料在动物实验中的平均mRNA表达结果图。
图21为本发明实施例提供的复合材料在免疫组化染色中的IHC结果图。
图22为本发明实施例中小鼠用药60天后主要器官的组织学切片图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种复合材料，具体制备方法如下：
1）八面体二氧化铈的制备：称取434.3mg的Ce(NO3)3·6H2O与3.8mg的Na3PO4·12H2O分别溶解在10mL与30mL去离子水中，得到对应的两种溶液，然后将上述两种溶液在聚四氟乙烯瓶中混合1小时，然后将装有混合物的聚四氟乙烯瓶放在水热合成高压反应釜中，再将该高压反应釜转移至温度控制的恒温鼓风干燥箱中，在170℃下加热进行反应12小时，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min得到沉淀物，用无水乙醇清洗2次，去离子水清洗1次，在50℃恒温烘干箱中干燥过夜，得到所述八面体二氧化铈，记为CeO2；
2）表面氨基化处理：在室温条件下使用超声方法将步骤1）中得到的所述八面体二氧化铈分散在装有无水乙醇的圆底烧瓶中，得到八面体二氧化铈悬浮液，浓度为0.5mmol/mL，然后加入2mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，再使用磁力搅拌器在60℃搅拌过夜，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min除去上清，用去离子水进行清洗3次来进行纯化，在烘箱中50℃干燥过夜，得到氨基功能化的二氧化铈，记作CeO2@APTES；
其中，表面氨基化处理的具体流程示意图见图1所示，以水热合成法制备八面体二氧化铈纳米粒子因表面含有羟基，在引入APTES并加热至60℃使烷基断裂，新形成的Si-O键在二氧化铈表面呈网状结构，纳米粒子外围延伸-NH2键，构成氨基功能化的二氧化铈；
3）复合材料的制备：将步骤2）中得到的所述氨基功能化的二氧化铈（10mmol）分散在20mL去离子水中，超声振荡1h，然后在磁力搅拌下加入100微升的N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）和1mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL），再称取3mg的二氢卟吩e6加入溶液中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌24小时进行反应，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min除去上清，用去离子水进行清洗2次，在50℃恒温干燥箱中干燥过夜，得到所述复合材料，记作CeO2@Ce6；
其中，复合材料的制备的具体流程示意图见图2所示，氨基功能化的二氧化铈在洗去多余的APTES后，加入NHS/EDC反应堆活化-NH2键，然后加入Ce6，活化后的-NH2键与Ce6的羰基键合形成新的纳米复合粒子，即CeO2@Ce6。
实施例2
与实施例1相比，除了将所述二氢卟吩e6的加入量替换为3.5mg外，其他与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，除了将所述Ce(NO3)3·6H2O的加入量替换为440mg以及Na3PO4·12H2O的加入量替换为4mg外，其他与实施例1相同。
实施例4
与实施例1相比，除了将所述Ce(NO3)3·6H2O的加入量替换为430mg以及Na3PO4·12H2O的加入量替换为3.5mg外，其他与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，在八面体二氧化铈的制备中，除了将“在170℃下加热进行反应12小时”替换为“在165℃下加热进行反应10小时”外，其他与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比，在八面体二氧化铈的制备中，除了将“在170℃下加热进行反应12小时”替换为“在175℃下加热进行反应14小时”外，其他与实施例1相同。
实施例7
与实施例1相比，在八面体二氧化铈的制备中，除了将“在170℃下加热进行反应12小时”替换为“在175℃下加热进行反应10小时”外，其他与实施例1相同。
实施例8
与实施例1相比，除了将所述Ce(NO3)3·6H2O的加入量替换为430mg以及Na3PO4·12H2O的加入量替换为3mg外，其他与实施例1相同。
实施例9
与实施例1相比，除了将所述N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）的加入量替换为92μL以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL）的加入量替换为0.958mL外，其他与实施例1相同。
实施例10
与实施例1相比，除了将所述N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）的加入量替换为86.3μL以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL）的加入量替换为0.895mL外，其他与实施例1相同。
实施例11
与实施例1相比，除了将所述N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）的加入量替换为103.6μL以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL）的加入量替换为1.02mL外，其他与实施例1相同。
实施例12
与实施例1相比，除了将所述N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）的加入量替换为109.3μL以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL）的加入量替换为0.895mL外，其他与实施例1相同。
实施例13
与实施例1相比，除了将所述N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）的加入量替换为109.3μL以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL）的加入量替换为1.086mL外，其他与实施例1相同。
实施例14
与实施例1相比，除了将所述八面体二氧化铈分散在装有无水乙醇的圆底烧瓶中得到八面体二氧化铈悬浮液的浓度替换为0.4mmol/mL，其他与实施例1相同。
实施例15
一种复合材料，具体制备方法如下：
1）八面体二氧化铈的制备：称取434.3mg的Ce(NO3)3·6H2O与3.8mg的Na3PO4·12H2O分别溶解在10mL与30mL去离子水中，得到对应的两种溶液，然后将上述两种溶液在聚四氟乙烯瓶中混合1小时，然后将装有混合物的聚四氟乙烯瓶放在水热合成高压反应釜中，再将该高压反应釜转移至温度控制的恒温鼓风干燥箱中，在170℃下加热进行反应12小时，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min得到沉淀物，用无水乙醇清洗2次，去离子水清洗1次，在50℃恒温烘干箱中干燥过夜，得到所述八面体二氧化铈；
2）表面氨基化处理：在室温条件下使用超声方法将步骤1）中得到的所述八面体二氧化铈分散在装有无水乙醇的圆底烧瓶中，得到八面体二氧化铈悬浮液，浓度为0.6mmol/mL，然后加入3mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，再使用磁力搅拌器在55℃搅拌过夜，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min除去上清，用去离子水进行清洗3次来进行纯化，在烘箱中50℃干燥过夜，得到氨基功能化的二氧化铈，记作CeO2@APTES；
3）复合材料的制备：将步骤2）中得到的所述氨基功能化的二氧化铈分散在20mL去离子水中，超声振荡1h，然后在磁力搅拌下加入100微升的N-羟基丁二酰亚胺溶液（浓度0.2mg/mL）和1mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液（浓度0.3mg/mL），再称取3mg的二氢卟吩e6加入溶液中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌24小时进行反应，然后以9000rpm/min的转速进行离心15min除去上清，用去离子水进行清洗2次，在50℃恒温干燥箱中干燥过夜，得到所述复合材料。
实施例16
与实施例15相比，除了将“使用磁力搅拌器在55℃搅拌过夜”替换为“使用磁力搅拌器在65℃搅拌过夜”外，其他与实施例15相同。
实施例17
将实施例1中制备得到的CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品分别进行扫描电镜（SEM，scanning electron microscope）表征，具体的SEM图见图3和图4所示。其中，图3是CeO2@Ce6样品的SEM图，图4中的（d）图是CeO2样品的SEM图，图4中的（e）图是CeO2@APTES样品的SEM图，从图3-4中可以看到，CeO2样品具有标准的八面体结构，且表面较粗糙，粒径在100nm左右。与之形成鲜明对比的是CeO2@APTES样品与CeO2@Ce6样品的SEM图，形成的CeO2@APTES样品与CeO2@Ce6样品的纳米粒子表面均匀包裹一层有机物。
实施例18
为了验证实施例1中制备得到的最终产物CeO2@Ce6样品的成分，本实施例对CeO2@Ce6样品进行能谱（EDX，Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy，能量色散X射线光谱仪）分析，具体的EDX图如图5所示，从图5中可以确定，最终产物CeO2@Ce6样品中含有Ce、Si、C等元素，能谱结果定性说明了在最终产物CeO2@Ce6样品中，一定含有APTES成分，Ce6的含量还需进一步检测。
实施例19
将实施例1中制备得到的CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品分别进行FTIR（Fourier Transform Infrared Spectrometer，傅里叶变换红外光谱仪）表征，具体的FTIR谱图见图6所示。同时，将实施例1中制备得到的CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品分别进行XRD（diffraction of x-rays，X射线衍射）表征，具体的XRD谱图见图7所示。
从图6-7中可以看出，CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品的傅里叶红外图谱范围是400-4000cm-1，图7中三个样品均表现出Ce-O的特征吸收峰。在图6中，CeO2样品对应的曲线在1637cm-1出现的峰是来自材料吸收水分子中的O-H的弯曲振动，在3400cm-1处出现的峰对应于未氨基化处理的二氧化铈表面羟基的O-H；CeO2@APTES样品对应的曲线在3400cm-1处峰强度降低，这种变化来自于APTES氨基化二氧化铈后使该峰强度降低；另外，CeO2@APTES样品对应的曲线在1554cm-1和790cm-1处出现了来自于-NH2的对称弯曲振动和O-Si的伸缩振动，在1000-1200cm-1出现不对称的Si-O的伸缩振动峰，在3000cm-1附近的峰来自-CH2的振动。CeO2@Ce6样品对应的曲线中3000cm-1附近的-CH2峰增强，在1712cm-1处出现了C=O的二氢卟吩e6特征峰，所以可以得出二氢卟吩e6已经成功键合到二氧化铈表面的结论。图7证明了在由CeO2样品制备得到CeO2@Ce6样品的过程中二氧化铈晶型未发生变化。
实施例20
将实施例1中制备得到的CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品（并以二氢卟吩e6即Ce6作为对照）分别进行UV-Vis（Ultraviolet and visible spectrophotometry，紫外-可见光分光光度法）表征，具体的UV-Vis谱图见图8所示，是利用紫外-可见光分光光度计测试的待检测样品的紫外可见吸收光谱。
从图8中可以看出，通过UV-Vis谱图来表征特征吸收峰，CeO2样品对应的曲线主要吸收区域在200-480nm，CeO2样品对应的曲线与CeO2@APTES样品对应的曲线在350nm波段有强烈的吸收，是由于二氧化铈中的电荷从O2p轨道跃迁到Ce4f轨道吸收能量产生的，在CeO2@Ce6样品对应的曲线中，吸收峰值右移，现阶段研究中，对CeO2的吸收光谱蓝移现象的解释还不统一。较常见的量子尺寸效应局限于小尺寸的纳米结构离子，不适用于本实验来解释该现象。故主要考虑原因为：由于Ce6的还原作用，Ce4+到Ce3+的价态转变，CeO2的颗粒边界以及氧空位周围Ce3+浓度增加，铈离子的价态转移引起的静电势效应导致了带隙的蓝移；Ce6在200-800nm之间有四个吸收峰，最大峰位于404nm，在282nm和506nm处有两个小吸收峰，在670nm附近有一个较强的吸收峰；CeO2@Ce6样品对应的曲线在282nm和506nm附近新增小吸收峰，670nm附近新增较强吸收峰，是来自Ce6的特征吸收峰。
实施例21
将实施例1中制备得到的CeO2样品、CeO2@APTES样品以及CeO2@Ce6样品分别进行Zeta电位（Zeta potential）分析，具体的Zeta电位图见图9所示，是利用Zetasizer系列电位仪测量的待检测样品的ζ电势，从图9中可以看出，CeO2样品表面ζ电位为19.2mV，氨基功能化后CeO2@APTES样品表面ζ电位为9.52mV，而CeO2@Ce6样品表面ζ电位为-35.3mV，说明了表面负载了带负电的小分子Ce6后，纳米颗粒（CeO2@Ce6样品）表面的ζ点位发生了变化。
实施例22
为了验证复合材料对ROS的去除能力，将实施例1中制备得到的CeO2@Ce6样品进行红光照射检测吸收光谱试验，具体是将CeO2@Ce6样品中加入ABDA（9,10-Anthracenediyl-bis(methylene)-dimalonic acid，9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸），然后用红光照射（635nm）以30秒的间隔检测对应的吸收光谱，对应的红光照射检测吸收光谱试验的结果如图10所示。从图10中可以看出，由于ABDA可与CeO2@Ce6样品发生产生单线态氧的反应，ABDA的吸光度在260nm处150秒时下降，同时，由于Ce6分子通过光降解而被消耗，因此402nm处的谱带表现出相似的趋势；150秒后，在402nm处的频带仍显示下降趋势，但是ABDA保持恒定，这种现象归因于CeO2的ROS去除能力。由于氧化应激的产生主要是由于内源性抗氧化剂防御与ROS产生之间的不平衡，在炎症反应和aPDT期间，活性氧水平可能迅速升高，CeO2作为一种良好的ROS清除剂，可以与超氧化物和过氧化氢发生催化反应，以模仿超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的生物学作用，实现ROS的去除。
实施例23
将实施例1中制备得到的CeO2@Ce6样品通过超声分散悬浮在去离子水中以形成浓度为1mol/L的胶体悬浮液。
实施例24
将实施例23中得到的胶体悬浮液进行加入去离子水分别制备得到浓度是5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L的样品（例如，每升的浓度是5mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是5mmol），分别记作5mM组、10mM组、15mM组、20mM组，同时，将去离子水作为对照，记作Control组，将上述各组进行体外生物安全性分析，具体是在上述各组对应的样品上分别培养24h、48h和72h后人牙龈成纤维细胞（Human gingival fibroblasts，HGFs，ScienCell，San Diego，CA，USA），然后进行CCK-8（cell counting kit-8）测定，对应的人牙龈成纤维细胞培养的细胞存活率结果如图11所示。从图11中可以看出，在10mM或更小的浓度下，细胞存活率超过90％，随着浓度增加到20mM，细胞活力仍超过70％，因此，实施例1中制备得到的CeO2@Ce6样品具有良好的体外生物安全性。
在本实施例中，将HGFs（human gingival fibroblasts，人牙龈成纤维细胞）分别与浓度为0mmol/L（即Control组）、10mmol/L（即10mM组）和15mmol/L（即15mM组）的CeO2@Ce6样品一起孵育，然后进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)染色，DAPI标记的核呈蓝色荧光，均质且完整，表明在Control组和10mM组中具有良好的生物相容性和生物安全性。当用浓度为15mmol/L的CeO2@Ce6样品孵育细胞时，CeO2@Ce6样品与Control组之间出现明显差异，可见，CeO2@Ce6样品的浓度是10mmol/L时具有良好的生物相容性和生物安全性。
在本实施例中，用红细胞裂解测定法评估CeO2@Ce6的血液相容性（5mM组-20mM组），具体是将5mM组、10mM组、15mM组、20mM组分别与人RBC(redbloodcell，红细胞)相容，同时以Triton-X 100（聚乙二醇辛基苯基醚）和PBS（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffersaline）分别用作阳性对照与阴性对照，分别记作Positive与Negative，观察对应的人RBC的照片和溶血分析结果，具体的血液相容性结果见图12所示。从图12中可以看出，显示的溶血率均低于5％，表现出优异的血液相容性，这种现象可以解释为众所周知的CeO2的抗氧化性能降低了高浓度纳米颗粒的毒性。
实施例25
将实施例24中得到的10mM组（每升的浓度是10mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是10mmol）的样品进行抗菌性能分析，具体是将10mM组的样品分别进行培育牙周炎致病菌中的牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）与具核梭杆菌（F.nucleatum），在有光照射与无光照射的情况下，分别计算死/活细菌数，同时，将实施例1中制备得到的CeO2样品加入去离子水分散得到浓度是10mmol/L的样品，分别进行培育牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌，在有光照射与无光照射的情况下，分别计算死/活细菌数，并以去离子水作为对照组进行相同的操作，具体的死/活细菌数统计结果见图13所示，图13中（a）图对应的是牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），图13中（b）图对应的是具核梭杆菌（F.nucleatum）；其中，Control对应的是以去离子水作为对照组在无光照射的情况下计算的死/活细菌数，Light对应的是以去离子水作为对照组在有光照射的情况下计算的死/活细菌数，CeO2+L与CeO2分别是CeO2样品加入去离子水分散得到的浓度是10mmol/L的样品进行培育牙周炎致病菌时，在有光照射与无光照射的情况下计算的死/活细菌数，CeO2@Ce6+L与CeO2@Ce6分别是实施例24中得到的10mM组的样品进行培育牙周炎致病菌时，在有光照射与无光照射的情况下计算的死/活细菌数。从图13可以看出，由于活菌被染成绿色，死亡细菌被染为红色，这取决于革兰氏阴性细菌的蛋白排斥性，对照组显示为绿色，相反，光动力治疗的CeO2@Ce6样品（10mM组）显示为大部分红色的死亡细菌，表明CeO2@Ce6样品可以发挥抗菌作用。
在本实施例中，将上述的实验组分别进行计算CFU（Colony-Forming Unit，菌落形成单位）值，具体的，将实施例24中得到的10mM组（每升的浓度是10mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是10mmol）的样品进行抗菌性能分析，具体是将10mM组的样品分别进行培育牙周炎致病菌中的牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌，在有光照射与无光照射的情况下，分别计算CFU值，同时，将实施例1中制备得到的CeO2样品加入去离子水分散得到浓度是10mmol/L的样品，分别进行培育牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌，在有光照射与无光照射的情况下，分别计算CFU值，并以去离子水作为对照组进行相同的操作，具体的CFU值统计结果见图14所示，其中，图14中（a）图对应的是牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），图14中（b）图对应的是具核梭杆菌（F.nucleatum）。从图14可以看出，在有光照射和无光照射的情况下，CeO2样品的CFU值均与CeO2@Ce6样品的CFU值相似，表明铈可以发挥抗菌作用，而Ce6掺入CeO2中不会损害该性质，采用CeO2@Ce6的光治疗使不同的细菌种类的CFU减少了4个log以上，表明复合纳米粒子光动力治疗可以取得较好的抗菌效果。
在本实施例中，将上述的实验组分别用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）测定牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生物膜的代谢活性，具体的代谢活性结果如图15所示，其中，图15中（a）图对应的是牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），图15中（b）图对应的是具核梭杆菌（F.nucleatum），从图15可以看出，4天单菌种生物膜的代谢活性结果是：对于每个菌种，未光照的CeO2@Ce6样品与CeO2样品的MTT结果相似，检测的MTT结果与死/活细菌数和CFU值结果的趋势相似，CeO2@Ce6样品的光照组抑制率明显强于其他组，这些数据表明，CeO2@Ce6样品介导的aPDT对牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌具有较强的抑制作用。
实施例26
将实施例24中得到的10mM组（每升的浓度是10mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是10mmol）的样品进行抗炎性能分析，具体是将10mM组的样品进行培育牙龈卟啉单胞菌LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）浓度1μg/mL刺激3h后统计炎症因子TNF（tumornecrosis factor，肿瘤坏死因子）-α，IL-6（Interleukin-6，白细胞介素-6），IL-1β（interleukin-1β，白细胞介素-1β），IL-10（Interleukin-10，白细胞介素-10），Arg-1（arginine-1，精氨酸-1）和TNF-β的平均mRNA表达（未刺激等于1；n=3；平均值±sd），同时，将实施例1中制备得到的CeO2样品加入去离子水分散得到浓度是10mmol/L的样品同样采用上述操作统计炎症因子TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-10，Arg-1和TNF-β的平均mRNA表达，并以Triton-X 100（聚乙二醇辛基苯基醚）和PBS（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline）分别用作阳性对照与阴性对照进行相同的操作，分别记作Positive Congtrol与NegativeCongtrol，具体的平均mRNA表达结果见图16所示。从图16可以看出，在无光照的情况下，CeO2@Ce6不仅降低了TNF-α、IL-1β和IL-6等M1型巨噬细胞相关因子的mRNA水平，并且促进了M2型巨噬细胞相关因子的表达。对于牙龈卟啉单胞菌LPS引起的炎症，CeO2@Ce6不仅显示出强大的抗炎潜能，而且促进了M1表型巨噬细胞向M2表型巨噬细胞的转化，表明CeO2@Ce6样品可以发挥抗炎作用。
在本实施例中，为了进一步证实CeO2@Ce6的抗炎机制，通过NF-κB（nuclearfactor kappa-B，核因子κB）/p65实验评估了NF-κB信号通路的抑制情况，具体是通过免疫荧光分析检测Raw 264.7细胞中的NF-kB/p65，并在显微镜下计数（n＝3；平均值±sd）（p<0.05），得到的具体的阳性细胞计数结果见图17所示。脂多糖可以激活NF-κB信号通路，从而导致炎症因子如TNF-α，IL-1β和IL-6的高表达。NF-κB/p65亚基从胞质到核的转运是NF-κB信号通路活化的关键过程，抑制活化的NF-κB的核转运很重要。图17显示，CeO2和CeO2@Ce6均可抑制NF-κB/p65信号通路，CeO2和CeO2@Ce6的阳性细胞计数均明显低于对照组，CeO2和CeO2@Ce6组之间的差异不显着。因此，证明了CeO2@Ce6纳米平台可通过抑制NF-κB/p65信号通路活化来发挥显着的抗炎作用。
实施例27
在本实施例中，由于成骨作用的再生能力有限以及细菌感染下免疫微环境的不利影响，牙周炎的牙周组织再生仍然具有挑战性。为了证明在LPS激活炎症状态下对小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3（Mouse osteoblast cell line）成骨分化潜能的影响，收集LPS刺激小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7后的培养基，配制炎性成骨培养基，建立炎性微环境，在炎症性微环境中，LPS刺激巨噬细胞的炎症性条件培养基显着抑制了MC3T3的成骨分化。通过实时PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）分析成骨因子OCN（免疫荧光化学检测骨钙素），COL-1，ALP（alkaline phosphatase，碱性磷酸酶染色）和RUNX-2（Runt-relatedtranscription factor 2）的相对mRNA水平，具体的相对mRNA表达结果见图18所示，在第7天进行ALP染色，在第21天用ARS（Alizarin Red S，茜素红S）染色矿化结节，OCN免疫荧光染色以检测MC3T3成骨细胞分化，最后进行OCN免疫荧光染色统计（p<0.05），具体的OCN免疫荧光染色统计结果见图19所示。
从图18可以看出，PCR结果显示，相较于LPS组MC3T3成骨分化受到明显抑制，CeO2@Ce6组OCN，COL-1，ALP和RUNX-2成骨相关因子的表达升高，ALP染色以及ARS染色结果明显增强。从图19可以看出，TNF-α、IL-1β、IL-6可刺激破骨细胞的形成和骨吸收，LPS组条件培养基比其他组的培养基含有更多的TNF-α，IL-1β和IL-6，因此导致成骨活性降低，CeO2@Ce6的抗氧化活性可保护MC3T3免受炎性细胞因子的影响，其可再生能力改善了长期矿化结果。这些结果表明，CeO2@Ce6的免疫调节作用可长期影响成骨作用。
实施例28
将实施例24中得到的10mM组（每升的浓度是10mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是10mmol）的样品进行动物实验，具体是在BALB/c裸鼠中LPS和细菌（牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌）共同建立的牙周炎模型进行，LPS和细菌处理后，小鼠的牙龈变红肿，将10mM组的样品对小鼠进行光动力治疗，定量分析小鼠周围组织中IL-1β，IL-6，Arg-1和IL-10的平均mRNA表达，同时，将实施例1中制备得到的CeO2样品加入去离子水分散得到浓度是10mmol/L的样品同样采用上述操作统计IL-1β，IL-6，Arg-1和IL-10的平均mRNA表达，具体的平均mRNA表达结果见图20所示，有光照的组别是+L。从图20可以看出，LPS和混合细菌处理后，小鼠的牙龈变红肿，在CeO2@Ce6光动力治疗后，上述炎症反应逐渐消失，这有助于促进牙周疾病的功能恢复，对照组中炎性细胞的总数显着高于其他四组，与对照组相比，所有四个组的IL-1β和IL-6的表达水平均有不同程度的降低。但是，与对照组相比，所有四个实验组的Arg-1和IL10的表达水平均有不同程度的提高，它们全部显示与空白对照的不同。
在本实施例中，将上述的实验组中TNF-α、IL-1β、IL-6进行IHC（immunohistochemistry，免疫组化染色）以及IHC的相对统计值计算，具体的IHC结果如图21所示，从图21中可以看出，经CeO2@Ce6光动力治疗后，牙周炎的牙周组织中TNF-α，IL-1β和IL-6的表达显着降低，与PCR结果类似，这意味着CeO2@Ce6光动力治疗可以抑制这种炎症反应并调节相关因子的水平，而CeO2@Ce6光动力治疗的效果优于其他组的原因可能是精准的纳米平台系统可以利用aPDT产生的ROS有效地破坏了细菌的细胞壁，随后，强大的ROS调节能力在调节LPS和混合细菌引起的局部牙周炎的鼠模型中对残留ROS的调节起着重要的作用。aPDT和CeO2的协同作用使第一阶段（脂质过氧化）和第二阶段（抗氧化作用）分别在最佳时间发挥了有效作用。
实施例29
将实施例24中得到的10mM组（每升的浓度是10mmol/L的样品，对应的CeO2@Ce6样品的含量是10mmol）的样品进行长期体内生物安全性实验，具体是在BALB/c裸鼠中局部注射10mM组的样品60天后，进行主要器官的H＆E组织学分析，具体的小鼠用药60天后主要器官的组织学切片图像见图22所示。图22表明，龈下注射CeO2@Ce6后未发生形态学变化或发炎迹象，表明CeO2@Ce6不会引起小鼠全身重大的毒性反应。
需要特别说明的是，本发明实施例制备的复合材料在实际应用于牙周炎等细菌感染性疾病的治疗时，可以高效的杀灭细菌，不引起细菌的耐药性，发挥抗菌抗感染的作用，同时可以调节ROS，降低光动力治疗的副作用，有效的保护周围正常细胞；另一方面，还可以起到很好的抗炎作用，将炎症细胞从促炎的M1型转变为抗炎的M2型，从而恢复牙周组织的再生潜力，不仅可以用于牙周炎的治疗，也可用于其他细菌感染性疾病的治疗，具有优异的抗菌抗炎效果。
本发明实施例有益效果如下，本发明实施例制备的复合材料具备优异的抗菌抗炎，通过采用八面体二氧化铈、NHS、EDC、光敏剂和3-氨基丙基三乙氧基硅烷等作为原料，制备得到的复合材料既可最大化抗菌抗炎的治疗效果，又能减小光动力治疗的副作用。而提供的制备方法简单，制备的复合材料可自调节释放ROS，解决了在光动力治疗中局部免疫反应失衡的问题，最大化抗菌抗炎治疗效果，具有良好的市场应用前景，制备的复合材料可以作为一种新型的可用于抗菌光动力治疗的纳米药物，可在光照激发下瞬间释放大量的ROS来杀灭细菌，然后序列性的快速清除残余的ROS，防止高局部氧化应激，以防止其对周围的正常组织产生损伤，并且调节周围细菌导致的炎症状态，解决了过量ROS水平引起的促炎症反应的副作用，尤其是是对于牙周炎的治疗，避免牙周组织由于过量ROS造成不可逆的损伤，有效提高了牙周炎中的抗菌光动力治疗的生物安全应用，尤其是在抗菌抗炎药物领域具有广阔的应有价值和市场前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种复合材料，其特征在于，包括以下的原料：八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，以及适量的光敏剂和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，且所述八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔量之比为1000：0.015-0.019：0.14-0.17。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述八面体二氧化铈、N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔量之比为1000：0.016-0.018：0.15-0.16。
3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述八面体二氧化铈包括以下的原料：六水硝酸铈和十二水磷酸三钠，且所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠的质量比是430-440：3-4。
4.根据权利要求3所述的复合材料，其特征在于，所述八面体二氧化铈的制备方法是：按照比例称取所述六水硝酸铈与所述十二水磷酸三钠，并采用水热法在165-175℃下进行反应，得到所述八面体二氧化铈。
5.一种如权利要求1-4任一所述的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照比例称取所述八面体二氧化铈并加入分散介质进行分散得到八面体二氧化铈悬浮液，然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行氨基化处理，得到氨基功能化的二氧化铈；
将所述氨基功能化的二氧化铈分散在水中，然后按照比例加入所述N-羟基丁二酰亚胺和所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后加入光敏剂进行搅拌反应，离心得到沉淀物，清洗，干燥，得到所述复合材料。
6.根据权利要求5所述的复合材料的制备方法，其特征在于，在所述的复合材料的制备方法中，所述氨基化处理是在加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷后在55-65℃搅拌混合，然后进行离心、干燥，得到氨基功能化的二氧化铈。
7.根据权利要求5所述的复合材料的制备方法，其特征在于，所述八面体二氧化铈悬浮液的浓度为0.4mmol/mL-0.6mmol/mL。
8.一种采用权利要求5-7任一所述的复合材料的制备方法制备得到的复合材料。
9.一种纳米药物，其特征在于，部分或全部包含如权利要求1或2或3或4或8所述的复合材料。
10.一种如权利要求9所述的纳米药物在制备抗菌抗炎药物中的应用。
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