CN111454614B - 3d生物打印墨水及其制备方法和应用 - Google Patents

3d生物打印墨水及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111454614B
CN111454614B CN202010470447.0A CN202010470447A CN111454614B CN 111454614 B CN111454614 B CN 111454614B CN 202010470447 A CN202010470447 A CN 202010470447A CN 111454614 B CN111454614 B CN 111454614B
Authority
CN
China
Prior art keywords
printing
silk fibroin
gel
biological
ink
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010470447.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111454614A (zh
Inventor
王卉
陈晓敏
张克勤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN202010470447.0A priority Critical patent/CN111454614B/zh
Publication of CN111454614A publication Critical patent/CN111454614A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111454614B publication Critical patent/CN111454614B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D11/00—Inks
    • C09D11/30—Inkjet printing inks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B29C64/112—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material using individual droplets, e.g. from jetting heads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D11/00—Inks
    • C09D11/02—Printing inks
    • C09D11/04—Printing inks based on proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Abstract

本发明涉及一种3D生物打印墨水及其制备方法和应用。3D生物打印墨水的制备方法包括以下步骤：对丝素蛋白水溶液施加50V以下的恒定电压，电压施加时间为120min以下，得到丝素蛋白电凝胶，然后在30℃～100℃下去除丝素蛋白电凝胶中的气泡，冷却后即得到3D生物打印墨水。本发明的生物打印墨水适用于3D打印技术，其采用纯丝素蛋白制备，不添加其他化学试剂，获得的纯丝素蛋白墨水兼具良好的3D可打印性和优异的生物相容性，且打印成型后交联方式简便，交联后的支架机械性能良好。

Description

3D生物打印墨水及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及3D打印技术领域，尤其涉及一种3D生物打印墨水及其制备方法和应用。
背景技术
三维(3D)打印技术是一种基于分层制造原理发展起来的新兴制造技术，通过计算机控制以逐层叠加的方式形成3D结构，生物3D打印技术是3D打印技术的一个分支。生物3D打印是一门结合计算机科学、细胞生物学、材料学及医学的综合学科。生物3D打印墨水简称生物墨水，是生物3D打印的关键组件。理想的生物墨水首选应该具备良好的打印成型性，而且还应同时具备生物相容性、可降解性、有无毒副作用、以及适宜的机械性质等较多方面。由于对生物打印墨水的高要求，目前适用于不同生物3D打印技术的生物墨水已经成为制约该技术发展的一个障碍。如何取得生物墨水可打印性和生物相容性之间的平衡是合理设计生物墨水的出发点。
生物墨水主要是由生物可打印性材料和生物活性物质(细胞、生长因子和蛋白质等)构成。生物墨水材料主要有四种类型，包括水凝胶、微载体、细胞聚集体和脱细胞基质成分。其中水凝胶材料是目前生物墨水材料的研究热点。水凝胶由于具有与天然组织相类似的微环境，适合包裹细胞进行生物3D打印，而被广泛应用于生物墨水材料。目前应用的生物墨水材料以高分子材料为主，但是，目前用于挤出成型生物3D打印技术的生物墨水材料中，很难同时兼具优异的生物相容性与良好的可打印性。合成高分子材料在3D打印成型效果和精度有一定的优势，但合成高分子材料的生物相容性较差，因此在生物3D打印领域应用中受到限制。而天然高分子材料所形成的水凝胶具有优良的生物相容性，非常适合包裹细胞进行生物3D打印，但是天然高分子材料的可打印性较差，很难实现对复杂3D结构的打印成型，需要寻求合适的交联机制提高其可打印性。
不同的生物3D打印技术由于打印原理不同，对于对应的墨水材料的性能要求也不尽相同。其中挤出成型生物3D打印技术一般是将“生物墨水”存储在一个温度可控的料筒中，喷嘴与料筒相连并安装在一个多轴的定位台上，由压力控制给料的微细喷嘴将墨水挤出。该技术具有灵活性好，快速打印方便，易于操作而应用广泛。但是，挤出成型生物3D打印技术若要实现直写挤压打印，其对生物墨水的流变性能和保形性提出了严格的要求。生物3D打印技术要求生物墨水材料具有剪切稀化的流变性能，从而避免打印过程中堵塞喷头，并防止打印过程中对细胞的机械损伤。并且还要求墨水材料从打印喷头中出来以后能直接在接收平台上通过合适的交联机制打印成型，完成所需宏观-微观结构体成型。当然，在满足以上对墨水材料严格的流变性能要求上，还需要满足良好的生物相容性。正如前面提到的，如何取得生物墨水可打印性和生物相容性之间的平衡是合理设计生物墨水的基础和难点。
丝素蛋白水凝胶作为家蚕丝素蛋白的一种重要的表现形态，生物性能优良，其内部保持大量的溶剂水和高度交联的空间网络结构，可应用于制备创口敷料、药物缓释载体、细胞培养支架等组织工程。丝素蛋白因其良好的生物相容性、合适的生物降解性、良好的机械性能和丰富的来源等优势受到研究人员的高度重视。近年来，以“丝素蛋白作为生物墨水”的相关研究发展快速。通常天然蚕丝经脱胶、溶解和透析可得到再生丝素蛋白水溶液，但是再生丝素蛋白溶液不具备生物墨水合适的粘度特性，可打印性较差。近年来，研究者用通过掺混其他高粘度生物材料来获取良好流变性能的丝素蛋白生物墨水。这一方法大大改善了丝素蛋白材料在生物3D打印的可打印性。如Sommer(Marianne R.Sommer,ManuelSchaffner,Davide Carnelli,and André R.Studart.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,34677-34685.)将微米级和纳米级的聚己内酯微球作为生物墨水制孔模板，通过在丝素溶液中添加魔芋葡甘露聚糖来增加粘度，改善墨水流变特性以适应3D挤压性打印。最终采用多糖溶于水的特征制成纯丝素多级孔的骨支架模型。美国Ashley M(Ashley M.Compaan,Kyle Christensen,
Figure BDA0002514131340000021
and Yong Huang.ACS Biomater.Sci.Eng.2017,3,1519-1526.)提出两步胶凝工艺用于丝素蛋白溶液3D打印，采用在打印过程中形成海藻酸钙交联和酶促交联实现生物打印。
但是，目前研究者采用的添加化学试剂或掺混其他高粘度生物材料的方式，虽然可以显著改善丝素蛋白材料的可打印性，但是往往这种方法制备的生物墨水中丝素蛋白含量的减少，未能完全展现丝素蛋白材料优异的生物特性，并且化学试剂的残留会对细胞的长期生长行为产生不利影响。因此，制备高含量的丝素蛋白或纯丝素蛋白的生物墨水是目前3D打印中需要迫切解决的问题。
发明内容
为解决生物3D打印中丝素蛋白生物墨水制备和交联的困难，本发明的目的是提供一种3D生物打印墨水及其制备方法和应用。本发明的生物墨水适用于3D打印技术，其采用纯丝素蛋白制备，不添加其他化学试剂，获得的纯丝素蛋白墨水兼具良好的3D可打印性和优异的生物相容性，且打印成型后交联方式简便，交联后的支架机械性能良好。
本发明的一种3D生物打印墨水的制备方法，包括以下步骤：
对丝素蛋白水溶液施加50V以下的恒定电压，电压施加时间为120min以下，得到丝素蛋白电凝胶，然后在30℃～100℃下去除丝素蛋白电凝胶中的气泡，冷却后即得到3D生物打印墨水。
进一步地，丝素蛋白水溶液的浓度为5wt％～20wt％。优选地，丝素蛋白水溶液的浓度为8wt％～15wt％。
进一步地，丝素蛋白水溶液的制备方法包括以下步骤：
蚕丝经过脱胶、溶解、透析和离心后制得丝素蛋白水溶液，其中，透析过程中，截留分子量为3500kDa。
在水溶液中，丝素蛋白表面带有负电荷，在恒定电压的作用下，丝素蛋白会向正极迁移并聚集，从而形成丝素蛋白电凝胶。
进一步地，去除丝素蛋白水凝胶中的气泡的过程包括以下步骤：
将丝素蛋白电凝胶置于30℃～100℃的恒温条件下，使丝素蛋白电凝胶从凝胶状态转变成溶胶状态，然后在真空条件下除去气泡。该去除气泡的过程可重复多次。通过反复变温处理和真空处理去除电凝胶内部气泡可获得物质均一的纯丝素蛋白3D生物打印墨水。
进一步地，除去气泡后置于1～10℃下2～20h使去除气泡的丝素蛋白电凝胶从溶胶状态转变成凝胶状态，即得到3D生物打印墨水。
进一步地，3D生物打印墨水的黏度为0.1～104Pa.s。进一步地，在温度20℃～100℃条件下，且在剪切力102Pa.s以上，3D生物打印墨水由凝胶状态转变成溶胶状态。
在本发明上述制备方法中，由丝素蛋白溶液到纯丝素蛋白3D生物打印墨水这一过程中，丝素蛋白经历了“溶液-凝胶-溶胶-凝胶”的转变。纯丝素蛋白溶液和经30℃～100℃处理后的电凝胶溶液呈现的是“非牛顿流体”的特性，而丝素蛋白电凝胶和纯丝素蛋白3D生物打印墨水的流变均在低剪切速率下呈现“剪切变稀”特性。
另外，在高剪切力下，丝素蛋白电凝胶出现显著的“剪切变稠”的特性，增加了针头容易堵塞的可能。而经30℃～100℃处理后，本发明的丝素蛋白3D生物打印墨水在高剪切力下仍呈现“剪切变稀”特性。这充分说明，在30℃～100℃下去除丝素蛋白电凝胶中的气泡过程优化了电凝胶可打印性的流变性能。
本发明还要求保护采用上述方法所制备的3D生物打印墨水，其包括纯丝素蛋白电凝胶。
本发明还要求保护上述3D生物打印墨水在生物3D打印中的应用。
进一步地，生物3D打印包括以下步骤：
根据设定的3D打印模型参数，将3D生物打印墨水在0℃～30℃条件下进行3D打印，在3D生物打印墨水被挤出喷头前后的过程中，3D生物打印墨水发生凝胶-溶胶-凝胶转变，直至完成打印，，打印成型后得到3D打印纯丝素蛋白凝胶支架，对得到的3D打印纯丝素蛋白凝胶支架进行交联固化，得到基于纯丝素蛋白的3D打印材料。进一步地，在进行3D打印之前，将3D生物打印墨水在0℃～30℃条件下预控制一定时间，使其由3D生物打印墨水达到预设喷头温度。
进一步地，3D生物打印墨水被挤出喷头前，其为凝胶状态，当其被挤出喷头时，由凝胶转变为溶胶，使其顺利流出喷头，当其被挤出喷头后，由溶胶转变为凝胶，从而完成一个凝胶-溶胶-凝胶转变过程。重复上述过程，直至依照设定的3D打印模型参数完成3D打印。
进一步地，3D打印过程中，采用接收平台接收基于纯丝素蛋白的3D打印材料，接收平台的温度为10℃以下(以提高打印出的3D结构的稳定性，促进3D打印纯丝素蛋白凝胶支架固化成型)，优选地，接收平台的温度为0℃～10℃。
本发明的3D生物打印墨水适用于制备各种3D打印材料，如纯丝素蛋白凝胶支架等。
进一步地，3D打印过程中，3D生物打印墨水的打印速度为10～20mm/s。
进一步地，交联固化包括以下步骤：
将打印成型后的材料在0℃～10℃下静置直至交联固化；或
将打印成型后的材料在-20℃～-80℃下冷冻干燥，直至干燥完全。
目前，3D打印材料常用的交联方法有添加交联剂、紫外光固、盐浴和酶促等，这些在后期生物墨水中混合细胞，会对细胞产生毒性。而采用本发明的3D生物打印墨水打印出的支架通过温度处理进行彻底交联，其为物理交联方式，改善了其他凝胶采用交联剂，盐浴等方式的交联。避免了其他交联方式产生对细胞的毒性物质，能够完全展现出丝素蛋白材料优异的生物特性，为利用本发明的3D生物打印墨水所制备的打印支架优异的生物相容性提供了可能。
由于本发明的3D生物打印墨水为纯丝素蛋白，其在0℃～10℃下静置状态下，会发生蛋白结构转变，通过物理交联方式直至交联固化，打印成型后，可在上述低温范围内固化。因此，受丝素蛋白自身性质的限制，本发明的3D生物打印墨水在制备完成后，具有一定保质期，一般是在完成墨水制备后的2天之内，否则在存放过程中，3D生物打印墨水会发生彻底交联固化。
本发明的3D生物打印墨水在打印成型后，可在-20℃条件下冷冻四到五个小时，在-80℃条件下过夜冷冻干燥，获得纯丝素蛋白3D打印冻干支架。制备的3D打印支架具有一定强度和弹性。并且冻干支架内部具有微米级的微孔结构，体外的细胞培养实验结果表明所打印的纯丝素蛋白3D支架可显著促进细胞在其表面的粘附、增殖和生长。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明利用丝素蛋白凝胶化过程对电场和温度的敏感特性，在不添加任何其他化学物质的条件下制备出满足挤出型3D打印技术生物墨水基本要求的纯丝素蛋白墨水材料，其制备方式简单，快捷，绿色，环保。电场的作用可控制丝素蛋白水凝胶的流变性能，电凝胶的温敏特性可有效去除凝胶内部气泡。进一步通过合理的温度调控纯丝素蛋白墨水材料的流变性能可有效地提高纯丝素蛋白墨水材料的可打印性。
本发明制备的3D生物打印墨水为纯丝素蛋白，其形成的3D生物打印墨水仍具备温敏特性，打印过程中，通过打印喷头温度的控制，可优化打印过程中生物墨水的流变特性，显著提高墨水材料的可打印性。
本发明中利用纯丝素蛋白水溶液在电场和温度的作用下制备的纯丝素蛋白生物墨水，相较于其他一般丝素蛋白凝胶支架具有较高的机械性能，所打印的纯丝素蛋白支架具备良好的机械性能和优异的生物相容性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为在稳定电场下制备的丝素蛋白电凝胶实物照片；
图2为纯丝素蛋白3D生物打印墨水实物照片；
图3为不同丝素蛋白材料的流变测试结果；
图4为不同丝素蛋白材料的红外光谱图；
图5为利用本发明的纯丝素蛋白3D生物打印墨水3D打印出的凝胶支架实物照片，标尺为500μm；
图6为本发明制备的纯丝素蛋白3D打印冻干支架的扫描电子显微镜图像；
图7为本发明制备的纯丝素蛋白3D打印冻干支架进行体外细胞培养第7天的共聚焦图像，标尺为200μm；
图8为各种天然生物材料3D打印凝胶支架机械性能的对比图；
图9为本发明制备的纯丝素蛋白3D打印出的不同填充间距凝胶支架的机械性能图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
在本实施例中提供了一种用于3D生物打印骨缺损支架的3D生物打印墨水的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，配制丝素蛋白水溶液；
蚕丝经过脱胶、溶解、透析和离心后制得丝素蛋白水溶液。脱胶、溶解、透析过程均采用本领域常用技术手段，具体可参考文献Rockwood D N,Preda R C,Yücel,Tuna,etal.Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin[J].Nature Protocols,2011,6(10):1612-1631.。其中，透析过程中采用的透析袋的截留分子量为3500kDa。最终制备的丝素蛋白水溶液的浓度为10wt％。
步骤2，将丝素蛋白水溶液在稳定电场作用下制成丝素蛋白电凝胶；
将步骤1制备的丝素蛋白水溶液在稳定电场作用下(U＝20V)通电处理25min，具体步骤参考文献Leisk G G,Lo T J,Yucel T,et al.Electrogelation for ProteinAdhesives[J].Advanced Materials,2010,22(6):711-715。经上述步骤后制备得到丝素蛋白电凝胶。图1为丝素蛋白电凝胶的实物照片，从图中可看出，其呈凝胶状，且其中含有大量气泡，导致凝胶外观不均一、不透明。
步骤3，将制备的丝素蛋白电凝胶通过反复变温处理和真空处理去除电凝胶气泡获得3D生物打印墨水；
将在稳定电场下制备的丝素蛋白电凝胶置于高温烘箱(60℃)中，待电凝胶从凝胶状态转变成溶胶状态时，取出放置于真空泵中抽真空，以去除溶液中的气泡，然后置于低温冰箱(4℃)中，使去除气泡的电凝胶从溶胶状态转变为凝胶状态。以上过程可重复多次，直至获得均一的纯丝素蛋白凝胶，即为3D生物打印墨水。图1为3D生物打印墨水的实物照片，从图中可看出，其呈凝胶状，且其外观不均一，呈半透明。
丝素蛋白溶液到纯丝素蛋白墨水材料这一过程中“溶液-凝胶-溶胶-凝胶”状态的相转变过程中，各物质的流变测试结果详见图3，红外光谱图见图4，其中SF表示丝素蛋白水溶液，e-gel-U为步骤2制备获得的丝素蛋白电凝胶，e-gel-T为步骤3最终制备的纯丝素蛋白3D生物打印墨水，e-gel-S为电凝胶在步骤3的高温下形成的溶胶。从图3中可看出，丝素蛋白水溶液和高温下形成的溶胶呈现的是“非牛顿流体”的特性，而丝素蛋白电凝胶和纯丝素蛋白3D生物打印墨水的流变均在低剪切速率(＜102 1/s)下呈现“剪切变稀”特性，在高剪切力(＞102 1/s)下电凝胶出现显著的“剪切变稠”特性，这增加了针头容易堵塞的可能，而纯丝素蛋白3D生物打印墨水在高剪切力(＞102 1/s)下仍呈现“剪切变稀”特性。
实施例2
在本实施例中提供了通过实施例1制备的纯丝素蛋白3D生物打印墨水3D打印凝胶支架。
将实施例1制备的纯丝素蛋白3D生物打印墨水置于3D打印机上，打开3D打印机控制面板，设置喷头温度为5℃，将纯丝素蛋白3D生物打印墨水置于喷头进行温度预控制15min，使其纯丝素蛋白3D生物打印墨水达到预设喷头温度。利用平台接收打印支架，平台温度设置为5℃。根据3D打印机设定模型3D打印纯丝素蛋白凝胶支架，3D打印出的纯丝素蛋白凝胶支架见图5，其层数为10层。
实施例3
在本实施例中提供了一种纯丝素蛋白3D打印支架在3D生物打印骨缺损材料中的应用，包括：
将实施例2制备的纯丝素蛋白凝胶支架置于-20℃条件下冷冻四到五个小时，然后在-80℃条件下置于冷冻机中过夜冷冻干燥，获得纯丝素蛋白3D打印冻干支架。
采用电子扫描电镜(SEM)观察以上制备的3D打印支架，冻干支架内部具有微米级的微孔结构，其结构详见图6。
利用以上制备的3D打印支架进行体外细胞培养，培养细胞为前成骨细胞MC3T3，所培养的细胞采用荧光蛋白进行标记。图7为细胞培养第7天的共聚焦图像，从图中可看出，支架内部及表面均显示大量荧光，说明细胞生长良好，以上实验结果表明，本发明所打印的纯丝素蛋白3D支架可显著促进细胞在其表面的粘附、增殖和生长。
此外，以上制备的3D打印凝胶支架具有良好的强度和弹性。根据目前相关文献，常应用于三维打印技术的天然生物材料如胶原(Col-based)、明胶(Gel-based)、海藻酸盐(SA-based)、丝素蛋白(SF-based)，其打印成型的凝胶支架的强度和杨氏模量通常是在几十帕到几百千帕，其机械性能详见图8。本发明制备的纯丝素蛋白凝胶支架最大强度最高可达1兆帕以上，杨氏模量可达0.4兆帕以上，其机械性能详见图9。图9中，1mm、1.5mm、2mm、3mm分别代表打印不同填充间距纯丝素蛋白3D凝胶支架，结果表明，本发明制备的纯丝素蛋白凝胶支架具有良好的机械性能。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对丝素蛋白水溶液施加50V以下的恒定电压，电压施加时间为120min以下，得到纯丝素蛋白电凝胶，将所述纯丝素蛋白电凝胶置于30℃～100℃的恒温条件下，使所述纯丝素蛋白电凝胶从凝胶状态转变成溶胶状态，然后在真空条件下除去气泡，除去气泡后置于1～10℃下2～24h，去除气泡的纯丝素蛋白电凝胶从溶胶状态转变成凝胶状态，即得到所述3D生物打印墨水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白水溶液的浓度为5wt％～20wt％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述3D生物打印墨水的黏度为0.1～104Pa.s。
4.权利要求1-3中任一项所述的制备方法所制备的3D生物打印墨水，其特征在于，其包括纯丝素蛋白电凝胶。
5.权利要求4所述的3D生物打印墨水在生物3D打印中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，生物3D打印包括以下步骤：根据设定的3D打印模型参数，将所述3D生物打印墨水在0℃～30℃条件下进行3D打印，在所述3D生物打印墨水被挤出喷头前后的过程中，3D生物打印墨水发生凝胶-溶胶-凝胶转变，直至完成打印，打印成型后交联固化，得到基于纯丝素蛋白的3D打印材料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：3D打印过程中，3D生物打印墨水的打印速度为10～20mm/s。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，交联固化包括以下步骤：将打印成型后的材料在0℃～10℃下静置直至交联固化；或将打印成型后的材料在-20℃～-80℃下冷冻干燥，直至干燥完全。
CN202010470447.0A 2020-05-28 2020-05-28 3d生物打印墨水及其制备方法和应用 Active CN111454614B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010470447.0A CN111454614B (zh) 2020-05-28 2020-05-28 3d生物打印墨水及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010470447.0A CN111454614B (zh) 2020-05-28 2020-05-28 3d生物打印墨水及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111454614A CN111454614A (zh) 2020-07-28
CN111454614B true CN111454614B (zh) 2022-05-24

Family

ID=71675182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010470447.0A Active CN111454614B (zh) 2020-05-28 2020-05-28 3d生物打印墨水及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111454614B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112957526B (zh) * 2021-02-22 2022-05-17 苏州大学 基于丝素蛋白的取向性生物墨水及其制备方法和应用
CN113274554A (zh) * 2021-05-14 2021-08-20 清华大学 一种基于凝胶微球的3d打印生物墨水及其应用
CN115227871B (zh) * 2022-08-10 2023-08-01 北京积水潭医院 一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106866996A (zh) * 2017-03-13 2017-06-20 武汉纺织大学 一种蚕丝丝素蛋白质凝胶的快速制备方法
CN107998449A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 一种3d打印高强度生物墨水材料
WO2020041381A1 (en) * 2018-08-20 2020-02-27 Trustees Of Tufts College Systems and methods for 3d printing of proteins
CN110859994A (zh) * 2019-08-21 2020-03-06 东华大学 一种改性柞蚕丝素蛋白3d打印支架及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501172B2 (en) * 2008-09-26 2013-08-06 Trustees Of Tufts College pH-induced silk gels and uses thereof
WO2010123945A2 (en) * 2009-04-20 2010-10-28 Allergan, Inc. Silk fibroin hydrogels and uses thereof
WO2015170342A1 (en) * 2014-05-09 2015-11-12 Council Of Scientific & Industrial Research Sophorolipid mediated accelerated gelation of silk fibroin
CN106215245A (zh) * 2016-07-21 2016-12-14 青岛三帝生物科技有限公司 基于3d打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管
CN108314798B (zh) * 2017-01-17 2021-03-05 武汉力诚生物科技有限公司 一种植物多糖气凝胶空气净化材料及制备方法
KR101983741B1 (ko) * 2017-04-04 2019-09-10 한림대학교 산학협력단 바이오 잉크 및 이의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106866996A (zh) * 2017-03-13 2017-06-20 武汉纺织大学 一种蚕丝丝素蛋白质凝胶的快速制备方法
CN107998449A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 一种3d打印高强度生物墨水材料
WO2020041381A1 (en) * 2018-08-20 2020-02-27 Trustees Of Tufts College Systems and methods for 3d printing of proteins
CN110859994A (zh) * 2019-08-21 2020-03-06 东华大学 一种改性柞蚕丝素蛋白3d打印支架及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Electrogelation for Protein Adhesives";Gary G. Leisk，et al.;《Advanced Materials》;20091124;第22卷;第711-715页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111454614A (zh) 2020-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111454614B (zh) 3d生物打印墨水及其制备方法和应用
Li et al. Review of 3D printable hydrogels and constructs
Ouyang et al. A generalizable strategy for the 3D bioprinting of hydrogels from nonviscous photo‐crosslinkable inks
Jiang et al. Direct ink writing with high-strength and swelling-resistant biocompatible physically crosslinked hydrogels
Wu et al. 3D bioprinting of gellan gum and poly (ethylene glycol) diacrylate based hydrogels to produce human-scale constructs with high-fidelity
Melchels et al. Development and characterisation of a new bioink for additive tissue manufacturing
Li et al. Bioink formulations for bone tissue regeneration
CN113679888B (zh) 光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架
CN106581762B (zh) 一种3d打印生物墨水、制备方法及3d打印成型方法
CN109851819B (zh) 一种可注射丝素蛋白多孔水凝胶及其制备方法
Han et al. Advances of hydrogel-based bioprinting for cartilage tissue engineering
CN111676537A (zh) 一种基于近场电纺技术的丝素蛋白组织工程支架制备方法
CN103143062A (zh) 活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法与成形系统
WO2023179422A1 (zh) 弹性多孔支架及其制备方法和应用
Liu et al. Hybrid polycaprolactone/hydrogel scaffold fabrication and in-process plasma treatment using PABS
CN110420351B (zh) 一种3d打印柔性多孔支架材料及其制备方法
Kunwar et al. Three-dimensional printing of double-network hydrogels: recent Progress, challenges, and future outlook
Yang et al. Tunable metacrylated silk fibroin-based hybrid bioinks for the bioprinting of tissue engineering scaffolds
CN111040138A (zh) 一种基于挤出技术的聚己内酯支架材料的制备方法
WO2016090893A1 (zh) 一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法
Huang et al. Polyurethane–gelatin methacryloyl hybrid ink for 3D printing of biocompatible and tough vascular networks
CN116726247A (zh) 一种3d打印强韧丝素蛋白支架材料的制备方法和应用
CN111494712A (zh) 一种融合有nt3的丝素蛋白神经移植物的制备方法
Maher et al. Formed 3D bio-scaffolds via rapid prototyping technology
Chen et al. Preparation of a novel regenerated silk fibroin-based hydrogel for extrusion bioprinting

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant