CN111454359B - Cd47抗体或其免疫活性片段及应用 - Google Patents

Cd47抗体或其免疫活性片段及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型CD47抗体或其免疫活性片段、或包含所述抗体/免疫活性片段的组合物。该CD47抗体不会引起红细胞凝集，且与红细胞、血小板表现出极弱水平的低结合或不结合。本发明提供了编码所述CD47抗体或其免疫活性片段的核酸、表达载体、宿主细胞。此外，本发明提供了该CD47抗体或含有该CD47抗体/免疫活性片段的药物组合物用于制备治疗CD47介导的疾病的药物的用途。

Description

CD47抗体或其免疫活性片段及应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及包括抗体技术领域及免疫领域，更具体的涉及CD47抗体或其免疫活性片段及应用。
背景技术
CD47也被称为整合素相关蛋白(Integrin Associated Protein，IAP)，广泛的表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(Signalregμlatoryproteinα，SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。CD47在20世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种类型的人类肿瘤中表达，包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌(BC)和其他实体肿瘤。它的表达和活性已经与许多疾病和失调相关联。它是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，并带有一个免疫球蛋白样结构域和五个跨膜区，其作为SIRPα的细胞配体，通过信号调节蛋白α(SIRPα)的NH2末端的V样结构域与SIRPα结合。SIRPα主要表达于骨髓细胞，包括巨噬细胞，粒细胞，树突状细胞(DC)，肥大细胞，和它们的前体细胞，包括造血干细胞。
CD47是一个“自我”标记，代表“别吃我”信号。人体需要20-30万亿的红细胞，以此保持氧气有效的运输到全身各处。红细胞的生命周期较短，仅有120天，每小时有100亿的红细胞生成，也有无数衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬清除。然而巨噬细胞是如何区分年轻和衰老的红细胞，只进攻衰老红细胞的机理却不为人知。直到2000年，Oldenborg等人证实CD47是细胞表面一个重要的“self”标记，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。年轻的红细胞表达较高的CD47向巨噬细胞释放“自己人，别吃我”的信号，而衰老的红细胞CD47下调，最终被巨噬细胞清除。
不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。多个研究表明在细胞水平上，通过阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，在体内通过CD47抗体阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效的抑制肿瘤在小鼠体内的生长。
针对阻断SIRPα-CD47信号通路已有多种抑制剂的研究报道，包括FortySevern公司的抗CD47单抗Hu5F9-G4(US9382320B2)、Celgene公司的单抗CC9002(专利US9045541B2)、信达生物的单抗ADI-26630(专利CN201710759828.9)、天境生物的单抗13H3/1F8(专利CN201780003451)等，此外还有TRILLIUMTHERAPEUTICS，INC.公司的双功能融合蛋白TTI-621(专利US20150329616A1)、ALX公司的ALX148(专利US20160186150A1)等，目前处于临床PhaseI/II。临床初步结果显示与CD20联合治疗CD20复发或难治性滤泡性淋巴瘤(FL)及大B细胞淋巴瘤(DLBCL)取得了令人惊喜的疗效，ALX148联合Trastuzumab、Pembrolizumab在胃癌(GC)、头颈癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)都显示了一定的疗效。迄今CD47抑制剂(包括单抗、SIRPα融合蛋白)与CD20、HER2、PD-1等多个抗体抑制剂处于临床研究进展中。
现已开发的处于临床或临床前的CD47抑制剂在阻断CD47与SIRPα结合、促进巨噬细胞发挥吞噬作用的同时，会在不同程度上引起血红细胞的凝集。此外这些CD47单克隆抗体与红细胞及血小板有较高的靶向结合性，使得相应抗体不仅在治疗效果大打折扣、也引入了药物副作用，在临床上发生红细胞和血小板降低及其他相关副作用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种CD47抗体或其免疫活性片段及应用，低毒、高效，在体外未发生红细胞凝集，不会导致红细胞的清除。此外，本发明提供的CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性。本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段在肿瘤细胞与人正常红细胞或人外周血PBMC或其他可能表达CD47分子的其他正常细胞的混合细胞群体中，能够特异靶向肿瘤细胞。此外，本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段，在功能上能够有效地阻断CD47与SIRPα结合、激活介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在一些实施方案中，本发明提供结合CD47或其片段(优选人CD47蛋白质)的抗CD47抗体或其免疫活性片段(优选人CD47抗原结合片段)。
在一些实施方案中，本发明所述的CD47抗体或其免疫活性片段包括：(a)重链可变区(VH)链，VH链的序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少90％的一致性：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41；(b)轻链可变区(VL)链，VL链的序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少90％的一致性：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42。
在一些其它实施方案中，本发明所述的CD47抗体或其免疫活性片段包括VH/VL序列对，所述的VH/VL序列对包括VH和VL链的氨基酸序列及其核苷酸序列，该序列对与选自包括以下序列对的组中的VH和VL氨基酸序列对具有至少90％(例如，至少95％，96％，97％，98％，99％，或99.5％)的一致性：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：29和SEQID NO：30，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。
在一些实施方案中，本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段包含选自以下的一个或多个重链互补决定区HCDR序列：(1)HCDR1，其包含与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：81的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(2)HCDR2，其包含与选自SEQID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：77，SEQID NO：82的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(3)HCDR3，其包含与选自SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(4)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(1)、(2)和(3)的HCDR。
在一些实施方案中，本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段包含选自以下的一个或多个轻链互补决定区LCDR的序列：(1)LCDR1，其包含与选自SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ IDNO：79的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(2)LCDR2，其包含与选自YDS，SGS，NAK，YAS，GAT，YTS，DTS，YSS的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(3)LCDR3，其包含与选自SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：63，SEQID NO：65，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：83的氨基酸序列具有至少90％(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％)的同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(4)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(1)、(2)和(3)的LCDR。
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或其免疫活性片段包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：71，SEQ IDNO：76，SEQ ID NO：81的氨基酸序列，或由以上氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：82的氨基酸序列，或由以上氨基酸序列组成；HCDR3包含选自SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78的氨基酸序列或由以上氨基酸序列组成；LCDR1包含选自SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由以上氨基酸序列组成；LCDR2包含选自YDS，SGS，NAK，YAS，GAT，YTS，DTS，YSS的氨基酸序列或由以上氨基酸序列组成；LCDR3包含选自SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ IDNO：83所示的氨基酸序列或由以上氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明所述的CD47抗体可以是嵌合的或人源化的，其轻链恒定区任选人抗体κ链(SEQ ID NO：86)或λ链恒定区，重链恒定区任选人抗体IgG1(SEQ IDNO：84)，或IgG4(S228P)(SEQ ID NO：85)恒定区。
在一些实施方案中，所述免疫活性片段选自Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。
在一些实施方案中，CD47抗体或其免疫活性片段可以不同程度的阻断人CD47与SIRPα的相互作用，并在不同水平上激活巨噬细胞介导对CD47+细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，本发明提供的CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性。
在一些实施方案中，本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段在肿瘤细胞与人正常红细胞或人外周血PBMC或其他可能表达CD47分子的其他正常细胞的混合细胞群中，能够特异靶向肿瘤细胞。
本发明提供了编码以上任意所述CD47抗体或其免疫活性片段的核酸，提供了包含所述核酸的表达载体，提供了包含所述表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞优选酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾细胞等哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其免疫活性片段的其它细胞。
本发明提供了制备以上任意所述CD47抗体或其免疫活性片段的方法。
在一些实施方案中，本发明提供一种双特异性抗体。所述双特异性抗体包括包括不同的两个臂，第一臂(arm 1)和第二臂(arm 2)，其中的一个臂(arm 1)包括能够与人CD47结合的以上任意所述CD47抗体或其免疫活性片段，另一个臂(arm 2)包括不与人CD47结合的其他单克隆抗体或融合蛋白。所述另一个臂(arm 2)能够与恶性肿瘤细胞结合。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明提供的CD47抗体或其免疫活性片段或包含本发明所述的CD47抗体或其免疫活性片段作为其中一个臂的双特异性抗体，和药学上任选的药用载体。
在一些实施方案中，本发明还提供一种上述CD47抗体或其免疫活性片段在制备治疗肿瘤疾患CD47过度表达的药物中的应用。
优选的是，肿瘤疾患包括血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，血液瘤为急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤(MM)、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的至少一种；实体瘤为淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤和其他实体瘤中的至少一种。
在另一些实施方案中，本发明的方法还涉及通过联合疗法治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者(人)施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其免疫活性片段和一种或多种其它药物。如利妥昔单抗、曲妥珠单抗等。
本发明采用多重免疫及筛选方法，提供了一种低毒高效的CD47抗体或其免疫活性片段，在体外未发生红细胞凝集，不会导致红细胞的清除。此外，本发明提供的CD47抗体与血小板及红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合，展现出于CD47+肿瘤细胞更加特异的靶向特异性，在功能上能够有效地阻断CD47与SIRPα结合、激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。
附图说明
图1显示小鼠免疫血清检测结果，图1A显示ELISA血清检测结果，图1B显示FACS血清检测结果。
图2显示CD47抗体与人CD47重组融合蛋白结合的剂量效应，图2A显示CD47抗体与表达人CD47-His蛋白结合剂量效应I，图2B显示CD47抗体与人CD47-His蛋白结合的剂量效应关系II。
图3显示CD47抗体与表达人CD47的细胞结合活性(FACS)，图3A显示CD47抗体与CHO-K1-hCD47细胞剂量结合效应，图3B显示CHO-K1-CynoCD47细胞剂量结合效应，图3C显示CD47抗体与表达人CD47细胞剂量结合效应，图3D显示CD47抗体与Raji细胞剂量结合效应，图3E显示CD47抗体与CCRF细胞剂量结合效应，图3F显示CD47抗体与Jurkat细胞剂量结合效应。
图4显示CD47抗体在蛋白水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断剂量效应，图4A显示CD47抗体对CD47蛋白和SIRPα结合阻断的剂量效应I，图4B显示CD47抗体对人CD47-His和SIRPα蛋白的阻断活性剂量效应II。
图5显示CD47抗体在细胞水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断(FACS)，图5A显示CD47抗体对Jurkat和SIRPα结合阻断剂量效应，图5B显示CD47抗体对CCRF和SIRPα结合阻断剂量效应。
图6显示CD47抗体对促进红细胞凝集活性检测，图6A显示显微镜下观察结果，图6B显示96孔板中的反应结果。
图7显示CD47抗体与红细胞的结合分析，图7A显示CD47抗体与红细胞结合剂量效应，图7B显示CD47抗体与表达人CD47红细胞结合力强度对比。
图8显示CD47抗体与血小板的结合分析，图8A显示CD47抗体与表达人CD47血小板结合剂量效应，图8B显示CD47抗体与表达人CD47血小板的结合力对比。
图9显示CD47在不同肿瘤细胞系中的表达水平，图9A显示CD47在一系列不同肿瘤细胞系表达水平，图9B显示CD47在另一系列不同肿瘤细胞系表达水平。
图10显示CD47抗体在肿瘤细胞与红细胞混合细胞群中的靶向特异性，图10A显示不同浓度CD47抗体分别与肿瘤细胞及红细胞结合靶向特异性评价(荧光强度)，图10B显示10μg/mLCD47抗体与肿瘤结合靶向特异性评价(结合细胞比例)，图10C显示0.5μg/mLCD47抗体与肿瘤结合靶向特异性评价(结合细胞比例)。
图11显示CD47抗体(鼠源)对激活巨噬细胞MDM吞噬肿瘤细胞(HL60)的作用检测(ADCP)。
图12显示CD47抗体(嵌合)介导巨噬细胞对不同肿瘤细胞的吞噬作用，图12A显示CD47抗体介导人巨噬细胞(来自4位血液捐献者)对Jurkat的吞噬作用，图12B显示CD47抗体介导人巨噬细胞对Jurkat和Raji的吞噬作用。
图13显示本发明CD47抗体不会介导巨噬细胞对红细胞的吞噬作用，图13A为柱状图显示不同CD47抗体介导人巨噬细胞对红细胞的吞噬作用，图13B为流式细胞直接呈现不同CD47抗体介导人巨噬细胞对红细胞的吞噬作用。
图14显示本发明CD47抗体不会介导免疫细胞对红细胞的ADCC效应，图14A显示CD47抗体介导的免疫细胞对Raji细胞的ADCC活性，图14B显示CD47抗体介导的免疫细胞对红细胞的ADCC活性。
具体实施方式
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
术语定义：
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。“抗体”(或“Abs”)和“免疫球蛋白”(或“Igs”)是具有相同结构特征的糖蛋白，抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接(也称为“VH/VL对”)，每条重链和轻链也具有规则排列的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一端有一个可变结构域(VL)，另一端有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
术语“单克隆抗体”是指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，不涉及其制备的方法。单克隆抗体或其免疫活性片段可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术等或其它本领域已知的生产技术来产生，本发明中涉及单克隆抗体制备的方法包括杂交瘤细胞体外培养制备或通过DNA重组技术制备。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
术语“可变”是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDRs)或高变区。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。大部分FR区采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDRs一起促成抗体的抗原结合位点的形成。请参考，例如，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种生物学效应功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体杀伤途径(CDC)等。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列进行区分，将抗体可以分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种同种型别可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。根据抗体轻链恒定区(CL)的不同可以划分κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
“抗体免疫活性片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分能够结合完整抗体结合的抗原。其中该部分不含完整抗体的Fc区中的恒定重链结构域(即CH2，CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体免疫活性片段的实例包括Fab，Fab′，Fab′-SH，F(ab′)2，ScFv和Fv片段。Fab片段包括重链/轻链可变区和轻链的恒定结构域及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab′片段对产生的，在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸的。Fv片段是IgG和IgM类型抗体通过酶法分析后产物中最小的片段。Fv片段抗原结合区，其由VH和VC区域组成，但是他们缺少CH1和CL区域。VH和VL通过非共价键在Fv片段里结合在一起。ScFv是Fv类型片段，其包括了通过易弯曲多肽链接在一起的VH和VL区域。
本发明所述的术语“嵌合抗体”指重链和/或轻链的一部分(一般指可变区)衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分(一般指恒定区)衍生自另一物种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性。在本发明中涉及的嵌合抗体如来自鼠源CD47抗体的重链/轻链可变区通过抗体工程技术嫁接到人源抗体的重链/轻链的恒定区，其表现出相似的生物活性。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的序列，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的序列。本发明中人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列(主要包括恒定区及FR区)为人源序列取代，CDR区采取不改变或少量突变，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，降低在人体中引起的免疫原性。
术语“双特异性抗体”是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。
术语“表位”是指与抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
本文中术语“竞争”指用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD47或其片段)的特异性结合。
术语“阻断”表示存在本发明的抗体时能够减少的CD47信号传递。CD47介导的信号传递阻断指本发明的CD47抗体存在时CD47信号传递水平低于CD47的对照水平(即不存在抗体时的CD47信号传递水平)，降低的幅度大于或等于5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％，可使用多种标准技术测量CD47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/或响应CD47激活的荧光素酶报告试验。
术语“载体”在本文中使用时是指能够通过转化扩增与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”是指引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。并能够表达外源核酸于细胞内或细胞膜或释放至胞外。
术语“凝集”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。
本发明所述的CD47抗体可以在体外用于免疫测定中，本发明的CD47抗体可以偶联荧光素酶、生物素酶等可检测标记，在液相或固相中用于FACS、IHC、ELISA等直接或间接的免疫测定，包括竞争性或非竞争性。本发明提供的CD47抗体能方便地用于试剂盒中，体内或体外的生物流体内或组织上的CD47可被本发明提供的CD47抗体检测出来。能用于任何含有可检测量的CD47的样品。样品可以包括但不限于液体如尿、唾液、脑脊髓液、血液、血清及类似物，或者样品可以是固体或半固体如组织、粪便及类似物，或者，可以是如那些常用于组织学诊断的固体组织。
本发明提供的CD47抗体可以随意的与一种或多种试剂配制在一起，所述试剂能提高活性，或提高治疗效果。本发明提供的CD47抗体可以随意的与一种或多种药物配制在一起，所述其他药物包括但能够抑制肿瘤生长的小分子及大分子药物，优选地，所述其他药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。
本发明提供的CD47抗体或药物组合物可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外，皮下、腹腔、肺内和鼻内施用方式。非经胃肠道注射包括肌肉、静脉、动脉、腹腔或皮下施用。
以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
本发明示例性抗CD47抗体序列(可变区及CDR区序列)
表1.本发明示例性CD47抗体可变区序列
Figure BDA0002422328410000071
表2.本发明示例性CD47抗体重链和轻链的CDR序列
Figure BDA0002422328410000081
实施例1本发明CD47抗体的制备
(一)小鼠免疫及融合
10只小鼠(5只balb/c,5只C57bl/6)将按照表3进行免疫，免疫原采用CD47-mFc(Acro,CD7-H52A5,mFc tag)。
表3.免疫进程表
Figure BDA0002422328410000082
选择反应最佳的4只小鼠用于融合(ELISA血清效价大于256K，FACS血清效价大于1个log偏移度。)如图1A、图1B，选择AD335、AD336、AD355、AD356进行脾脏B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，一周后开展杂交瘤筛选，其中AD335、AD336属于balb/c品系，AD355、AD356属于C57bl/6品系。
抗体筛选方法中涉及蛋白水平及细胞水平的双重筛选，在蛋白水平筛选中，采用人CD47蛋白结合的ELISA检测方法；在细胞水平的筛选中，采用FACS方式高通量检测筛选，涉及多种细胞株，如构建表达人CD47(Hu-CD47)及食蟹猴CD47(Cyno-CD47)的CHO-K1-Hu-CD47/CHO-K1-Cyno-CD47的稳定细胞株，表达CD47的癌细胞株(如Jurkat、Raji等)，表达CD47的人红细胞。经历融合筛选及2次亚克隆筛选，获得多株分泌CD47单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，其中11株示例CD47抗体(如表1)能够不同程度阻断人CD47与人SIRPα的结合、或不同程度解除CD47介导的巨噬细胞吞噬作用的免疫抑制、或不引起血红细胞的凝集反应、或不与红细胞及血小板结合。
(二)本发明的CD47抗体及对照抗体的生产和纯化
本发明11株CD47抗体的氨基酸序列及CDR序列见表1、表2，体外构建11株CD47抗体的表达载体。具体地，将轻链可变区(VL)序列构建至人抗体轻链的κ链恒定区(SEQ ID NO:86)，将重链可变区(VH)的序列构建至人抗体重链的恒定区，任选的人IgG1(SEQ ID NO:84)或人IgG4(S228P)(SEQ ID NO:85)重链恒定区，优先人IgG4重链恒定区。
重组抗体重链/轻链氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将重组抗体的氨基酸进行密码子优化，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成基因经酶切后连接到pcDNA3.4载体。
对照抗体B6H12序列来自于专利WO2011143624A2；人源化抗体Hu5F9-G4(FortySeven)与美国专利US2015/0183874A1中的抗体“5F9”的序列相同，Hu5F9-G4为首个进入临床的CD47抗体抑制剂；AB6.12(Celgene)序列来源于美国专利US 9045541中的抗体“AB6.12”的序列，这株抗体在体外不会引起红细胞凝集现象；1H8、13H3序列来源于天境生物的专利CN201780003451，其专利里描述到这两株抗体相比其他临床抗体，与红细胞有着很低的结合；ADI-26630序列来自于信达生物专利CN201710759828.9，于2018年获得临床批件。
表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。所用转染试剂为ExpiFectamine 293Transfection Kit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*105cells/ml，转染后16-18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。经Protein A纯化，在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，Protein A柱子用平衡液(0.02MPB、0.15M NaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02M PB、0.15M NaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1M Tris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(Millipore UFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyClone SH30256.01)，SDS-PAGE检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE及SEC-HPLC检测纯度。
实验例1本发明的CD47抗体与人CD47重组融合蛋白结合的剂量效应(ELISA)
将hCD47-his(Cat#CD7-H5227，Lot#C56P1-737F1-FA)按照1μg/ml进行包被，包被缓冲液选择PBS(HyClone Lot:AC13298279)，100μl/孔，常温(25℃)包被16-18h，TBST洗板2次，PBS+3％BSA进行封闭，200μl/孔，常温(25℃)封闭16-18h，TBST洗板1次，扣干，37℃干燥2小时。按照330μl 100μg/ml配制本发明的CD47抗体及对照抗体，10μg/ml为第一个梯度，进行4倍梯度稀释，例如第二个梯度是将第一个梯度80μl加入240μlPBS，依次类推，共11个梯度浓度。37℃孵育1小时。自动洗板机PBST洗板3次后，每孔加入100μl 1：20000稀释的羊抗人HRP二抗(abcam Lot#：ab98624)，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板3次，最后一次洗涤完成后拿酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl TMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl 1％H2SO4终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。
结果显示本发明示例性抗体与人CD47蛋白都有着很好的结合活性，图2A、2B。其中6E8、99B5、15C4与Hu5F9-G4有着相似CD47的结合活性。
实验例2本发明的CD47抗体与表达人CD47的细胞结合活性(FACS)
利用流式细胞仪(BD FACSCelesta Cell Analyzer)测定本发明CD47抗体与表达人或食蟹猴CD47的CHO-K1稳定细胞株、Jurkat、CCRF-CEM、Raji等癌细胞系的结合活性。
本实验例共采用2种表达CD47的稳定细胞株(CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47)及3种癌细胞系，CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47源自南京金斯瑞生物技术有限公司，Jurkat(
Figure BDA0002422328410000101
TIB-152TM)属于T淋巴细胞白血病细胞，CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)属于人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞，Raji(上海中国科学院细胞库)属于人淋巴瘤细胞。分别将所列细胞进行消化后(悬浮细胞无需消化)，室温进行离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1×106cells/ml。每管PBS体积为250μL，抗体设置8个反应浓度，10μg/ml，3倍梯度稀释，调整抗体浓度后每管加入相应的蛋白250μL；室温孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗Goat Anti-human IgG/Alexa 647(Bioss Lot:AE041526)，室温避光孵育30mins后，加入1mL PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μL PBS重悬细胞，上机检测。
结果显示本发明示例性抗体在细胞水平上与CD47有着很好的结合活性。如图3A～3F。81C1、6E8、99B5与Hu5F9-G4同CD47+细胞的结合活性处于同一水平，15C4与13H3同CD47+细胞的结合活性处于同一水平，弱于Hu5F9-G4同CD47+细胞的结合活性。
实验例3本发明的CD47抗体在蛋白水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断剂量效应(ELISA)
Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&D System)，待测抗体同SIRPα-Fc竞争性结合CD47，检测抗体对SIRPα-Fc和CD47的结合阻断效果。
具体地，CD47(Acro，CD7-H5227-1mg,His tag)按照1μg/ml 100μl/孔在PBS缓冲液条件下包被，分别与不同浓度的待测样品一起混合，加入到预包被CD47抗原的96孔板中，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl Streptavidin-HRP，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μlTMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl1％H2SO4终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。待测抗体起始浓度10μg/ml，3倍梯度稀释，共12个浓度梯度。
结果显示本发明示例性抗体都能有效阻断人CD47蛋白与SIRPα的结合。如图4A、4B。所有示例性抗体对人CD47蛋白与SIRPα的结合阻断效果同Hu5F9-G4类似。
实验例4本发明的CD47抗体在细胞水平对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断(FACS)
将Jurkat/CCRF-CEM细胞进行室温离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1×107cells/ml。利用Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&D System)，分别与不同浓度的待测样品一起混合加入到Jurkat/CCRF-CEM细胞中(2.5×105cells/reaction)。每个反应体系为250μL，重组抗体的反应浓度为10个梯度，起始浓度300nM，3倍梯度稀释。4℃孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗Anti-SA iFlour647(genscript，3μg/mL)，4℃避光孵育30mins后，加入1mL PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μL PBS重悬细胞，上机检测。
结果显示CD47抗体在细胞水平上能够有效阻断人CD47配体SIRPα与CD47相互作用，如图5A、5B。
实验例5本发明的抗CD47抗体对促进红细胞凝集活性检测(Hemagglutinationactivity)
利用来自健康人的红细胞测定本发明CD47抗体及对照抗体对红血球的凝集活性。
具体实施如下：
使用柠檬酸钠等抗凝血剂收集全血；将全血置于15ml离心管，PBS补足至15ml，室温离心，200×g，10mins，弃上清；用PBS将RBCs补足至15mL，混匀后，室温离心，1500rpm，5mins。洗涤3次；最后一次洗涤后，使用PBS调节RBCs浓度为2％(如在1ml的RBCs中加入49ml的PBS；将重组蛋白及阳性抗体按照200μg/ml进行2倍梯度稀释，共计15个浓度梯度；使用96孔圆底板，每孔加入50μl相应浓度的重组蛋白或单抗与50μl的RBCs，室温孵育2h后观察并记录反应结果。
如图6B，对照抗体Hu5F9-G4在浓度达到0.137μg/ml时，红细胞会显著凝聚，本发明的所有示例抗体在浓度达到150μg/mL的实验中，未引起实质上的红细胞凝聚。在显微镜下进一步观察(图6A)，抗体Hu5F9-G4会导致数个红细胞聚集在一起，在图6B中则呈现出雾状。本发明实验了示例抗体对来自多个不同健康人的红细胞凝集，皆能显示出本发明抗体在红细胞凝集方面的安全性。
实验例6本发明的抗CD47抗体与红细胞结合分析
CD47单抗存在与红细胞(RBC)结合的特性，对CD47抗体抑制剂来说，存在药效受RBC干扰及肿瘤脱靶的潜在风险。若能筛选到与红细胞结合活性低的抗体株则能够降低脱靶的风险，提高其安全性。
具体实施如下：
1.RBC/血小板计数后，96孔板每孔2×105个细胞，每孔50μL。2.同时每孔加入相应抗体10μg/mL，3倍梯度稀释，共8孔，50μL。室温避光孵育30min。3.孵育完成，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647Affinipure Goat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。4.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPadPrism作图。
RBC来源：新鲜血液由肝素钠抗凝管(BD Vacutainer，367880)当天采取，捐献者：公司职员。新鲜血液经淋巴细胞分离液(Stemcell，07801)分离后，将底部的红细胞吸出，经过2次1000rpm离心5min及1次800rpm离心5min的洗涤后，用于本次实验。
表4实验例6采用的仪器和试剂列表
Figure BDA0002422328410000111
结果如图7A，我们惊奇的发现本发明的抗体15C4与红细胞结合活性非常弱，且弱于对照抗体天境生物的13H3与红细胞的结合活性；对照抗体AB6.12、ADI26630虽然体外不会导致红细胞凝血，但是与红细胞的结合较强；进一步实验(图7B)，15C4与红细胞的结合活性远远低于其他对照抗体与红细胞的结合，即使在抗体浓度达到10μg/ml水平下，也仅仅略高于hIgG与红细胞的结合活性(阴性对照)。
此外，本发明的CD47抗体99B5、100E9与红细胞的结合活性也显著弱于Hu5F9-G4与红细胞的结合活性。
实验例7本发明的抗CD47抗体与血小板结合分析
同CD47单抗结合红细胞一样，CD47单抗存在与血小板结合的特性，对CD47抗体抑制剂来说，存在血小板的降低带来的诸多副作用。若能筛选到与血小板结合活性低的抗体株则能够降低脱靶的风险，提高其安全性。具体实施如下：
取新鲜的血液用PBS按照1：1的比例稀释，充分混匀。小心轻柔地将稀释的血液沿着侧壁加入含有15ml淋巴分离液(Stemcell，07801)的sepMate-50(stemcell，86450)管中，1200g离心10分钟，减速度降至0。迅速倾倒上层细胞PBMC至新的50ml离心管中，1500rpm离心5分钟；取上清继续1200g离心5min，弃掉上清留沉淀加入PBS悬浮，1200g离心5min，重复两次。
重新用PBS悬浮得到的50μl血小板细胞到96孔板中，再加入梯度稀释的抗体50μl孵育30min，孵育结束后1200g离心5min弃掉上清加入200μl PBS清洗两次，然后加入100μl按比例稀释好的羊抗人二抗Alexa
Figure BDA0002422328410000122
647(Jackson，109605044)悬浮血小板遮光孵育30min，1200g离心5min弃掉上清加入200μl PBS清洗两次，最后用加入100μl PBS悬浮流式检测APC通道荧光强度
本发明的CD47抗体与血小板的结合活性类似于同红细胞的结合活性，6E8、99B5、100E9与血小板的结合活性显著弱于Hu5F9-G4、AB6.12与血小板的结合活性(图8B)；尤其15C4与血小板几乎没有结合活性或很低的结合水平，显著弱于13H3、Hu5F9-G4、AB6.12与血小板的结合(图8A)。
实验例8 CD47在肿瘤细胞中的表达水平
利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定Raji、Daudi、Ramous、HL60、MDA-MB231、SHP-77等血液瘤及实体瘤细胞系及RBC的CD47表达水平。具体实施如下：
1.先在显微镜下观察各细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。
2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬各细胞后，96孔板，每孔加入25×104个细胞，每孔50μL。
3.同时每孔加入相应抗体(H5F9-G4，HIgG)10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。
4.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。
5.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPad Prism作图。
表5实验例8采用的仪器和试剂列表
Figure BDA0002422328410000121
结果显示(图9A、9B)CD47在Daudi、CCRF-CEM、HL60、Raji、PC-3、Jurkat等血液瘤细胞株高表达，在MDA-MB-231、A431等实体瘤细胞株高表达。表明CD47抑制剂将有着广泛的应用前景，本发明同时研究了Daudi、Raji等细胞株的CD20表达水平，数据显示CD20和CD47在Daudi、Raji等细胞株上存在同时高表达的情形，体现了CD47抑制剂和CD20抑制剂联合用药的潜在应用价值，以及与PD-1等免疫检查点抑制剂的联合应用价值。
实验例9本发明的抗CD47抗体在肿瘤细胞与红细胞混合细胞群中的靶向特异性
将CD47高表达的肿瘤细胞株Raji与人体红细胞(RBC)以20:1混合，检测本发明抗体及对照抗体对肿瘤细胞株的靶向特异性。具体实施如下：
1.先在显微镜下观察Raji细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。
2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬Raji细胞后，加入CFSE(Abcam，Ab113853)后置于37℃，5％CO2培养箱中孵育15min。
3.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤，重新计数。
4.将RBC与Raji细胞20：1混合(RBC每孔20×105cells，Raji每孔1×105cells)，每孔50μL，同时每孔加入相应抗体10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。
5.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。
6.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPad Prism作图。
如图10A、10B、10C，结果显示本发明抗体15C4在肿瘤细胞和红细胞的混合细胞群中能够特异的靶向肿瘤细胞，特异性强于13H3。其他对照抗体Hu5F9-G4、AB6.12、ADI26630在混合细胞群中与红细胞有较强的结合，靶向肿瘤细胞相对较差。
实验例10本发明的CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的作用检测(ADCP)
效应细胞MDM分离诱导：抽取20个人的静脉血液分离PBMC，分离单核细胞，加入GM-CSF/M-CSF诱导分化MDM，1周后通过CD11b、CD14、CD45、CD163、CD206生物标志物进行鉴定分化的巨噬细胞MDM；ADCP：从培养箱中取出靶细胞HL-60，将细胞收集到15ml离心管，离心，弃去上清，用PBS重悬细胞，计数，用PKH26(SIGMA-ALDRICH)染靶细胞，放置37℃&5％CO2培养过夜；次日将靶细胞从培养基中取出，离心收集细胞，弃上清，使用完全培养基重悬，计数；取靶细胞，加入完全培养基，将细胞和待测样品加入到对应的96孔板中，50000cells/孔；室温孵育0.5h；从培养基中拿出效应细胞(MDM)，收集上清，加PBS清洗，加Accutase消化MDM，让其脱壁，加入相同体积的完全培养基终止消化，将细胞悬液转移到离心管中，将细胞上清和消化下来的细胞按照300g离心10min；取相应体积的MDM细胞，加入完全培养基，将MDM细胞加入到对应靶细胞的96孔板中。效应细胞：靶细胞＝1:1，37℃孵育4h；加Accutase，显微镜下观察贴壁的细胞是否消化下来(约15min)，取出细胞，将细胞转移到另一块板中，待消化完全将移出的细胞悬液重新加入对应孔中；离心，加入检测抗体CD11b，4℃孵育15min；加PBS到每孔，离心，弃去上清，加PBS重悬；流式细胞仪检测；数据分析：％PhagocytosisbyMDMs＝{(PKH26+&CD11b+cells)/AllPKH26+cells}×100％。
结果显示本发明示例抗体不论是鼠源完全抗体(图11)还是人-鼠嵌合抗体(图12A、12B)都显示出很强的介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性(ADCP)。
本发明的CD47抗体99B5、100E9、6E8等在多种肿瘤模型中都显示出了强于Hu5F9-G4、AB6.12的ADCP活性；15C4同样在Raji、Jurakt等肿瘤细胞株体现出了强大的ADCP介导能力，且强于Hu5F9-G4、AB6.12的ADCP介导能力。
实验例11本发明的CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬红细胞的作用检测(ADCP)
检测方法同实验例10，将红细胞替换肿瘤细胞作为靶细胞，检测本发明的CD47抗体是否对巨噬细胞吞噬红细胞存在激活作用。
结果如图13A、13B，本发明的示例抗体不会介导巨噬细胞对红细胞的吞噬，而对照抗体B6H12则显示出显著的介导巨噬细胞对红细胞的吞噬能力。由于B6H12采用了IgG1的恒定区，可能存在着较强的干扰，进一步的验证本发明的抗体不会介导巨噬细胞对红细胞的吞噬与重链恒定区无关，本发明将99B5、15C4的重链恒定区分别采用IgG1和IgG4(S228P)，结果显示(13B)都不会介导红细胞被巨噬细胞的吞噬。
实验例12本发明的抗体对肿瘤细胞及正常红细胞的ADCC活性
通过Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞作为效应细胞检测抗体对肿瘤细胞Raji及红细胞(RBC)ADCC活性，评估其介导的对肿瘤细胞的杀伤及对正常细胞的安全性。
具体实施如下：
1.先在显微镜下观察靶细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。
2.弃上清，用1640+0.5％FBS重悬靶细胞，混匀后加入白色平底无菌板，1×104cells/孔，每孔25μl。
3.在上述板中加入配制好的4倍终浓度的待测抗体，每孔25μl，37℃，5％CO2培养箱孵育30min。
4.孵育完成后，加入Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞，6×104cells/孔，每孔50μl。体积不足100μl(对照孔)，用1640+0.5％FBS培养基补足至100μl，混匀后37℃，5％CO2培养箱孵育6h。
5.每孔加入40μl Bio-glo，避光孵育5min，酶标仪读取化学发光。
表6实验例12采用的仪器和试剂列表
名称 品牌 货号
白色平底无菌板 Costar 3917
1640 Gbico 11875-093
FBS MRC CCS30010.02
Bio-glo promega G7940
酶标仪 SpectraMax i3X
结果显示抗体99B5和100E9对Raji细胞具有一定的ADCC肿瘤杀伤活性，对正常红细胞没有ADCC活性，B6H12虽然对Raji的ADCC活性较强，但其同时对RBC具有较强的ADCC活性。15C4对Raji和RBC皆没有ADCC活性，见图14A、图14B。
序列表
<110> 倍而达药业（苏州）有限公司
<120> CD47抗体或其免疫活性片段及应用
<130> 20200304
<160> 86
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Asp Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gaggtgcagc tgcagcagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaagga gccttgagtg gattggagtt gttaatccta acattggtgc tactacttac 180
aaccagatgt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aagaagggca 300
tacctcgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gacattgtgc tcacccagtc tccagtcacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgca gggccagcca aagtattaac aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagtat gattcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag actaacagct ggcctttcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Leu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Asp Phe Gly Lys Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Lys Asn Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Glu Met Tyr Phe Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaggtgcagc tgcagcagtc tgggactgag ctggtgaggc ctgggtcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agaaactgga tacattgggt gaaacagagg 120
cctttacaag gccttgaatg gattggtaac attgaccctt ctgatagtga aactcactac 180
aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca acagcctgac gtctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatggggc 300
gactttggta aatctgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gacattgtgc tcacccaatc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60
attaattgca ggacaagtaa aaatattagc aaatttttag cctggtatca agagaaacct 120
gggaaaacta ataagcttct tatctcctct ggatccactt tgcaatctgg aattccctca 180
aggttcagtg gcagtggctc tggtacagat ttcactctca ccatcagtaa cctggagcct 240
gaagattttg aaatgtattt ctgtcaacag cataatgaat acccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Leu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Lys Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Lys Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Asn Arg Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggcgaggc ctgggtcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg cttcaggcta caccttcacc agcaactgga tgcattgggt gaaacagagg 120
cctgaacttg gccttgaatg gattggtaat attgaccctt ctgatagtga aactcactac 180
aatcaaaaat tcaaggacag ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240
atgcttctca ccagcctgac atctgacgac tctgcggtct atttttgtgc aagatgggga 300
gactatggta aatatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctccgtcat cgtctcctca 360
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gatgtccaga taacccagtc tccatcttct cttgttgcat ctcctggaga aaccattact 60
attagttgca gggcaagtaa gaacattagc aaatttttag cctggtatca agagaaacct 120
gggaagacta aaaagcttct catctcctct ggatccactt tgcaatctgg agttccatca 180
agattcagtg gcaatagatc tgatacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 15
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gaggtgcagc tgcagcagcc aggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaagga gccttgagtg gattggagtt gttaatccta acattggtgc tactacttac 180
aaccagatgt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aagaagggca 300
tacctcgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gacattgtgc tgacacaatc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
ttcacatgtc gcgcaagtga gaatatttat agttatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta ctcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Asn Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gaggtccagc tgcagcagcc aggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaagga gccttgagtg gattggagtt gttaatccta acattggtgc tactacttac 180
aaccagatgt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aagaagggca 300
tacctcgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gatattgtgc tcacacaatc tacatcttct cttgctgctt ctcctggaga aaccattact 60
attaattgca gggcaagtaa gaacattagc aaatttttag cctggtatca agagaatcct 120
ggtaaaacta acaagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180
aggttcagtg gcagtggata tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Lys Asn Asn Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Pro Ala Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Val
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
Asp Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr
20 25 30
Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Ser Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 23
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta catatttacc agttacaata ttcactgggt taagcagaca 120
gctggacagg gcctggaatg gattggactt atttatccag gaaagaataa tacaacctat 180
aatcagaaat tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcagaa 300
ccggctacgt ttccttactg gggccaaggg actgtggtca ctgtctctgc a 351
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gatattatgc taactcagtc tcccgccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtcagt 60
ctttcctgta gggccagtca gagtattagc atctacctac actggtttca acaaaaatca 120
catgagtctc caagacttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agttacagct ggccgctcac gttcggtgct 300
gggtccaagc tggagctgaa a 321
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Asn Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Phe Trp Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gaggtccagc tgcagcagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaagga gccttgagtg gattggagtt gttaatccta acattggtgc tactacttac 180
aaccagatgt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aagaagggca 300
tacctcgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gacattgtgc tgacccagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gaccaagtga gaatatttac agtagtttaa catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatggt gcaacaaact tagcagatag tgtgccatca 180
aggttcagtg gcaatggatc aggcacacat tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240
gaagattttg ggacttatta ctgtcaaaat ttttggaata ctccgctcac attcggtact 300
gggaccaagc tggagctgaa g 321
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Ser Val Ile Thr His Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
caggtccagc tgcagcagtc tggagatgat ctggtaaagc ctggggcctc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctattaca ttaactggat aaaacagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gataggacgt attgctcctg gaagtgttat tactcactac 180
aatgaaatgt tcaagggcaa ggcaacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
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ttctatggta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 32
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcgcc 60
atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
aatggaacta ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240
gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaaac ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 33
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Phe Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Met Tyr Asp Pro Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Ala Tyr Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
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<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Val Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asp Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Thr Ser Asp Ser Leu Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
gaggtccagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg 60
tcctgcaaag cttttggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaaacagagg 120
ccagaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tagtatgtat 180
gacccggagt tccagggcaa ggccagtata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct actactgtgc tagatgggcc 300
tatgattacg ggtttgccta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
gatattgtgc tcacccaatc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
gtgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt gacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gcgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
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accaagctgg agctgaaa 318
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Gln Val His Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
caggtccacc tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaaga cttctgacta cacgatcacc agttactgga taaactggat taagcagagg 120
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agtcaaaaat tcaaggacaa ggccatattg actgtagaca aatcctccac cgcagcctac 240
ttgcaactca gtagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aaagtacccc 300
gcgggacagg gggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
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<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 41
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Thr Val Ile Thr His Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Arg Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
gaggtccagc tgcagcagtc tggagatgat ctggtagagc ctggggcctc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc accttttaca ttaactggat aagacagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gatgggacgt attgctcctg gaactgttat tactcacttc 180
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attcagctca gcagcctgtc atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagatctgat 300
ttctatggta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
gatattgtgc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcgcc 60
atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
aatggaacta ttaaactcct gatctattac tcatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240
gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatcgtaagc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaaac tggaaatcaa a 321
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr
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<211> 8
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<213> Artificial Sequence
<400> 46
Val Asn Pro Asn Ile Gly Ala Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<400> 47
Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Asp Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 48
Gln Ser Ile Asn Asn Asn
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 49
Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Phe Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 50
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Trp
1 5
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<211> 8
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<213> Artificial Sequence
<400> 51
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 52
Ala Arg Trp Gly Asp Phe Gly Lys Ser Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 53
Lys Asn Ile Ser Lys Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 54
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 55
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn Trp
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 56
Ala Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Lys Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 57
Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<400> 58
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 59
Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ile Tyr Pro Gly Lys Asn Asn Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ala Arg Ser Glu Pro Ala Thr Phe Pro Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 62
Gln Ser Ile Ser Ile Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<400> 63
Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
<400> 64
Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<400> 65
Gln Asn Phe Trp Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<400> 66
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
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<213> Artificial Sequence
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Ile Ala Pro Gly Ser Val Ile Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 68
Ala Arg Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 69
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 70
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 71
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 72
Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 73
Ala Arg Trp Ala Tyr Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 74
Ser Ser Val Ser Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 75
Gln His Trp Thr Ser Asp Ser Leu Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 76
Asp Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 77
Ile Asp Leu Tyr Asp Ser Glu Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 78
Thr Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 79
Gly Asn Ile His Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 80
Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Trp Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
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<400> 81
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr
1 5
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<211> 8
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Ile Ala Pro Gly Thr Val Ile Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<400> 83
Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 84
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 86
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.CD47抗体或其免疫活性片段，其VH和VL氨基酸序列对为：SEQ ID NO：37和SEQ IDNO：38。
2.如权利要求1所述的CD47抗体或其免疫活性片段，其特征在于，其重链互补决定区HCDR的序列HCDR1/ HCDR2/ HCDR3为SEQ ID NO：76/ SEQ ID NO：77/ SEQ ID NO：78；轻链互补决定区LCDR的序列LCDR1/ LCDR2/ LCDR3为SEQ ID NO：79/ NAK/ SEQ ID NO：80。
3.如权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段，其特征在于，所述CD47抗体是嵌合的或人源化抗体，其轻链恒定区任选人抗体κ链或λ链恒定区，重链恒定区任选人抗体IgG1或IgG4 S228P恒定区。
4.如权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段，其特征在于，所述免疫活性片段选自Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。
5.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段。
6.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求6所述的表达载体，优选所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。
8.一种双特异性抗体，其特征在于，包括不同的两个臂，其中的一个臂包括能够与人CD47结合的权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段，另一个臂包括能够与恶性肿瘤细胞结合、不与人CD47结合的其他单克隆抗体或融合蛋白。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段，或权利要求8所述的双特异性抗体，和药学上任选的药用载体。
10.权利要求1或2所述的CD47抗体或其免疫活性片段在制备治疗肿瘤疾患 CD47 过度表达的药物中的应用，所述肿瘤疾患为血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，所述血液瘤为急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；所述实体瘤为淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤中的至少一种。
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