CN111454349B - 一种鸡尾酒式混合受体及其在检测内分泌干扰物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鸡尾酒式混合受体及其在检测内分泌干扰物中的应用，属于内分泌干扰物检测分析技术领域。本发明同时加入雌激素受体α和雌激素受体β形成鸡尾酒式混合受体，采用胶体金比色法对内分泌干扰物进行检测，经试验验证，采用上述方法可明显的提高识别能力，实现更宽的识别范围，同时具有环保、操作简单等优点，且具有非靶向生物识别的优势，可以用于筛查未知的EDCs，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于内分泌干扰物检测分析技术领域，具体涉及一种鸡尾酒式混合受体及其在检测内分泌干扰物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
内分泌干扰物(EDCs)广泛存在于人类的生活环境中，其对人体和动物可能产生的影响已被报道，痕量的内分泌干扰物在日积月累中对人体会产生不可逆的影响。EDCs可通过食物链或直接接触等途径进入人或动物体内，干扰机体内分泌系统的功能，影响体内激素的合成、释放、转运、代谢及结合等过程，干扰血浆中正常激素水平的维持，从而对机体的生殖、发育、肿瘤发生、神经系统、免疫系统等产生多方面影响。
目前，有多篇报道已在乳制品和肉制品中检测到内分泌干扰物。报道中，内分泌干扰物的检测分析方法多种多样，比如高效液相和气相质谱色谱法，拉曼光谱法，酶联免疫法检测方法等，然而，发明人发现，其中HPLC和GS-MS仪器成本较高，不易进行现场快速检测；拉曼光谱法应用范围不够广；以单种受体作为识别分子的ELISA方法对待测物种类的检测范围不够宽。因此为解决以上问题，一种简单、快速、灵敏、检测范围宽的方法亟待开发。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种鸡尾酒式混合受体及其在检测内分泌干扰物中的应用。本发明同时加入雌激素受体α和雌激素受体β形成鸡尾酒式混合受体，采用胶体金比色法对内分泌干扰物进行检测，经试验验证，采用上述方法可明显的提高识别能力，实现更宽的识别范围，同时具有环保、操作简单等优点，且具有非靶向生物识别的优势，可以用于筛查未知的EDCs，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种鸡尾酒式混合受体，所述鸡尾酒式混合受体包括雌激素受体α和雌激素受体β。
本发明的第二个方面，提供一种内分泌干扰物检测试剂盒，所述试剂盒至少包括上述鸡尾酒式混合受体。
本发明的第三个方面，提供上述鸡尾酒式混合受体和/或内分泌干扰物检测试剂盒在内分泌干扰物检测中的应用。
所述应用方法具体为：基于上述鸡尾酒式混合受体和/或内分泌干扰物检测试剂盒采用胶体金比色法对内分泌干扰物进行检测。
本发明的第四个方面，提供一种检测内分泌干扰物的方法，所述方法包括：将上述鸡尾酒式混合受体与待测样品反应，然后加入胶体金孵育，采用胶体金比色法进行检测。
所述内分泌干扰物包括但不限于已知的己烯雌酚(DES)，己烷雌酚(HES)，17β-雌二醇(17β-E2)，雌酮(E1)，17α-雌二醇(17α-E2)，2,2-双(4-羟基苯基)-1,1,1-三氯乙烷(HPTE)，双酚A(BPA)，双酚B(BPB)和染料木黄酮(GS)，同时也包含其他目前未知的内分泌干扰物。
本发明的第五个方面，提供上述鸡尾酒式混合受体、内分泌干扰物检测试剂盒和/或检测内分泌干扰物的方法在非定向筛查未知内分泌干扰物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供一种鸡尾酒式混合受体及其在检测内分泌干扰物中的应用。本发明利用鸡尾酒式混合受体检测内分泌干扰物，可以明显的提高识别能力，实现更宽的识别范围，同时具有环保、操作简单等优点，有助于检测方法的广泛应用。其检测灵敏度较高，对于内分泌干扰物的检测灵敏度可达10-12M。该检测方法具有非靶向生物识别的优势，可以用于筛查未知的EDCs。因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明基于鸡尾酒式混合受体采用胶体金比色法对内分泌干扰物进行检测的原理示意图。
图2为本发明实施例1中胶体金TEM图和UV图。其中，A为TEM图，B为UV图。
图3为本发明实施例1中胶体金比色方法条件优化图，其中，A为对雌激素受体α的条件优化；B为对雌激素受体β的优化；C为对NaCl浓度的优化。
图4为本发明实施例1中分别对九种不同内分泌干扰物进行检测结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
金纳米颗粒具有长时间保存稳定，操作简便，环境污染小等优点，被广泛应用生物检测研究。因其具有一定的显色能力和生物兼容性等特点，金纳米颗粒比色分析法应运而生。1997年Elghanin等建立了一种经典的金纳米颗粒比色分析法，此后,又相继出现了多种改良的金纳米颗粒比色方法。
雌激素受体(ER)是配体激活的转录调节因子，介导卵巢类固醇激素17β-雌二醇(E2)的生理效应。雌激素受体包括α和β两种亚型。两种亚型具有相似的结构，都有四个功能区：NH2末端域(NTD)，包括AF1区，DNA结合域(DBD)，铰链区，和COOH末端配体结合域(LBD)，包括AF2区。受体α和β两种亚型在LBD配体结合域显示了59％的氨基酸序列一致性，在此区域的AF2区的配体结合位点有微小差异，正是因为这种微小差异使得两种亚型配体选择性有些许不同，由此决定两种不同亚型的雌激素受体有不同的特异性配体，对不同的配体也表现出不同的效应。同时ER具有非靶向生物识别的优势，可以用于筛查未知的EDCs。因此，本发明提出可以同时使用α和β两种亚型进行内分泌干扰活性物质的检测，从而使内分泌干扰物识别范围更宽，识别能力提高，有助于建立潜在新型内分泌干扰物非定向筛查方法。
基于ER胶体金比色方法原理具体为：胶体金呈现良好的分散性，溶液为红色，在一定浓度的氯化钠刺激下，胶体金发生团聚，溶液呈现紫色。当在胶体金溶液加入受体时，受体蛋白可以包裹于胶体金表面，对其形成保护，使胶体金稳定存在于氯化钠溶液中，溶液仍呈现红色。当加入内分泌干扰物时，受体与内分泌干扰物特异性结合，导致胶体金失去保护，在氯化钠溶液的刺激下发生团聚现象，溶液呈现紫色。因加入不同浓度的靶标呈现不同的团聚效果，由此检测不同浓度的内分泌干扰物。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种鸡尾酒式混合受体，所述种鸡尾酒式混合受体包括雌激素受体α和雌激素受体β。
其中，所述雌激素受体α和雌激素受体β浓度均控制为不高于25μg/mL，如2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、13μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL，通过优化条件可知，当雌激素受体α和雌激素受体β浓度均为10μg/mL时，检测效果最好。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种内分泌干扰物检测试剂盒，所述试剂盒至少包括上述鸡尾酒式混合受体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述鸡尾酒式混合受体和/或内分泌干扰物检测试剂盒在内分泌干扰物检测中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述内分泌干扰物为雌激素干扰物，包括但不限于已知的己烯雌酚(DES)，己烷雌酚(HES)，17β-雌二醇(E2)，雌酮(E1)，17α-雌二醇(17α-E2)，2,2-双(4-羟基苯基)-1,1,1-三氯乙烷(HPTE)，双酚A(BPA)，双酚B(BPB)和染料木黄酮(GS)，同时也包含其他目前未知的内分泌干扰物。
本发明的又一具体实施方式中，所述应用方法具体为：基于上述鸡尾酒式混合受体和/或内分泌干扰物检测试剂盒采用胶体金比色法对内分泌干扰物进行检测。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测内分泌干扰物的方法，所述方法包括：将上述鸡尾酒式混合受体与待测样品反应，然后加入胶体金孵育，采用胶体金比色法进行检测。
本发明的又一具体实施方式中，所述混合式受体与待测样品反应具体条件为室温下反应1-3h，优选为2h。
本发明的又一具体实施方式中，加入胶体金震荡孵育时间为室温下1-2h，优选为1h。
本发明中所用胶体金颗粒粒径分布均匀，为圆球形纳米颗粒，粒径分布在20nm左右，大小均一，呈现较好的分散性，同时制备的胶体金紫外可见光谱无杂峰，其最大吸收峰位于520nm处，是胶体金的特征吸收峰；所述胶体金优选采用柠檬酸三钠还原法制得。
本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法还包括向其中加入NaCl溶液形成高盐溶液，继续震荡孵育直至颜色不再变化；测量波长为520nm和620nm处的吸光度，以A650nm/A520 nm的比值变化确定待测样品中内分泌干扰物的浓度。
本发明的又一具体实施方式中，所述高盐溶液NaCl浓度不高于900mM，如150mM，300mM，400mM，450mM，500mM，700mM和900mM，更进一步优选为450mM。
本发明的又一具体实施方式中，所述内分泌干扰物为雌激素干扰物，包括但不限于已知的己烯雌酚(DES)，己烷雌酚(HES)，17β-雌二醇(17β-E2)，雌酮(E1)，17α-雌二醇(17α-E2)，2,2-双(4-羟基苯基)-1,1,1-三氯乙烷(HPTE)，双酚A(BPA)，双酚B(BPB)和染料木黄酮(GS)，同时也包含其他目前未知的内分泌干扰物。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述鸡尾酒式混合受体、内分泌干扰物检测试剂盒和/或检测内分泌干扰物的方法在非定向筛查未知内分泌干扰物中的应用。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
(1)胶体金的制备与表征
将1mL氯金酸(1％，w/w)溶液加入100mL容量瓶中，加超纯水定容至100mL，倒入干净烧杯，并在电热板上加热。在上述溶液开始沸腾后，迅速加入3mL的1％(w/v)柠檬酸三钠，剧烈搅拌，使其从最初的淡黄色变成透明的酒红色，直到混合物的颜色保持稳定后继续搅拌10min。最后，将得到的酒红溶液自然冷却至室温，保存在4℃的提前处理过的棕色玻璃瓶中，以备进一步使用。通过TEM扫描证实制备的胶体金的尺寸、形貌和分散性，并测量胶体金吸光度从400nm到800nm的紫外吸收光谱图。利用透射电子显微镜对胶体金进行表征，结果如图1所示，本实验所制备的胶体金颗粒呈球状，大小均一，呈现较好分散性，颗粒粒径平均在20nm左右；同时制备的胶体金紫外可见光谱无杂峰，其最大吸收峰位于520nm处，是胶体金的特征吸收峰。故本实验制备胶体金成功。
(2)ERα和ERβ浓度优化
分别将浓度为0、2、4、6、8、10、11、13、15、20、25μg/mL的ERα20μL和超纯水40μL混匀后添加到96孔板中，然后加入100μL胶体金溶液震荡孵育1h再加入130mM NaCl溶液50μL，震荡孵育，观察颜色变化，直到体系颜色不再变化时通过酶标仪记录520nm吸光度值。优化得ERα最佳浓度为10μg/mL。ERβ浓度优化方法与ERα浓度优化方法相同，优化得ERβ最佳浓度为10μg/mL。
确定ERα和ERβ的最优浓度并分别使用优化后的浓度对内分泌干扰物进行检测，A650 nm/A520 nm值为纵坐标，内分泌干扰物浓度为横坐标，绘制标准曲线图。分析比较ERα和ERβ对不同内分泌干扰物的识别能力。(3)鸡尾酒式混合受体的制备和NaCl浓度优化
将原浓度的ERα和ERβ分别稀释至20μg/mL，取等体积稀释后的ERα和ERβ混合，震荡混匀，使混合后的受体溶液浓度各自保持在10μg/mL，备用。
将96孔板中标记1到8序号，每个孔中添加鸡尾酒型混合受体20μL和超纯水40μL，震荡混匀后添加100μL胶体金溶液震荡孵育1h后，分别将浓度为0，150，300，400，450，500，700和900mM的NaCl溶液40μL加入对应的1-8号孔板，每个样品三个平行。观察溶液的颜色变化，直至颜色不再变化时通过酶标仪记录520nm吸光度值。优化得NaCl溶液最佳浓度为450mM。
(4)基于鸡尾酒式混合受体胶体金比色方法检测步骤
首先用20μL鸡尾酒式混合受体与10-5-10-13M一系列浓度的40μL内分泌干扰物室温下反应2h后向上述溶液中加入100μL胶体金溶液震荡孵育1h，然后加入40μL 450mM的NaCl溶液，震荡孵育，每个浓度三个平行。观察颜色变化，直至颜色不再变化时通过酶标仪记录520nm和650nm吸光度值。A650 nm/A520 nm值为纵坐标，EDCs浓度为横坐标，绘制标准曲线图。分别对九种不同内分泌干扰物进行检测。
结果图4所示，ERα与ERβ对不同的雌激素干扰物有不同的识别效果，GS和BPB对ERβ的亲和效果大于ERα，使用鸡尾酒式混合受体，对多种内分泌干扰物识别能力均有所提高，识别范围变宽，灵敏度高于单一受体。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种检测内分泌干扰物的方法，其特征在于，所述方法包括：将鸡尾酒式混合受体与待测样品反应，然后加入胶体金孵育，采用胶体金比色法进行检测；
所述鸡尾酒式混合受体为雌激素受体α和雌激素受体β；
雌激素受体α和雌激素受体β浓度均为10 μg/mL；
所述方法还包括向其中加入NaCl 溶液形成高盐溶液，继续震荡孵育直至颜色不再变化；测量波长520 nm和620 nm 处的吸光度，以A650 nm/A520 nm的比值变化确定待测样品中内分泌干扰物的浓度；
所述高盐溶液NaCl 浓度为450 mM；
所述内分泌干扰物为雌激素干扰物雌酮，双酚B。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述鸡尾酒式混合受体与待测样品反应具体条件为室温下反应1-3 h，加入胶体金震荡孵育时间为室温下1-2 h。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述鸡尾酒式混合受体与待测样品反应具体条件为室温下反应2 h，加入胶体金震荡孵育时间为室温下1 h。
4.权利要求1-3任一项所述检测内分泌干扰物的方法在非定向筛查内分泌干扰物中的应用，其特征在于，所述内分泌干扰物为雌激素干扰物雌酮，双酚B。
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| Sensitive detection of estradiol based on ligand binding domain of estrogen receptor and gold nanoparticles;Busayapongchai P等;《Analytical biochemistry》;20161108;摘要，第62页第2.6小节 * |
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