CN111450317A - 一种生物可降解组织工程尿道支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物可降解组织工程尿道支架及其制备方法，该生物可降解组织工程尿道支架的材料为聚乳酸‑共‑乙醇酸酯、聚己内酯和增溶剂以重量比例为70：30：2～10形成的共聚物，一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法包括a)改性材料溶液共混制备、b)医学影像处理和建模、c)3D模板打印和d)支架制备，本发明将PLGA和PCL两种生物可降解聚合物进行溶液共混改性，并添加柠檬酸三乙酯作为增容剂，通过调整共混比例与增容剂的含量，使改性后的材料在保持了柔性与拉伸强度的同时，韧性有了较大的改善；基于3D打印技术，结合医学影像数据及软件处理，可针对患者病灶打印出可溶性模板，制得个性化定制的组织工程尿道支架。

Description

一种生物可降解组织工程尿道支架及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及尿道支架的技术领域，特别是一种生物可降解组织工程尿道支架及其制备方法的技术领域。
【背景技术】
目前尿道狭窄段病灶长度距离较长的患者常常需要通过替代狭窄段尿道进行治疗。颊粘膜、唇粘膜及舌黏膜等口腔粘膜是目前世界上公认的最佳的移植材料，但其短期不可再生和有限性以及取材之后补片材料供体部位的并发症(如腮腺导管损伤和咀嚼肌病变等)仍然无法得到完美地解决。
上世纪90年代，Langer等人提出了组织工程学的概念。组织工程学概念最基本的思路在于生物体外分离、培养细胞，也就是在具有特定空间结构的支架上种植种子细胞，由细胞不断增殖，分泌出细胞外基质(ECM)，进而形成具备一定功能与结构的组织。组织工程所采用的支架主要为两种类型：由脱细胞组织提取的基质以及由生物可降解材料合成的支架。其中，由脱细胞组织提取的基质为丝素蛋白基质、小肠黏膜下层或脱细胞膀胱基质等。生物可降解材料为生物可降解聚合物如聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)或聚乳酸-共-己内酯(PLCL)等。相比于脱细胞组织基质，经过筛选的生物可降解聚合物材料不仅可以有接近基质的高生物相容性与低免疫原性，同时也可以为了弥补单一聚合物的缺点，通过物理及化学方法进行改性，得到一系列机械性能可调控的材料。
组织工程的核心是建立由细胞和生物材料支架构成的三维复合体。一个理想的支架应具有如下性质：1.三维多孔且内部贯通的孔网络结构；2.适配的生物相容性；3.合适的表面化学；4.与植入组织相匹配的力学性质。近年来多个课题组对基于生物可降解材料的组织工程支架制备方法已有较多研究。Selim等(M.Selim,A.Bullock,K.Blackwood,C.Chapple and S.MacNeil,BJU Int.,2011,107,296-302.)采用电纺丝技术，将PLGA-85纺织成直径约5μm的细丝，缠绕于细棒上，最终编织为多孔的支架，但支架无法承受较大形变。为了应对泌尿功能障碍问题，相关人员尝试进行多项研究以通过组织工程结合细胞培养的生物材料体外研究膀胱再生的可能性。例如Xu等(C.Xu,R.Inai,M.Kotaki andS.Ramakrishna,Tissue Eng.,2004,10,1160-1168.)同样采用电纺丝技术，将PLCL-75纺织成直径仅550nm的细丝，形成具有高孔隙率与低密度的支架，在膀胱组织工程中具有巨大的应用前景，但其机械性能仍需改进。因此，有必要开发出一种力学性能适用于人体尿道生理环境的材料，并制备成尿道支架，从而更好地对患者进行替代狭窄段尿道治疗。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种生物可降解组织工程尿道支架及其制备方法，所制备的尿道支架柔性、拉伸强度和韧性均良好，且可为患者定制贴合病灶的特定形状。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一种生物可降解组织工程尿道支架，该生物可降解组织工程尿道支架的材料为聚乳酸-共-乙醇酸酯、聚己内酯和增溶剂以重量比例为70：30：2～10形成的共聚物。
作为优选，所述增溶剂为柠檬酸三乙酯。
作为优选，所述聚乳酸-共-乙醇酸酯为乳酸和乙醇酸以重量比例为1～9：1形成的共聚物。
一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，包括如下步骤：
a)改性材料溶液共混制备：称取重量比例为70：30：2～10的聚乳酸-共-乙醇酸酯、聚己内酯和增溶剂，再加入单体总质量的0.7～0.8％的催化剂，随后在50～70℃下加热搅拌共同溶解于有机溶剂之中，其中溶质和有机溶剂的质量体积比为15.3～16.5：80，接着升温至100～120℃后再加热回流3.5～4.5h，待冷却至室温后，在剧烈搅拌下进行醇沉直至产生大量白色絮状沉淀物，再将沉淀物抽滤出并淋洗数次，然后干燥得到PLGA与PCL的共混材料；
b)医学影像处理和建模：提取患者尿道病灶医学影像，确定患者的病灶区域，单独分离出待修复的尿道模型，通过度量患者正常部分的尿道，得到修复的目标直径，随后根据目标直径模拟重建修复模型，得到修补尿道病灶的定制化支架模型；
c)3D模板打印：采用3D打印机对步骤b)中得到修补尿道病灶的定制化支架模型进行打印，在润湿后抛光至表面光滑，再冲洗干净并干燥，得到支架模板；
d)支架制备：将步骤a)中得到的PLGA与PCL的共混材料溶于有机溶剂中，溶质和有机溶剂的质量体积比为3.5～4.5：25，再将步骤c)中得到的支架模板浸没在PLGA与PCL的共混材料溶液中5～15s，再匀速向上提拉，待有机溶剂挥发完全后，重新进行下一次的提拉，如此重复数次直至支架模板表面形成厚度为180～220μm的PLGA与PCL的共混材料层，得到组装体，再将组装体置入35～55℃的恒温热水浴中搅拌，并不断换水，溶解掉组装体内部的支架模板，再在消毒后，得到成品。
作为优选，所述步骤a)中，催化剂为对甲苯磺酸。
作为优选，所述步骤a)中，有机溶剂为1,2-二氯乙烷。
作为优选，所述步骤c)中，3D打印的线材为PVA线材，逐层打印的层厚度为0.10～0.14mm，填充度为55～65％。
作为优选，所述步骤d)中，有机溶剂为二氯甲烷。
本发明的有益效果：本发明针对PLGA易断裂和低韧性的缺点，将PLGA和PCL两种生物可降解聚合物进行溶液共混改性，并添加柠檬酸三乙酯作为增容剂，通过调整共混比例与增容剂的含量，使改性后的材料在保持了柔性与拉伸强度的同时，韧性有了较大的改善，从而制备出力学性能更适合人体尿道生理环境的材料；基于3D打印技术，结合医学影像数据及软件处理，可针对患者病灶打印出可溶性模板，制得个性化定制的组织工程尿道支架，相比于传统的电纺丝法与一般的牺牲模板法，本发明所制备的尿管支架不仅形状与尺寸可控，且可根据不同患者的不同病情进行针对性修复，从而提高手术成功率，降低患者术后风险，此外也可用于人体各部位的组织工程中，因此具备相当程度的普适性、扩展性与临床可用性。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是医学影像处理修复与建模简要示意图；
图2是材料表面细胞生长的激光共聚焦扫描显微镜图像及材料细胞毒性图；
图3 PCL/PLGA共混改性示意图；
图4共混材料SEM图像及加入TEC的增容效果示意图；
图5不同比例PLGA/PCL共混力学性能图；
图6不同PLGA体系的DSC曲线图；
图7 PVA模版SEM图像；
图8支架内、外表面与径向断面SEM图像；
图9尿管支架弹性效果图；
图10医学影像MIMICS建模示意图；
图11 3D打印PVA模版制备图；
图12组织工程尿道支架制备图。
图2中，A)PLGA-75表面的Hela细胞图像；(B)PLGA-75表面的L929细胞图像；(C)PCL表面的L929细胞图像；(D)PLGA-50表面的L929细胞图像；(E)PLGA-90表面的L929细胞图像；(F)不同材料的细胞增殖率对比。
图4中，(A)PLGA/PCL；(B)PLGA/PCL/TEC。
图7中，(A)抛光前模版边缘SEM低倍像；(B)抛光前内表面SEM图像；(C)抛光后模版边缘SEM低倍像；(D)抛光后内表面SEM图像。
图11中，A)软件操作参数设置界面；(B)模版3D切片模型；(C)3D打印机Finder实物模版打印过程；(D)PVA模版3D打印成品。
图12中，(A)PVA模版溶解示意图；(B)溶解过程中的模版截面图；(C)组织工程尿道支架PLGA/PCL/TEC(70:30:4)成品。
【具体实施方式】
材料与试剂：
聚己内酯(PCL,Mw＝5.0×104)购于苏威(美国)。聚乳酸-共-乙醇酸酯(PLGA-90,PLGA-75,PLGA-50,Mw＝3.0×104)购于丹盛塑胶(中国)。二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、柠檬酸三乙酯(Triethyl citrate,TEC)和对甲苯磺酸(TsOH)购于泰坦(中国)。PVA 3D打印线材购于ESUN(中国)。胎牛血清、细胞培养基、二甲基亚砜(DMSO)、Hochest 33342(用于细胞核染色)和Alexa Fluor 594(用于细胞膜染色)购于Thermo Fisher(美国)。胰酶购于Macklin(中国)。二甲基噻唑-二苯基溴化四唑(MTT)购于Sigma-Aldrich(美国)。
实施例一、PLGA/PCL/TEC(70：30：2)scaffold的制备：
a)改性材料溶液共混制备：称取10.5g的聚乳酸-共-乙醇酸酯、4.5g的聚己内酯、0.12g的对甲苯磺酸和0.3g的柠檬酸三乙酯(相对于聚合物质量为2％)，在60℃下加热搅拌共同溶解于80ml的1,2-二氯乙烷之中。接着升温至110℃后再加热回流4h。待冷却至室温后，在剧烈搅拌下，缓慢滴加180ml的无水乙醇，产生大量白色絮状沉淀物。再将沉淀物抽滤出并用乙醇淋洗数次，然后利用红外灯进行干燥，得到PLGA与PCL的共混材料，记为PLGA/PCL/TEC 70：30：2。其中，聚乳酸-共-乙醇酸酯为乳酸和乙醇酸以重量比例为3：1形成的共聚物PLGA-75。
b)医学影像处理和建模：参阅图10，将患者的CT或NMR图像导入Materialise'sInteractive Medical Image Control System(MIMICS)后，在软件中确定患者的病灶区域，对尿道部分进行阈值划分(图10,A)初步划分出尿道区域，并将无关区域擦除，即可得到单独分离的尿道模板(图10,C)。将模板以stl格式导出，导入至Unigraphics NX(UG NX)中进行进一步修复(图10,B)。对患者的尿道模板多处采点进行拟合，得到尿路中轴线的特征样条曲线。根据患者的尿道平均内径，以中轴线为引导线进行扫略，得到定制的尿道牺牲模板模型(图10,D)。模型保存为stl格式后，即可进行后续3D打印及材料复合组装。
c)3D模板打印：根据模型，通过切片软件FlashPrint将初始牺牲模板模型以层高0.12mm进行切片(图11,A)。切片完成后，采用FDM型3D打印机Finder(Flashforge,China)对步骤b)中得到修补尿道病灶的定制化支架模型进行打印，线材采用PVA材质(eSoluble,ESUN,China)，通过铜制喷头(直径350μm)进行逐层打印，层厚度设定为0.12mm，基准打印速度设定为15mm/s，填充度设定为60％。将打印完毕的模板去除底座后，用少量蒸馏水润湿表面，抛光至表面光滑，随后以乙醇冲洗并干燥，得到支架模板，命名为PVA template。
e)支架制备：参看图12，将4g的步骤a)中得到的PLGA/PCL/TEC 70：30：2溶于25ml的二氯甲烷之中，再将步骤c)中得到的PVA template浸没在PLGA/PCL/TEC 70：30：2溶液中10s，然后以5mm/s匀速向上提拉，待二氯甲烷挥发完全后，重新进行下一次的提拉，如此重复数次直至PVA template表面形成厚度为200μm的PLGA/PCL/TEC 70：30：2的共混材料层，得到组装体，记为PLGA/PCL/TEC(70：30：2)@PVAtemplate。接着将PLGA/PCL/TEC(70：30：2)@PVA template置入45℃的恒温热水浴中搅拌，并不断换水，溶解掉PLGA/PCL/TEC(70：30：2)@PVA template内部的PVA template，再利用环氧乙烷消毒后，即得个性化定制的尿道修复支架PLGA/PCL/TEC(70：30：2)scaffold。
实施例二、PLGA/PCL/TEC(70：30：4)scaffold的制备：
柠檬酸三乙酯的含量为0.6g(相对于聚合物质量为4％)，其他同实施例一。
实施例三、PLGA/PCL/TEC(70：30：6)scaffold的制备：
柠檬酸三乙酯的含量为0.9g(相对于聚合物质量为6％)，其他同实施例一。
实施例四、PLGA/PCL/TEC(70：30：8)scaffold的制备：
柠檬酸三乙酯的含量为1.2g(相对于聚合物质量为8％)，其他同实施例一。
实施例五、PLGA/PCL/TEC(70：30：10)scaffold的制备：
柠檬酸三乙酯的含量为1.5g(相对于聚合物质量为10％)，其他同实施例一。
实施例六、材料的生物相容性测试：
1.细胞毒性测试：
将PCL、PLGA-90、PLGA-75、PLGA-50制备成圆片状薄膜各6片，铺于24孔培养板。
将Hela细胞、L929细胞复苏传代，并用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞并计数，制成浓度为1.5x105个/mL的细胞悬液，接种于铺好薄膜的24孔培养板，每孔33μL，再每孔加入467μL培养液，置于37℃、5％的CO2培养箱(Thermo Fisher,USA)中培养2d。
2d后，吸出孔内所有液体，每孔加入2mg/mL的MTT溶液30μL，继续在培养箱中培养4h后，小心吸净液体，每孔加入150μL DMSO，在振荡器上震荡5min使晶体溶解，在酶标仪(Varioskan,USA)490nm处检测吸光度值。以无聚合物薄膜的孔作为阴性对照，按照如下公式计算不同聚合物的细胞相对增殖率(Relative Growth Rate,RGR)：
Figure BDA0002445149320000081
其中Am为聚合物薄膜上的液体吸光度值，An为阴性对照组的液体吸光度值。
2.细胞活动观察：
将PCL、PLGA-90、PLGA-75、PLGA-50制备成方片状薄膜各4片，铺于6孔培养板紫外灭菌15min。分别将1x105 Cell/孔接种在铺好聚合物薄膜的六孔板中，在5％CO2，37℃培养箱内培养24h。用PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)洗涤，37℃避光分别用Hochest 33342对细胞核染色，Alexa Fluor 594对细胞膜染色，以Confocal Laser Scanning Microscope(TCS SP8STED Leica,Germany)观察细胞活性。
本发明中选用的细胞为小鼠成纤维细胞L929及子宫颈癌细胞Hela。这两种细胞在材料表面生长时，当细胞的活性很好，会贴附于表面形成梭型形态，因此可以根据观察细胞的形态来表征细胞的存活情况，进而判断材料是否能够提供适宜的环境供给细胞生长。
PLGA是乙醇酸(Glycolic Acid,GA)与乳酸(Lactic Acid,LA)的共聚物，根据LA与GA的质量比不同可分为一系列的共聚物(PLGA-75即表示LA与GA质量比为75：25；PLGA-90即表示LA与GA质量比为90：10；PLGA-50即表示LA与GA质量比为50：50)。图2展示了在ConfocalLaser Scanning Microscope观察下，材料表面的细胞生长情况及其细胞毒性。经过24h培养后，可以观察到，生长于PLGA-75及PCL薄膜表面的L929细胞(图2B,C)大量繁殖，分布均匀，细胞核清晰可见，且绝大部分细胞都以梭型贴壁形式存活，黏附于材料表面，结合其细胞增殖率，可知其具有相当好的生物相容性；对比PLGA-90及PLGA-50两种材料薄膜表面的L929细胞(图2D-E)，可以发现细胞繁殖程度一般，细胞核较模糊，以梭型贴壁形式存在的细胞占全部细胞的比例低，因此其细胞存活情况一般。
本文采用MTT法，在所选的四种材料制成的薄膜上分别与小鼠成纤维细胞L929及子宫颈癌细胞Hela共培养后，测定其细胞相对增值率(图2F)，对细胞毒性分级。根据《美国药典》的细胞毒性分级法，可知PLGA-75为0级，其余材料均达到了I级，证明了材料的生物安全性。
从CLSM图像上的对比并结合细胞增殖率数据，可知在PLGA系列共聚物中，PLGA-75有最佳的生物相容性与细胞毒性；与此同时PCL作为改良力学性能的材料，本身也具有较低的细胞毒性与足够的生物相容性，因此以PLGA-75与PCL共混作为支架材料可以满足组织工程对于生物相容性的需求。
实施例七、混溶物相容性及力学性能测试：
1.力学性能测试：
按GB/T 528-1998标准，将材料制备成4mm宽，1mm厚的标准哑铃形样条，在Instron4465 Universal Electromechanical Tester(Instron,USA)上测试材料的力学性能，拉伸速度20mm/min，测试温度25℃。
2.SEM测试：
取共混材料的断面，喷上金粉，在Phenom Pro Scanning electron microscopy(Phenom,China)观察其形态。
3.DSC测试：
称取15mg材料，氮气保护下在Q2000 Modulated Differential ScanningCalorimeter(TA,USA)以10℃/min的恒定升温速率从0℃升温至200℃。
参阅图3，尿道环境对于组织工程尿道材料的机械性能偏向于柔且韧。PLGA与PCL均为生物可降解材料。PLGA的生物相容性极好，足以胜任人工ECM的需求，虽然其较柔软，但由于其本身脆性较大，因此作为支架具有力学上的不稳定性。而PCL的优点在于其在具备较好的生物相容性的同时，材质上更偏向于韧且硬。本发明基于两种材料的特点，通过共混改性的方式来获得具有一定力学强度，且本身仍能体现柔且韧的材料。
但是，PLGA与PCL直接共混后相容性很差，从SEM图中(图4,A)可以看到PLGA与PCL在直接共混后，两相之间界面清晰，PCL大小不一的颗粒随机分散在PLGA中。共混的相容性差对材料的力学性能并没有提升，甚至是有所降低。
从不同比例PLGA/PCL共混的力学性能图(图5,A)中可以看到，随着PLGA中PCL的含量增多，其拉伸强度逐渐降低，这是由于两者不相容导致其内部存在大量尺度较大的相界面，降低了界面的粘合力，使得其拉伸强度有所降低；而杨氏模量在逐步增加，这是由于PCL本身材质的刚性更大，形变更难以发生，当PCL含量增多时，材料的刚性也随之增大；断裂伸长率因为PCL的高韧性而有较小的上升，但总体而言提升不大。
通过在PLGA/PCL 70：30中添加TEC，可使PLGA与PCL和其发生酯交换反应，形成PLGA-TEC-PCL，反应方程式如下：
Figure BDA0002445149320000111
PLGA-TEC-PCL可以有效地促进两相的相容性，使得相界面在尺寸上明显降低(图4,B)，两相结合得更紧密，从而起到改善两相相容性的效果。随着TEC含量的增多，从(图5,B)中可以看到，其断裂伸长率与拉伸强度均呈现先增后减的趋势，这说明了通过反应形成的PLGA-TEC-PCL可以有效地增加两相间的粘合力，使材料的韧性及抗拉伸能力得到有效地提升；而当TEC添加过多时，局部堆积的PLGA-TEC-PCL反而会使材料内部产生缺陷，阻碍了分子链段的运动能力，使得其韧性及反而降低；同时，TEC的添加量对杨氏模量的影响并不大，可能是因为决定材料刚性主要由高聚物本身的性质决定，反应增容并不会改变其刚性。
因此通过添加一定量的PCL及TEC所制得的PLGA/PCL/TEC 70：30：6，可以使得材料在保持较好的柔性及抗拉伸性能的同时，韧性有了较大的提升，更适合应用于尿道支架的制备。
参看下表1及图6，图中各线条自上而下依次为纯PLGA、PLGA/PCL 70：30及在PLGA/PCL 70：30中添加了2、4、6、8、10份质量TEC的共混材料的DSC曲线。从图上和表中可以看到，相较于纯PLGA而言，添加了PCL及一定比例的TEC后，共混材料的玻璃化转变温度、熔融温度及熔融热焓都有一定程度降低，且大致随着TEC添加量的增加而逐渐降低。这是由于TEC含量的增多，使得PLGA-TEC-PCL随之增多，材料内部相界面减小，PLGA与PCL分布更加均匀。
Figure BDA0002445149320000121
表1不同PLGA体系的DSC曲线
实施例八、支架模板的抛光对尿管支架表面形貌影响的测试：
取抛光前后的支架模板外表面及采用该支架模板所制备的尿管支架内表面，喷上金粉，在Phenom Pro Scanning electron microscopy(Phenom,China)观察其形态。
由于3D打印是一个逐层叠加的过程，在模板制造过程中不可避免会出现台阶纹(图7,A)，而存在台阶纹的模板会使得支架的内表面产生大量的破损与缺陷(图7,B)；因此需要对打印完的模板表面用去离子水进行抛光，形成较为光洁的模板(图7,C)，光洁的模板可以使得外覆的支架内表面没有大尺度上的缺损(图7,D)，降低了支架受外力导致破损的可能性，同时提高了制造的精度。
实施例九：尿管支架表面形貌测试：
取制备好的尿管支架表面、内壁与径向断面，喷上金粉，在Phenom Pro Scanningelectron microscopy(Phenom,China)观察其形态。
参阅图8，从图上可以清晰地看到，尿管支架内外表面具有多孔的网状结构，孔的直径约为1μm至3μm，分布较为均匀。这些孔是由涂覆溶液的二氯甲烷逐渐挥发，留下溶于其中的聚合物的骨架所形成。
组织工程支架大多要求为多孔结构，其原因也在于支架内部可以有更好的连通性，确保营养物质的运输与渗透，以模拟细胞外基质的特性。从SEM中可以看到，内外表面多孔的网状结构在内层都互相联通，随着材料在生物降解的过程中，孔洞不断扩大，细胞在孔洞中可以不断黏附并增殖，直至达到支架的内部，形成更加均匀、密实的组织结构，提高了组织再生的成功率。
实施例十、尿管支架弹性测试：
经过改性后的材料具有一定的弹性、抗拉伸能力及柔韧性，可以在受到外力弯曲或挤压时保证结构的完好，并在外力消失后恢复原状(图9,A)。弯曲及挤压导致的破裂是由于材料的拉伸强度及韧性不足所导致，因此最终选择了拉伸强度与韧性均较高的PLGA/PCL/TEC 70：30：6作为支架的材料，来保证支架机械性能的稳定。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种生物可降解组织工程尿道支架，其特征在于：该生物可降解组织工程尿道支架的材料为聚乳酸-共-乙醇酸酯、聚己内酯和增溶剂以重量比例为70：30：2～10形成的共聚物。
2.如权利要求1所述的一种生物可降解组织工程尿道支架，其特征在于：所述增溶剂为柠檬酸三乙酯。
3.如权利要求1或2中任一项所述的一种生物可降解组织工程尿道支架，其特征在于：所述聚乳酸-共-乙醇酸酯为乳酸和乙醇酸以重量比例为1～9：1形成的共聚物。
4.一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a)改性材料溶液共混制备：称取重量比例为70：30：2～10的聚乳酸-共-乙醇酸酯、聚己内酯和增溶剂，再加入单体总质量的0.7～0.8％的催化剂，随后在50～70℃下加热搅拌共同溶解于有机溶剂之中，其中溶质和有机溶剂的质量体积比为15.3～16.5：80，接着升温至100～120℃后再加热回流3.5～4.5h，待冷却至室温后，在剧烈搅拌下进行醇沉直至产生大量白色絮状沉淀物，再将沉淀物抽滤出并淋洗数次，然后干燥得到PLGA与PCL的共混材料；
b)医学影像处理和建模：提取患者尿道病灶医学影像，确定患者的病灶区域，单独分离出待修复的尿道模型，通过度量患者正常部分的尿道，得到修复的目标直径，随后根据目标直径模拟重建修复模型，得到修补尿道病灶的定制化支架模型；
c)3D模板打印：采用3D打印机对步骤b)中得到修补尿道病灶的定制化支架模型进行打印，在润湿后抛光至表面光滑，再冲洗干净并干燥，得到支架模板；
d)支架制备：将步骤a)中得到的PLGA与PCL的共混材料溶于有机溶剂中，溶质和有机溶剂的质量体积比为3.5～4.5：25，再将步骤c)中得到的支架模板浸没在PLGA与PCL的共混材料溶液中5～15s，再匀速向上提拉，待有机溶剂挥发完全后，重新进行下一次的提拉，如此重复数次直至支架模板表面形成厚度为180～220μm的PLGA与PCL的共混材料层，得到组装体，再将组装体置入35～55℃的恒温热水浴中搅拌，并不断换水，溶解掉组装体内部的支架模板，再在消毒后，得到成品。
5.如权利要求4所述的一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，催化剂为对甲苯磺酸。
6.如权利要求4所述的一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，有机溶剂为1,2-二氯乙烷。
7.如权利要求4所述的一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中，3D打印的线材为PVA线材，逐层打印的层厚度为0.10～0.14mm，填充度为55～65％。
8.如权利要求4所述的一种生物可降解组织工程尿道支架的制备方法，其特征在于：所述步骤d)中，有机溶剂为二氯甲烷。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112694724A (zh) * 2020-12-08 2021-04-23 上海浦景化工技术股份有限公司 一种适用于3d打印的可降解线材
CN113244460A (zh) * 2021-04-29 2021-08-13 南开大学 一种促进组织再生的取向微通道支架及其制备方法
CN114191612A (zh) * 2021-12-23 2022-03-18 南开大学 一种孔结构可控的细胞外基质支架制备方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIFAN XU等: "Biodegradable Scaffolds for Urethra Tissue Engineering Based on 3D Printing", 《ACS APPL. BIO MATER.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112694724A (zh) * 2020-12-08 2021-04-23 上海浦景化工技术股份有限公司 一种适用于3d打印的可降解线材
CN113244460A (zh) * 2021-04-29 2021-08-13 南开大学 一种促进组织再生的取向微通道支架及其制备方法
CN114191612A (zh) * 2021-12-23 2022-03-18 南开大学 一种孔结构可控的细胞外基质支架制备方法及应用

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