CN111433349A - 用于急性肝胰腺坏死病的控制的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

通常，本发明技术涉及用于动物系统中疾病控制的新策略。具体地，本发明技术涉及用于生物控制水生系统中的病原体的新颖方法、系统和组合物。具体地，本发明可以包括用于对水产养殖系统中影响虾的传播疾病的病原体进行生物控制的新颖技术、系统和方法。

Description

用于急性肝胰腺坏死病的控制的系统和方法
本申请要求以下项的权益和优先权：2017年8月7日提交的美国临时专利申请No.62/541,824，标题为“Systems and Methods for the Control of AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease A/K/A Early Mortality Syndrome”；2018年4月2日提交的国际PCT申请No.PCT/US18/25766，标题为“Novel System for the Biocontrolof Pathogens in Aquaculture and Other Animal Systems”；2018年5月22日提交的国际PCT申请No.PCT/US18/33976，标题为“Transbiotic Regulation of Bacterial GeneExpression”。通过引用将上述申请的整个说明书和附图整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年8月7日，名为PCT7-AF.txt，大小为12KB。
技术领域
通常，本发明技术涉及用于控制致病因子的新型转基因策略。特别地，本发明的技术可以包括通过使用表达一种或多种降低虾肠病原性弧菌的毒力/适宜性的分子的基因工程细菌来治疗和/或预防早期死亡率综合症(EMS)与死亡率敏感的生物体相关的新颖系统、方法和组合物。
本发明的技术可以包括通过引入由基因修饰的细菌递送至目标宿主的“群体猝灭”分子来破坏细菌群体感应及其相关毒力和生物膜形成的新颖系统。在一些实施方案中，本发明技术可以包括新颖的EMS控制策略，该策略包括引入配置过高效率的基因工程供体细菌菌株，并将群体淬灭分子连续传递到目标宿主/环境，从而导致细菌群体感应分子水平的下降，从而可调节EMS介导的病原体的致病状态。
本发明的技术可以进一步包括用于通过引入反义RNA(asRNA)来调节细菌基因表达的新颖系统，所述反义RNA可以破坏靶向的致病基因和/或其产物(RNA、蛋白质)的表达。在一些实施方案中，本发明的技术可以包括被配置得太高效的新型基因工程供体细菌菌株，并且连续地将病原体破坏性分子和/或asRNA多核苷酸递送至受体病原体/宿主以治疗和/或预防EMS介导的疾病状况。
背景技术
水产养殖的发展已使全球粮食生产从传统的捕捞生产方法发生了重大转变。在人口增长以及传统捕捞渔业生产缺乏增长的推动下，水产养殖业迅速发展，已成为世界粮食生产生态系统的主要组成部分。现在，水产养殖在许多新兴经济体中发挥着关键作用，因为它有潜力促进粮食生产，同时有助于减轻对鱼类资源的压力。正如联合国粮食及农业组织(粮农组织)在其《2016年世界渔业和水产养殖状况报告》中所指出的那样，水产养殖是动物蛋白生产增长最快的领域，大大超过了传统的捕捞渔业产量。例如，人口基金估计，水产养殖产量目前占人类消费海产品总产量的一半。
全球人口的增长，对海鲜的需求不断增长以及捕捞渔业对产量的限制将不可避免地导致水产养殖业继续在全球范围内扩张，并伴有疾病的发生和传播的风险。尽管世界上越来越多地依靠水产养殖作为粮食生产的主要来源，尤其是在许多发展中经济体中，传统的水产养殖系统仍面临着一些技术和生物学挑战，限制了它们的整体有效性。水产养殖系统的一个主要缺点是通常将水生动物置于高密度生产系统中。这可能会因拥挤和水质状况欠佳而造成压力，从而使疾病易于传播。特别是，水产养殖系统中的疾病暴发可能导致水生种群大量损失，导致商业水产养殖业遭受巨大的经济损失。实际上，据报道，在过去的20年中，这种疾病的爆发使水产养殖业损失了数百亿美元。
就虾类养殖而言，疾病问题尤为严重。据人口基金称，尽管全球水产养殖对虾的产量有所增加，但主要的生产国，特别是在亚洲，由于对虾病的普遍存在，产量大幅下降。这有几个原因。首先，与脊椎动物不同，虾缺乏适应性和先天性免疫反应机制的许多关键组成部分，从而阻止了许多传统的诱导或增强自然抗病性的方法。其次，大多数主要的致病病毒会引起非常低水平的持续性感染，这种感染可能在看似健康的虾类中以中等到非常高的流行率发生。大多数虾病原体是垂直传播的，疾病是大量病毒放大后暴露于各种形式的环境或生理压力的结果。压力源包括处理、产卵、水质差或温度或盐度突然变化。虾病毒也可以水平传播。一旦病毒载量高且疾病显着，感染的水平传播就伴随着疾病的传播。第三，虾通常同时或依次感染多种病毒，甚至是同一病毒的不同毒株。这一事实对水产养殖系统的诊断、检测和病原体排除提出了重大挑战。
急性肝胰腺坏死病(AHND)，也称为早期死亡综合征(EMS)，已成为对虾养殖中最具破坏性的疾病之一。EMS已严重影响了东半球和西半球的一些国家的水产养殖业，例如中国、越南、马来西亚、泰国和墨西哥。如图1所示，全球水产养殖联盟估计，由于EMS造成的亚洲虾类养殖业损失达10亿美元。在某些情况下，环境管理体系的暴发导致虾水产养殖种群的损失达到惊人的80％。EMS是由弧菌属细菌引起的，例如哈维氏弧菌和副溶血弧菌可以口服传播。这些弧菌种定居在虾的胃肠道中并产生一种毒素，该毒素引起虾的消化器官(称为肝胰腺)的组织破坏和功能障碍。EMS通常在放养后20-30天内影响幼体后虾，并经常导致高达100％的死亡率。
当前，没有可用的方法来治疗EMS。预防或治疗EMS爆发的传统策略实际上可能会加剧疾病传播。例如，对池塘底部和水进行彻底消毒以杀死可能的EMS载体的尝试实际上可能会促进EMS疾病的流行，而不是通过消除潜在的竞争性微生物种群来控制它。此外，消毒剂的使用不仅破坏了微生物成熟的系统，而且还破坏了微生物。这些方法已经显示出对治疗由发光弧菌引起的疾病(即哈维弧菌和与引起EMS的细菌密切相关的其他细菌)无效。
还进行了其他尝试来创建和分离无EMS病原体的水产养殖种群。但是，这样的努力很缓慢，并且需要大量的专业知识和诊断功能，而这些功能和功能价格昂贵，更不用说很大程度上无效了。抗生素的大规模应用已应用于虾类水产养殖，特别是在幼体和生长期的生产周期中。敏感性测试表明，引起细菌的环境管理体系已经对各种抗生素产生了抗药性。这样，使用抗生素来控制EMS已与环境和人类健康问题相关联，包括细菌抗性和疾病在水生环境中的持久性。虾可食组织中抗生素残留的积累也可能改变人类肠道菌群，并引起食物中毒或过敏问题。在其他情况下，已经尝试了其他方法，例如将免疫刺激剂或噬菌体处理用于靶向其他类型的虾类水产养殖病原体，但在商业和实践上取得的成功有限，并且对于导致EMS的病原体同样无效。
一种提出的解决方案是利用基于工程RNA的分子。例如，近几十年来已广泛探索了asRNA作为高度特异性的抗菌药物的用途。反义RNA(asRNA)技术利用RNA分子的产生，该RNA分子与靶mRNA互补并杂交。asRNA与目标mRNA杂交的结果是，mRNA无法充当蛋白质翻译的模板，因此asRNA-mRNA相互作用导致细菌中mRNA编码蛋白的水平降低或降低。此外，靶向的mRNA可被RNase水解，导致转录后基因沉默。然而，将asRNA实际应用于抗菌治疗的最大障碍之一是asRNA的生产和向感染部位的传递方式。面临的挑战是如何在很长一段时间内连续产生和输送足够数量的asRNA，以极低的成本或没有成本使病原体中的目标必需基因沉默。
关于对虾水产养殖种群中的EMS病原体进行生物防治的上述问题可能代表了长期需要有效且经济的解决方案。
如将在下面更详细讨论的，当前的发明技术克服了传统EMS病原体控制系统的局限性，同时满足了真正有效的EMS载体生物防治策略的目标。
发明概述
通常，本发明技术涉及用于动物系统疾病控制的新策略。具体地，本发明可以包括用于水生系统中的病原体的生物防治的新颖技术、系统和方法。在某些实施方案中，这可以通过向表达特定分子的宿主引入基因修饰细菌来实现，所述分子可以下调关键的靶向病原体基因和/或破坏导致例如致病性和/或生物膜形成的分子途径。本发明的技术可以进一步包括用于生物控制水产养殖系统中的毒力特异性病原体的新颖系统。该系统还可以使用新型的交叉王国机制引入工程微生物，这些工程微生物可以使用asRNA灭活病原体中的特定基因，asRNA可以破坏可抑制细菌病原体群体中群体感应和/或生物膜形成的一种或多种目的基因和/或特定分子的表达。
本发明技术的一方面可以包括通过引入工程微生物来对虾水产养殖中的细菌疾病进行生物控制的系统、方法和技术，所述工程微生物可以调节群体感应分子的浓度和/或生物利用度，作为EMS致病性的新方法。本发明的一方面包括通过使用表达一种或多种降低虾肠中病原性弧菌的致病性/适合性的分子的基因工程的肠细菌来治疗和/或预防虾中EMS的系统、方法和组合物。在一个优选的方面，本发明涉及基因工程肠虾细菌的产生，其被构造为减少虾肠中的群体传感器或自诱导剂分子，以治疗和/或预防与EMS相关的虾死亡率。
本发明的另一方面可以包括用于降低环境中的自诱导剂2(AI-2)水平、从而破坏病原体群体感应以及生物膜的产生的系统、方法和组合物。在一个优选的方面，本发明可以包括降低调节弧菌的致病状态的细菌群体感应(QS)分子的水平，这又可以是有效的EMS控制策略的一部分。例如，QS分子的自诱导剂2(AI-2类，呋喃糖基硼酸二酯)可上调弧菌的EMS发病机理。其他方面可包括通过控制另外两类QS分子来控制弧菌QS调控的基因表达，所述两类额外的QS分子包括酰化的高丝氨酸内酯(AHL)和CAI-1类的QS分子。因此，在一个优选的方面，本发明包括基因修饰的细菌的产生，其可以被构造为在能够定居虾肠以降低由病原体或其他能够QS的细菌产生的外源性AI-2水平的肠细菌中过表达来自大肠杆菌的lsr操纵子。在这个方面，QS分子的AI-2水平的降低可以减少和/或预防弧菌的EMS发病机理。
本发明的另一方面可以包括系统、方法和组合物，以降低环境中的AI-1自诱导分子水平，从而破坏病原体群体感应以及生物膜的产生。在一个优选的方面，本发明包括基因修饰的肠细菌的产生，其可以被配置为过表达以表达高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)以灭活QS分子的AHL类(Hal-1)，它也可以激活病原体基因在弧菌中的表达。
本发明还涉及基因修饰的供体细菌的利用，所述基因修饰的供体细菌可被配置为产生某些靶向于真核系统中特定细菌基因和/或其产物(RNA，蛋白质)的asRNA多核苷酸。这些asRNA多核苷酸可以抑制或减少某些基因的表达和/或引起致病剂中基因产物的损伤或降解。本发明可以包括用于控制病原性细菌，例如引起EMS的弧菌的新技术、系统和方法。
本发明技术的一个目的可以包括新颖的系统、方法和组合物，用于通过asRNA对受体致病细菌中的细菌基因表达进行转基因调控。本发明的一个实施方案可以包括在宿主中携带的供体细菌中有效表达高水平的asRNA。在某些实施方案中，该供体细菌可以是经基因工程改造以表达一种或多种异源asRNA多核苷酸的共生、内共生和/或益生菌肠或其他细菌。
本发明的另一个目的可以包括在供体细菌中产生异源asRNA，该异源asRNA可以进一步被递送至受体细菌，更具体地为引起EMS的致病细菌。这些异源asRNA多核苷酸可以靶向特定基因和它们的RNA和/或蛋白质产物，其可以是独特的和/或限于靶细菌病原体。这样的异源asRNA多核苷酸可以是完全互补的，或相对于其靶标含有错配；这两个方面都可能导致其目标降级或损害其翻译，使它们无法实现其功能。
本发明的又一个目的可以包括抑制受体细菌中靶基因的表达，从而抑制宿主真核生物中细菌的种群和/或细菌的致病活性。
本发明的另一目的可以包括产生可以编码一个或多个异源asRNA多核苷酸的一个或多个质粒和/或细菌人工染色体(BAC)。另一个目的可以包括将编码一种或多种asRNA的特定遗传元件整合到病原体的基因组中。本发明的另一个目的是通过供体细菌菌株中的组成型、诱导型、异源或同源基因启动子/终止子对产生可产生非编码RNA分子，例如上述异源asRNA多核苷酸的遗传构建体。本发明的又一个目的可以包括某些蛋白质或其他因素的共表达，其可以保护非编码RNA分子免于降解。
本发明的另一个目的可以包括开发可以产生异源asRNA多核苷酸的基因修饰的营养缺陷型细菌菌株，所述异源asRNA多核苷酸可以进一步通过纳米管更有效地递送至靶病原体。
本发明的另一个目的可以包括针对各种水生生物例如虾的新颖的生物防治策略。在一个优选的实施方案中，本发明的另一个目的可以包括用于水产养殖种群的新颖的生物防治策略。在该实施方案中，本发明的技术包括用于在水产养殖系统中生长的水生动物中敲除必需病原体基因的各种跨界机制。这可以通过将工程微生物引入表达特定异源asRNA多核苷酸的水产养殖动物种群来实现，所述特定异源asRNA多核苷酸可以下调和/或抑制所选病原体必需基因。
在一个优选的方面，本发明可以包括基因修饰的细菌的产生，其可以被配置为在弧菌中表达一种或多种靶向DNA甲基化的asRNA。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括基因修饰的细菌的产生，其可以被配置为表达一种或多种靶向弧菌DNA腺嘌呤甲基化酶dam基因的asRNA。在这一方面，asRNA被配置为在共培养期间或在宿主-病原体系统中显着抑制哈维氏弧菌中的dam表达。在该优选方面，本发明可以进一步包括通过肠细菌将病原体特异性asRNA-dam递送至感染和/或易感宿主，所述肠细菌被配置为减少虾肠副溶血弧菌中的dam表达，从而防止EMS相关的死亡率。
本发明的另一个目的可以包括靶向多个必需的细菌特异性基因靶标以沉默以及抑制QS介导的致病状态的方法，使得可以有选择地减少在水产养殖环境中生长的虾种群中引起EMS的弧菌病原体。在该实施方案中，本发明可以包括包含基因修饰的细菌的饲料的产生，所述基因修饰的细菌被配置为表达可以抑制弧菌群体中群体感应的特定群体猝灭分子，从而控制EMS。在其他方面，本发明可以包括包含基因修饰的细菌的饲料的产生，所述基因修饰的细菌被配置为表达可以靶向和抑制一个或多个弧菌病原体基因的选择的asRNA。在一个实施方案中，可以将这种处理过的饲料引入对病原体敏感或受病原体影响的群体。
在本发明的一些方面，由基因修饰的细菌表达的此类干扰RNA分子，例如asRNA和/或群体猝灭分子可以充当疫苗来免疫虾。因此，本发明的一个目的可以包括使用基因修饰的细菌来定殖和表达在针对EMS的水生动物例如在水产养殖系统中生长的虾类种群中提供个体或畜群免疫的分子。
本发明的另一目的可以是遗传修饰的共生和/或益生细菌菌株的产生，其可以表达针对引起EMS的弧菌的一种或多种群体猝灭分子和/或抑制性RNA分子。在某些实施方案中，对虾细菌的肠内或共生菌如肠杆菌属(Enterobacter sp.)进行基因修饰，以表达一种或多种针对引起EMS的弧菌的群体猝灭分子和/或抑制性RNA分子。
再其他的实施方案可以包括基因修饰的微生物，其可以包括可以进一步共表达具有加工酶活性的某些蛋白质的基因构建体。此类共表达的蛋白质可包括可抑制和/或增强抑制性RNA分子的翻译后加工和/或修饰的酶。其他类似的实施方案可以包括将微生物引入可以表达或甚至过表达可以增强抑制性RNA分子的动员的各种基因和/或可以激活可以靶向病原性途径的次级下游宿主基因的基因的靶生物。
最后，本发明人描述了本发明的实施方案，该实施方案包括用于由RNaseIII缺陷的基因修饰的细菌喂虾的方案，所述细菌表达针对引起EMS的弧菌的抑制性RNA分子。
根据下面的详细附图和描述，本发明的其他方面将变得明显。
附图简述
结合在说明书中并构成说明书一部分的附图示出了本发明的一个或多个实施例，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅出于说明本发明的一个或多个优选实施例的目的，并且不应被解释为限制本发明。
图1：示例性细菌群体感应途径。
图2：表达内酯酶AidH的群体淬灭细菌特异性地降低了哈维弧菌的发光。(A)与Ag1-pAidH的共培养减少了对所有自诱导剂都有反应的wt V.harveyi的发光。(B)与Ag1-pAidH的共培养强烈降低了仅响应AI-1的V.harveyi 117的发光。(C)与Ag1-pAidH共培养不会降低不响应AI-2的V.harveyi 118的发光。
图3：表达lsr操纵子的群体淬灭细菌特异性地降低了哈维弧菌的发光。(A)与Ag1-pLsr的共培养减少了对所有自诱导剂都有反应的wt V.harveyi的发光。(B)与Ag1-pLsr的共培养弱弱地减少了仅对AI-1产生响应的V.harveyi 117的发光。(C)与Ag1-pAidH的共培养强烈地降低了仅对AI-2作出反应的V.harveyi 119的发光。
图4：Quorum淬灭细菌特异性地减少了V.harveyi的生物膜形成。(A)与AG1-pAidH共同生长仅通过对相应内酯AI-1敏感的V.harveyi菌株减少生物膜的形成。(B)与AG1-pLuc共同生长仅通过对AI-2敏感的V.harveyi菌株减少生物膜的形成。
图5：AI-1和AI-2的消耗累计减少发光，但不减少生物膜的形成。(A)与Ag1-pAidH’、Ag1-pLsr和Ag1-pAidH-pLsr共培养对野生型V.harveyi发光的影响。(B)生物发光差异曲线说明了通过Ag1-pAidH'、Ag1-pLsr和双重构建体AG1-pAidH'pLsr猝灭群体的时间差异。(C)与Ag1-pAidH’、AG1-pLsr和AG1-pAidH’pLsr共培养对生物膜形成野生型V.harveyi的影响。
图6：定点淬灭阴沟肠杆菌菌株对弧菌攻击期间对虾的保护作用。(A-B试验1)，A，喂食Ag1-Luc、Ag1-pLsr和Ag1-pAidH细菌的虾的成活率。B，感染后12小时的总死亡率计数。(C-D试验)C，喂食Ag1-Luc、Ag1-pLsr、Ag1-pAidH和Ag1-pLsr-AidH细菌的虾的成活率。D，感染后120小时的总死亡率计数。
图7：喂食定肠肠杆菌的虾猝灭菌株在副溶血弧菌肠道中的毒力基因表达。(A)Mam7表达水平；(B)Pir样毒素表达水平。
图8：表达阴沟肠杆菌的asRNA-dam对弧菌攻击期间对虾的保护作用。A-B试验1，A，用Ag1-Luc(对照)或Ag1-asRNA-dam喂养的虾的成活率。B，感染后5天的总死亡率计数。C-D试验2。C，由Ag1-Luc(对照)或Ag1-asRNA-dam喂养的虾的成活率。B，感染后5天的总死亡率计数。
图9：由表达asRNA-dam的肠杆菌喂养的虾肠中的副溶血弧菌中的毒力基因表达。(A)Mam7表达水平；(B)类pir毒素表达水平。
图10：假想弧菌中mam7基因启动子的假想位置和Dam靶序列在mam7基因上游的位置。
图11A-C：这项工作中使用的质粒图谱。质粒设计在“材料和方法”部分中进行了描述。用于克隆pAidH和pLsr质粒的基因的序列，在下面序列表的部分下列出。
图12：在基因修饰的细菌中表达的asRNA的示意图。
图13：哈维氏弧菌中的群体感应。LuxM、LuxS和CqsA酶分别合成自诱导剂HAI-1、AI-2和CAI-1。这些自诱导剂分别在细胞表面被LuxN、LuxP-LuxQ和CqsS受体蛋白检测到。A.在低信号分子浓度下，受体自磷酸化并通过LuxU将磷酸盐转移至LuxO。磷酸化激活LuxO，LuxO与s54一起激活小调节RNA(sRNA)的产生。这些sRNA与伴侣Hfq一起使编码反应调节因子LuxRVh的mRNA不稳定。因此，在没有自诱导剂的情况下，不会产生LuxRVh蛋白。B.在高浓度的自诱导剂存在下，受体蛋白从激酶转换为磷酸酶，这导致LuxO的去磷酸化。去磷酸化的LuxO是无活性的，因此不会形成sRNA，并且会产生应答调节剂LuxRVh。
图14：asRNA阻断dam基因表达的潜在作用。起点/DnaA启动子区域甲基化的减少导致DNA复制调节环的破坏和弧菌细胞分裂的抑制。Dam表达的抑制通过未知机制抑制生物膜形成，所述机制可能包括对特定基因启动子的转录抑制，导致细胞生长减慢。
发明详述
本发明包括多个方面，这些方面可以以不同方式组合以大体上描述与控制和治疗急性肝胰腺坏死病A/K/A早期死亡综合症(EMS)有关的新颖系统、方法和组合物。提供以下描述以列出元件并描述本发明的一些实施例。这些元素与初始实施例一起列出，但是应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建另外的实施例。各种描述的示例和优选实施例不应解释为将本发明限制为仅明确描述的系统、技术和应用。此外，该描述应被理解为支持并涵盖在本申请或任何后续申请中具有任意数量的所公开元素、每个要素单独使用、以及所有要素的任何以及所有各种排列和组合的所有各种实施例、系统、技术、方法、设备和应用的描述和权利要求。
本发明可以包括用于抑制群体感应(QS)、QS介导的发病机制以及靶病原细菌中生物膜形成的系统、方法和组合物。(见图1)。通常，QS描述了与细菌种群密度相关的刺激和反应系统。群体感应可以使细菌不断产生低分子量信号分子并将其排泄到周围环境中，这些分子通常称为自诱导剂(AI)。随着细菌数量的增加，AIs的浓度也会增加。在限定的AI浓度阈值下，细菌群体可能会表达同步的AI特异性反应-通常是表型，例如毒力、光产生或生物膜形成，当由一组细胞而不是单个细菌部署时，这种方法会更有效。这种群体感应反应可以极大地增强细菌病原体的毒力基因表达，并使细菌(如细菌生物膜)更难以通过抗生素或其他化学手段阻止微生物的生长。
在一个实施方案中，本发明可以包括一种分离的表达载体，例如被配置为在基因修饰的细菌中表达的质粒，该质粒可以进一步表达一种或多种异源多肽，该多肽主动地将AI从周围环境转运回到基因修饰的细菌中。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括一个或多个分离的表达载体，例如被配置为在细菌中表达的质粒，所述细菌可以进一步表达异源的lsr操纵子，优选来自示例性生物大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌。如上所述，lsr操纵子编码一个ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和相关的伴侣，这些伴侣将AI-2主动泵入细菌细胞。通过这样做，周围环境中的AI-2浓度降低了，在某些情况下降低到接近零的浓度，从而防止了QS介导的许多病原细菌(如弧菌)中病原状态的激活。
本发明进一步包括新颖的系统、方法和组合物，以降低其他水生环境的水产养殖中的AI-2水平，从而降低和/或治疗虾中的EMS。在一个特定的实施方案中，该新颖的系统可以包括在虾肠中的肠细菌中异源lsr操纵子的过表达。示例性肠细菌可包括鼠伤寒沙门氏菌，以及肠杆菌属，例如Ag1。在一个实施方案中，通过lsr操纵子的过表达，可以将AI-2主动转运回细菌细胞，从而可以充分降低靶环境中的AI-2浓度以防止QS介导的致病状态激活。
在另一个实施方案中，可以对诸如Ag1的肠细菌进行基因修饰以表达和/或过表达来自细菌染色体的异源lsr操纵子。这些经基因修饰的细菌可以例如通过注入细菌的饲料或通过将细菌直接递送到例如池塘或其他水产养殖环境中的虾种群而引入到虾或其他水产养殖或水生生物中。一旦永久和/或短暂地定居在虾肠中，经基因改造的肠细菌可能会表达和/或过表达异源lsr操纵子，这反过来会产生上述ABC转运蛋白和相关的伴侣蛋白，可将AI-2主动转运回细菌细胞，从而可以显着降低培养基中的浓度，从而防止QS介导的病原细菌中致病状态的激活。
本发明进一步包括新颖的系统、方法和组合物，以降低其他水生环境的水产养殖中的AI-2水平，从而降低和/或治疗虾中的EMS。在一个特定的实施方案中，该新颖的系统可以包括在基因修饰的肠细菌中异源lsr操纵子的过表达，所述肠细菌可以例如通过注入细菌的虾饲料或将细菌直接递送到例如池塘或其他水产养殖环境中的虾种群。如上所述，肠细菌的非限制性实例可包括鼠伤寒沙门氏菌，以及肠杆菌属，例如Ag1，或增强虾生长的其他益生菌。异源lsr操纵子编码ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和相关的伴侣蛋白，可将AI-2主动转运至基因修饰的细菌细胞中，从而可以显着降低培养基中的浓度，从而防止QS介导的EMS中致病状态的激活导致引起弧菌，该弧菌可以配置为对自诱导分子，尤其是AI-2作出反应。更具体地，可以减少和/或消除QS分子AI-2的细胞外储库，从而防止QS表型(例如生物膜)的形成以及QS介导的弧菌和其他病原体物种中EMS致病性基因的激活和表达。
在一个实施方案中，一种或多种虾共生、内共生和/或益生菌的基因修饰菌株可以包含一种或多种可能导致异源lsr操纵子过表达的遗传构建体。在该实施方案中，可以将转基因肠细菌引入目标虾或水产养殖虾种群，并成为宿主天然微生物组的一部分。lsr操纵子的过表达可能会导致ABC转运蛋白和相关伴侣蛋白的数量增加，这些蛋白会主动将EMS病原体(如本文鉴定的各种弧菌)产生的AI-2转运到基因修饰的肠细胞中，从而抑制QS，以及此类弧菌病原体物种的生物膜形成。
在一个优选的实施方案中，过表达异源lsr操纵子的基因修饰的共生细菌、共生共生细菌和/或益生菌可以在虾的肠道或其他部位定居。在这个实施方案中，一旦定居在宿主中，基因修饰的细菌的垂直传播就可以传递到宿主的后代，从而自然地将病原性QS和生物膜抑制作用复制到后代。另外，基因修饰的细菌也可以通过脱落而将修饰的细菌分布到环境中，从而水平地传播到整个宿主种群。这种特征可以允许将修饰的细菌一次性和/或定期施用到宿主和/或宿主的环境，从而产生显着的商业、技术和成本优势。
在另一个实施方案中，定植的细菌可以过表达lsr操纵子，已经成为宿主天然微生物组的一部分，可以连续表达ABC转运蛋白和相关的伴侣蛋白，将由EMS病原体产生的AI-2主动转运回定殖的基因修饰的细菌中，例如，从最早的幼虫阶段到成年阶段，通过肠道或其他区域的弧菌会阻止QS介导的EMS在宿主整个生命周期中的发病。这样，这种基因修饰的细菌可以充当AI-2分子的分子库。此外，由于肠道细菌载体可能是宿主微生物组中本来已经存在的一部分，因此其存在可能不会对生物体、环境或最终消费者构成任何风险。
本发明的技术可以进一步包括控制目标宿主中异源lsr操纵子表达的水平和时间的方法和技术。在一个优选的实施方案中，异源lsr操纵子的表达可以在诱导型启动子或其他新基因开关的控制下。基因转换可以由转换分子控制，转换分子可以是水溶性的食品级分子，可以添加到宿主生物的环境或食物供应中。该开关分子的存在可以激活异源lsr操纵子的表达和/或过表达。不存在可能会阻止或减少异源lsr操纵子的表达。
该实施方案可以在遗传构建体中证明，其可以包括其他转录调控元件，例如启动子、终止子、共激活子和共阻遏物，以及可以调控异源lsr操纵子的表达和/或过表达的其他调控元件。这样的系统可以允许控制系统内表达的lsr操纵子蛋白的时间和数量。另外的实施方案可以包括可以通过另外的外部和/或环境因素，例如特定蛋白质或化合物的存在，例如响应病原体而产生的应激相关蛋白质，或者甚至是由病原体等产生的蛋白质和其他前体化合物。
本发明可以包括用于向EMS易感生物和/或种群，优选在水产养殖环境中生长的水生生物，引入基因修饰的细菌，优选表达异源lsr操纵子的肠细菌的系统、方法和组合物。在该实施方案中，定植的细菌可能过表达lsr操纵子，并已成为宿主天然微生物组的一部分，并且可以连续表达ABC转运蛋白和相关伴侣蛋白，它们主动通过肠道或其他区域运输由EMS病原体(如弧菌)产生的AI-2，从而为人群提供了针对EMS(最好是弧菌介导的EMS)的预防性保护。
在优选实施方案中，示例性lsr操纵子可被鉴定为SEQ ID NO.2或与其具有70％至99％的同源性的序列。在该实施方案中，lsr操纵子可以是表达盒的一部分，并且可以进一步与启动子可操作地连接。
本发明可以包括用于通过抑制细菌QS来抑制致病性和在靶病原细菌中形成生物膜的系统、方法和组合物。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括用于抑制/灭活自诱导剂-1分子(AH-1)的系统、方法和组合物。在该优选实施方案中，可以对内共生、共生和/或益生菌进行基因修饰，以表达和/或过表达一种或多种使AI-1分子，特别是AHL类(Hal-1)QS分子失活的异源酰化高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)。这种异源AHL内酯酶的表达可以进一步抑制致病性基因在一种或多种EMS引起的弧菌中的表达。在一些实施方案中，AHL的减少可以减少水产养殖环境或其他自然环境(例如可以充当虾感染的阶段大门的池塘和湖泊)中的弧菌细菌库。
在一个实施方案中，本发明可以包括分离的表达载体，例如被配置为在细菌中表达的质粒，该细菌可以进一步表达一种或多种抑制QS和/或生物膜产生以及致病性基因表达的异源多肽，优选通过抑制/灭活QS分子的AHL类(Hal-1)。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括和一个或多个分离的表达载体，例如被配置为在细菌中表达的质粒，该细菌可以进一步表达异源AHL内酯酶，优选地来自Ochrobactrum。
如上所述，表达AHL内酯酶的细菌可降低致病性弧菌的毒力/适应性。在虾上。因此，本发明进一步包括抑制其他水生环境的水产养殖中的弧菌物种的QS、生物膜形成和致病性/适应性并因此减少和/或治疗虾中EMS的新颖系统、方法和组合物。在一个特定的实施方案中，该新颖的系统可以包括异源AHL内酯酶的过量表达，例如在虾肠中肠细菌中的aidH。示例性肠细菌可包括鼠伤寒沙门氏菌以及肠杆菌，如Ag1。aidH基因编码一种水解蛋白，该蛋白通过失活QS分子的AHL类(Hal-1)来干扰QS介导的功能，从而阻止QS介导的细菌(优选为引起EMS的弧菌)中病原体的激活。
在另一个实施方案中，可以对诸如Ag1的肠细菌进行基因修饰以表达和/或过表达异源的aidH基因。可以例如通过注入细菌的饲料将该基因修饰的细菌引入虾或其他水产养殖或水生生物中。一旦永久和/或短暂地定居在虾肠中，经基因改造的肠细菌可能会表达和/或过表达异源aidH基因，从而导致上述QS分子的AHL类(Hal-1)失活，从而抑制QS介导的细菌致病状态的激活。
本发明还包括新颖的系统、方法和组合物，以减少其他水生环境的水产养殖中的活性AI-1活性，从而减少和/或治疗虾中的EMS。在一个特定的实施方案中，该新颖的系统可以包括在遗传修饰的肠细菌中过表达异源aidH基因，所述肠细菌可以例如通过注入细菌的虾饲料引入到虾的肠中。如上所述，肠细菌的非限制性实例可包括鼠伤寒沙门氏菌，以及肠杆菌属，例如Ag1。异源aidH基因编码在环境中使AI-1失活的多肽，该多肽可以防止QS介导的EMS中致病状态的激活，从而引起弧菌，该弧菌可以被配置为对自诱导分子，特别是AI-1作出反应。更具体地，可以减少和/或灭活QS分子AI-1的细胞外储库，以防止形成诸如生物膜的QS表型、以及QS介导的弧菌和其他病原体物种中EMS致病性基因的激活和表达。
在一个实施方案中，一种或多种虾共生、内共生和/或益生菌的基因修饰菌株可以包含一种或多种可能导致异源aidH基因过表达的遗传构建体。在该实施方案中，可以将转基因肠细菌引入目标虾或水产养殖虾种群，并成为宿主天然微生物组的一部分。aidH基因的过度表达可能导致由EMS病原体(例如本文鉴定的各种弧菌)产生的AI-1类QS介体失活，从而抑制QS以及此类弧菌病原体物种中的生物膜形成。
在一个优选的实施方案中，过表达异源aidH基因的基因修饰的共生细菌、共生共生细菌和/或益生菌可以在虾的肠或其他部分定居。在这个实施方案中，一旦定居在宿主中，基因修饰的细菌的垂直传播就可以传递到宿主的后代，从而自然地将病原性QS和生物膜抑制作用复制到后代。另外，基因修饰的细菌也可以通过将其作为废物分布到环境中而水平地传播到整个宿主种群。这种特征可以允许将修饰的细菌一次性和/或定期施用到宿主和/或宿主的环境，从而产生显着的商业、技术和成本优势。
在另一个实施方案中，定植的细菌可以过表达异源aidH基因，已经成为宿主天然微生物组的一部分，并且从最早的幼虫阶段到成年阶段，通过肠道或其他区域持续抑制由EMS病原体(如弧菌)产生的AI-1，从而在宿主的整个生命周期中阻止QS介导的EMS发病机理。此外，由于肠道细菌载体可能是宿主微生物组中本来已经存在的一部分，因此其存在可能不会对生物体、环境或最终消费者构成任何风险。
本发明的技术可以进一步包括控制目标宿主中异源aidH基因表达的水平和时间的方法和技术。在一个优选的实施方案中，异源aidH基因的表达可以在诱导型启动子或其他新基因开关的控制下。基因转换可以由转换分子控制，转换分子可以是水溶性的食品级分子，可以添加到宿主生物的环境或食物供应中。该开关分子的存在可以激活异源aidH基因的表达和/或过表达。它的缺乏可能阻止或减少异源aidH基因的表达。
该实施方案可以在遗传构建体中得到证明，该遗传构建体可以包括其他转录调控元件，例如启动子、终止子、共激活子和共阻遏物，以及可以调控异源aidH基因的表达和/或过表达的其他调控元件。这样的系统可以允许控制系统内表达的aidH基因蛋白的时间和数量。另外的实施方案可以包括可以通过另外的外部和/或环境因素，例如特定蛋白质或化合物的存在，例如与响应病原体产生的应激相关蛋白，甚至由病原体产生的蛋白和其他前体化合物等。
本发明可以包括用于向EMS易感生物和/或种群，优选在水产养殖环境中生长的虾，引入基因修饰的细菌，优选地表达表达异源aidH基因的肠细菌的系统、方法和组合物。在该实施方案中，定殖的细菌可以过量表达已经成为宿主天然微生物组一部分的aidH基因，并且可以通过肠或其他区域持续抑制由EMS病原体(如弧菌)产生的AI-1，从而为人群提供了针对EMS(尤其是由弧菌介导的EMS)的预防性保护。
在一个优选的实施方案中，示例性的异源AHL内酯酶可以包括来自O曲霉的被鉴定为SEQ ID NO.1或具有70％至99％同源性的序列的aidH基因。在该实施方案中，异源aidH可以是表达盒的一部分，并且可以进一步与启动子可操作地连接。
本发明的技术可以包括通过选择性灭活病原性、必需或其他靶基因来控制特定细菌或其他病原体的毒力的系统和方法。这种靶向的基因失活可以通过将异源asRNA分子从供体细菌表达和递送至目标宿主病原体来实现。在一个优选的实施方案中，可以对一种或多种供体细菌种类或菌株进行基因工程改造，以表达异源asRNA分子，所述异源asRNA分子可以在靶标致病剂，优选为EMS致病剂中起到调节和/或抑制基因表达的作用。
在某些实施方案中，asRNA可包括非编码单链RNA分子，其可表现出与从靶基因转录的特定信使RNA(mRNA)链的互补关系。另外的实施方案可以包括相对于其靶mRNA具有一个或多个错配的asRNA。无论mRNA与asRNA之间的同源性如何，在该实施方案中，asRNA可以与互补mRNA物理配对并结合。这种互补结合可以通过碱基配对RNA分子来抑制互补mRNA的翻译，从而在物理上阻碍或在空间上阻碍翻译机制。
应当注意，当提及asRNA是互补的时，这意味着用于反义抑制的多核苷酸可以对应于编码靶多肽的序列的全部或部分互补序列、靶多肽转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分互补序列、或编码靶多肽的转录本的编码序列和非翻译区的全部或部分互补序列。另外，反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即，与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即，与靶序列的互补序列小于100％相同)。
反义抑制可用于抑制同一细胞中多种蛋白质的表达。此外，部分反义核苷酸可用于破坏靶核酸分子的表达。通常，可以使用至少10个核苷酸、20个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、500、550、500、550或更大以及它们之间的任何数量的反义序列。该序列可以与信使RNA的任何序列互补，即，其可以在5'末端或加帽位点附近，在加帽位点下游，在加帽位点和起始密码子之间，并且可以覆盖非编码区的全部或一部分，可以桥接非编码和编码区，与全部或部分编码区互补，与编码区的3'末端互补，或与mRNA的3'非翻译区互补。
反义序列可以与独特序列或重复序列互补，从而提高结合的可能性。因此，反义序列可涉及独特序列，重复序列的单个单元或重复序列的多个单元的结合。制备反义核酸分子的方法是本领域公知的。
这样，在某些实施方案中，本发明可以包括抑制疾病致病剂，更优选EMS致病剂的核酸分子表达的系统、方法和组合物。当涉及抑制靶基因的表达时，是指核酸分子的表达被抑制、破坏或以其他方式受到干扰，从而保护目标宿主免受疾病侵害。抑制靶基因的表达通常还可以指被抑制、破坏或以其他方式受到干扰的核酸分子的翻译，从而保护真核受体或目标宿主免受疾病侵害。抑制靶基因的表达也可能意味着核酸分子(例如asRNA多核苷酸)的表达抑制，破坏或以其他方式干扰病原体中必需基因的表达或翻译，从而使真核受体或目标宿主的感染率、传播率、病原体负荷或疾病症状比野生型(WT)宿主低。
如上所述，在一个实施方案中，本发明可包括在EMS致病剂中使用与靶基因的核酸分子互补的asRNA。在一个优选的实施方案中，可以对供体细菌进行基因修饰以表达异源asRNA。该表达可以是表达载体的一部分，并且可以是表达盒的一部分，并且可以进一步与表达控制序列可操作地连接。可以将这种基因修饰的供体细菌引入目标宿主并表达可以从供体细菌输出并被吸收到靶EMS致病剂中的靶异源asRNA，该靶EMS致病剂在该实施方案中可以是病原细菌。异源的asRNA，被传递到病原性弧菌中，可能会阻止目标核酸分子编码的蛋白质的正常表达。这可能会干扰EMS致病剂的生命周期、复制能力和/或致病性，从而提供有效的抗菌剂递送系统。在该实施方案中，供体细菌可以是共生细菌菌株，其可以在目标宿主中持续存在并提供异源asRNA的连续表达，从而在宿主靶中提供持续的产生以对抗EMS致病剂。在另外的实施方案中，供体细菌可以是益生菌或类似益生菌的细菌，其可以在目标宿主中持续存在并且在有限的时间段内表达异源asRNA并将其传递给受体细菌病原体。以这种方式，目标宿主多次暴露于益生菌或类似益生菌的细菌可以有效地递送异源asRNA，但不能永久地持久存在于目标宿主内。
在另一个优选的实施方案中，可以将遗传修饰的供体细菌引入尚未暴露于EMS致病剂的目标宿主，并且可以表达可从供体细菌输出到目标宿主的细胞和/或细胞内环境中的靶异源asRNA。递送至受体宿主的异源asRNA可以作为预防性治疗，这样，当将诸如致病性弧菌的目标EMS致病因子引入目标宿主时，异源asRNA会阻止由靶向核酸分子，并可能阻止EMS致病剂定植或影响目标宿主的能力。在该实施方案中，供体细菌可以是共生细菌菌株，其可以在目标宿主中持续存在并提供异源asRNA的连续表达，从而在宿主中提供持续的预防性疫苗生产，从而赋予EMS致病剂一定程度的免疫力。
另外的实施方案可以包括一个或多个靶基因的asRNA诱导的基因失活。例如，在一个优选的实施方案中，基因失活可以针对毒力、外壳蛋白、代谢活性、感染途径和/或能量产生等必不可少的一种或多种病原体基因。虽然以示例性模型提供，但靶基因可能包括一个或多个基因，这些基因负责细菌的致病性或引起宿主疾病的能力。
在一个实施方案中，本发明可以包括在EMS致病因子中鉴定靶基因。在该优选实施方案中，靶基因可包括EMS致病因子的必需基因，这意味着抑制、破坏或干扰一种或多种必需基因的表达和/或翻译会导致EMS致病菌数量减少、EMS致病菌致病性降低、EMS致病试剂的生命周期中断、在真核宿主中定植的能力、在宿主中逃避特定或普遍的免疫反应或导致疾病的能力。
在一个实施方案中，针对EMS致病因子中待表达或抑制的核酸序列(靶核酸分子或靶基因)的异源asRNA可以表达、抑制或与任何这样的靶核酸分子竞争结合位点，当给予这些靶核酸分子时，导致对真核宿主的保护免受致病因子的影响。
根据本发明的一个方面，提供了一种控制病原体感染的生物的方法，该方法包括向目标宿主生物给药，该宿主生物在一个优选的实施方案中可以包括水生生物，该核酸试剂包括一种核酸序列，该核酸序列包括：特异性下调至少一种必需靶病原体基因产物的表达，其中在目标宿主中至少一种必需靶标病原体基因产物的表达下调，使目标宿主免受病原体引起的疾病状态的影响。
在一个优选的实施方案中，这种核酸剂可包括鉴定为SEQ ID NO.4的asRNA多核苷酸，或其同源物和/或直系同源物，或具有70％-99％同源性的其他序列。另外的实施方案可以包括跨越引起EMS的病原体的各种菌株的基本靶基因之间的大于平均同源性的区域的任何核酸。一个优选的实施方案可以包括跨越比弧菌的各种菌株的基本靶基因之间具有大于平均同源性的区域的任何核酸。在引起EMS的引起弧菌的病原体的例子中，如下文一般所示，这可以包括编码鉴定为SEQ ID NO.4的dam基因的区域。如其他地方所述，dam是弧菌中的必需基因，并参与基因表达的调节。Dam还参与了许多引起EMS的细菌中毒力途径的调节。
在一个优选的实施方案中，本发明可以包括一种或多种经遗传工程改造的Ag1细菌，其被构造成将一种或多种asRNA分子递送至宿主生物中的病原细菌。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括一种或多种经遗传工程改造的细菌，其被构造成递送一种或多种鉴定为SEQ ID NO.3或其具有70％至99％同源性的序列的asRNA分子，用于抑制dam基因表达，或在水生宿主生物(例如虾或其他通常通过水产养殖饲养的生物)中引起EMS的致病细菌中被鉴定为SEQ ID NO.3或其具有70％至99％同源性的序列。
在另一个优选的实施方案中，当前的发明技术可以将该技术扩展到共生微生物，所述共生微生物在宿主的组织、后代和/或卵的整个发育过程中和成年阶段都持续存在。以这种方式，经遗传修饰的微生物可以连续地产生和递送asRNA分子以靶向病原体，例如引起EMS的弧菌。这可以用于在已经感染的宿主中治疗EMS疾病，和/或免疫易感宿主。
本发明可以进一步包括一种或多种用于抑制多种病原体基因表达的载体，其中所述载体包含一种或多种可以对应于一种或多种选择的病原体基因的异源asRNA多核苷酸。该实施方案可以包括质粒表达系统的使用。在一些实施方案中，该质粒可以具有一个或多个表达盒，包括：至少一个基因抑制盒，其包含与表达控制序列可操作地连接的多核苷酸，其中该多核苷酸编码异源asRNA分子，其被配置为减少靶病原体基因的表达，如本文一般所述。
本发明的一个优选实施方案包括用于调节多种病原体基因的载体，其中包含一个或多个asRNA的载体可以对应于一个或多个选择的宿主基因。该实施方案可以包括质粒表达系统的使用。在一些实施方案中，该质粒可以具有一个或多个表达盒，包括：至少一个基因抑制盒，其包含与表达控制序列可操作地连接的多核苷酸，其中多核苷酸编码异源asRNA分子，其被配置为减少靶病原体基因的表达，如本文一般所述。
本发明还包括用于抑制宿主中引起EMS的试剂基因表达的载体，其中所述载体包含至少一个基因抑制盒，所述基因抑制盒包含与表达控制序列可操作连接的多核苷酸，该多核苷酸编码一个减少靶病原体基因表达的asRNA分子。在一个实施方案中，编码asRNA的多核苷酸包含SEQ ID NO.3的核苷酸序列。用于基因抑制盒的合适启动子的实例包括但不限于Pupp、T7启动子、bla启动子、U6启动子、pol II启动子、Ell启动子和CMV启动子等。任选地，基因促进盒和基因抑制盒的每个启动子序列可以是诱导性的和/或组织特异性的。
在其他方面，本发明包括施用治疗有效量的一种或多种如上所述一般表达异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的基因修饰的供体细菌。在一个实施方案中，该治疗有效量可以是细菌的量，或者是供体基因修饰的细菌表达的异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭剂分子的量，其可能被运出供体并被目标弧菌病原体吸收以改善、减少或消除疾病状况(最好是EMS)，和/或所述群体猝灭剂分别抑制GQ介导的致病性。在一个优选的实施方案中，asRNA和一种或多种群体猝灭剂可以如本文一般描述的共表达。
在另一个实施方案中，该治疗有效量可以是基因修饰细菌的量，或者是供体基因修饰细菌表达的异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭剂分子的量，其可以被运出供体，使得宿主对后来引入的引起EMS的弧菌病原体的感染抵抗力增强。
在另一个实施方案中，该治疗有效量可以是可以通过垂直和/或水平转移在目标宿主群体内定植或成为地方病的基因修饰的供体细菌的量。
在一个实施方案中，本发明可包括施用治疗有效量的基因修饰细菌的方法，所述基因修饰细菌被表达以表达异源asRNA多核苷酸，所述异源asRNA多核苷酸可以靶向弧菌中与DNA甲基化有关的必需靶基因。在优选的实施方式中，该靶基因可包括SEQ ID NO.4或其中具有70％至99％同源性的序列。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于调节弧菌或其他细菌病原体中的DNA甲基化的方法。在该实施方案中，该方法可以包括施用治疗有效量的基因修饰的细菌的步骤，该基因被修饰以表达异源asRNA多核苷酸，该多核苷酸可以靶向弧菌中与DNA甲基化有关的必需靶基因。在一个优选的实施方案中，该靶基因可包括SEQ ID NO.4或其中具有70％至99％同源性的序列。
在一个实施方案中，本发明可以包括施用治疗有效量的基因修饰的细菌的方法，所述基因修饰的细菌被配置成表达异源asRNA多核苷酸，其可以靶向弧菌中与DNA甲基化有关的必需靶基因，并且其中所述asRNA可以被鉴定为SEQ ID NO.3或其中具有70％至99％同源性的序列。
本发明的替代实施方案可以包括新颖的体外和/或体内方法，以选择可以在病原体基因抑制的有效系统中使用的共生细菌。特别地，本发明的另一个目的可以包括一种新颖的体外和/或体内方法，以选择可以在有效的病原体基因抑制系统中使用的共生宿主细菌。这些共生宿主细菌在人类中可能是非致病性的，并且进一步具有可培养性，可转化性，质粒动员，并且能够分泌靶核酸(例如asRNA等)，在宿主种群中是地方性的或能够成为地方性的、可分散的，例如通过雾化，能够在环境中生存并且优选在生活的所有阶段被宿主食用或摄取。
在另一方面，本发明包括产生本发明载体的方法。在另一方面，本发明包括用于产生本发明的转化的或遗传修饰的微生物的方法，例如通过用重组质粒转化来产生的方法。
本发明的另一个实施方案可以包括被配置为表达本发明一些实施方案的异源核酸试剂例如asRNA或核酸构建体例如质粒的细胞，例如遗传修饰的微生物。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括基因修饰的细菌，其被配置为表达异源的asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子。
本发明的另一个实施方案可以包括细胞，其包含本发明一些实施方案的分离的核酸试剂，例如asRNA或群体猝灭分子，或核酸构建体，例如质粒，其中所述细胞选自由细菌细胞、藻类细胞、共生细菌和水表面微生物细胞组成的组。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明一些实施方案的细胞的可摄入化合物。
在另一个优选的实施方案中，可以修饰细菌的种类或菌株以产生可以与弧菌中编码DNA腺嘌呤甲基化酶(Dam)的mRNA互补的asRNA。这些修饰的细菌可以包括作为虾的正常菌群一部分的菌株或物种，和/或与诸如虾或其他水生生物的目标宿主共生和/或内共生的菌株。引入后，这些基因改造细菌可能会被虾吸收并成为正常菌群的一部分。
在该实施方案中，鉴定为SEQ ID NO.1的asRNA可以在供体细菌如大肠杆菌或肠杆菌菌株如Ag1中表达，并且可以抑制dam或其他必需基因在目标宿主中的弧菌中的表达。在另一个实施方案中，在供体细菌中表达的被鉴定为SEQ ID NO.1的asRNA-Dam，其鉴定为SEQID NO.4，其可以减少引起EMS的弧菌适应性，并且还产生生物膜形成或发病机理的明显下降。如在完全并入的PCT申请No.PCT/US18/33976中发现的观察结果所表明的，弧菌适应性的降低可能与受体弧菌细胞中Dam表达的降低直接相关：1)弧菌DNA的甲基化程度降低了30％与表达asRNA-Dam的细菌共培养时；2)弧菌复制起点oriC和dnaA启动子(DNA复制起始中的关键元件)的甲基化程度比未暴露于表达asas-Dam的细菌的对照少2倍；3)弧菌dam基因的表达也相对于对照降低了2倍；4)弧菌dnaA基因的表达相对于对照降低了3倍；5)当暴露于模型动物生物体中表达asRNA-Dam的肠杆菌Ag1时，弧菌dam基因的表达可能降低6倍。这样的结果证明了本发明通过有针对性地将asRNA从供体中产生和递送到宿主生物体中来控制疾病和生物膜产生的能力。
如上所述，异源asRNA或群体猝灭分子的递送可以通过引入遗传修饰的宿主特异性供体微生物，例如肠、内生、共生和/或内共生细菌来实现。这类经过基因修饰的宿主特异性微生物可能包括：1)作为目标病原体正常内部或外部细菌微生物组一部分的微生物；2)经修饰能够在目标宿主、组织、细胞或宿主环境中定殖的微生物；3)被目标宿主用作食物或能源的微生物；或4)在益生菌或类似益生菌的微生物、特定动物、植物、组织、细胞或宿主环境中，经过修饰可在目标宿主中定植或暂时保留的微生物。如上所述，在一个优选的实施方案中，异源asRNA供体细菌可包括大肠杆菌，以及来自肠杆菌属的细菌，例如本文所述的Ag1。
在一个优选的实施方案中，供体细菌可以用人工产生的遗传构建体转化，例如可以产生异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的质粒。在某些情况下，可以通过缀合和其他方式将这样的质粒构建为可转移至其他细菌，这可以允许构建体的广泛分布。在某些实施方案中，在递送异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的供体细菌中的组成型、诱导型、异源或同源基因启动子/终止子对的控制下，可以在质粒和/或BAC上编码asRNA分子和/或群体猝灭分子。在另一个实施方案中，可以将用于产生异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的遗传构建体整合到递送或宿主细菌的细菌基因组中。
在另一个优选的实施方案中，一个或多个异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子可以通过可以自然定殖在宿主上或被构造成定殖在宿主上的基因修饰的供体细菌被递送到目标动物宿主/种群。然后，在一个优选的实施方案中，供体细菌可以将表达异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的基因构建体传播到周围环境中的天然存在的宿主微生物和/或病原细菌。在这个实施例中，一旦定居在目标宿主中，修饰细菌的垂直传播可能会传递到宿主的后代，从而自然地将病原细菌的抗性复制到后代。另外，经过修饰的细菌也可以通过将经修饰的细菌作为废物分配到环境中而整体上水平地传播到宿主群体。这样的特征可以允许将基因修饰的细菌一次性或至少定期地施用于宿主和/或宿主的环境，从而产生显着的商业优势。
本发明的技术可以进一步包括控制供体细菌中异源asRNA多核苷酸表达的水平和时间的方法和技术。在一个优选的实施方案中，一种或多种异源asRNA多核苷酸的表达可以在新型基因开关的控制下。这种基因转换可以由转换分子控制，转换分子可以是水溶性的食品级分子，可以添加到宿主生物的环境或食物中。该开关分子的存在可以激活例如异源asRNA产生。在没有它的情况下，可能不会发生asRNA的产生，或者只能以可忽略的水平发生。
本发明的另外的实施方案可以包括优化异源asRNA多核苷酸的有效性的方法和系统。在一个优选的实施方案中，asRNA可以与伴侣蛋白共表达和/或融合以保护RNA分子免于降解。另外的优选实施方案可以包括分泌标签/部分的共表达和/或融合，其可以促进异源asRNA多核苷酸的分泌和/或摄取，从而提高其有效性。
细菌内切核糖核酸酶、外切核糖核酸酶和RNA降解体可能降解非编码RNA分子，如asRNA。在一个实施方案中，本发明的技术可以包括对先前鉴定的递送细菌进行修饰以使其表达降低或这些蛋白质家族的功能或活性失活。表达和/或活性的这种降低或失活可以抑制或降低单链非编码RNA物种的降解。在一个优选的实施方案中，可以对先前鉴定的宿主特异性细菌进行遗传修饰以在RNA内切核糖核酸酶、外切核糖核酸酶和/或降解体缺乏的背景中有效表达异源asRNA多核苷酸。在一个优选的实施方案中，供体细菌可以缺乏或具有降解的RNase III功能。在这个优选的实施方案中，可以通过同源重组或其他合适的方法敲除这些非编码RNA分子降解基因。
本发明技术的另一个实施方案可以包括促进宿主特异性细菌基因的过表达的系统和方法，已知该基因可增强非编码RNA分子(例如asRNA和/或gRNA)的稳定和/或动员，以及其基础遗传构建体(例如质粒)的动员和传播。在这个优选的实施方案中，一种或多种已知稳定asRNA或动员遗传构建体例如质粒的基因可以被过表达以延长其寿命并促进在宿主生物/细胞/组织内的移动。
在另一个实施方案中，非编码RNA分子，例如异源asRNA多核苷酸，可以由工程化和/或基因修饰的细菌递送，所述细菌诱导细胞内连接的形成，特别是在非最佳环境条件下，或周围环境缺少某些必需营养素的条件下。以这种方式，细菌可以形成纳米管，以在相连的细胞之间交换营养，遗传物质和其他化学信号，从而帮助在微生物群落内分配代谢功能。在该实施方案中，可以对营养缺陷型细菌进行遗传修饰以诱导纳米管的形成，其可以允许将asRNA从供体细菌直接传播至靶标或受体细菌。在另一个实施方案中，可以对营养缺陷型细菌进行遗传修饰以诱导纳米管的形成，所述纳米管可以允许将编码asRNA的遗传构建体传播至靶向缺乏人工遗传构建体的细菌。在这种配置中，在某些环境或营养缺乏的条件下，传递细菌可以向社区中的其他细菌传播asRNA和/或编码asRNA的遗传构建体，例如质粒。这种作用可能有助于损害大量病原细菌中特定靶基因的表达。
在该实施方案中，这样的遗传构建体可以包括转录调节部分，例如启动子、终止子、共激活子和共阻遏子，以及可以在原核以及真核系统中被调节的类似控制元件。这样的系统可以允许控制系统内表达的异源asRNA多核苷酸或其他非编码RNA分子的类型、时间和数量。另外的实施方案可以包括可以通过外部因素诱导的遗传构建体，例如细胞内特定蛋白质或化合物的存在，例如响应于病原体而产生的应激相关蛋白质，或者甚至是病原体等所产生的蛋白质和其他前体化合物。
如上所述，在一个优选的实施方案中，一种或多种异源asRNA多核苷酸可以通过基因修饰的细菌被递送到虾的目标宿主/种群，所述基因修饰的细菌可以自然地或被配置为与虾定居和/或共生。在这个实施方案中，一旦定居在宿主中，修饰细菌的垂直传播就可以传递到宿主的后代，从而自然地将病原性抗性复制到后代。在某些实施方案中，表达一种或多种异源asRNA多核苷酸的基因修饰细菌可以在虾的整个生命周期中定居。例如，表达一种或多种异源asRNA多核苷酸的基因修饰的供体细菌可以在虾上定居，而该虾是：卵、无节幼体、原生动物、mysis、幼虫后阶段或成年。在该实施方案中，定殖的细菌可以表达异源asRNA多核苷酸，其可以被指导从供体细菌表达和运输，并被受体病原体细菌吸收并抑制表达或一种或多种必需基因。而且，这些定居的细菌已经永久和/或暂时成为宿主天然微生物组的一部分，在某些情况下，可以通过肠从最早的幼体阶段到成年阶段连续地输送异源asRNA多核苷酸，从而在宿主的整个生命周期内提供特定病原体基因的病原体特异性mRNA下调。此外，由于供体细菌载体可能是宿主微生物组中自然已经存在的一部分，因此它的存在可能不会对生物体、环境或最终消费者构成任何风险。
本发明的技术可以包括用于产生宿主特异性细菌，尤其是可以作为宿主特异性的肠道或共生细菌的方法和技术，所述宿主特异性的肠道或共生细菌可以用作针对异源asRNA多核苷酸和群体猝灭分子的合适供体载体，这些分子针对影响水生生物的细菌病原体。作为示例性模型，虾可以用作目标宿主。然而，如本领域普通技术人员可以理解的，这样的方法和技术可以应用于多种不同的生物。
如本文所用，术语“水产养殖”包括在受控条件下的水生生物的养殖。
本文所用的术语“水生生物”和/或“水生动物”包括在淡水或盐水中生长的生物。水生生物/动物包括脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、鱼类、软体动物，包括虾(例如，对虾、Penaeus esculentu、白对虾、南美蓝对虾、西方白对虾、日本对虾、南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、Penaeus aztecus、Penaeus duorarum、印度对虾、墨吉对虾、加州对虾、短沟对虾、Penaeus monodon、卤水虾、淡水虾等)、螃蟹、牡蛎、扇贝、对虾蛤、软骨鱼(例如鲷鱼、鳟鱼、鲈鱼、鲈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾鱼、鲤鱼斑马鱼、红鼓等)、甲壳类动物等。虾还包括在水产养殖中养殖的虾。
术语“益生菌”是指可以在宿主中定殖并提供益处的微生物，例如细菌。术语“益生菌”还指可以在宿主上定殖足够长的时间以研究治疗或有效量的异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的微生物，例如细菌。益生菌可以包括内共生细菌或自然存在的菌群，它们可以永久地暂时定居在动物(例如水生生物)上。益生菌生物还可以包括藻类和真菌，例如酵母。
细菌载体的具体实例包括细菌(例如球菌和棒状杆菌)、丝状藻类和碎屑。在宿主的整个生命周期中是内源的可转化细菌载体细胞的具体实施方案可以包括本文列出的所有那些。另外的实施方案可以包括一种或多种另外的细菌菌株。
术语“操纵子”是指由连接的基因组成的单元。
“群体猝灭剂”或“群体猝灭”分子是指抑制QS和/或生物膜形成和/或减少细菌致病性的异源或同源分子。
本发明可以包括用于在共生供体细菌物种或菌株中表达gRNA的新颖系统和方法，其可以被CRISPR/Cas9系统用来破坏表达CRISPR/Cas9基因的病原细菌中的靶基因，例如dam，或QS基因。通常，CRISPR/Cas9可用于通过共表达对要靶向的基因和核酸内切酶Cas9特异的gRNA产生敲除或破坏靶基因。CRISPR可能包含两个部分：gRNA和非特异性CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)。gRNA可以是短的合成RNA，由可允许Cas9结合的支架序列和约20个核苷酸的间隔区或靶向序列组成，该序列定义了要修饰的基因组靶标。在一个优选的实施方案中，示例性细菌，例如共生，内共生细菌可以被遗传修饰以产生一种或多种靶向病原性或其他靶基因的遗传序列并且可以与靶细菌的天然存在的Cas9核酸内切酶相关的gRNA。在另一个优选的实施方案中，可以对示例性细菌，例如内生细菌和/或肠细菌进行基因修饰，以产生靶向病原性或其他靶基因的遗传序列(例如弧菌中的dam)的一个或多个gRNA，并且可以与靶细菌的天然存在的Cas9核酸内切酶相关。
如本文所用，术语“反义RNA”或“asRNA”是指作为单链寡核苷酸的RNAi剂。在典型的asRNA中，单链与全部或部分靶mRNA互补。asRNA的互补性可以与特定基因转录本的任何部分互补，即在5'非编码序列、3'非翻译序列、内含子或编码序列处。可以将asRNA引入细胞以通过与碱基互补并物理阻碍翻译机制来抑制互补mRNA的翻译。反义RNA与互补的mRNA靶序列退火，并且由于核糖体接近或核糖体阅读的位阻，mRNA靶序列的翻译被破坏。反义RNA机制不同于RNA干扰(RNAi)，RNAi干扰是一个相关过程，在该过程中，双链RNA片段(dsRNA，也称为小干扰RNA(siRNA))触发了催化介导的基因沉默，最常见的是靶向RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合并降解mRNA。asRNA分子链与mRNA或DNA退火可能会导致双链RNA、杂合RNA/DNA双链体或类似于前体tRNA的双链RNA通过细胞中的核糖核酸酶快速降解，或通过反义化合物本身裂解靶RNA迅速降解。
如本文所用，弧菌是具有弧形棒状弧菌的革兰氏阴性兼性厌氧细菌的属，其是弧菌属中的一个物种。在一些实施方案中，弧菌属可以包含以下任何一种或多种弧菌，并以所有可能的组合包括：适应弧菌、产气克氏杆菌、抗弧菌、aestuarianus、agarivorans、albensis、苜蓿弧菌、溶藻菌、鳗弧菌、areninigrae、artabrorum、大西洋弧菌、典型弧菌、azureus、巴西弧菌、牛弧菌、卡氏弧菌、坎贝利弧菌、干酪乳杆菌、查加斯弧菌、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、珊瑚虫弧菌、牡蛎弧菌、环食动物、恶魔弧菌、重氮营养醋杆菌、埃祖拉弧菌、fischeri、弗氏弧菌、富通弧菌、真菌弧菌、鸡弧菌、瞪羚弧菌、gigantis、卤虫弧菌、哈维氏弧菌、肝弧菌、海马弧菌、西班牙弧菌、冬青弧菌、鱼痢弧菌、indicus、kanaloae、慢性弧菌、斜视弧菌、火神孤菌、地中海弧菌、梅氏弧菌、模仿弧菌、粘虫弧菌、natriegens、navarrensis、neonates、海王星弧菌、大米弧菌、黑曲霉醇弧菌、奥达利弧菌、东方铁线莲弧菌、pacinii、副溶血弧菌、鱼叉、槟榔屿弧菌、柚子弧菌、桥弧菌、解蛋白弧菌、轮虫弧菌、红色弧菌、rumoiensis、沙门葡萄弧菌、眼球弧菌、splendidus、超级弧菌、绦虫弧菌、塔斯马尼斯弧菌、tubiashii、创伤弧菌、wodanis和xuii。
如本文所用，短语“宿主”或“目标宿主”是指携带致病性病原体的生物或种群，或易受致病性病原体影响的生物或种群。“宿主”或“目标宿主”可以进一步包括能够携带引起疾病的病原体的生物或种群。
如本文所用，术语“控制”和/或“生物控制”是指减少和/或调节病原体/疾病的进展和/或传播。
如本文所用，“疫苗”是指导致主动和被动免疫的组合物。多肽和多核苷酸及其表达的基因产物都在本文中称为疫苗。饲料可以包括经处理的细菌，其被配置为表达异源RNA多核苷酸和/或群体猝灭分子也可以是疫苗。将经处理的饲料喂养给动物可以是疫苗接种。
如本文所用，短语“饲料”是指作为饲料方案的一部分引入的动物可食用材料，或者在水生动物的情况下直接应用于水中。“经处理的饲料”是指用经处理的细菌处理的饲料，所述经处理的细菌被配置为表达细菌多核苷酸和群体猝灭分子，如本文一般所述。“饲料还可以是虾类养殖池塘/水产养殖接种物。
如本文所用，术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。通常，“核酸”或“核酸剂”聚合物以单链或双链形式存在，但也已知形成包含三条或更多链的结构。术语“核酸”包括天然存在的核酸聚合物以及包含已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，所述核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键是合成的，天然存在的和非天然存在的，其具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式被代谢。示例性类似物包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。“DNA”、“RNA”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文可互换使用。
当与例如细胞或核酸、蛋白质或载体结合使用时，术语“重组”表示该细胞、生物体、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组或野生型)形式中找不到的基因，或表达天然表达的基因，这些天然基因否则会异常表达、过表达、表达不足或根本不表达。
术语“基因修饰”、“生物转化”、“转基因”、“转化”、“转化”和“转染”在含义上与“重组”相似。“转化”、“转基因”和“转染”是指多核苷酸向宿主生物的基因组或细胞中的转移。多核苷酸的这种转移可导致多核苷酸的遗传稳定遗传或导致多核苷酸保留在染色体外(未整合到细胞的染色体中)。遗传稳定的遗传可能潜在地要求转基因生物或细胞在一段时间内经历一种或多种条件，这些条件需要转录部分或全部转移的多核苷酸才能使转基因生物或细胞生存和/或生长。转化到细胞中但未整合到宿主染色体中的多核苷酸仍作为表达载体保留在细胞内。为了使表达载体保留在细胞或细胞的后代中，可能需要在一定的生长或环境条件下使细胞生长。此外，为了发生表达，可能需要将生物体或细胞保持在一定条件下。包含重组多核苷酸的宿主生物或细胞可被称为“转基因”或“转化的”生物或细胞，或简称为“转化体”，以及重组生物或细胞。
术语“载体”是指可以将DNA、RNA、蛋白质或多肽引入宿主的某些方式。待引入宿主的多核苷酸、蛋白质和多肽本质上可以是治疗性或预防性的；可以编码或为抗原；本质上可以是监管的；等等。载体种类繁多，包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。
“表达载体”是能够在选择的宿主细胞或生物中复制的核酸。表达载体可以复制为自主结构，或者可以全部或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中，也可以用作将外来DNA传递到细胞的穿梭载体，并且从而与宿主细胞基因组一起复制。因此，表达载体是能够在选定的宿主细胞、细胞器或生物体中复制的多核苷酸，例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段，并且表达载体上的某些基因(包括目的基因)被转录并翻译成细胞、细胞器或生物体内的多肽或蛋白质；或本领域已知的任何合适的构建体，其包含“表达盒”。相反，如本文实施例中所述，“盒”是含有本发明表达载体的一部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒，并且其包含与表达控制序列可操作连接的所需多核苷酸序列。
当表达控制序列控制和调节该多核苷酸序列的转录和/或翻译时，该多核苷酸序列与该表达控制序列(例如，启动子和任选的增强子)“有效连接”。如本文所用，短语“基因产物”是指RNA分子或蛋白质。此外，术语“基因”有时可以指遗传序列，该基因的转录的和可能修饰的mRNA，或该mRNA的翻译蛋白。
本教导考虑根据所选病原体物种，例如弧菌的物种、靶向同系物和直系同源物。同源序列包括直系同源和旁系同源序列。术语“旁系同源的”涉及导致旁系同源基因的物种的基因组内的基因复制。术语“直系同源”由于祖先关系而涉及不同生物中的同源基因。因此，直系同源物是在给定两个物种的最后一个共同祖先中源自单个祖先基因的进化对应物(Koonin EV and Galperin MY(Sequence-Evolution-Function:ComputationalApproaches in Comparative Genomics.Boston:Kluwer Academic；2003.Chapter 2,Evolutionary Concept in Genetics and Genomics.Available from:www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20255/)，因此具有相同功能的可能性很高。因此，直系同源物通常起着与另一物种的原始物种相似的作用。
同源性(例如，同源性百分比，序列同一性+序列相似性)可以使用计算成对序列比对的任何同源性比较软件来确定。如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括提及两个序列中比对时相同的残基。当使用序列同一性的百分比来表示蛋白质时，会认识到不相同的残基位置通常因保守的氨基酸取代而有所不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代并因此不会改变分子的功能特性。如果序列在保守取代上有所不同，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列应具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的手段是本领域技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是全部错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为零的情况下，保守取代的评分在0与1之间。计算保守取代的得分，例如，根据Henikoff S和Henikoff JG的算法[Amino acid substitution matrices fromprotein blocks.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992,89(22):10915-9]。
根据一个具体的实施方案，同源序列与本文提供的序列(核酸或氨基酸序列)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至完全相同。在50％-99％之间的任何SEQ ID No 1-4的同源序列可以包括在本发明的某些实施方案中。
可以监测病原体基因产物的下调表达，例如，通过直接检测基因转录本(例如通过PCR)，通过检测由基因编码的多肽(例如通过Western印迹或免疫沉淀)，通过检测由该基因编码的多肽的生物活性(例如，催化活性，配体结合等)，或通过监测宿主的变化(例如，宿主运动性降低等)。另外，或者可替代地，可以通过测量与未用本发明的试剂处理的野生型(即对照)宿主相比的宿主中的病原体水平(例如细菌水平等)来监测病原体基因产物的表达下调。
如本文所用，术语“干扰RNA分子”或“干扰RNA”是指能够抑制或“沉默”病原体中靶基因表达的RNA多核苷酸。在某些实施方案中，“干扰RNA分子”或“干扰RNA”可包括asRNA或异源asRNA。抑制性RNA序列与靶基因转录物的部分可以大于90％相同，或甚至100％相同。备选地，RNA的双链体区可以在功能上定义为能够在严格条件下与一部分靶基因转录物杂交的核苷酸序列(例如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，60℃杂交12lb小时；然后洗涤)。与靶基因转录物互补的单链核苷酸序列的长度可以是至少约18、19、21、25、50、100、200、300、400、491、500、550、600、650、700、750、800、900、1000或更多个碱基。在本发明的一些实施方案中，双链核苷酸序列的长度为约18至约530个或更长的核苷酸。
应当注意，可以根据编码靶基因转录物的DNA的核酸序列来定义asRNA，并且应当理解，与基因编码序列相对应的asRNA序列包含该基因编码序列的RNA互补序列，或转录为RNA的该基因的其他序列。
例如，为了沉默目的mRNA的表达，可以如下选择适合用于本发明的一些实施方式的asRNA的合成。首先，扫描包括3'UTR和5'UTR的mRNA序列。其次，使用任何序列比对软件(例如可从NCBI服务器获得的BLAST软件)将mRNA序列与合适的基因组数据库进行比较(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)。滤出与其他编码序列具有显着同源性的mRNA序列中的推定区域。选择合格的靶序列作为asRNA合成的模板。优选的序列是与基因组中的其他基因几乎没有同源性的序列，以减少“脱靶”效应。将理解的是，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于仅包含RNA的那些分子，而是还涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
根据一个具体的实施方案，用于异源asRNA多核苷酸和/或群体猝灭分子或供体的载体是细菌。在其他实施方案中，供体是藻类细胞。根据本发明的教导，可以使用各种藻类，因为它们是许多宿主的重要组成部分，这些宿主机会性地以微生物以及小型水生动物如轮虫为食。可以根据本教导使用的藻类的实例包括但不限于蓝绿藻以及绿藻。特别是，Actinastrumhantzschii、镰形纤维藻、螺旋纤维藻、Aphanochaete elegans、衣藻属、小球藻椭球体、蛋白核小球藻、斑点小球藻、催眠性绿球菌、Chodatella brevispina、锐新月藻、Closteriopsis acicularis、Coccochloris peniocystis、Crucigenia lauterbomii、Crucigenia tetrapedia、椭圆冠藻、葡萄球菌藻、草苔、Eudorina elegans、Gloeocystisgigas、Golenkinia minutissima、Gonium multicoccum、日本南野鲶藻、Oocystismarssonii、Oocystis minuta、Oocystis pusilla、特克斯棕榈藻、苔藓、Paulschulziapseudovolvox、Pediastrum clathratum、Pediastrum duplex、Pediastrum simplex、胶状浮游藻、尖鳞毛蕨、粘着假球菌藻、Quadrigula closterioides、光脚放射性球菌藻、罗汉松藻、普拉滕斯螺旋藻、角斗鱼藻、Tetraedron bitridens、Trochiscia hystrix、鱼腥草、螺旋鱼腥藻、突厥色球菌藻、柱状地衣、Bucapsis sp.属(U.Texas No.1519)、旋毛虫藻、铜绿微囊藻、根瘤菌属、木耳、Oscillatoria lutea、席藻、高原棘线藻。
在另一个实施方案中，可以将包含被配置为表达asRNA和/或群体猝灭分子的基因修饰细菌的组合物配制成可进一步被配置为分散到环境中的水分散性颗粒或粉末。在又一个实施方案中，本发明的组合物还可包含可湿性粉剂、喷雾剂、乳剂、胶体、水溶液或有机溶液、粉剂、丸剂或胶体浓缩物。可以将组合物的干燥形式配制成在润湿时立即溶解，或者以控制释放、持续释放或其他时间依赖性方式溶解。替代地或附加地，该组合物可以包含水溶液。这样的水溶液或悬浮液可以作为浓缩的储备溶液提供，该浓缩的储备溶液在施用之前被稀释，或者作为可供立即施用的稀释溶液。这样的组合物可以以多种方式配制。通过与各种惰性材料混合，它们可以用作可湿性粉剂、颗粒剂或粉剂，惰性材料例如是无机矿物(硅酮或硅衍生物、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物性材料(粉状玉米芯、稻壳、核桃壳等)。含有基因修饰的细菌的制剂或组合物可包括铺展剂-佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以用作泡沫、悬浮液、乳油等。成分可以包括生物剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
可以包括表达异源RNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的基因修饰的共生供体细菌的本发明的组合物可以用于动物或其他宿主中病原体的生物控制。这样的应用包括向宿主施用有效量的组合物，其从供体表达足够的异源RNA多核苷酸和/或群体猝灭分子，其可以被运出供体并被靶病原体吸收，从而干扰靶必需基因的表达，从而控制病原体和/或病原体疾病对宿主的影响。
本发明的组合物可用于体内控制病原体基因表达和/或QS及其作用。这样的应用包括向目标宿主例如虾施用有效量的组合物，其抑制宿主携带的病原体，减少或消除宿主中的疾病状态以及使病原体不可转移至例如宿主群体。因此，无论使用何种方法，表达异源RNA多核苷酸和/或群体猝灭分子的基因修饰共生供体细菌的量均可以以杀灭或抑制病原体和/或抑制QS或其对病原体的作用的有效量施用，其将取决于多种因素，例如待控制的特定宿主、病原体的类型等，在一些情况下例如要处理的水源，环境条件以及组合物的施用方法、速率和数量。用于环境、全身或叶面施用的组合物的浓度将根据特定制剂的性质、施用方式、环境条件和杀生物活性的程度而广泛变化。
根据一些实施方案，以有效减少或抑制至少一种病原体基因产物的表达和/或减少或抑制QS和/或减少或抑制生物膜形成的量提供异源asRNA多核苷酸和/或群体淬灭分子。如本文所用，“抑制量”或“有效量”或“治疗有效量”是指足以将靶基因下调(减少)靶基因至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更高例如60％、70％、80％、90％或甚至高达100％的asRNA的量。所有范围包括在具体说明的范围之间的范围。如本文所用，“抑制量”或“有效量”或群体猝灭分子是指足以使靶病原体(优选为引起EMS的病原体)中的QS和/或生物膜形成降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更高例如60％、70％、80％、90％或甚至高达100％的定额猝灭分子。所有范围包括在具体说明的范围之间的范围。
如本文所用，术语“基因”或“多核苷酸”是指任意长度的单核苷酸或核酸残基的聚合物。多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物，并且可以是双链或单链的。多核苷酸可以包含修饰的核酸(例如，甲基化的)、核酸类似物或非天然存在的核酸，并且可以被非核酸残基中断。例如，多核苷酸包括任何序列的基因、基因片段、cDNA、分离的DNA、mRNA、tRNA、rRNA和分离的RNA、重组多核苷酸、引物、探针、质粒和载体。定义中包括已经被修饰的核酸聚合物，无论是天然修饰还是通过干预。
如本文中所使用的，术语“大约”或“大概”是指±10％。每当在此指出数值范围时，其意图是包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围/范围以及从第一指示数字到第二指示数字的范围/范围”在本文中可互换使用，并且旨在表示包括第一和第二指示数字以及其间的所有小数和整数。
术语“包含”、“包含”、“含有”、“具有”及其缀合物表示“包括但不限于”。术语“由...组成”是指“包括并限于”。术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是附加成分、步骤和/或零件不会实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围(例如1到6)的描述应视为已明确公开了一些子范围，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这与范围的广度无关。
如本文所用，术语“系统”和/或“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于化学、药理、生物学、生化和医学领域的从业者从已知方式、手段、技术和规程已知的或容易从已知方式、手段、技术和规程开发的那些方式、手段、技术和规程。如本文所用，术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减慢或逆转病情的进展，实质上改善病情的临床或美学症状或实质上防止病情的临床或美学症状的出现。
如本文所用，“共生”或“共生体”通常是指作为宿主的共生体的细菌。它还可能包括在宿主的整个生命周期内(无论是内部还是外部)持续存在的细菌，并且还可能水平传播到宿主的后代或卵中。共生菌还可以包括在宿主细胞外部甚至在宿主的组织、淋巴或分泌物中定居的细菌。内共生体通常是指内部共生体的一个亚组。
如本文所用，“转基因”是指生活在目标宿主生物体内的天然或共生细菌内部的RNA多核苷酸或群体猝灭剂的产生，所述细菌被设计为抑制目标宿主或病原体基因的表达。
本发明利用分子生物学领域的常规技术。公开本发明中一般使用方法的基本文献包括：Green and Sambrook,4th ed.2012,Cold Spring Harbor Laboratory；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1993)；和Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,1994-current,John Wiley&Sons。除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以在例如Benjamin Lewin,Genes IX,published by Oxford University Press,2007(ISBN0763740632)；Krebs,et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.,1994年出版(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.在1995年出版(ISBN 1-56081-569-8)，中找到。
现在参考以下实施例将更容易理解一般描述的本发明，这些实施例仅出于说明本发明实施方案的某些方面的目的而包括在内。实例并非旨在限制本发明，如本领域技术人员将从以上教导和以下实例中认识到的那样，其他技术和方法可以满足权利要求并且可以在不脱离要求保护的本发明的范围的情况下采用。确实，尽管已经参照本发明的优选实施例具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
实施例
实施例1：用肠细菌预防EMS破坏群体感应构建设计。
为了降解AI-1，本发明人过量表达了来自Ochrobactrum的内酯酶AidH。与蜡状芽孢杆菌AiiA内酯酶不同，AidH的催化活性不需要锌，锌在海水和/或人工水产养殖环境中可能只存在少量。本发明人将aidH基因置于在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中均有效的强Pupp启动子的控制之下。将pupp-aidH表达盒克隆到pAD43穿梭载体和pACYC184中。为了从环境吸收AI-2，本发明人克隆并过表达了大肠杆菌Isr操纵子。为了降低AI-1和AI-2信号分子的浓度，本发明人进一步使用相容的质粒构建体共表达AI-1和AI-2淬灭构建体。质粒设计在材料和方法中描述。将所有质粒转化入肠溶性天然分离株肠杆菌属。
实施例2：哈维氏弧菌与表达辅助aidH的AG1构建体的共培养导致弧菌发光减少
如图1中总体所示，本发明人证明了所构建菌株的群体猝灭特性。在该实施方案中，本发明人用一系列对AI-1和AI-2有不同反应的哈氏弧菌菌株进行了发光猝灭实验。对于该测定，在具有透明底部的96孔测定板中，将群体猝灭AG1构建体与发出荧光的弧菌菌株共培养12-16小时。表达中性基因的对照构建体(例如AG1-pOX或AG1-pLuc)在平行实验中用作对照菌株。在细菌生长期间，同时监测发光和培养光密度。如本发明人所观察到的，弧菌菌株的发光在早期的静止生长期急剧增加，表现出细菌群体感应。
再次，如图2所示，表达aidH内酯酶基因的AI-1、AG1细菌构建体证明了具有淬灭野生型哈氏弧菌116(图2A)和仅对AI-1响应的哈氏弧菌117突变株(图2B)的发光的能力。然而，当本发明人将基因修饰的细菌与仅对AI-2有反应的哈氏弧菌118菌株共培养时，未观察到发光猝灭(图2C)。将荧光素酶表达为中性基因(pLuc)的细菌构建体用作对照。与AG1-pAidH共培养弧菌的突出的发光猝灭作用表明，新的基因工程细菌菌株是有效的群体猝灭剂，如生物发光减少所表明。
实施例3：哈维氏弧菌与表达lsr的AG1构建体的共培养导致弧菌发光减少。
接下来，本发明人证明了在Ag1中过表达lsr操纵子导致群体猝灭。在这个实施方案中，本发明人利用Ag1-pLsr构建体进行了如上所述的类似实验。作为对照构建体，使用携带无插入物的质粒的Ag1-pOX菌株。如图3所示，AI-2、AG1-pLsr将野生型哈氏弧菌116的生物发光猝灭至与Ag1-pAidH相似的程度(图3A)。但是，对哈氏弧菌117(仅对AI-1负责)的生物发光影响可忽略不计(图3B)。相反，仅对AI-2应答的弧菌119型弧菌的生物发光通过与Ag1-pLsr共同培养而被淬灭(图3C)。因此，本发明人证实了新颖的基因修饰的细菌构建体既特异性又有效地降低了弧菌的群体感应。
实施例4：哈维氏弧菌与群体猝灭Ag1构建体的共培养导致降低的弧菌适应性和减 少的生物膜形成。
如上所述，生物膜的形成是许多细菌的重要致病性状。为了建立设计的群体猝灭构建体的抗病原性机制，本发明人研究了它们对哈氏弧菌对生物膜形成的影响。如下所示，本发明人证明了在将AG1与哈氏弧菌菌株共培养导致可检测到的生物膜层的同时，单独的AG1几乎不产生生物膜。如图4A所示，通过AG1-pAidH从细菌培养基中清除AI-1会导致所有响应AI-1的弧菌菌株(例如116和118)的生物膜形成减少，但不是由不响应AI-1的突变株117引起的。本发明人进一步证明，淬灭AI-2分子的AG1-pLsr能够减少所有对AI-2敏感的菌株(例如野生型116及其突变体119)中生物膜的形成。但是，与AG1-pLsr的共培养对仅响应AI-1的哈氏弧菌118的生物膜形成没有负面影响。因此，使用机会病原体哈维氏菌作为示例性模型生物，本发明人表明，在某些实施方案中，新型的群体猝灭构建体能够有效且特异性地减少生物膜的形成(图4)。
实施例5：在Ag1中aidH和Isr的共表达导致弧菌发光减少，但不减少生物膜形成。
在本发明的一个实施方案中，本发明人证明了表达单个群体猝灭因子(例如，lsr或aidH)的细菌构建体对发光和生物膜形成均表现出相似但部分的作用。有理由认为，两个群体猝灭剂一起共表达可能会导致累加结果。因此，本发明人在兼容的质粒载体pACYC184中在相同的强pupp启动子的控制下克隆并表达了aidH基因，该质粒载体可以与细菌细胞中的pOX类型的质粒共存。pLsr(pOX)和pAidH’(pLuc)质粒均被引入AG1细胞。如图5所示，尽管与质粒pAD-AidH相比，pACYC184-AidH的拷贝数较低，但它产生了足够的AidH蛋白，可以有效地猝灭弧菌发光(图5A，B)并减少生物膜的形成(图5C)。尽管观察到了pLSR和pAidH'共表达对生物膜形成的任何影响，但在数据中证明了对弧菌生物发光的累积影响。重要的是，两个群体猝灭构建体的共表达允许本发明的实施方案覆盖不同的细菌种群生长阶段。
实施例6：虾喂食/副溶血弧菌攻击。
为了确定破坏肠细菌中的群体感应是否为虾提供了免受病原性弧菌的保护，并且是否降低了与EMS相关的死亡率，本发明人使用副溶血弧菌作为示例性病原体进行了虾EMS试验。在该实施方案中，为了在虾肠中建立群体淬灭细菌种群，在表达弧菌之前，通过表达各种质粒编码的群体淬灭分子或asRNA-dam的肠杆菌喂养虾5天。
为了确认Ag1细菌能够在虾肠中生存并持续存在，进行了初步定植实验。Ag1被编码荧光GFP蛋白的质粒pGFPuv(Clontech)转化。对虾喂食含Ag1-pGFPuv的食物10天，并在第5天和第10天通过在荧光显微镜下分析虾肠(在肠中检测到GFP荧光)并使用孤立的虾肠通过平板计数法(通过GFP荧光鉴定出Ag1菌落)来检测到Ag1的存在。用Ag1喂食5天后，虾肠中的细菌滴度约为2.8E+06cfu/g，在第10天略有升高(见下表1)。在该实施方案中，在向虾喂入基因修饰的细菌后的第5天，本发明人开始了弧菌攻击。
实施例7：EMS诱导的死亡率计数。
在此示例中，进行了两项独立的EMS挑战试验。如图6所示，在试验1中，弧菌感染似乎是急性的，并在所有测试组中均产生了快速死亡。弧菌攻击后12-24小时内，对照组的100％虾死亡。但是，喂虾的Ag-AidH1p细菌感染的发生被延迟了(感染后12小时内死亡率为37％，对照组为68％)，并且Ag-AidH1p组中有20％在5天的实验中存活了下来，而对照组没有虾存活(图6A-B)。
优化了感染条件以进行第二定额淬灭虾试验。感染剂量减少了10倍，并且在攻击前添加了额外的洗涤步骤以消除弧菌培养物中细菌毒素的积累。在该试验中，感染的发生较慢，仅喂食Ag1-Luc的对照组在感染后第5天的总死亡率达到55％。在这些条件下，所有定额淬灭菌株为虾提供了一定程度的保护。对于表现最佳的组，Ag-AidH1p，感染后5天后的总死亡率为25％，而对照组为55％。虾喂食Ag-1pLsr和Ag-AidH1p-lsr的死亡率分别为31％和34％(图6C-D)。
实施例8：从虾中输入肠杆菌群体淬灭菌株Ag1-pAidH，Ag1-pLsr和Ag1-pLlsr- pAidH的肠中的弧菌中减少表达毒力基因。
如上所述，对于许多病原菌而言，群体感应是毒力调节的重要组成部分，并参与毒力基因表达的调节。这样，本发明人选择了两个单独的副溶血性弧菌毒力因子，即Mam7和PirA，作为该优选实施方案中弧菌的致病性状态的标记。Mam7是一种粘附蛋白，可与纤连蛋白结合，对于在感染的早期阶段弧菌最初与宿主细胞的附着至关重要。PirA是参与EMS开发的细胞毒性蛋白。
如图7所示，在感染后48小时的试验2中收集了活虾和死虾，并通过qPCR对从虾肠中提取的mRNA评估了Mam7和Ap4的表达水平。喂食所有群体猝灭肠杆菌菌株的虾肠中的弧菌中，Mam7的表达降低了约2倍。死虾肠中弧菌中Mam7表达水平与对照组活虾中的Mam7表达水平大致相同，这表明mRNA在死虾中并未降解(参见图7A)。在喂食所有群体猝灭细菌菌株的虾中得到的弧菌中，毒素PirAmRNA的表达也降低了，在喂食Ag1-pAidH细菌的虾中观察到了最高的降低。值得注意的是，与所有其他组相比，该对虾组的成活率更高。与所有存活的虾相比，死虾肠中弧菌中pirA表达水平几乎提高了10倍(见图7B)。
实施例9：通过用表达针对弧菌的asRNA的肠虾细菌接种虾来预防EMS。
如上所述，在一个实施方案中，邀请技术包括新颖的方法、系统和组合物，用于通过另一种细菌产生的asRNA调节靶基因在细菌中的表达，所述asRNA靶向受体细菌表达的目的基因。例如，在一个实施方案中，本发明可以包括减少与表达asRNA-dam的肠杆菌Ag1共培养的弧菌中的dam表达。在弧菌中，依赖dam的DNA甲基化参与了致病性途径的调控。因此，dam表达水平的降低应导致弧菌毒力降低。在这种asRNA策略的一个潜在实施方案中，将虾喂入表达Ag1的asRNA-dam的Ag1，然后用副溶血弧菌攻击。
实施例10：EMS诱导的死亡率计数。
在这个例子中，进行了两个独立的挑战试验。如图8所示，在两个试验中，与对照组相比，喂食表达asRNA-dam(Ag1-asRNA-dam)肠杆菌的虾的死亡率降低。在图8A-B所示的一个挑战试验中，将配置为表达非特异性蛋白(Ag1-Luc)的Ag1喂入虾中作为对照。在这个例子中，死亡率的降低是中等的，用Ag1-asRNA-dam喂养的虾死亡率为43％，而对照组为59％(见图8)。在图8C-D所示的第二项试验中，饲喂Ag1-asRNA-dam的虾的死亡率比饲喂Ag1-Luc的虾降低了2倍以上。感染后第5天的死亡率为24％，而对照组为55％(图8C-D)。第一次和第二次试验之间结果的差异可以用以下事实来解释：在第二次试验中，弧菌培养物在将细菌添加到虾类食物中之前先漂洗了3次，这有可能减少食物中细菌毒素的积累。
实施例11：从虾中摄得肠杆菌的虾获得的弧菌中毒力基因的表达降低，所述虾表 达作为靶向弧菌dam基因表达的asRNA。
在该实施例中，在挑战弧菌后48小时，通过qPCR对从试验2中收集的死和活虾的肠中提取的RNA通过qPCR评估副血弧菌毒力基因mam7和pirA的表达水平。从虾饲喂Ag1-asRNA-dam的肠中获得的弧菌中，两种毒力基因的表达均大大降低。在该组中，mam7基因表达降低了3.5倍，而pirA表达降低了约10倍(图9)。
实施例12：Mam7表达可以通过Dam依赖性DNA甲基化来调节。
重要的是，qPCR分析表明，喂食了Ag1-asRNA-dam的虾的弧菌中mam7的表达减少，表明mam7的表达可能受Dam依赖性DNA甲基化的调节。Mam7基因调控，包括启动子和/或其他顺/反式调控因子，以前尚未鉴定。为了检查mam7表达的Dam依赖性调节的可能性，本发明人用Softberry软件(http://www.softberry.com/)分析了mam7基因(VP1611)的上游，以预测mam7启动子的位置和组成。如图10所示，在mam7起始密码子上游288bp处发现了潜在的基因启动子。在启动子区域发现了四个潜在的Dam DNA甲基化酶甲基化靶序列(GATC)，其中一个与-10启动子元件重叠。这种预测的启动子组成强烈暗示了mam7基因表达的Dam依赖性调控。
实施例13：使用肠虾细菌，该肠虾细菌经工程改造以表达群体感应破坏分子或 asRNA，其靶向弧菌中必需/和/或毒力基因的沉默。
本发明人在本文中描述了一种系统、方法和组合物，其为了使用基因工程细菌，更具体地讲，将肠虾细菌工程化以表达群体感应破坏分子和/或靶向必需/和/或毒力基因沉默的asRNA，以保护虾免受弧菌感染的发展并降低与EMS相关的死亡率。进一步证明，喂食定额淬灭细菌和/或表达asRNA-dam的虾虾肠道中的弧菌降低了毒力基因mam7和pirA的表达。总之，这些结果证明了本发明技术的某些实施方案，其使用工程肠细菌作为保护虾免受病原体感染的有效平台。
示例14：材料和方法。
菌株和质粒的设计与构建
表2中列出了本发明中使用的所有菌株和质粒。为了产生生物活性菌株，将下述质粒转化到电感受态肠杆菌细胞中。质粒的描述如下：(a)使用Vector NT程序将Ochrobactrum sp.(Mei等，2010)的pAidH–aidH基因密码子优化至肠杆菌表达。密码子优化的基因补充有核糖体结合位点，并通过IDTDNA订购为DNA片段。使用寡核苷酸pAD-act-for和pAD-lact-rev进行附加PCR(表3)。为了克隆，使用
Figure BDA0002411616470000421
HiFi DNA组装试剂盒(NEB)组装扩增的基因序列和线性化的pAD43质粒(图10A)；(b)pLuc–被用作编码中性基因的对照质粒。如上所述制备，但是使用萤光素酶基因代替了aidH；(c)pAidH’，pLuc’。载体pACYC184用于产生表达aidH(luc)的pAD/pSF兼容载体。要用相应的启动子扩增基因，终止子和核糖体结合位点，使用pACYC-for和pACYC-rev寡核苷酸进行附加PCR。最后，使用
Figure BDA0002411616470000422
HiFi DNAAssembly Kit(NEB)将PCR产物克隆到EcoRV线性化的pACYC184质粒中。质粒图谱见图10。
由GENESCRIPT制备的质粒：(a)pLsr–包含在多拷贝质粒载体pSF-OXB19(Sigma)中lacUV启动子控制下表达的大肠杆菌lsr操纵子。质粒图谱见图10。(b)p(asDam)和p(asGFP)用于产生反义RNA(asRNA)的配对末端(PT)RNA稳定设计用于创建表达asRNA的盒。将38bp长的侧翼反向GC延伸片段添加到特定asRNA序列的两端，形成发夹结构，末端带有asRNA环。将rrnB终止子(来自rrnB E.coli基因的终止子)置于表达asRNA的表达盒末端207bp长的连接序列之后，并将该表达盒在Pupp启动子的控制下克隆到pAD-43-25质粒中。
细菌生长
LBS培养基用于细菌生长(10g/L细菌色氨酸，5g/L酵母提取物，20g/L NaCl，50mMTris-HCl pH 7.5)。必要时，可按以下浓度使用抗生素：羧苄青霉素50μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml，氯霉素25μg/ml。
生物膜测定
哈氏弧菌和肠杆菌Ag1菌株在LBS培养基中生长过夜，稀释至OD6000.2-0.4，并与弧菌混合，弧菌/Ag1的比例为5/1。然后将150μl混合培养物添加到96孔板的孔中(对每个处理分析3个独立的实验，每个实验重复8个技术重复)，并在28℃下不摇动孵育24小时。孵育后，根据O'Toole(O'Toole，2011)所述的规程，用结晶紫将细菌生物膜染色，并在550nm的Tecan读板器上测量吸光度。
生物发光测定
弧菌菌株和肠杆菌Ag1菌株(群体猝灭剂)在LBS培养基中生长过夜，稀释至OD600nm为0.1-0.2，并在底部透明的黑色96孔组织培养板上以1：1的比例混合。板被透气的透明膜覆盖。混合培养物在Sinergy H4平板阅读器中于28℃下定期充气，生长12h。每20分钟进行一次发光和OD600nm测量。每个实验条件取8条平行曲线；进行了2次独立实验；显示了平均曲线。
qRT-PCR
通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量弧菌细胞中的相对基因表达。使用OmegaE.Z.N.A细菌RNA试剂盒分离总RNA。通过使用Mx3000P QPCR系统(Agilent Technologies)进行实时PCR扩增。使用
Figure BDA0002411616470000431
通用的一步式RT-qPCR试剂盒(NEB)进行一步式RT-PCR。使用的寡核苷酸浓度和循环条件根据制造商的建议。基因和基因特异性引物分别在表5和6中列出。每个反应中使用的细菌细菌总RNA少于25ng。使用gyrB mRNA表达水平作为归一化的内部参考，计算特定转录本的相对表达水平。
数据分析
从至少三个独立的实验中计算出平均值(SEM)的平均值和标准误。所有其他数据均通过SigmaPlot的Anova测试进行了分析。在P值＜0.05时，接受实验组之间差异的显着性。
虾弧菌挑战
细菌：肠杆菌属。用表2中所示的质粒转化Ag1。细菌在LB中与相应的抗生素一起生长过夜，然后离心并混合入浓度为1E+10CFU/gm饲料的商品虾类食品(Zeigler PL 40)中并冷藏。将制成的饲料以体重的10％喂给一克虾(1-2克)，每天分三批喂食。
虾饲喂：在7加仑水族箱中(n＝12)保持1g体重的SPF虾(虾改良系统，佛罗里达州伊斯拉摩拉达)。虾被随机分配到治疗组中：喂以商业饲料加Ag1-Luc(ns)的虾，喂以商业饲料Ag1-pLsr的虾；用Ag1-pAidH喂虾的商业食品；虾饲喂Ag1-pAidH的商业食品，虾饲喂Ag1-pLsr-AidH的商业食品。在挑战弧菌之前5天以及在挑战过程中通过饲料向虾提供细菌。
EMS挑战：将EMS+副溶血性弧菌分离株在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)+2％NaCl中培养，生长过夜，离心，漂洗3次，然后悬浮在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中。使悬浮液达到1010CFU/ml的浓度。将1毫升制备的悬浮液与一克虾饲料(Zeigler PL 40)混合，然后浸入饲料中15分钟。给虾喂5％的体重。
EMS诱导的死亡率计数：弧菌激发后第2-5天进行死亡率计数。对所有处理组的虾进行了4-6次生物重复(单独的水箱)分析。
表格
表1：用表达GFP的Ag1喂养的虾肠中的荧光负荷。
组 荧光细菌负荷，5天，cfu/g 荧光细菌负荷，10天，cfu/g
虾饲喂Ag1-GFP 2.8E+06 7.7E+07
虾饲料商业食品 0 0
表2：细菌菌株和质粒。
Figure BDA0002411616470000451
表3：用于内酯酶克隆的寡核苷酸。
Figure BDA0002411616470000461
表4：qPCR分析中使用的寡核苷酸。
Figure BDA0002411616470000462
表5：qPCR分析中使用的基因
基因 染色体位置 功能 参考文献
gyrB 1:11353-13770 DNA促旋酶亚基B
mam7 1:1708552-1711200 黏附素 (Krachler et al.,2011)
pirA 质粒 早期死亡综合征毒素 (Lee et al.,2015)
参考文献
以下参考文献通过引用整体并入本文：
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Figure BDA0002411616470000471
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序列表
SEQ ID NO.1
DNA
aidH(内酯酶基因)
Ochrobactrum
ATGACAATTAATTATCATGAATTGGAAACCAGTCACGGTCGTATCGCAGTCCGTGAGTCAGAAGGGGAAGGTGCGCCGCTGCTGATGATACATGGTAATAGCAGTTCCGGGGCGATTTTTGCGCCACAGCTTGAGGGGGAAATAGGAAAGAAATGGCGTGTCATTGCCCCAGATCTGCCGGGACATGGAAAGAGCACGGACGCAATCGACCCGGACCGCTCTTACAGCATGGAAGGCTACGCTGATGCCATGACAGAGGTTATGCAACAACTCGGTATTGCAGATGCGGTGGTATTCGGCTGGAGCCTTGGAGGTCATATTGGCATAGAAATGATCGCGCGTTACCCAGAAATGCGTGGTTTAATGATTACGGGCACCCCTCCGGTTGCACGGGAAGAAGTAGGACAAGGCTTTAAGAGTGGTCCAGATATGGCGCTTGCAGGTCAAGAAATTTTTTCAGAACGGGATGTTGAGTCTTACGCTCGGAGTACGTGCGGAGAACCTTTTGAAGCTAGTCTTTTGGACATCGTAGCACGGACTGACGGGCGGGCTAGACGCATTATGTTCGAAAAATTTGGGAGTGGAACTGGCGGTAACCAACGGGACATCGTTGCTGAAGCACAATTACCTATTGCCGTAGTGAATGGGCGGGATGAACCATTTGTCGAGTTGGACTTCGTTAGCAAAGTTAAATTTGGAAACCTCTGGGAAGGTAAAACTCATGTAATCGACAATGCGGGACATGCTCCTTTCCGGGAAGCTCCAGCTGAGTTCGATGCATATCTCGCCCGCTTCATACGTGATTGTACGCAGTAA
SEQ ID NO.2
DNA
lsr操纵子
大肠杆菌
ATGCAAACGAGTGATACCCGCGCGTTACCGCTACTTTGCGCCCGCTCGGTTTATAAACAGTATTCAGGGGTCAATGTCCTGAAAGGCATCGATTTTACGTTGCATCAGGGGGAGGTCCACGCCCTGCTCGGCGGCAATGGTGCCGGTAAATCGACGTTAATGAAGATTATTGCCGGTATTACCCCTGCTGATAGCGGTACGCTGGAGATTGAGGGCAACAACTACGTCAGATTAACGCCAGTTCATGCTCATCAGCTGGGTATTTATCTCGTTCCCCAGGAACCGCTGCTTTTCCCAAGCCTGTCGATAAAAGAAAACATCCTGTTTGGGCTGGCAAAAAAACAGCTCTCCATGCAGAAAATGAAGAACTTGCTGGCGGCGCTGGGCTGCCAGTTTGATCTGCATAGTCTGGCAGGATCGCTGGATGTCGCCGATCGCCAAATGGTGGAAATCCTCCGCGGGCTGATGCGCGACTCGCGGATTCTGATCCTCGATGAACCTACCGCCTCGCTTACCCCTGCGGAAACCGAACGCTTGTTTAGTCGCTTGCAAGAGCTGCTTGCTACTGGCGTGGGTATTGTTTTTATCTCGCATAAGCTGCCGGAAATTCGCCAGATTGCCGATCGAATTAGCGTGATGCGCGACGGAACCATCGCCTTAAGCGGCAAAACCAGCGAACTGTCTACCGACGACATTATTCAGGCCATCACCCCAGCGGTACGGGAAAAATCGCTCTCTGCCAGCCAAAAATTATGGCTGGAGTTACCTGGTAACCGCCCACAACATGCCGCCGGAACGCCGGTGCTGACACTGGAAAATCTGACCGGCGAAGGTTTCAGGAATGTCAGCCTGACGCTCAATGCCGGAGAAATTCTGGGCCTGGCTGGGCTGGTGGGGGCCGGACGCACAGAACTGGCCGAGACGCTCTATGGTCTGCGTACTTTGCGTGGCGGACGCATTATGCTGAATGGTAAAGAGATCAATAAATTATCCACTGGAGAACGTTTACTGCGCGGTCTGGTTTATCTGCCGGAAGATCGCCAGTCATCCGGACTGAATCTCGATGCTTCGCTGGCCTGGAACGTCTGCGCCCTTACTCATAACCTTCGTGGATTCTGGGCGAAAACCGCGAAAGATAATGCCACCCTGGAACGTTATCGTCGGGCGCTGAATATTAAATTCAACCAACCGGAACAAGCTGCACGGACATTATCCGGTGGCAACCAGCAAAAAATCCTCATTGCCAAATGCTTGGAAGCTTCGCCGCAAGTATTGATTGTCGATGAGCCGACGCGCGGCGTGGATGTCTCGGCCCGTAATGATATCTACCAGCTGTTGCGCAGCATCGCCGCACAAAATGTGGCTGTGCTGCTTATCTCCTCCGACCTGGAAGAGATCGAACTGATGGCAGATCGTGTGTATGTGATGCATCAGGGCGAAATTACCCACTCTGCACTGACCGAGCGCGATATTAATGTCGAGACTATTATGCGCGTTGCCTTCGGCGATAGTCAGCGTCAGGAGGCGTCATGCTGAAGTTTATTCAGAACAACCGTGAAATCACGGCACTGCTGGCGGTGGTGCTGCTGTTTGTATTACCCGGTTTTCTCGACCGCCAGTATTTAAGTGTGCAAACGCTGACCATGGTTTATAGCAGCGCGCAAATCCTGATCCTGCTGGCAATGGGCGCGACGCTGGTAATGCTTACGCGCAATATTGATGTTTCAGTGGGTTCGATTACCGGAATGTGCGCGGTGCTGTTGGGGATGTTACTGAACGCAGGATATTCACTACCTGTTGCTTGTGTCGCGACTTTACTGCTTGGTTTGCTCGCGGGATTTTTCAACGGTGTCCTGGTCGCGTGGCTAAAGATCCCTGCCATTGTTGCCACCCTTGGCACGTTAGGGTTGTACAGAGGCATCATGTTGCTGTGGACTGGCGGCAAATGGATTGAAGGGTTACCCGCCGAACTGAAACAGCTCTCCGCCCCGCTGCTGCTTGGCGTTTCAGCAATTGGTTGGTTGACGATAATTCTGGTGGCATTTATGGCCTGGCTGCTGGCAAAGACGGCGTTTGGACGCAGTTTTTATGCCACGGGCGATAATTTACAGGGCGCTCGTCAACTGGGCGTTCGTACTGAAGCCATTCGCATTGTGGCATTTTCGTTGAACGGCTGCATGGCGGCACTGGCGGGAATTGTGTTTGCTTCGCAGATTGGTTTTATCCCCAACCAGACCGGTACCGGGCTGGAGATGAAAGCAATTGCAGCCTGCGTGCTGGGCGGCATTAGTTTGCTCGGTGGTTCCGGTGCGATCATTGGTGCGGTACTCGGCGCATGGTTCCTGACGCAGATCGATAGCGTACTGGTGCTGTTGCGCATTCCGGCATGGTGGAATGATTTTATCGCGGGTCTGGTTCTGCTGGCGGTGCTGGTGTTTGATGGACGCCTGCGTTGTGCGCTGGAACGTAATCTACGGCGGCAAAAATATGCCCGCTTTATGACGCCACCGCCATCCGTTAAACCCGCTTCGTCAGGTAAAAAACGGGAGGCCGCATAATGCGTATTCGCTACGGTTGGGAACTGGCTCTTGCCGCACTGCTCGTTATTGAGATTGTCGCATTTGGTGCAATTAACCCGCGAATGTTAGATCTCAATATGTTGCTGTTCAGCACCAGTGACTTTATCTGCATTGGCATTGTCGCCCTACCGCTAACGATGGTGATTGTCAGTGGCGGGATCGATATTTCGTTTGGTTCGACCATCGGCCTCTGCGCCATTGCATTGGGCGTACTGTTTCAAAGTGGTGTGCCGATGCCGCTGGCGATACTCCTGACCTTACTGCTCGGCGCATTGTGCGGGCTGATCAACGCCGGATTAATTATCTATACCAAAGTTAACCCGCTGGTGATTACGCTTGGCACGCTGTATCTGTTTGCCGGAAGCGCTCTGCTGCTTTCCGGTATGGCCGGAGCGACGGGGTACGAAGGTATTGGTGGATTCCCGATGGCGTTTACAGATTTCGCTAACCTGGATGTGCTGGGACTCCCCGTTCCGCTGATTATCTTCCTGATATGTCTCCTCGTTTTCTGGCTCTGGCTGCATAAAACCCATGCCGGACGTAATGTGTTTTTGATTGGGCAAAGCCCGCGCGTGGCGCTTTATAGCGCGATTCCAGTTAACCGTACCTTATGTGCGCTCTATGCCATGACGGGGCTGGCGTCTGCGGTCGCCGCTGTGCTGCTGGTATCGTATTTTGGTTCAGCACGTTCCGATCTCGGTGCGTCGTTTCTGATGCCCGCCATCACCGCCGTGGTGCTTGGCGGGGCCAATATTTATGGTGGTTCCGGTTCCATTATCGGCACCGCCATTGCGGTTTTATTAGTGGGATATTTGCAACAAGGTTTGCAAATGGCAGGAGTGCCAAATCAGGTGTCCAGCGCCCTTTCCGGTGCGCTACTTATCGTCGTTGTCGTAGGTCGTTCCGTTAGCCTGCATCGCCAGCAAATTAAAGAGTGGCTGGCGCGTCGGGCCAATAACCCATTGCCATAAAGGATATCTTCATGACACTTCATCGCTTTAAGAAAATCGCCTTACTTAGCGCTCTTGGCATTGCCGCAATCTCTATGAATGTGCAGGCCGCAGAGCGTATTGCATTTATTCCCAAACTGGTTGGCGTGGGATTTTTTACCAGCGGTGGCAACGGCGCACAACAAGCGGGTAAAGAGCTGGGCGTTGATGTGACCTACGACGGGCCGACAGAACCCAGTGTTTCTGGTCAGGTACAGTTGATTAATAACTTCGTCAATCAAGGTTATAACGCCATTATCGTTTCTGCGGTTTCGCCTGATGGCTTGTGTCCGGCACTGAAACGCGCCATGCAACGTGGTGTGAGAGTGCTGACCTGGGACTCTGATACTAAACCGGAGTGCCGCTCTTACTACATTAATCAGGGAACGCCCGCCCAGTTAGGAGGTATGTTGGTGGATATGGCGGCGCGTCAGGTGAATAAAGACAAAGCCAAAGTCGCGTTTTTCTACTCAAGCCCCACCGTTACGGACCAAAACCAGTGGGTGAAAGAAGCGAAAGCGAAAATCGCCAAAGAGCATCCAGGCTGGGAAATTGTCACTACGCAGTTTGGCTATAACGATGCCACTAAATCGTTACAAACCGCAGAAGGAATATTAAAAGCGTATAGCGATCTCGACGCCATTATCGCCCCCGATGCCAACGCCCTGCCCGCTGCCGCACAAGCCGCAGAAAACTTGAAAAATGACAAAGTAGCGATTGTCGGATTCAGTACGCCAAATGTGATGCGCCCGTATGTAGAGCGCGGCACGGTGAAAGAATTTGGCCTGTGGGATGTGGTTCAGCAAGGCAAAATTTCAGTGTATGTCGCGGATGCATTATTGAAAAAAGGATCAATGAAAACGGGCGACAAGCTGGATATCAAGGGCGTAGGTCAGGTTGAAGTCTCGCCAAACAGCGTTCAGGGCTATGACTACGAAGCGGATGGTAATGGCATCGTACTGTTACCGGAGCGCGTGATATTCAACAAAGAGAATATCGGCAAATACGATTTCTGATGTGCATTACTTAACCGGAGTAAGTTATGGCAGATTTAGACGATATTAAAGATGGTAAAGATTTTCGTACCGATCAACCGCAAAAAAATATCCCTTTTACCCTGAAAGGTTGCGGTGCGCTGGATTGGGGAATGCAGTCACGCTTATCGCGGATATTTAATCCGAAAACGGGTAAAACCGTGATGCTGGCTTTTGACCATGGTTATTTTCAGGGACCGACTACCGGACTTGAACGCATTGATATAAATATCGCCCCGCTGTTTGAACATGCCGATGTATTAATGTGTACGCGCGGCATTTTGCGCAGCGTAGTTCCCCCTGCGACCAATAGGCCGGTGGTACTGCGGGCGTCAGGTGCGAACTCTATTCTGGCGGAATTAAGTAATGAAGCCGTGGCGTTATCGATGGATGACGCCGTGCGCCTGAACAGTTGCGCGGTGGCGGCGCAGGTTTATATCGGCAGCGAATATGAACATCAGTCGATCAAAAATATTATTCAGCTGGTTGATGCCGGAATGAAAGTGGGAATGCCGACCATGGCCGTGACTGGCGTGGGCAAAGATATGGTGCGCGATCAGCGTTATTTCTCGCTCGCGACTCGAATCGCCGCTGAAATGGGGGCGCAAATTATCAAAACCTATTATGTCGAAAAAGGTTTTGAACGGATTGTTGCCGGATGTCCGGTACCCATTGTTATTGCTGGCGGTAAAAAATTACCGGAGCGCGAGGCGCTGGAAATGTGCTGGCAGGCTATCGATCAGGGCGCTTCTGGTGTGGATATGGGGCGTAATATTTTCCAGTCTGACCATCCGGTGGCGATGATGAAAGCCGTACAGGCGGTGGTTCACCATAACGAAACGGCTGATCGGGCATATGAACTCTATCTGAGTGAAAAACAGTAACTGCGGATCTAAGGAGAAGAATTATGCACGTCACACTGGTTGAAATTAACGTTCATGAAGACAAGGTTGACGAGTTTATCGAAGTTTTTCGCCAGAACCACCTGGGCTCTGTACAGGAAGAAGGCAATTTGCGCTTCGATGTCTTACAGGACCCGGAAGTGAATTCGCGCTTTTATATCTACGAAGCCTATAAAGATGAAGACGCAGTGGCGTTCCATAAAACCACGCCCCACTACAAAACCTGTGTCGCGAAACTGGAATCTTTAATGACCGGGCCGCGTAAAAAACGTCTGTTCAATGGTTTGATGCCGTGAATCTACCTCGAGGTTTATGGCTCGACTCTTTACCCTTTCAGAATCAAAGTACTACCTGATGGCGCTGGATGCAGGCACCGGAAGTATTCGGGCTGTGATATTCGACCTGGAAGGCAATCAAATAGCAGTGGGACAGGCGGAGTGGCGGCATCTGGCAGTACCGGACGTTCCTGGTTCTATGGAATTTGATCTCAACAAAAACTGGCAACTGGCGTGTGAGTGTATGCGCCAGGCGCTGCACAACGCCGGCATAGCCCCGGAGTATATCGCTGCCGTTTCGGCATGTTCGATGCGTGAAGGCATTGTTTTATATAATAATGAAGGAGCCCCGATCTGGGCCTGCGCCAATGTGGATGCCAGAGCGGCACGCGAAGTTAGCGAACTTAAAGAACTGCACAACAATACCTTTGAAAACGAAGTTTATCGCGCGACCGGACAAACACTGGCTTTAAGTGCCATCCCCAGATTACTTTGGCTGGCGCACCATCGTTCCGATATTTACCGTCAGGCATCAACCATCACCATGATCAGCGACTGGCTGGCCTATATGCTCAGCGGCGAACTGGCGGTGGATCCCTCTAACGCTGGCACCACGGGACTTCTTGATCTAACCACCCGTGACTGGAAACCTGCATTGCTGGATATGGCTGGCCTACGTGCCGATATTCTTTCTCCTGTCAAAGAAACCGGCACATTGCTGGGCGTGGTAAGTTCACAAGCGGCGGAACTCTGCGGTCTGAAGGCGGGCACTCCGGTGGTCGTTGGAGGAGGCGACGTGCAGCTTGGTTGCCTTGGGTTAGGCGTTGTGCGTCCGGCACAAACCGCGGTTCTTGGCGGCACATTCTGGCAGCAAGTTGTAAATTTAGCCGCGCCGGTGACAGACCCAGAAATGAACGTGCGCGTTAATCCTCATGTTATTCCTGGCATGGTACAAGCTGAATCTATAAGCTTTTTTACCGGACTCACCATGCGCTGGTTCCGCGATGCTTTCTGTGCCGAAGAAAAACTGATTGCCGAACGTTTAGGCATCGACACCTATACGCTGCTGGAAGAGATGGCCAGTCGGGTGCCGCCTGGGTCGTGGGGCGTAATGCCGATCTTCTCCGACAGAATGCGCTTTAAAACCTGGTATCACGCTGCGCCTTCCTTTATTAACTTGTCCATTGACCCGGATAAATGTAACAAAGCGACATTGTTCCGTGCGCTGGAAGAAAATGCGGCGATTGTATCAGCGTGTAACTTGCAGCAAATTGCTGATTTCTCGAATATTCATCCTTCATCGTTAGTCTTTGCAGGCGGAGGTTCAAAAGGGAAATTATGGAGTCAAATTCTCGCTGATGTCTCGGGATTACCCGTCAATATTCCGGTGGTCAAAGAAGCCACTGCATTAGGATGTGCCATTGCAGCTGGCGTCGGTGCCGGAATTTTTTCATCAATGGCAGAAACCGGAGAACGCCTGGTTCGCTGGGAACGGACGCACACACCAGACCCGGAAAAGCATGAACTTTATCAGGATTCACGCGATAAGTGGCAGGCAGTTTATCAGGATCAGCTGGGGCTGGTTGATCATGGACTGACGACGTCGTTATGGAAAGCGCCTGGGTTATAG
SEQ ID NO.3
asRNA
靶向dam基因在弧菌中表达的反义RNA序列
UAAUUCAACAAGAAUUGGGACAACUCCAGUGAAAAGUUCUUCUCCUUUACUCAU
SEQ ID NO.4
DNA
dam基因
弧菌
ATGAAAAAGCAACGAGCCTTTCTTAAGTGGGCAGGAGGCAAATACGGTCTGGTTGAAGACATCCAACGTCATTTACCACCGGCTCGAAAGCTAGTTGAACCCTTTGTTGGTGCTGGCTCGGTTTTTCTAAATACCGACTATGACCACTATCTACTGGCGGATATTAACCCCGACCTGATTAATCTCTATAACTTACTAAAAGAGCGTCCTGAAGAGTACATCTCAGAAGCGAAGCGCTGGTTTGTTGCAGAGAACAATCGCAAAGAAGCGTACTTGAATATTCGCGCCGAGTTTAATAAAACGGATGACGTGATGTACCGCTCGTTGGCGTTCCTATACATGAACCGCTTTGGCTTTAATGGCTTATGTCGTTATAACAAAAAAGGCGGCTTTAATGTCCCGTTTGGTTCTTACAAAAAGCCTTATTTCCCAGAAGCGGAGCTAGAATTCTTTGCTGAAAAAGCCAAGAAAGCGACGTTCGTATGTGAAGGTTACCCAGAAACGTTCAGTCGAGCGCGTAAAGGCAGCGTGGTTTATTGCGATCCACCGTACGCACCGTTGTCGAACACGGCGAACTTTACCTCTTATGCTGGCAACGGCTTTACGCTGGATGATCAAGCTGCATTGGCTGATATTGCAGAGAAAGCCGCAACTGAACGTGGTATCCCTGTTCTGATCTCAAACCATGACACGACATTAACGCGTCGCCTTTATCATGGTGCGGAGCTTAATGTCGTAAAAGTGAAGCGAACCATCAGTCGTAATGGCAGTGGTCGTAATAAAGTTGACGAGTTGCTGGCGCTATTTCGTGCACCTGACGCGGACAAATCTGACTCTTAA
序列表
<110> 卵石实验室公司
<120> 用于急性肝胰腺坏死病的控制的系统和方法
<130> 90115.00260
<150> 62541824
<151> 2017-08-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> Ochrobactrum
<400> 1
atgacaatta attatcatga attggaaacc agtcacggtc gtatcgcagt ccgtgagtca 60
gaaggggaag gtgcgccgct gctgatgata catggtaata gcagttccgg ggcgattttt 120
gcgccacagc ttgaggggga aataggaaag aaatggcgtg tcattgcccc agatctgccg 180
ggacatggaa agagcacgga cgcaatcgac ccggaccgct cttacagcat ggaaggctac 240
gctgatgcca tgacagaggt tatgcaacaa ctcggtattg cagatgcggt ggtattcggc 300
tggagccttg gaggtcatat tggcatagaa atgatcgcgc gttacccaga aatgcgtggt 360
ttaatgatta cgggcacccc tccggttgca cgggaagaag taggacaagg ctttaagagt 420
ggtccagata tggcgcttgc aggtcaagaa attttttcag aacgggatgt tgagtcttac 480
gctcggagta cgtgcggaga accttttgaa gctagtcttt tggacatcgt agcacggact 540
gacgggcggg ctagacgcat tatgttcgaa aaatttggga gtggaactgg cggtaaccaa 600
cgggacatcg ttgctgaagc acaattacct attgccgtag tgaatgggcg ggatgaacca 660
tttgtcgagt tggacttcgt tagcaaagtt aaatttggaa acctctggga aggtaaaact 720
catgtaatcg acaatgcggg acatgctcct ttccgggaag ctccagctga gttcgatgca 780
tatctcgccc gcttcatacg tgattgtacg cagtaa 816
<210> 2
<211> 7409
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 2
atgcaaacga gtgatacccg cgcgttaccg ctactttgcg cccgctcggt ttataaacag 60
tattcagggg tcaatgtcct gaaaggcatc gattttacgt tgcatcaggg ggaggtccac 120
gccctgctcg gcggcaatgg tgccggtaaa tcgacgttaa tgaagattat tgccggtatt 180
acccctgctg atagcggtac gctggagatt gagggcaaca actacgtcag attaacgcca 240
gttcatgctc atcagctggg tatttatctc gttccccagg aaccgctgct tttcccaagc 300
ctgtcgataa aagaaaacat cctgtttggg ctggcaaaaa aacagctctc catgcagaaa 360
atgaagaact tgctggcggc gctgggctgc cagtttgatc tgcatagtct ggcaggatcg 420
ctggatgtcg ccgatcgcca aatggtggaa atcctccgcg ggctgatgcg cgactcgcgg 480
attctgatcc tcgatgaacc taccgcctcg cttacccctg cggaaaccga acgcttgttt 540
agtcgcttgc aagagctgct tgctactggc gtgggtattg tttttatctc gcataagctg 600
ccggaaattc gccagattgc cgatcgaatt agcgtgatgc gcgacggaac catcgcctta 660
agcggcaaaa ccagcgaact gtctaccgac gacattattc aggccatcac cccagcggta 720
cgggaaaaat cgctctctgc cagccaaaaa ttatggctgg agttacctgg taaccgccca 780
caacatgccg ccggaacgcc ggtgctgaca ctggaaaatc tgaccggcga aggtttcagg 840
aatgtcagcc tgacgctcaa tgccggagaa attctgggcc tggctgggct ggtgggggcc 900
ggacgcacag aactggccga gacgctctat ggtctgcgta ctttgcgtgg cggacgcatt 960
atgctgaatg gtaaagagat caataaatta tccactggag aacgtttact gcgcggtctg 1020
gtttatctgc cggaagatcg ccagtcatcc ggactgaatc tcgatgcttc gctggcctgg 1080
aacgtctgcg cccttactca taaccttcgt ggattctggg cgaaaaccgc gaaagataat 1140
gccaccctgg aacgttatcg tcgggcgctg aatattaaat tcaaccaacc ggaacaagct 1200
gcacggacat tatccggtgg caaccagcaa aaaatcctca ttgccaaatg cttggaagct 1260
tcgccgcaag tattgattgt cgatgagccg acgcgcggcg tggatgtctc ggcccgtaat 1320
gatatctacc agctgttgcg cagcatcgcc gcacaaaatg tggctgtgct gcttatctcc 1380
tccgacctgg aagagatcga actgatggca gatcgtgtgt atgtgatgca tcagggcgaa 1440
attacccact ctgcactgac cgagcgcgat attaatgtcg agactattat gcgcgttgcc 1500
ttcggcgata gtcagcgtca ggaggcgtca tgctgaagtt tattcagaac aaccgtgaaa 1560
tcacggcact gctggcggtg gtgctgctgt ttgtattacc cggttttctc gaccgccagt 1620
atttaagtgt gcaaacgctg accatggttt atagcagcgc gcaaatcctg atcctgctgg 1680
caatgggcgc gacgctggta atgcttacgc gcaatattga tgtttcagtg ggttcgatta 1740
ccggaatgtg cgcggtgctg ttggggatgt tactgaacgc aggatattca ctacctgttg 1800
cttgtgtcgc gactttactg cttggtttgc tcgcgggatt tttcaacggt gtcctggtcg 1860
cgtggctaaa gatccctgcc attgttgcca cccttggcac gttagggttg tacagaggca 1920
tcatgttgct gtggactggc ggcaaatgga ttgaagggtt acccgccgaa ctgaaacagc 1980
tctccgcccc gctgctgctt ggcgtttcag caattggttg gttgacgata attctggtgg 2040
catttatggc ctggctgctg gcaaagacgg cgtttggacg cagtttttat gccacgggcg 2100
ataatttaca gggcgctcgt caactgggcg ttcgtactga agccattcgc attgtggcat 2160
tttcgttgaa cggctgcatg gcggcactgg cgggaattgt gtttgcttcg cagattggtt 2220
ttatccccaa ccagaccggt accgggctgg agatgaaagc aattgcagcc tgcgtgctgg 2280
gcggcattag tttgctcggt ggttccggtg cgatcattgg tgcggtactc ggcgcatggt 2340
tcctgacgca gatcgatagc gtactggtgc tgttgcgcat tccggcatgg tggaatgatt 2400
ttatcgcggg tctggttctg ctggcggtgc tggtgtttga tggacgcctg cgttgtgcgc 2460
tggaacgtaa tctacggcgg caaaaatatg cccgctttat gacgccaccg ccatccgtta 2520
aacccgcttc gtcaggtaaa aaacgggagg ccgcataatg cgtattcgct acggttggga 2580
actggctctt gccgcactgc tcgttattga gattgtcgca tttggtgcaa ttaacccgcg 2640
aatgttagat ctcaatatgt tgctgttcag caccagtgac tttatctgca ttggcattgt 2700
cgccctaccg ctaacgatgg tgattgtcag tggcgggatc gatatttcgt ttggttcgac 2760
catcggcctc tgcgccattg cattgggcgt actgtttcaa agtggtgtgc cgatgccgct 2820
ggcgatactc ctgaccttac tgctcggcgc attgtgcggg ctgatcaacg ccggattaat 2880
tatctatacc aaagttaacc cgctggtgat tacgcttggc acgctgtatc tgtttgccgg 2940
aagcgctctg ctgctttccg gtatggccgg agcgacgggg tacgaaggta ttggtggatt 3000
cccgatggcg tttacagatt tcgctaacct ggatgtgctg ggactccccg ttccgctgat 3060
tatcttcctg atatgtctcc tcgttttctg gctctggctg cataaaaccc atgccggacg 3120
taatgtgttt ttgattgggc aaagcccgcg cgtggcgctt tatagcgcga ttccagttaa 3180
ccgtacctta tgtgcgctct atgccatgac ggggctggcg tctgcggtcg ccgctgtgct 3240
gctggtatcg tattttggtt cagcacgttc cgatctcggt gcgtcgtttc tgatgcccgc 3300
catcaccgcc gtggtgcttg gcggggccaa tatttatggt ggttccggtt ccattatcgg 3360
caccgccatt gcggttttat tagtgggata tttgcaacaa ggtttgcaaa tggcaggagt 3420
gccaaatcag gtgtccagcg ccctttccgg tgcgctactt atcgtcgttg tcgtaggtcg 3480
ttccgttagc ctgcatcgcc agcaaattaa agagtggctg gcgcgtcggg ccaataaccc 3540
attgccataa aggatatctt catgacactt catcgcttta agaaaatcgc cttacttagc 3600
gctcttggca ttgccgcaat ctctatgaat gtgcaggccg cagagcgtat tgcatttatt 3660
cccaaactgg ttggcgtggg attttttacc agcggtggca acggcgcaca acaagcgggt 3720
aaagagctgg gcgttgatgt gacctacgac gggccgacag aacccagtgt ttctggtcag 3780
gtacagttga ttaataactt cgtcaatcaa ggttataacg ccattatcgt ttctgcggtt 3840
tcgcctgatg gcttgtgtcc ggcactgaaa cgcgccatgc aacgtggtgt gagagtgctg 3900
acctgggact ctgatactaa accggagtgc cgctcttact acattaatca gggaacgccc 3960
gcccagttag gaggtatgtt ggtggatatg gcggcgcgtc aggtgaataa agacaaagcc 4020
aaagtcgcgt ttttctactc aagccccacc gttacggacc aaaaccagtg ggtgaaagaa 4080
gcgaaagcga aaatcgccaa agagcatcca ggctgggaaa ttgtcactac gcagtttggc 4140
tataacgatg ccactaaatc gttacaaacc gcagaaggaa tattaaaagc gtatagcgat 4200
ctcgacgcca ttatcgcccc cgatgccaac gccctgcccg ctgccgcaca agccgcagaa 4260
aacttgaaaa atgacaaagt agcgattgtc ggattcagta cgccaaatgt gatgcgcccg 4320
tatgtagagc gcggcacggt gaaagaattt ggcctgtggg atgtggttca gcaaggcaaa 4380
atttcagtgt atgtcgcgga tgcattattg aaaaaaggat caatgaaaac gggcgacaag 4440
ctggatatca agggcgtagg tcaggttgaa gtctcgccaa acagcgttca gggctatgac 4500
tacgaagcgg atggtaatgg catcgtactg ttaccggagc gcgtgatatt caacaaagag 4560
aatatcggca aatacgattt ctgatgtgca ttacttaacc ggagtaagtt atggcagatt 4620
tagacgatat taaagatggt aaagattttc gtaccgatca accgcaaaaa aatatccctt 4680
ttaccctgaa aggttgcggt gcgctggatt ggggaatgca gtcacgctta tcgcggatat 4740
ttaatccgaa aacgggtaaa accgtgatgc tggcttttga ccatggttat tttcagggac 4800
cgactaccgg acttgaacgc attgatataa atatcgcccc gctgtttgaa catgccgatg 4860
tattaatgtg tacgcgcggc attttgcgca gcgtagttcc ccctgcgacc aataggccgg 4920
tggtactgcg ggcgtcaggt gcgaactcta ttctggcgga attaagtaat gaagccgtgg 4980
cgttatcgat ggatgacgcc gtgcgcctga acagttgcgc ggtggcggcg caggtttata 5040
tcggcagcga atatgaacat cagtcgatca aaaatattat tcagctggtt gatgccggaa 5100
tgaaagtggg aatgccgacc atggccgtga ctggcgtggg caaagatatg gtgcgcgatc 5160
agcgttattt ctcgctcgcg actcgaatcg ccgctgaaat gggggcgcaa attatcaaaa 5220
cctattatgt cgaaaaaggt tttgaacgga ttgttgccgg atgtccggta cccattgtta 5280
ttgctggcgg taaaaaatta ccggagcgcg aggcgctgga aatgtgctgg caggctatcg 5340
atcagggcgc ttctggtgtg gatatggggc gtaatatttt ccagtctgac catccggtgg 5400
cgatgatgaa agccgtacag gcggtggttc accataacga aacggctgat cgggcatatg 5460
aactctatct gagtgaaaaa cagtaactgc ggatctaagg agaagaatta tgcacgtcac 5520
actggttgaa attaacgttc atgaagacaa ggttgacgag tttatcgaag tttttcgcca 5580
gaaccacctg ggctctgtac aggaagaagg caatttgcgc ttcgatgtct tacaggaccc 5640
ggaagtgaat tcgcgctttt atatctacga agcctataaa gatgaagacg cagtggcgtt 5700
ccataaaacc acgccccact acaaaacctg tgtcgcgaaa ctggaatctt taatgaccgg 5760
gccgcgtaaa aaacgtctgt tcaatggttt gatgccgtga atctacctcg aggtttatgg 5820
ctcgactctt taccctttca gaatcaaagt actacctgat ggcgctggat gcaggcaccg 5880
gaagtattcg ggctgtgata ttcgacctgg aaggcaatca aatagcagtg ggacaggcgg 5940
agtggcggca tctggcagta ccggacgttc ctggttctat ggaatttgat ctcaacaaaa 6000
actggcaact ggcgtgtgag tgtatgcgcc aggcgctgca caacgccggc atagccccgg 6060
agtatatcgc tgccgtttcg gcatgttcga tgcgtgaagg cattgtttta tataataatg 6120
aaggagcccc gatctgggcc tgcgccaatg tggatgccag agcggcacgc gaagttagcg 6180
aacttaaaga actgcacaac aatacctttg aaaacgaagt ttatcgcgcg accggacaaa 6240
cactggcttt aagtgccatc cccagattac tttggctggc gcaccatcgt tccgatattt 6300
accgtcaggc atcaaccatc accatgatca gcgactggct ggcctatatg ctcagcggcg 6360
aactggcggt ggatccctct aacgctggca ccacgggact tcttgatcta accacccgtg 6420
actggaaacc tgcattgctg gatatggctg gcctacgtgc cgatattctt tctcctgtca 6480
aagaaaccgg cacattgctg ggcgtggtaa gttcacaagc ggcggaactc tgcggtctga 6540
aggcgggcac tccggtggtc gttggaggag gcgacgtgca gcttggttgc cttgggttag 6600
gcgttgtgcg tccggcacaa accgcggttc ttggcggcac attctggcag caagttgtaa 6660
atttagccgc gccggtgaca gacccagaaa tgaacgtgcg cgttaatcct catgttattc 6720
ctggcatggt acaagctgaa tctataagct tttttaccgg actcaccatg cgctggttcc 6780
gcgatgcttt ctgtgccgaa gaaaaactga ttgccgaacg tttaggcatc gacacctata 6840
cgctgctgga agagatggcc agtcgggtgc cgcctgggtc gtggggcgta atgccgatct 6900
tctccgacag aatgcgcttt aaaacctggt atcacgctgc gccttccttt attaacttgt 6960
ccattgaccc ggataaatgt aacaaagcga cattgttccg tgcgctggaa gaaaatgcgg 7020
cgattgtatc agcgtgtaac ttgcagcaaa ttgctgattt ctcgaatatt catccttcat 7080
cgttagtctt tgcaggcgga ggttcaaaag ggaaattatg gagtcaaatt ctcgctgatg 7140
tctcgggatt acccgtcaat attccggtgg tcaaagaagc cactgcatta ggatgtgcca 7200
ttgcagctgg cgtcggtgcc ggaatttttt catcaatggc agaaaccgga gaacgcctgg 7260
ttcgctggga acggacgcac acaccagacc cggaaaagca tgaactttat caggattcac 7320
gcgataagtg gcaggcagtt tatcaggatc agctggggct ggttgatcat ggactgacga 7380
cgtcgttatg gaaagcgcct gggttatag 7409
<210> 3
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<221>
<222>
<223> 靶向dam基因在弧菌中表达的反义RNA序列（Anti-sense RNA sequencetargeting expression of dam gene in
Vibrio）
<400> 3
uaauucaaca agaauuggga caacuccagu gaaaaguucu ucuccuuuac ucau 54
<210> 4
<211> 840
<212> DNA
<213> 弧菌（Vibrio sp.）
<400> 4
atgaaaaagc aacgagcctt tcttaagtgg gcaggaggca aatacggtct ggttgaagac 60
atccaacgtc atttaccacc ggctcgaaag ctagttgaac cctttgttgg tgctggctcg 120
gtttttctaa ataccgacta tgaccactat ctactggcgg atattaaccc cgacctgatt 180
aatctctata acttactaaa agagcgtcct gaagagtaca tctcagaagc gaagcgctgg 240
tttgttgcag agaacaatcg caaagaagcg tacttgaata ttcgcgccga gtttaataaa 300
acggatgacg tgatgtaccg ctcgttggcg ttcctataca tgaaccgctt tggctttaat 360
ggcttatgtc gttataacaa aaaaggcggc tttaatgtcc cgtttggttc ttacaaaaag 420
ccttatttcc cagaagcgga gctagaattc tttgctgaaa aagccaagaa agcgacgttc 480
gtatgtgaag gttacccaga aacgttcagt cgagcgcgta aaggcagcgt ggtttattgc 540
gatccaccgt acgcaccgtt gtcgaacacg gcgaacttta cctcttatgc tggcaacggc 600
tttacgctgg atgatcaagc tgcattggct gatattgcag agaaagccgc aactgaacgt 660
ggtatccctg ttctgatctc aaaccatgac acgacattaa cgcgtcgcct ttatcatggt 720
gcggagctta atgtcgtaaa agtgaagcga accatcagtc gtaatggcag tggtcgtaat 780
aaagttgacg agttgctggc gctatttcgt gcacctgacg cggacaaatc tgactcttaa 840

Claims (158)

1.构造用于早期死亡综合征(EMS)的生物控制的基因修饰的细菌，包括：
基因修饰的供体细菌，可以被引入目标宿主并表达至少一种异源反义RNA多核苷酸(asRNA)，所述异源反义RNA多核苷酸被构造为转移出所述基因修饰的供体细菌并被所述目标宿主的引起EMS的病原体摄入，以抑制所述引起EMS的病原体中至少一种必需基因的表达。
2.根据权利要求1所述的基因修饰的细菌，其中所述引起EMS的病原体包括弧菌种。
3.根据权利要求2所述的基因修饰的细菌，其中所述必需基因包括负责DNA甲基化的基因。
4.根据权利要求3所述的基因修饰的细菌，其中所述负责DNA甲基化的基因包括DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因。
5.根据权利要求4所述的基因修饰的细菌，其中所述dam基因包含SEQ ID NO.4或与SEQID NO.4具有约75％或更高的同源性的序列。
6.根据权利要求5所述的基因修饰的细菌，其中所述异源asRNA包括被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因或其同源物表达的异源asRNA。
7.根据权利要求6所述的基因修饰的细菌，其中所述被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因表达的异源asRNA包括鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA。
8.根据权利要求7所述的基因修饰的细菌，其中所述基因修饰的供体细菌包括选自以下的基因修饰的供体微生物：共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、基因修饰的供体藻类和自体基因修饰的供体细菌。
9.根据权利要求8所述的基因修饰的细菌，其中所述目标宿主是水生生物。
10.根据权利要求9所述的基因修饰的细菌，其中所述水生生物是虾和/或在水产养殖中养殖的虾。
11.根据权利要求10所述的基因修饰的细菌，其中所述基因修饰的供体细菌包括以所述基因修饰的供体细菌为成分的饲料或虾养殖池接种物。
12.根据权利要求10所述的基因修饰的细菌，其中所述表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过垂直传播来传播给虾后代。
13.根据权利要求10所述的基因修饰的细菌，其中所述表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过水平传播来传播给虾种群。
14.根据权利要求8所述的基因修饰的细菌，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致由一种或多种弧菌种引起的EMS的致死率降低。
15.根据权利要求8所述的基因修饰的细菌，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致减少生物膜的形成、或减少包括一种或多种引起EMS的弧菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达。
16.根据权利要求8所述的基因修饰的细菌，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致一种或多种引起EMS的弧菌的致病性降低。
17.用于病原细菌的生物防治的水生生物可摄取化合物，包含：
具有基因修饰的供体细菌的用于EMS感染和/或易感染的水生生物的处理的饲料或液体接种物，所述基因修饰的供体细菌可以通过所述处理的饲料或通过水传播引入目标宿主，并且进一步表达至少一种异源反义RNA多核苷酸(asRNA)，所述异源反义RNA多核苷酸被构造为转移出所述基因修饰的供体细菌并被所述目标宿主的引起EMS的病原体摄入，并抑制所述引起EMS的病原体中至少一种必需基因的表达。
18.根据权利要求17所述的水生生物可摄取化合物，其中所述引起EMS的病原体包括弧菌种。
19.根据权利要求18所述的水生生物可摄取化合物，其中所述必需基因包括负责DNA甲基化的基因。
20.根据权利要求19所述的水生生物可摄取化合物，其中所述负责DNA甲基化的基因包括DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因。
21.根据权利要求20所述的水生生物可摄取化合物，其中所述dam基因包含SEQ IDNO.4或与SEQ ID NO.4具有约75％或更高的同源性的序列。
22.根据权利要求21所述的水生生物可摄取化合物，其中所述异源asRNA包括被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因或其同源物表达的异源asRNA。
23.根据权利要求22所述的水生生物可摄取化合物，其中所述被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因表达的异源asRNA包括鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA。
24.根据权利要求23所述的水生生物可摄取化合物，其中所述基因修饰的供体细菌包括选自以下的基因修饰的供体微生物：共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、基因修饰的供体藻类和自体基因修饰的供体细菌。
25.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述目标宿主是水生生物。
26.根据权利要求25所述的水生生物可摄取化合物，其中所述水生生物是虾。
27.根据权利要求26所述的水生生物可摄取化合物，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
28.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述表达被鉴定为SEQ IDNO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过垂直传播来传播给虾后代。
29.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述表达被鉴定为SEQ IDNO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过水平传播来传播给虾种群。
30.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致由一种或多种弧菌种引起的EMS的致死率降低。
31.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致减少生物膜的形成、或减少包括一种或多种引起EMS的弧菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达。
32.根据权利要求24所述的水生生物可摄取化合物，其中所述基因修饰的供体细菌表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA，其中施用治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌导致一种或多种引起EMS的弧菌的致病性降低。
33.一种治疗生物中的早期死亡综合征(EMS)的方法，包括以下步骤：
产生构造为表达异源asRNA多核苷酸的基因修饰的供体细菌，所述异源asRNA多核苷酸与引起EMS的细菌病原体的一种或多种DNA甲基化基因的mRNA互补；
将所述基因修饰的供体细菌引入被所述引起EMS的细菌病原体感染和/或易于感染的目标宿主；
表达与所述引起EMS的细菌病原体的所述一种或多种DNA甲基化基因互补的所述异源asRNA多核苷酸；
将所述异源asRNA多核苷酸转移出所述基因修饰的供体细菌；
将所述异源asRNA多核苷酸引入所述引起EMS的细菌病原体中，其中所述引起EMS的细菌病原体摄入所述异源asRNA多核苷酸；和
抑制所述引起EMS的细菌病原体的所述一种或多种DNA甲基化基因的表达，从而引起所述引起EMS的细菌病原体中DNA甲基化的减少。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述引起EMS的细菌病原体包括弧菌种。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述DNA甲基化基因包括DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述dam基因包含SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4具有约75％或更高的同源性的序列。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述异源asRNA包括被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因或其同源物表达的异源asRNA。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因表达的异源asRNA包括鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述基因修饰的供体细菌包括选自以下的基因修饰的供体微生物：共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、基因修饰的供体藻类和自体基因修饰的供体细菌。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述目标宿主是水生生物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述水生生物是虾。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ IDNO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过垂直传播来传播给虾后代。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述表达被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ IDNO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA的基因修饰的供体细菌通过水平传播来传播给虾种群。
45.根据权利要求39所述的方法，将所述基因修饰的供体细菌引入目标宿主包括下列步骤：向虾中引入表达治疗有效量的被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的所述异源asRNA的所述基因修饰的供体细菌，其中施用所述治疗有效量的所述异源asRNA导致由一种或多种引起EMS的弧菌引起的EMS的致死率降低。
46.根据权利要求39所述的方法，将所述基因修饰的供体细菌引入目标宿主包括下列步骤：向虾中引入表达治疗有效量的被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的所述异源asRNA的所述基因修饰的供体细菌，其中施用所述治疗有效量的所述异源asRNA导致减少生物膜、或减少包括一种或多种引起EMS的弧菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达。
47.根据权利要求39所述的方法，将所述基因修饰的供体细菌引入目标宿主包括下列步骤：向虾中引入表达治疗有效量的被鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的所述异源asRNA的所述基因修饰的供体细菌，其中施用所述治疗有效量的所述异源asRNA导致一种或多种引起EMS的弧菌的致病性降低。
48.一种破坏病原细菌中群体感应的方法，包括：
转化细菌以产生基因修饰的细菌，该基因修饰的细菌被构造为表达至少一种异源群体猝灭系统，该系统被构造为从环境中去除外源性自诱导剂-2(AI-2)分子并将它们转移到所述基因修饰的细菌中；
将所述基因修饰的细菌引入感染能够QS的病原体的生物或环境中，和/或引入易于被能够QS的病原细菌定植的生物或环境中；和
表达所述至少一种异源群体猝灭系统分子，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述生物包括水生生物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述水生生物包括虾。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述病原细菌包括引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌包括弧菌种。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述表达被构造为从环境中去除外源性AI-2分子并将它们转移到所述基因修饰的细菌中的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达可操作地连接启动子的异源lsr操纵子，所述启动子被构造为表达将外源性自诱导剂分子AI-2从所述环境主动地泵送到所述转化的细菌细胞中的至少一种ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和至少一种伴侣蛋白。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述异源lsr操纵子被鉴定为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有约75％或更高的同源性的序列。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述启动子包括组成型和/或诱导型启动子。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述基因修饰的细菌包括选自以下的基因修饰的细菌：肠基因修饰的供体细菌、共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、和大肠杆菌、或其他共生细菌。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将具有所述基因修饰的细菌作为成分的处理的饲料或液体接种物引入虾和/或水产养殖环境。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将所述基因修饰的细菌直接引入虾和/或水产养殖环境。
60.根据权利要求57所述的方法，并且还包括下列步骤：将被构造为表达异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌通过垂直和/或水平转移传播到虾种群。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述表达所述异源lsr操纵子的步骤，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制，上述步骤包括下列步骤：表达所述异源lsr操纵子，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中生物膜的形成、或包括所述病原细菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达被降低和/或抑制。
62.根据权利要求57所述的方法，其中所述表达所述异源lsr操纵子的步骤，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制，上述步骤包括下列步骤：表达所述异源lsr操纵子，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中所述病原细菌的QS介导的致病性被降低和/或抑制。
63.根据权利要求57所述的方法，其中所述表达所述异源lsr操纵子的步骤，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制，上述步骤包括下列步骤：表达所述异源lsr操纵子，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中治疗和/或预防由弧菌引起的EMS。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述表达所述异源lsr操纵子的步骤，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制，上述步骤包括下列步骤：表达所述异源lsr操纵子，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中由一种或多种弧菌种引起的EMS引起的所述目标宿主的死亡率降低。
65.用于病原细菌的生物防治的水生生物可摄取化合物，包含：
具有基因修饰的供体细菌的用于病原细菌感染和/或易感染的目标宿主的处理的饲料或液体接种物，所述基因修饰的供体细菌具有异源核酸，所述异源核酸可以通过所述处理的饲料或通过水传播引入目标宿主，并且进一步其中所述异源核酸编码至少一种异源群体猝灭分子，所述异源群体猝灭分子被构造为从环境中去除外源性自诱导剂-2(AI-2)分子并将它们转移到所述基因修饰的细菌中，从而导致所述病原细菌中群体感应(QS)的降低和/或抑制。
66.根据权利要求65所述的化合物，其中所述目标宿主包括水生生物。
67.根据权利要求66所述的化合物，其中所述水生生物包括虾。
68.根据权利要求67所述的化合物，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
69.根据权利要求68所述的化合物，其中所述病原细菌包括引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌。
70.根据权利要求69所述的化合物，其中所述引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌包括弧菌种。
71.根据权利要求70所述的化合物，其中异源核酸包含可操作地连接启动子的lsr操纵子，所述启动子被构造为表达将自诱导剂分子外源性AI-2从所述环境主动地泵送到所述基因修饰的细菌细胞中的至少一种ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和至少一种伴侣蛋白。
72.根据权利要求71所述的化合物，其中所述lsr操纵子被鉴定为SEQ ID NO.2或与SEQID NO.2具有约75％或更高的同源性的序列。
73.根据权利要求72所述的化合物，其中所述启动子包括组成型和/或诱导型启动子。
74.根据权利要求73所述的化合物，其中所述基因修饰的细菌包括选自以下的基因修饰的细菌：肠基因修饰的供体细菌、共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、和大肠杆菌、或其他共生细菌。
75.根据权利要求74所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌可以通过垂直和/或水平转移而传播。
76.根据权利要求74所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源lsr操纵子的基因修饰的细菌，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中生物膜的形成、或包括所述病原细菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达被降低和/或抑制。
77.根据权利要求74所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源lsr操纵子的基因修饰的细菌，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中所述病原细菌的QS介导的致病性被降低和/或抑制。
78.根据权利要求74所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源lsr操纵子的基因修饰的细菌，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中治疗和/或预防由弧菌引起的EMS。
79.根据权利要求74所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源lsr操纵子的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源lsr操纵子的基因修饰的细菌，其中所述环境中外源性AI-2分子的水平降低至这样的水平，其中由一种或多种弧菌种引起的EMS引起的所述目标宿主的死亡率降低。
80.一种破坏病原细菌中群体感应的方法，包括：
转化细菌以产生基因修饰的细菌，该基因修饰的细菌被构造为表达至少一种异源群体猝灭分子，该异源群体猝灭分子被构造为抑制一种或多种外源性自诱导剂-1(AI-1)分子；
将所述基因修饰的细菌引入感染能够QS的病原体的生物或环境中，和/或引入易于被能够QS的病原细菌定植的生物或环境中；和
表达所述至少一种异源群体猝灭分子，其中所述环境中外源性AI-1分子的水平抑制至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被降低和/或抑制。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述生物包括水生生物。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述水生生物包括虾。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述病原细菌包括引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌包括弧菌种。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述表达被构造为一种或多种外源性AI-1分子的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AI-1分子失活的高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AHL类QS分子失活的AHL内酯酶。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述外源性AHL类QS分子包括外源性Hal-1。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达异源aidH基因。
90.根据权利要求86所述的方法，其中所述异源aidH基因被鉴定为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有约75％或更高的同源性的序列。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述启动子包括组成型和/或诱导型启动子。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述基因修饰的细菌包括选自以下的基因修饰的细菌：肠基因修饰的供体细菌、共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、和大肠杆菌、或其他共生细菌。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将具有所述基因修饰的细菌作为成分的处理的饲料或液体接种物引入虾和/或水产养殖环境。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将所述基因修饰的细菌直接引入虾和/或水产养殖环境。
95.根据权利要求92所述的方法，并且还包括下列步骤：将被构造为表达异源aidH的所述基因修饰的细菌通过垂直和/或水平转移传播到虾种群。
96.根据权利要求92所述的方法，其中所述表达所述异源aidH的步骤包括表达异源aidH，使得所述环境中外源性AI-1分子的水平抑制至这样的水平，其中生物膜的形成、或包括所述病原细菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达被降低和/或抑制。
97.根据权利要求92所述的方法，其中所述表达所述异源aidH的步骤包括表达异源aidH，使得所述环境中外源性AI-1分子的水平抑制至这样的水平，其中所述病原细菌的QS介导的致病性被降低和/或抑制。
98.根据权利要求92所述的方法，其中所述表达所述异源aidH的步骤包括表达异源aidH，使得所述环境中外源性AI-1分子的水平抑制至这样的水平，其中治疗和/或预防由弧菌引起的EMS。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述表达所述异源aidH的步骤包括表达异源aidH，使得所述环境中外源性AI-1分子的水平抑制至这样的水平，其中由一种或多种弧菌种引起的EMS引起的所述目标宿主的死亡率降低。
100.用于病原细菌的生物防治的水生生物可摄取化合物，包含：
具有基因修饰的供体细菌的用于病原细菌感染和/或易感染的目标宿主的处理的饲料或液体接种物，所述基因修饰的供体细菌具有异源核酸，所述异源核酸可以通过所述处理的饲料或通过水传播引入目标宿主，并且进一步其中所述异源核酸编码至少一种异源群体猝灭分子，所述异源群体猝灭分子被构造为抑制外源性自诱导剂-1(AI-1)分子，从而导致所述病原细菌中群体感应(QS)的降低和/或抑制。
101.根据权利要求100所述的化合物，其中所述目标宿主包括水生生物。
102.根据权利要求101所述的化合物，其中所述水生生物包括虾。
103.根据权利要求102所述的化合物，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
104.根据权利要求103所述的化合物，其中所述病原细菌包括引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌。
105.根据权利要求104所述的化合物，其中所述引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌包括弧菌种。
106.根据权利要求105所述的化合物，其中所述表达被构造为一种或多种外源性AI-1分子的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AI-1分子失活的高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)。
107.根据权利要求106所述的化合物，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AHL类QS分子失活的AHL内酯酶。
108.根据权利要求107所述的化合物，其中所述外源性AHL类QS分子包括外源性Hal-1。
109.根据权利要求108所述的化合物，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达异源aidH基因。
110.根据权利要求106所述的化合物，其中所述异源aidH基因被鉴定为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有约75％或更高的同源性的序列。
111.根据权利要求110所述的化合物，其中所述启动子包括组成型和/或诱导型启动子。
112.根据权利要求110所述的化合物，其中所述基因修饰的细菌包括选自以下的基因修饰的细菌：肠基因修饰的供体细菌、共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、和大肠杆菌、或其他共生细菌。
113.根据权利要求112所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源aidH的所述基因修饰的细菌可以通过垂直和/或水平转移而传播。
114.根据权利要求112所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源aidH的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源aidH的基因修饰的细菌，其中所述外源性AI-1的水平抑制至这样的水平，其中生物膜的形成、或包括所述病原细菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达被降低和/或抑制。
115.根据权利要求112所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源aidH的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源aidH的基因修饰的细菌，其中所述外源性AI-1的水平抑制至这样的水平，其中所述病原细菌的QS介导的致病性被降低和/或抑制。
116.根据权利要求112所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源aidH的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源aidH的基因修饰的细菌，其中所述外源性AI-1的水平抑制至这样的水平，其中治疗和/或预防由弧菌引起的EMS。
117.根据权利要求112所述的化合物，其中所述被构造为表达所述异源aidH的所述基因修饰的细菌包括这样的被构造为表达所述异源aidH的基因修饰的细菌，其中所述外源性AI-1的水平抑制至这样的水平，其中由一种或多种弧菌种引起的EMS引起的所述目标宿主的死亡率降低。
118.一种破坏病原细菌中群体感应的方法，包括：
转化细菌以产生基因修饰的细菌，该基因修饰的细菌被构造为表达第一异源群体猝灭分子，所述第一异源群体猝灭分子被构造为抑制一种或多种外源性自诱导剂-1(AI-1)分子；
转化细菌以产生基因修饰的细菌，该基因修饰的细菌被构造为表达第二异源群体猝灭分子，所述第二异源群体猝灭分子被构造为从环境中去除外源性自诱导剂-2(AI-2)分子并将它们转移到所述基因修饰的细菌中；
将所述基因修饰的细菌引入感染能够QS的病原体的生物或环境中，和/或引入易于被能够QS的病原细菌定植的生物或环境中；
表达所述第一和第二异源群体猝灭分子，其中所述环境中外源性AI-1和AI02分子的水平降低和/或抑制至这样的水平，其中通过所述病原细菌的QS分子调节的发病特征/基因表达被破坏。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述目标宿主包括水生生物。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述水生生物包括虾。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述病原细菌包括引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述引起早期死亡综合征(EMS)的病原细菌包括弧菌种。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述表达被构造为从环境中去除外源性AI-2分子并将它们转移到所述基因修饰的细菌中的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达可操作地连接启动子的lsr操纵子，所述启动子被构造为表达将外源性自诱导剂分子AI-2从所述环境主动地泵送到所述转化的细菌细胞中的至少一种ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和至少一种伴侣蛋白。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述lsr操纵子被鉴定为SEQ ID NO.2或与SEQID NO.2具有约75％或更高的同源性的序列。
126.根据权利要求123所述的方法，其中所述表达被构造为一种或多种外源性AI-1分子的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AI-1分子失活的高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AHL类QS分子失活的AHL内酯酶。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述外源性AHL类QS分子包括外源性Hal-1。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达异源aidH基因。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述aidH基因被鉴定为SEQ ID NO.1或与SEQID NO.1具有约75％或更高的同源性的序列。
131.根据权利要求125和129所述的方法，其中所述基因修饰的细菌包括选自以下的基因修饰的细菌：肠基因修饰的供体细菌、共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、和大肠杆菌、或其他共生细菌。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将具有所述基因修饰的细菌作为成分的处理的饲料或液体接种物引入虾和/或水产养殖环境。
133.根据权利要求131所述的方法，其中所述将所述基因修饰的细菌引入生物或环境的步骤包括以下步骤：将所述基因修饰的细菌直接引入虾和/或水产养殖环境。
134.根据权利要求131所述的方法，并且还包括下列步骤：将被构造为表达第一和第二源群体猝灭分子的所述基因修饰的细菌通过垂直和/或水平转移传播到虾种群。
135.根据权利要求131所述的方法，其中所述表达所述第一和第二异源群体猝灭分子的步骤包括表达第一和第二异源群体猝灭分子，使得所述环境中外源性AI-1和AI-2分子的水平降低和/或抑制至这样的水平，其中生物膜的形成、或包括所述病原细菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达被降低和/或抑制。
136.根据权利要求131所述的方法，其中所述表达所述第一和第二异源群体猝灭分子的步骤包括表达第一和第二异源群体猝灭分子，使得所述环境中外源性AI-1和AI-2分子的水平降低和/或抑制至这样的水平，其中所述病原细菌的QS介导的致病性被降低和/或抑制。
137.根据权利要求131所述的方法，其中所述表达所述第一和第二异源群体猝灭分子的步骤包括表达第一和第二异源群体猝灭分子，使得所述环境中外源性AI-1和AI-2分子的水平降低和/或抑制至这样的水平，其中治疗和/或预防由弧菌引起的EMS。
138.根据权利要求131所述的方法，其中所述表达所述第一和第二异源群体猝灭分子的步骤包括表达第一和第二异源群体猝灭分子，使得所述环境中外源性AI-1和AI-2分子的水平降低和/或抑制至这样的水平，其中由一种或多种弧菌种引起的EMS引起的所述目标宿主的死亡率降低。
139.一种治疗生物中的早期死亡综合征(EMS)的方法，包括以下步骤：
产生被构造为表达以下一种或多种的基因修饰的供体细菌：
异源asRNA多核苷酸，与引起EMS的细菌病原体的一种或多种DNA甲基化基因的mRNA互补；和/或
群体猝灭系统，还包含：
第一异源群体猝灭分子，被构造为抑制一种或多种外源性自诱导剂-1(AI-1)分子；和/或
第二异源群体猝灭分子，被构造为从环境中去除外源性自诱导剂-2(AI-2)分子并将它们转移到所述基因修饰的供体细菌中；
将所述基因修饰的供体细菌引入被所述引起EMS的细菌病原体感染和/或易于感染的目标宿主。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述目标宿主是水生生物。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述水生生物是虾。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述虾包括在水产养殖中养殖的虾。
143.根据权利要求140所述的方法，其中所述引起EMS的病原体包括弧菌种。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述DNA甲基化基因包括DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述dam基因包含SEQ ID NO.4或与SEQ IDNO.4具有约75％或更高的同源性的序列。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述异源asRNA包括被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因或其同源物表达的异源asRNA.
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述被构造为抑制DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因表达的异源asRNA包括鉴定为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有约85％或更高的同源性的序列的异源asRNA。
148.根据权利要求143所述的方法，其中表达被构造为从环境中去除外源性AI-2分子并将它们转移到所述基因修饰的供体细菌中的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达可操作地连接启动子的lsr操纵子，所述启动子被构造为表达将外源性自诱导剂分子AI-2从所述环境主动地泵送到所述转化的细菌细胞中的至少一种ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)和至少一种伴侣蛋白。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述lsr操纵子被鉴定为SEQ ID NO.2或与SEQID NO.2具有约75％或更高的同源性的序列。
150.根据权利要求143所述的方法，其中所述表达被构造为一种或多种外源性AI-1分子的至少一种异源群体猝灭分子的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AI-1分子失活的高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达被构造为使外源性AHL类QS分子失活的AHL内酯酶。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述外源性AHL类QS分子包括外源性Hal-1。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述表达被构造为使外源性AI-1分子失活的AHL内酯酶的步骤包括下列步骤：表达异源aidH基因。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述异源aidH基因被鉴定为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有约75％或更高的同源性的序列。
155.根据以上任何一项权利要求所述的方法，其中所述基因修饰的供体细菌包括选自以下的基因修饰的供体微生物：共生基因修饰的供体细菌、虾益生菌基因修饰的供体细菌、虾共生基因修饰的供体细菌、虾内共生基因修饰的供体细菌、虾肠基因修饰的供体细菌、Ag1、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、基因修饰的供体藻类、或其他共生细菌。
156.根据以上任何一项权利要求所述的方法，并且还包括向目标宿主提供治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌，其中所述治疗有效量导致由一种或多种引起EMS的弧菌引起的EMS的致死率降低。
157.根据以上任何一项权利要求所述的方法，并且还包括向目标宿主提供治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌，其中所述治疗有效量导致减少生物膜、或减少包括一种或多种引起EMS的弧菌引起的毒素产生所涉及那些的致病基因的表达。
158.根据以上任何一项权利要求所述的方法，并且还包括向目标宿主提供治疗有效量的所述基因修饰的供体细菌，其中所述治疗有效量导致一种或多种引起EMS的弧菌的致病性降低。
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