CN111432633B - 用于培养普通章鱼真蛸的双幼体的方法 - Google Patents

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Abstract

基于包含麦秆虫Phtisica marina和长鳃麦秆虫和/或钩虾属物种类型的钩虾亚目物种的饵料饮食来饲养普通章鱼真蛸直至其沉降(底栖阶段)的方法。优化了光照条件、水更新、温度等因素以获得双幼体的最大存活率。

Description

用于培养普通章鱼真蛸的双幼体的方法
技术领域
本发明涉及一种用于培养普通章鱼即真蛸(Octopus vulgaris)的幼体的方法。特别地，本发明涉及允许该物种的双幼体的沉降期的培养方案。因此，本发明属于水产养殖领域。
背景技术
普通章鱼(真蛸，Octopus vulgaris)由于其生长迅速、繁殖力强、易于被捕捞、市场价格高和需求量高，是水产养殖中具有多样化的高潜力的物种。章鱼的工业肥育始于1996年，西班牙西北部的加利西亚。这种关注来自西班牙海洋学研究所的研究者所获得的结果(Iglesias,J.和Fuentes,L.(2014)“Octopus vulgaris paralarval culture,”于Cephalopod Culture,J.Iglesias,L.Fuentes和R.Villanueva编(New York,NY；Heidelberg；Dordrecht；London:Springer),427-450)，在先导性试验中，发现750克稚鱼在仅4个月内就达到了商业大小(2.5-3千克)。继这些初步结果取得进展之后，于1997年获得了12公吨(t)的产量，主要位于加利西亚的Rías Bajas(García-García,J等人(2004)Costanalysis of octopus ongrowing installation in Galicia.Spanish Journal ofAgricultural Research,2:531-537)。
然而，由于肥育个体的供应完全依赖于在自然环境中捕获的稚鱼，因此这种类型的生产潜力非常有限。由于这些原因，这种类型的生产在2012年减少到仅4.5t，并且目前没有任何有意义的数据。限制这种生产的另一方面是缺少用于成鱼的人工饲料，目前依赖于具有低商业价值的冷冻饵料(例如甲壳类动物、鱼等)。然而，该领域中最近的研究(CerezoValverde,J.,&García,B.G.(2017)High feeding and growth rates in common octopus(Octopus vulgaris)fed formulated feeds with an improved amino acid profileand mixture of binders.Aquaculture Research,48(7),3308-3319)正在改善用人工饲料获得的结果。所有这些问题的解决方案在于通过培养技术生产稚鱼，而不是从自然环境中捕获它们。但是，生命初期的高死亡率(实际上为100％)阻止了商业水平上的稚鱼生产(Iglesias和Fuentes,2014)。
由于上述原因，商业水平上章鱼的水产养殖的存活力主要取决于个体在称为双幼体(paralarva)的生命阶段中的存活率的提高。该阶段的特征在于生活在水柱中的个体(它们是浮游生物)。该阶段的持续时间主要取决于温度和饮食，可能在20℃持续65-70天(Iglesias和Fuentes,2014)。最初，这些个体具有特有的外貌(图1)，体重为0.20至0.30mg干重，并且在每个臂上呈现3个吸盘。当章鱼超过9mg干重并呈现18至20只吸盘时，它们采取小的成年章鱼的典型形状并迁移至底部(它们变成底栖的)，进入幼年阶段。达到此点后，要澄清的一个重要之处是在日本已产生了关于普通章鱼培养的部分参考文献(Okumura,S.,等人(2005)Improved survival and growth in Octopus vulgaris paralarvae byfeeding large type Artemia sp.and Pacific sandeel,Ammodytespersonatus.Aquaculture 244,147-157)。然而，最近已表明日本种群是不同的物种，现称作中华章鱼(Octopus sinensis)(Amor,M.D.等人(2017).Morphological assessment ofthe Octopus vulgaris species complex evaluated in light of molecular-basedphylogenetic inferences.Zoologica Scripta,46(3),275-288)，因此任何比较必须小心进行，因为结果是不同的并且在欧洲种群中几乎不会再现(Iglesias和Fuentes,2014)。
在双幼体期的死亡率似乎与动物技术和/或营养方面有关。在生命的第一阶段，使用活饵料已经获得了最佳结果，迄今为止最好接受的是甲壳纲十足目动物尤其是Maja蟹属物种的幼体(zoea(蚤类))。第一次在捕获条件下成功闭合真蛸周期是于2001年，使用蟹蚤作为饵料，但在该试验中仅有两只章鱼达到成年龄。其他作者获得了类似的结果，但在沉降中存活率不超过5％(Iglesias和Fuentes,2014)。还应补充的是，这些经验是不可再现的，因为随后的结果已表明了显著的可变性(Garrido,D.,等人(2016).Meta-analysisapproach to the effects of live prey on the growth of Octopus vulgarisparalarvae under culture conditions.综述于Aquaculture doi:10.1111/raq.12142)。应当补充说明的是，在所有试验中使用了甲壳类幼体例如螃蟹，由于它们的成本和难以大规模获得，这在商业规模上是不可行的。
迄今为止，唯一商业上可行的饵料是卤虫属物种(Artemia sp.)，一种容易获得的小型甲壳类动物，在以幼鱼为食的水产养殖中非常有用。然而，用该卤虫属物种进行的试验没有实现达到双幼体的沉降所需的生长或存活，尽管在丰富其营养状况方面进行了大量尝试。使用这些饵料的另一种替代方法是设计具有适于幼体发育的营养状况的人工惰性微粒饲料(直径0.5-2mm)。不同的研究尝试了这种途径，但迄今为止，在存活和生长方面没有观察到显著的改善，这可能是由于诸如低接受度、低浮力或缺乏合适的营养状况的原因的总和。最近，已经申请了一项专利(ES2599603)，提出了一种新型的惰性饮食，改善了以前的结果。然而，通过这种饮食获得的结果(73天时2.5mg干重)仍然远不及在前面使用蟹蚤的研究中获得的45天时9.5mg干重。由于上述原因，必须鉴定替代的饵料，其可以以合理的成本被圈养生产，或者其是丰富的并且在自然环境中容易获得。
最后，另一个基本方面是需要具有已证明有效的标准化培养的方法或方案。在这方面有许多研究，如Iglesias和Fuentes(2014)的上述综述所示，尽管结果仍然不充分。在这方面，最近的研究(Garrido,D.,等人(2017).Assessment of stress and nutritionalbiomarkers in cultured Octopus vulgaris paralarvae:effects of geographicalorigin and dietary regime.Aquaculture,468,558-568)提出了比较它们在不同的章鱼种群(大西洋和地中海)中的结果的标准化方案。该方案已经作为OCTOWELF项目AGL2013-49101-C2-1-R MINECO.西班牙政府的一部分进行的不同测试的基础)。
以下描述的本发明利用了一种新的饵料，由于其在确定的海洋生态位中的丰富性，该饵料易于从自然环境中收集，并且还获得了比卤虫属物种的那些饵料更大的双幼体生长值，且接近于用甲壳纲十足目幼体获得的双幼体生长值，使得它们在65至75日龄时的沉降超过9mg干重。基于先前的研究，还提出了改进的培养方案，其使得在整个浮游期直至沉降时双幼体的存活率显著增加。
发明内容
本发明的普通章鱼即真蛸的幼体培养方法使章鱼的第一生命阶段(称为双幼体)的存活力得到显著改善，为该物种的商业化培养克服了至今为止的障碍即双幼体存活。
本发明人已经发现，使用新的培养参数尤其是新的饵料(食物)，相对于这种物种的先前培养，允许在章鱼双幼体中获得高的存活率和生长率。
本发明中的术语双幼体涉及普通章鱼即真蛸从其已经放弃卵的覆盖物(孵化)到其完全沉降在海底或池底(底栖阶段)的发育状态。由于它们本身不发生变态，不能称为幼体期，因此使用术语双幼体将其与幼年-成年期区分。双幼体生活在水柱中，因此也称其为“浮游阶段”。该阶段的持续时间主要取决于培养条件(水温、光照、培养体积等)和饲料。例如，可以说在20℃和适合的饲料下，该阶段的持续时间为65-75天(Iglesias和Fuentes，2014)。最初，这些个体具有特征性的外貌(图1)，重0.2至0.3mg(干重)。当章鱼超过9mg干重时，认为它们已经到达沉降阶段(通常这发生在65和75日龄之间)。此时，它们开始获得小成年章鱼的典型形状(图6)并迁移至底部(它们变成底栖)。从这时候开始，它们主要在池的底部(而不是在水柱中)进食，并且它们趋向于寻求躲藏处(不透明的一些类型)，显示出对少光的区域的偏好。
在沉降之前，有一个中间阶段，我们可以将其称为预沉降，当双幼体的干重为6至9mg时开始，这通常发生在50至70日龄，并持续到沉降时。该预沉降阶段的特征在于，双幼体开始迁移至底部而没有完全沉降，并且当已经到达沉降阶段时结束。
一旦沉降，幼年(底栖)阶段开始。在该阶段，个体开始以甲壳类动物如小蟹和虾(长度约1cm)为食，并且它们也可以以基于这些相同的冷冻甲壳类动物的惰性饲料或针对头足类动物的一定类型的特定饲料为食(Iglesias和Fuentes,2014)。然而，本发明涉及培养达到双幼体的沉降的方法。对于本发明，特别是钩虾属物种(Jassa.spp.)类型的钩虾亚目物种，优选镰形叶钩虾(Jassa falcata)和理石叶钩虾(Jassa marmorata)，和两种类型的麦杆虫(caprelids)：Phtisica属物种和Caprella属物种，优选Phtisica marina和长鳃麦秆虫(Caprella equilibra)已被鉴定为用于培养章鱼双幼体的新型饵料。
钩虾亚目物种和麦秆虫都属于端足类的组。
本发明还涉及一种用于培养位于含水培养池中的普通章鱼真蛸的双幼体的方法，所述方法的特征在于其包括向所述培养池中加入选自以下的饵料：
-钩虾属物种类型的钩虾亚目物种，
-Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫，或
-这些的组合。
钩虾属物种类型的钩虾亚目物种优选选自镰形叶钩虾和理石叶钩虾。
Phtisica属物种类型的麦秆虫优选选自Phtisica marina，和Caprella属物种的麦秆虫为长鳃麦秆虫。
该饵料可以作为唯一的食物加入，或者与卤虫属物种或其它甲壳类动物蚤类(例如，当获得的饵料的数量不足时，或当它们出生时，双幼体不具有允许其捕获和摄取该饵料的尺寸)组合加入。在两种饵料的情况下，可以使用现有技术中描述的最常见的密度，并且它们可以在0.1至1个/ml之间波动(优选约0.5个/ml)。如现有技术中所示，以各种剂量给予饵料是合适的，优选每天3-5剂量。
在加入钩虾属物种类型的钩虾亚目物种和Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫的组合(混合物)的情况下，优选饵料的总数的1-10％以Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫的形式给予，和90-99％为钩虾属物种类型的钩虾亚目物种。更优选地，给予5％的Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫和95％的钩虾属物种类型的钩虾亚目物种。
在一个优选的实施方案中，从双幼体的生命的1至10天之间的一天加入钩虾亚目物种直至达到其沉降，而从生命的20至30天之间的一天加入麦秆虫直至达到其沉降。
当将钩虾亚目物种与麦秆虫一起给予时，所用的一种和另一种的比例优选是上文指出的那些。用钩虾属物种类型的钩虾亚目物种喂食的起始可以如提到的在第1天(从卵孵化的日子)和10日龄之间变化。考虑到当它们出生时双幼体的尺寸以及它们攻击和摄取饵料的能力，这种喂食的起始可以在生命的所述几日之间变化，本领域技术人员通过观察双幼体的行为可以容易地看到这些。
在本发明的另一个优选的实施方案中，钩虾属物种类型的钩虾亚目物种从双幼体的生命的第一天开始施用直至其沉降，而Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫从生命的第10天开始施用直至其沉降。优选地，当钩虾属物种类型的钩虾亚目物种与Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫共同施用时，它们的比例如之前所指出的。
在本发明的另一个优选的实施方案中，钩虾属物种类型的钩虾亚目物种与Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫均从双幼体的生命的第30天起施用直至其沉降。优选地，当钩虾属物种类型的钩虾亚目物种与Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫共同施用时，它们的比例如之前所指出的。
在一个优选的实施方案中，为了优化具有较好比率的饵料:双幼体的饵料的总数且避免对个体的压力的目的，培养池中的双幼体的密度为3-7个双幼体/升。在沉降池的情况下(参见下面的详细描述)，个体的密度将降低，优选密度为0.1-0.5个双幼体/升。
在一个优选的实施方案中，向培养池中加入每个双幼体/天总共3-5个个体的这些饵料(无论它们是钩虾属物种类型的钩虾亚目物种，Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫，或这些的组合)，分配剂量使得池中总是有可用的饵料。为了实现这一点，调整第一剂量，估计从前一天起池中剩余的饵料的数量，每天的剂量总数优选在1和4之间波动。举例而言，如果池中有300个双幼体，那么在加入3个饵料每个双幼体/天的情况下，每天要加入的饵料的数量将是900(300×3)。加入这900个饵料，优选以1-4个剂量分配。
所提供的饵料的大小优选地作为双幼体的大小/虫龄的函数而变化。在一个优选的实施方案中，在第一阶段，从生命的第1天至20至30日龄，加入总长度1-4mm(尾节和眼睛的中部之间的距离)的钩虾属物种类型的钩虾亚目物种。从该点(20-30日龄)直到50-70天，加入长度在2-8mm的钩虾亚目物种和长度在4-30mm的Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫。最后，在50-70天的生命直至沉降，将饲料再次限制为总长度为1-4mm的钩虾亚目物种。最后的变化是由于最近沉降的双幼体中进行的观察，其在沉降期间明显变得更脆弱，可能在池底部被更大的钩虾亚目物种攻击。
在一个优选的实施方案中，在生命的第一天和预沉降阶段(6-9mg干重和生命的50-70天之间)之间使用的培养池优选是截锥形和黑色的，其体积可以优选在100至1000升之间。在一个更优选的实施方案中，达到6mg干重(通常在50至70天之间发生)的双幼体将被单独转移到另一个培养池(以下称为沉降池)中。该沉降池将具有平底，并且优选是透明的(例如，灰色)和矩形或方形，更优选地，其将具有200至400升的容积，40至60厘米的高度，并且部分覆盖有网格或帆布。这些沉降池将事先准备好，并充满来自原始池的水(熟化的水)，并且优选地包括躲藏处(例如直径为1至2厘米的PVC管)和小石头，以丰富栖息地。所有这些将使与池更换相关的应力最小化。
本发明的方案中的另一个重要方面是，在双幼体的全部培养中，保持池的底部不虹吸(也就是说，不吸入可能在底部的剩余食物和幼体)。以这种方式，幸存的饵料留下定殖并保持其清洁，因为作为食腐质者它们消耗了沉积在底部的有机物质，从而阻止了病原体的繁殖。由于消除了虹吸过程可能引起的应力，因此相应地改善了双幼体的健康。
在本发明的方法的一个优选的实施方案中，在双幼体的培养期间，通过放置在池的边缘(而不是中心位置)的灯或光来人工照亮池，从而引起表面上光入射角的变化，并且由于光的反射和折射的变化而在水柱内产生不均匀的光条件。优选使用荧光灯(冷白光)。
所提供的光的强度水平优选在40至800lux(69至1436W/m2)变化。更优选地，所用的水平是对于双幼体的生命的最初10至15天为600至800lux(1077至1436W/m2)，和生命的10至15天为300至600lux(517至1077W/m2)。当观察到预沉降的第一双幼体(6至9mg且在生命的50至70天)时，将光降至40至300lux(69至517W/m2)的范围，并如此保持直到所有的双幼体已沉降或已被转移到沉降池。
一旦已将双幼体转移到沉降池，灯的相同位置和在截锥形池中使用的最后强度(40至300lux，即69至517W/m2)将被保持。在双幼体的整个发育过程中(从生命的第一天)到沉降的光周期将是10至14小时的光，优选地8:00至22:00h。
关于其余的培养水条件，绿色水(green water)的更新百分比和使用也代表了重要的方面。在这两种情况下，参考文献中的方案可以有许多变化，但是没有能看到彼此之间差异的测试。由于上述原因，本发明提出了一种方案，该方案在作为双幼体的发育的函数的两个方面(更新和绿色水)均有变化。
优选地，在最初的两天期间，不进行任何类型的水的更新。优选地，更新以每小时更新池总体积的4％到10％的优选的流速开始，使得每天更新20％直到双幼体的生命的5天，并且在10到15天时从该水平增加到每天100％。这种更新保持在100％直到30天，并且从那里，更新保持持久开放(24小时)，这代表大约200％的每日更新。维持该更新百分比直到双幼体沉降或转移到沉降池(当达到6至9mg干重时，生命的约50至70天)。这种更新百分比(每天约200％)在沉降池中保持不变。
更新的开始优选在日常维护工作(测量氧气、温度等)和第一食物剂量之后的中午(约12:00)，除非存在氧气的下降(低于5.8mg/L)，在这种情况下，流动尽可能快地打开并且维持估计的时间，如果氧气水平不超过5.8mg/L，则可能延长估计的时间。
培养池中水的再循环可以通过既可以在闭合回路中起作用(通过水的再循环)又可以在开放回路中起作用的系统来进行。在这后一种情况下，将使用过滤系统，其防止沉降物或任何活的生物体的进入，尤其是可能潜在地是病原体的那些。水从池的输出通过出口过滤器来实现，该出口过滤器优选地为位于中心位置的管，并且具有300至400微米的网孔，优选地为300微米。
相应地且优选地，所述方法利用了绿色水的技术，该技术包括加入微藻(浮游植物)的混合物，优选地为等鞭金藻属物种(Isochrysis spp)和微拟球藻属物种(Nannochloropsis spp)。
如果需要，微藻的加入优选每天一次(从双幼体的生命的第一天开始)，且加入的量是获得0.7至1.5×106cls/mL浓度(优选1×106cls/mL)所需的量。藻的加入优选每天同一时间(一旦更新完成)进行，且仅在需要达到先前提到的藻浓度水平时进行。从30天开始，停止加入微藻，并且也不将其加入到沉降池中。
在一个优选的实施方案中，培养水中的氧浓度总是保持在高于5.5mg/l(且优选高于6mg/l)。至多，通过具有中等流量的通气器可以达到多达100％的饱和度，因为否则就会存在双幼体缺氧和大规模死亡的风险。
在另一个优选的实施方案中，水的盐度将是来自海洋的天然水的盐度(约35至36g/L)，防止可能引起大规模死亡的突然下降。
在另一个优选的实施方案中，培养水的温度总是保持在18至22℃。
为了测定用作不同培养阶段的参照的双幼体的干重，从池中取出双幼体的样品(优选10至30个双幼体)，按照Fiorito等人(2015).Guidelines for the Care andWelfare of Cephalopods in Research-A consensus based on an initiative byCephRes,FELASA and the Boyd Group.Laboratory animals,49(2_suppl),1-90的描述将其麻醉(海水中1.5％Cl2Mg)并处死(海水中3.5％Cl2Mg)。将这些幼体在烘箱(100℃20小时)中脱水，并在精密天平上称重。
本发明的培养方法或方案相对于已知的方案是有利的。关于所用的饵料，其明显优于其它先前饵料(例如，蟹蚤)的优点是它们非常容易获得，因为它们是天然产生的，并且在加利西亚河的筏、贝类养殖场和贻贝净化器上大规模产生(Camacho,A.P.,Gonzalez,R.,&Fuentes,J.(1991).Mussel culture in Galicia(NW Spain).Aquaculture,94(2-3),263-278)。此外，它涉及地理上广泛分布并具有季节性丰度变化的物种，其最大峰与章鱼的自然孵化期一致，在地中海列有每cm3多达30个个体(Scinto,A.,Benvenuto,C.,Cerrano,C.,&Mori,M.(2007).Seasonal cycle of Jassa marmorata Holmes,1903(Amphipoda)inthe Ligurian Sea(Mediterranean,Italy).Journal of Crustacean Biology,27(2),212-216)。
两组端足类物种(钩虾亚目物种和麦秆虫)都容易从位于加利西亚河流的贻贝培养筏中所用的品系中获得。相应地，在维持甲壳类和贻贝净化器的贝类养殖场的出口通道中也可以获得钩虾亚目物种。为了获得这些端足类物种，将贻贝的品系或群体浸没在具有水(25至30L)的池中并轻轻搅拌它们就足够了，这使得大多数从它们分离并移动到池壁。这些池将被运输到培养装置，优选使用小的通气器以避免氧下降。
一旦进入培养装置中，端足类物种表现出对于圈养易于适应，并且不需要任何特殊的维持条件。它们优选保存在类似于沉降池的培养池中，尽管没有覆盖并且具有更多的更新(每天10至12次更新)。对其喂养鱼饲料或随意供应的鱼肉或软体动物，避免底部留存过多未消耗的食物残余。
从饵料存储池中收集饵料使用不同的方法来进行。第一种是通过虹吸饵料储存池的壁和底部。端足类物种集中在网中，网的间隙可根据所寻找的饵料的尺寸而变化。该系统优选用于较大的饵料。第二收集系统由使用培养池的水的出口管的浓缩器组成。在该管的壁上设置网，网允许饵料进入(并且网的间隙可根据所需的饵料的尺寸而变化)，并且在管的底部(出口)设置较小的网(优选200微米)，将它们保持在管内。一旦饵料处于管的内部部分，就将其取出，并将饵料转移到接收器，以便将它们加入到双幼体池中。在两种情况下(虹吸和浓缩器)，都试图避免饵料与空气接触，因为这会导致它们在其外壳中积聚将阻止其浸没而使得其难以被双幼体捕获的气泡幼体。
本发明的方法已经获得40日龄时>90％、50日龄时>80％和60日龄时>65％的存活数据。这些结果甚至比迄今用螃蟹获得的最佳结果更好，因此比用卤虫属物种(唯一商业上可行的饮食)获得的结果更好，采用卤虫属物种其双幼体很少超过30日龄。关于生长，本发明提出的方案获得每天其干重的5至6％的重量增加。这些值低于先前作者用蟹蚤获得的7至8％，但高于许多用卤虫属物种获得的那些值(在大多数情况下为3至4％)，并且研究证实它们足以实现沉降，尽管相对于用蟹蚤饲养延迟了10-20天)。尽管有这种差异，但就获得蟹蚤的难度而言，获得所提出的饵料(端足类物种)的容易性使得端足类物种在推进其商业规模的培养方面具有明显的优势。
本发明的方法中所用的饵料的高天然可获性将允许工业生产(至少在小或中等规模)。还存在进行与筏和贻贝养殖场相关的多营养生产的可能性(不同物种的组合培养，其中利用一个物种的过剩或废物来喂养另一个物种，从而降低影响并增加收益性)。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括/包含”及其变体并不意在排除其他技术特征、加入、组分或步骤。对于本领域熟练技术人员来说，本发明的其它目的、优点和特征将部分地从说明书且部分地从本发明的实践中显现。以下实施例和附图是为了说明而提供的，而不是意图为限制本发明。
附图简述
图1：显示了最近从普通章鱼即真蛸孵出的双幼体的照片，其中可以看到其特征性的外貌。
图2：显示了示例性成年镰形叶钩虾(A)和理石叶钩虾(B)的照片。
图3：显示了示例性成年Phtisica marina，雄性和雌性(A)和长鳃麦秆虫，雄性和雌性(B)的照片。
图4：显示在不同实验中章鱼的双幼体的mg干重的增长的图：4A：对照组，仅由卤虫属物种喂养双幼体长达生命的40天，和实验组，用卤虫属物种和蚤类喂养长达30天，并且随后第31天至第50天仅用端足类物种喂养。条形图表示标准偏差。4B：用对照处理(卤虫属物种)喂养双幼体长达25天，和实验处理，用卤虫属物种长达8天，并从9日龄至25日龄用端足类物种处理。
图5：显示用于本发明的培养池的图。5A：从第一天到幼体进入沉降页面(6至9mg干重，通常发生在生命的第50至70天)的截锥形池。在该图中，示出了进水口(1)和光源(2)，中央通气(3)，设有过滤器的中央管(4)以及允许调节水高的外部排水装置(5)。5B：沉降池，其中将幼体转移直至到达沉降阶段(超过9mg干重)。在该图中显示了进水口(1)和光源(2)，悬挂并沉积在底部上的躲藏处(3)，配有过滤器的中央管(4)和允许调节水高的外部排水装置(5)。
图6：处于沉降阶段的双幼体。B)中也观察到了用作躲藏处的PVC管。
实施例
本发明通过发明人进行的试验来说明，这些试验揭示了本发明的产品的有效性。
实施例1：现有技术中已知的章鱼幼体培养试验(Garrido,D.等人(2017) .Aquaculture,468,558-568)：
实验在容积为500L的截锥形池中进行，该池的壁和底部为黑色，在中心位置进行轻至中度的通气。使用绿色水(浮游植物)，并且在整个实验期间(30天)每天更新150％，且借助于筒式过滤器以2微米过滤水。就光而言，使用36W冷白色荧光灯，其位于池的中央上部。在整个实验期间使用700lux的单一强度。食物基于富含微藻的卤虫属物种，而另一种富含海洋磷脂。全天分3次剂量供应卤虫属物种。30日龄的存活率在0.14至3.77％之间，而生长速度显示了每天干重增加3.9至6.4％。
实施例2：对照试验：普通章鱼幼体培养(1000l池)，从双幼体的生命的第1天至第 40天仅使用卤虫属物种作为饵料。
实验在1000l容积的截锥形池中进行，壁和底部为黑色，中心位置中度通气，防止气泡产生的水流阻碍双幼体自由通过池(图5A)。对于18.5至21.3℃的温度范围和35g/l的盐度(整个实验期间)，密度为5双幼体/升，且溶解氧的值在5.5至6.7mg/l之间波动。使用绿色水长达30天，在添加微藻时具有106cls/mL浓度的微拟球藻属物种和球等鞭金藻(Isochrysis aff.galbana)。该方法与先前的试验(现有技术的试验)相同，但是在该第二试验中更新的修改影响其浓度。这些差异在于前两天保持池封闭，进行池的“熟化”(与现有技术的方法的第一个差异)。在该阶段之后，开始更新(使用用筒式过滤器以1微米过滤的水)，在随后的5天内以池容积的15至20％的更新速率(10ml/s达5小时)开始，在15天时逐渐增加时间直到100％更新。该百分比保持如此直到第30天，从该第30天开始进行持续更新(每天24小时)，这表示每天更新大约200％，并且保持直到在生命的40天(第二个差异)时关闭该池。水的排出通过具有300微米的网的中心管进行，并且由于外部管而保持水的水平。
就光而言，在池的边缘(而不是中心位置)上使用了35W冷白色荧光灯，导致了整个表面的光入射角的改变，并在水柱内部产生了不均匀的光条件(第三个差异)。测试期间使用的强度值保持在三个强度水平内。生命的前15天使用的水平为600到800lux(1077到1436W/m2)，生命的15到40天的时段的使用水平为300到600lux(517到1077W/m2)(第四个差异)。从生命的第一天到测试结束，光周期为14:10(光照:黑暗)，例如在8:00到22:00之间。
整个测试(40天)中的食物均基于卤虫属物种，其用球等鞭金藻肥育7天并以0.5个/ml的密度供应至双幼体，分配剂量使得池中始终有饵料，范围为1至4剂量/天。由于生长速率(GI)每天增加不超过4％，并且维持在1至1.5mg干重之间，因此决定在40天时关闭池(见图4A)。在该日龄的存活率为65％起。
实施例3：普通章鱼幼体培养试验(1000l池)，从第1天到第30天使用卤虫属物种和 蟹蚤以及从第31天起用本发明的端足类。
该试验与先前的试验同时进行，使用相同的培养条件，目的是比较不同饵料的效果。在这种情况下，卤虫属物种用蟹蚤(0.1个/ml)补充，直至30日龄(然而，由于获得蚤的困难，这些仅能在前30天的10天内加入到池中，这降低了预期的生长)。从那时起，开始仅为它们提供端足类。一方面，钩虾属物种类型的钩虾亚目物种(优选镰形叶钩虾和理石叶钩虾)占个体总数的95％，和Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫(优选Phtisicamarina和长鳃麦秆虫)占个体总数的5％。钩虾亚目物种在长度上达到2至8mm，并且麦秆虫在长度上达到4至30mm。在端足类的情况下，喂食方案为每天每双幼体3至5个饵料，剂量分布为使得池中总是有饵料可用，这产生1至4个剂量/天的范围(相较于现有技术的第5个差异)。
从55日龄，观察到超过6mg干重的双幼体，其开始迁移到底部。将这些个体转移至称为沉降池(图5B)的新池中，该池具有400l体积、方形、50cm高、平底、灰色并且用超过其表面的3/4的遮蔽罩网覆盖。该池充满来从原始池的水，并且包括在池的底部的躲藏处(1至2cmPVC管)或垂直悬挂的缆线以及小石子以丰富栖息地。个体的密度为0.1双幼体/l。此时，看出双幼体变得脆弱(至少暂时地)并且可以被较大的饵料攻击，因此仅用长度最大4mm的钩虾亚目物种来喂食(第6个差异)。
在该沉降池中，从双幼体的30日龄开始，保持与初始池类似的更新百分比，即每天更新池的总体积的大约200％的持续更新(24小时)。水的排出通过具有300微米网的中心管进行。关于光照，在预沉降(在55天时和大于6mg干重)中观察到第一个双幼体时，在初始池中将光照降低到40至300lux(69至517W/m2)的范围。一旦转移至沉降池，在初始池(14:10)的相同光周期下，强度保持在约40lux(69W/m2)(第7个差异)。
在所描述的测试中没有双幼体的虹吸的池底部。目的是减少对双幼体的应力，并且还允许端足类定殖于池的底部，因为它们是腐食者并且有助于保持底部清除有机残留物，从而防止可能的病原体的增殖(第8个差异)。
端足类(钩虾亚目物种和麦秆虫)从用于加利西亚河流的贻贝培养的筏和净化器获得。将它们保存在与图5B的那些类似的1000l池(沉降池)中，但没有覆盖并且每天更新它们的体积10次。食物基于鱼饲料和随意供应的软体动物的食物残余。为了喂食双幼体，通过两个系统捕获端足类。通过虹吸池的壁和底部获得较大的端足类，并将其浓缩在网中。第二收集系统包括利用来自池本身的水的出口管的浓缩器，其中存储饵料。将500微米的网放置在允许饵料进入的管壁上，并且将200微米的网放置在管的底部(出口)，将其保持在管内。一旦饵料处于管的内部部分，就将该管从池中取出，并将饵料浓缩到接收器中，然后通过1-2l塑料罐加入到双幼体池(第9个差异)。
该试验的数据显示在生命的40天大于90％的存活率，和在生命的60天约65％的存活率。生长速率显示每天重量增加5至6％，在50日龄时达到5mg干重(图4A)，随后在65至75日龄时获得干重大于9mg的双幼体。
实施例4：对照试验：普通章鱼幼体培养(100l池)，从双幼体生命的第1天至第25天 仅使用卤虫属物种作为幼体饵料。
该测试在与前两个实施例中所描述的相同培养测试条件下进行，不同之处在于，水箱的容积为100l而不是1000l，并且使用了三个重复而不是一个。测试持续了25天。如实施例2中一样，使用对照处理，仅使用由球等鞭金藻肥育7天的卤虫属物种。如在图4B中所观察到的，双幼体的生长结果与实施例2的那些结果相似，在生命的25天时干重为约1mg幼体。
实施例5：普通章鱼幼体培养试验(100l池)，从生命的第1天到第8天使用卤虫属物 种且在生命的第9天至第25天使用本发明的端足类。
该试验在与实施例4中所述相同的培养条件下平行进行，目的是将卤虫属物种与使用实施例3的钩虾属物种类型的相同的端足类的实验处理进行比较。不同之处在于，在这种情况下，这些端足类从生命的第8天开始供应，因为这是当观察到大多数幼体都摄入这种类型的饵料的时候(本领域技术人员可以容易地看到这一点，观察双幼体的行为或执行以下实施例中说明的方案，以便知道何时开始提供饵料)。在这种情况下，在前8天的喂食仅由卤虫属物种(与实施例4相同的类型)组成，并且在9至10天之间给其喂食了卤虫属物种(个体总数的75％)和长度为1至3mm的钩虾属物种类型的端足类(25％)。从10天起，在与实施例3中相同的条件下(3-5个饵料/双幼体/天)，开始向幼体仅喂食这些端足类直到完成培养。如在图4B中可以观察到的，在本实施例中双幼体的生长结果与实施例3的那些相似，在25天时的生长速率为6.7％和存活率为70％。
实施例6：在不同虫龄的端足类捕获和摄取测试
与其余实验平行，进行了一项新实验，目的是更准确地确定双幼体能够捕获和摄取钩虾属物种类型的端足类的虫龄，和产卵之间是否有差异。为了这个目的，比较了从两个不同的雌性获得的双幼体，它们在孵化时表现出不同的初始重量。第一个雌性的双幼体平均干重为0.24mg，而第二个雌性的双幼体平均初始干重为0.29mg(均在该物种体重的正常范围内)。将两组双幼体在与前述实施例2至5相同的培养条件下以每升4个双幼体的密度放置在分开的100l池中。在这两种情况下，从生命的第一天供应钩虾属物种的端足类(20％至30％)和卤虫类物种(80％至70％)，密度为3至5个饵料/双幼体。
在这两种情况中，观察到所有端足类均被捕捉到。将捕捉到饵料并将其保留2至3分钟的双幼体从池(包括饵料)中移出，并在显微镜下观察(放大40倍)以确认其消化系统中有食物。该观测的技术细节可参见Nande,M.等人(2017).Prey Capture,Ingestion,andDigestion Dynamics of Octopus vulgaris Paralarvae FedLiveZooplankton.Frontiers in Physiology,8,573。在本实施例中，观察到最近孵出的0.24mg干重的双幼体从生命的第一天开始攻击饵料，但是摄取百分比仅为30％，因此可以认为供应所述饲料过早。另外，具有0.29mg干重的双幼体从生命的第一天开始表现出80％的摄取范围，这被认为适合开始供应钩虾属物种类型的端足类。
该测试表明，使用这些端足类开始喂食可能会在产卵批次之间发生变化，建议(尽管不是必需的)同时进行捕捉和摄取测试，以优化该饵料的喂食的起始。然而，这些饵料(端足类)可以从第一天就开始施用。
Figure BDA0002514734640000171
对照实验和本发明的那些实验之间结果的比较。
在将基于本发明的实验结果与现有技术中已知的结果进行比较后，对于给出的所有实施例(2、3、4和5)且包括使用本发明的方法以100和1000l进行的试验，改进明显是显著的。现有技术方法中的双幼体在30日龄的存活率(Garrido等人，2017)在约0.14至3.77％之间(该试验总共有18个池)，实验在此日龄完成。相反，在利用端足类进行的本发明的以1000l池进行的试验条件获得了40日龄时存活率超过90％，60日龄时存活率65％。相应地，在利用端足类的100l池中的培养条件获得了25日龄时高于70％的存活率。还必须指出，在1000l试验中，尽管具有次优饮食，利用卤虫属物种进行的处理表现出在40天时高于65％的存活率，这表明并不仅是使用端足类显示出区别，而且培养方案也改善了存活率。在重量方面，在现有技术的方法中(Garrido等人,2017)，获得了每天增加3.9至6.4％干重的生长速率，但仅有直到15日龄的数值，而本发明的方法对于使用端足类的池的数据为，对于1000l池获得了与现有技术最大值相似的增加(每天5至6％的干重)，和对于100l池每天6.5至7.5％的干重的增加。在1000l池的情况下，获得了65至75日龄的具有超过9mg干重的沉降的幼体。图4A和4B显示了使用本发明的方法在实施例2、3、4和5中的重量增加。在该情况中，还可以观察到使用端足类和卤虫属物种的处理之间的差异。

Claims (23)

1.一种用于培养位于含水培养池中的普通章鱼即真蛸(Octopus vulgaris)的双幼体的方法，所述方法的特征在于其包括向所述培养池中加入选自以下项的饵料：
-钩虾属物种(Jassa spp.)类型的钩虾亚目物种，或
-Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫，或
-钩虾属物种(Jassa spp.)类型的钩虾亚目物种与Phtisica属物种和/或Caprella属物种类型的麦秆虫的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述钩虾属物种类型的钩虾亚目物种选自镰形叶钩虾(Jassa falcata)和理石叶钩虾(Jassa marmorata)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Phtisica属物种类型的麦秆虫是Phtisicamarina，和所述Caprella属物种类型的麦秆虫是长鳃麦秆虫(Caprella equilibra)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中从所述双幼体的生命的第1天到20至30天，加入1至4mm的钩虾亚目物种，从该时间直到生命的50至70天，加入长度为2至8mm的钩虾亚目物种和长度为4至30mm的麦秆虫，从50至70天直到所述双幼体沉降，仅施用大小为长1至4mm的钩虾亚目物种。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中从所述双幼体的生命的第1天至第10天加入钩虾亚目物种直至其沉降，而从生命的第20天至第30天加入麦秆虫直至其沉降。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中从所述双幼体的生命的第1天起加入钩虾亚目物种直至其沉降，且从生命的第10天起加入麦秆虫直至其沉降。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中从所述双幼体的生命的第30天起加入钩虾亚目物种和麦秆虫两者直至其沉降。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中当加入钩虾亚目物种和麦秆虫的组合时，施用相对于饵料的总数1至10％的麦秆虫和相对于饵料的总数90至99％的钩虾亚目物种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中施用相对于饵料的总数5％的麦秆虫和95％的钩虾亚目物种。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述培养池中双幼体的密度为3至7个双幼体/升。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中每天每个双幼体将总共3至5个饵料供应到所述培养池。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中生命的第1天直到生命的第50至70天使用的培养池具有截锥形且是黑色的，和从第50至70天起，将所述双幼体转移到另一个平底的灰色培养池中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述平底的灰色培养池中双幼体的密度将为0.1至0.5个幼体/升。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过置于所述培养池的边缘的光来人工照亮所述培养池。
15.根据权利要求14所述的方法，其中对于所述双幼体的生命的最初10至15天供应的所述光的强度水平在1077至1436W/m2之间变化；从生命的10至15天直至生命的50至70天在517至1077W/m2之间变化，从该时间直至沉降，将所述光减少到69至517W/m2的范围。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中按如下更新所述培养池中的水：
在最初的两天期间在池中不进行任何类型的水的更新，随后以每小时池总体积的4％至10％的流速开始更新，使得对于最初的5天每天更新20％，并且在10到15天时从该水平增加到每天100％，该更新保持在100％直到30天，并且从此时间起所述更新每天保持持久开放24小时，这代表200％的每日更新，保持该更新百分比直至所述双幼体沉降。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中还向所述池加入微藻等鞭金藻属物种(Isochrysis spp.)和微拟球藻属物种(Nannochloropsis spp.)的混合物直至在所述加入时获得0.7至1.5×106cls/mL的其浓度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中每天加入一次所述微藻的混合物。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，特征在于所述培养池的水中的氧浓度大于5.5mg/l。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，特征在于所述培养池中的水的盐度为35至36g/l。
21.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，特征在于所述培养池中的水的温度为18至22℃。
22.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中保持所述培养池的底部没有虹吸。
23.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将所述饵料从其储存池加入到所述培养池，其通过虹吸所述饵料的储存池的壁和底部或通过使用所述培养池的水的本身出口管的浓缩器，使得在所述管上放置允许饵料进入的网和在管的底部放置较小的网以保持饵料在管的内部，并且一旦所述饵料处于所述管的内部部分，就将该管取出，并将所述饵料转移到接收器以将它们加入到双幼体池中。
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