CN111423491B - 一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用。一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用，所述十肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将含10个氨基酸残基的活性肽用于庆大霉素抗生素所导致的听觉毛细胞损伤中；检测后首次发现，该多肽化合物可以通过减少机体对庆大霉素的吸收，减少毛细胞的凋亡，进而对听觉毛细胞起到保护作用，改善耳毒性药物对听觉毛细胞的损害，且毒副作用小，是一种很有开发前景的听力保护药物，具有广阔的市场前景。

Description

一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用
技术领域
本发明涉及一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
庆大霉素(Gentamicin，Gen)是一种氨基糖苷类抗生素，常用于治疗细菌感染性炎症[1]。但这类药物具有较强的耳毒作用，可杀死哺乳动物内耳的毛细胞。内耳中的听觉毛细胞是一种终末分化的细胞，可将声音刺激转化为电信号，从而产生听觉。由于哺乳动物的听觉毛细胞是一种高度分化的细胞，已退出细胞分裂期，所以不具有再生能力。因此，由于Gen作用而导致的哺乳动物听觉毛细胞损失，常会造成听力的永久性丧失[2]。截止目前为止，由于听觉毛细胞损伤所导致的感音神经性耳聋疾病尚无理想的治疗药物或方法。如何保护听觉毛细胞免受Gen的侵害，已成为防治药物性耳聋疾病的关键。
已有研究表明，Gen的耳毒性与活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)密切相关[3]。随着Gen用药时间的延长，听觉毛细胞中的ROS含量会急剧增长，过量的ROS使毛细胞处于氧化应激状态，并对细胞内的DNA、蛋白和脂质等造成损伤，最终诱导细胞发生凋亡。因此，寻找一种可减少ROS产生的抗氧化物质，将有助于药物性耳聋疾病的治疗，并将有助于推动其相关防治药物的研发，具有非常重要的意义。
斑马鱼是近年来新兴起的，可用于Gen药源性耳聋防治药物研发的模式生物。它具有与人类相似的的内耳结构[4]，内耳中的听觉毛细胞在发育、结构和功能等方面与人类高度同源，易被耳毒性药物损伤。斑马鱼除内耳中的毛细胞外，还富含大量受神经支配的侧线听觉毛细胞。该侧线处毛细胞在结构、功能、基因调控和对Gen的反应等方面，也与人类的听觉毛细胞非常相似，且便于活体操作。当斑马鱼发育至第4天时，其内耳及侧线处的毛细胞既已发育完全。由于斑马鱼在发育早期全身透明，因此借助活体成像技术，可直接实时观察Gen对毛细胞的毒性作用。
目前借助模式生物，寻找对药物耳毒性损伤具有明显抑制作用的新型化合物，成为保护听觉毛细胞和治疗因听觉毛细胞损伤而导致的耳聋疾病的关键。
美国专利US20120258921A1(申请号US13440591)公开了用于治疗炎症的肽及其治疗用途和使用方法。含有转导序列的多肽通过与Toll样受体信号通路的相互作用抑制细胞因子活性和TNF-α的分泌。描述了说明该化合物在治疗中耳炎、噪声引起的听力损失、与年龄相关的听力损失和改善普通听力方面的功效的实验。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用。
本发明技术方案如下：
一种活性十肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种提取上述活性十肽的方法，步骤如下：
(1)将脉红螺去壳后，取全部软体组织部分，磨碎，然后加入软体组织重量1～10倍的酸溶液，酸溶液pH值1.0～4.0，然后加入软体组织重量5～20％的胃蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5h，然后调pH值至7.0～9.0，加入软体组织重量5～20％的胰蛋白酶和糜蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5h，离心，取上清液，然后经浓缩、冻干，制得脉红螺多肽提取物；
(2)将步骤(1)制得的脉红螺多肽提取物用缓冲盐溶液复溶，用葡聚糖凝胶G25进行柱分离，pH值6.0～8.0缓冲盐溶液为洗脱剂，洗脱5个柱体积，收集第3～5柱体积馏分，冻干，干粉盐水溶解，以Sephadex LH-20进行分离，以盐水为洗脱剂，按照10mL/45min的速度收集样品，每45min收集一份，将第14～20份的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物；
(3)将步骤(2)制得的多肽活性段粗提物用浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液溶解，经4.5μm微孔膜过滤，然后经Welch HILIC Amide柱分离，二元流动相为乙腈(ACN)和浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液，乙腈(ACN)与乙酸铵缓冲液的体积比为85:15，流速为0.8ml·min-1，收集210nm处具有体外DPPH自由基清除活性的吸收峰的洗脱液，鉴定确定氨基酸组成，冻干，制得具有抗氧化应激损伤功能的多肽。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，胃蛋白酶酶解pH值2.0～3.0，胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解pH值为7.2～8.0；进一步优选的，所述步骤(1)中，pH调节剂为盐酸和氢氧化钠。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶活比例为1：(0.2～5)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，缓冲盐体系为磷酸盐缓冲体系，pH值6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，鉴定确定氨基酸组成采用LC-MS蛋白鉴定技术。
上述活性十肽作为药效成分在制备治疗耳部疾病药物中的应用。
根据本发明优选的，所述耳部疾病为因听觉毛细胞受损导致的耳部疾病。
上述活性十肽作为有效成分在制备保护听觉毛细胞保健食品中的应用。
有益效果
本发明通过将含10个氨基酸残基的活性肽用于庆大霉素(Gen)所导致的听觉毛细胞损伤中；检测后首次发现，该多肽化合物可以通过减少机体对庆大霉素(Gen)的吸收，减少毛细胞的凋亡，进而对听觉毛细胞起到保护作用，改善耳毒性药物对听觉毛细胞的损害，且毒副作用小，是一种很有开发前景的听力保护药物，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为10μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞照片；
图中：方框处为耳部周围的五组听觉毛细胞；
图2为10μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞数量统计柱状图；
图中：***表示p<0.001；
图3为30μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞照片；
图中：方框处为耳部周围的五组听觉毛细胞；
图4为30μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞数量统计柱状图；
图中：***表示p<0.001；
图5为50μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞照片；
图中：方框处为耳部周围的五组听觉毛细胞；
图6为50μg/ml活性十肽处理斑马鱼后的毛细胞数量统计柱状图；
图中：***表示p<0.001；
图7为不同浓度活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞内Gen的含量照片；
图8为不同浓度活性十肽处理斑马鱼后，其毛细胞凋亡情况照片；
图中：A为对照组；B为Gen造模组；C为10μg/ml活性十肽处理组；D为30μg/ml活性十肽处理组；E为50μg/ml活性十肽处理组；
图9为实施例1制得的活性多肽经LC-MS蛋白鉴定技术获得的结果图谱。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
试剂配制：庆大霉素(Gen)标准品购自青岛生工生物科技有限公司，该标准品使用生理盐水溶解后，配制为1000M的储液。德克萨斯红染料购置AAT
Figure BDA0002458474880000031
TUNEL试剂盒购置南京诺唯赞生物科技有限公司；
YO-PRO-1染料购自赛默飞世尔科技有限公司；
实施例中所述的脉红螺购自济南市海鲜市场，为普通市售产品。
胚胎培养水组分如下：
KCl 0.17mM，NaCl 5mM，MgSO4 0.16mM，CaCl2 0.4mM，去离子水配制。
检测方法
nano-LC-LTQ-Orbitrap-MS/MS鉴定活性肽的序列
采用EASY-Nlc1000色谱系统(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)、LTQ OrbitrapVelos Pro质谱仪(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)对活性肽的氨基酸序列鉴定。纯化的肽用含有0.1％三氟乙酸的浓度为0.1mg·mL-1的超纯水溶解。然后将2μL样品注入捕集柱(100μm×20mm，RP-C18，thermo Inc.)中进行预浓缩。随后预浓缩的样品自动进入分析柱(75μm×150mm，RP-C18，thermo Inc.)。以0.1％(v/v)甲酸在超纯水为洗脱剂，分析时长：60min，检测方式：正离子模式，喷雾电压：1.8kV，离子传输毛细管温度：250℃，使用前经标准校正液校正，母离子扫描范围：350-1800m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA，Information Dependent Analysis)，每次全扫描(full scan)后采集最强的10个碎片图谱(MS2 scan)，碎裂方式：碰撞诱导解离(CID，collision-induced dissociation)，正态化能量35％,q值0.25,活化时间：30ms，动态排除时间：30s。MS1在M/Z 400时分辨率为60,000，MS2在离子阱中为单位质量分辨。一级质谱采用profile模式采集，二级质谱采用centroid方式采集以降低数据文件大小。Mascot 2.3软件(Matrix Science，USA)用于数据分析。数据库为蛾螺科数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2。固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M)；MS容差为±30ppm，MSMS容差为±0.15Da。NCBInr数据库用于肽鉴定。仅考虑具有低于0.05的预期值的鉴定的肽。BIOPEP数据库用于寻找先前鉴定的具有抗氧化氨基酸序列。活性肽氨基酸序列MS/MS质谱结果见图9。
实施例1
多肽制备方法步骤如下：
(1)将脉红螺去壳后，取全部软体组织部分，磨碎，采用多重消化道酶半仿生制备技术，即脉红螺组织加入5倍酸水溶液(pH值2.2)，按酶底物比为8％加入胃蛋白酶，37.6℃条件下振荡提取2h，随后调整反应体系pH值至7.8，按酶底物比为8％加入胰蛋白酶和糜蛋白酶，胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶活比例为1：1，37.6℃条件下振荡提取2h，反应液离心后取上层清液，浓缩，冻干，干粉低温保存，制得脉红螺多肽提取物；
(2)将步骤(1)制得的多肽提取物用缓冲盐溶液复溶，用葡聚糖凝胶G25，pH值6.8磷酸盐缓冲液为洗脱剂，洗脱5个柱体积，收集第3～5柱体积馏分，冻干，干粉盐水溶解，以Sephadex LH-20进行分离，以盐水为洗脱剂，按照10mL/45min的速度收集样品，每45min收集一份，结合体外DPPH自由基清除活性，将第14～20份的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物，采用GPC法，表征脉红螺活性肽段的分子量分布于＜3000Da的区域；
(3)将步骤(2)制得的多肽活性段粗提物用浓度10mM、pH5.8-6.2的乙酸铵缓冲液溶解，经4.5μm微孔膜过滤，然后经Welch HILIC Amide柱分离，二元流动相为ACN和浓度10mM、pH5.8-6.2的乙酸铵缓冲液，ACN与乙酸铵缓冲液的体积比为85:15，流速为0.8ml·min-1，结合体外DPPH自由基清除活性，收集210nm处具有活性的吸收峰的洗脱液，冻干，制得活性多肽，经LC-MS蛋白鉴定技术，确定其氨基酸组成。多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。结果如图9所示。
采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽。
实施例2：10μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
实验方法
1、斑马鱼样本前处理：
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下、14h光照/10h黑暗周期下，控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后6天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入24孔板中，每孔15尾，每组3个平行孔。
2、活性十肽处理：
采用实施例1人工合成方式合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽；
设置1个对照组，1个Gen造模组，1个活性十肽处理组。移除24孔板中的培养水，对照组加入2ml培养水溶液，在28℃恒温培养箱中培养1小时(hour，h)；Gen造模组2ml培养水中加入终浓度为125μM的Gen，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组2ml培养水中首先加入10μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1小时，然后同时加入终浓度为125μM的Gen和10μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
3、斑马鱼听觉毛细胞标记：
十肽处理结束后，吸除24孔板中的液体，并加胚胎培养水分别清洗各组斑马鱼。随后将终浓度为2μM的YO-PRO-1染料分别加入上述各组斑马鱼中，并28℃条件下避光孵育20min。孵育结束后，将YO-PRO-1溶液吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼。
4、听觉毛细胞数量统计：
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液麻醉上述各组斑马鱼，并在荧光显微镜下采集显示绿色荧光的毛细胞图像。根据采集图片，分别对各组斑马鱼的毛细胞(位于耳周围的五组)进行数量统计。
实验结果如图1、图2所示，在活体动物模型中，10μg/ml活性十肽可以有效减缓Gen诱导的听觉毛细胞的缺失。上述结果表明该浓度下的活性十肽可以在机体内部，有效保护听觉毛细胞，能够改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例3：30μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
斑马鱼样本前处理、斑马鱼听觉毛细胞标记与听觉毛细胞数量统计同实施例1。
活性十肽处理：
采用实施例1人工合成方式合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽；
设置1个对照组，1个Gen造模组，1个活性十肽处理组。移除24孔板中的培养水，对照组加入2ml培养水溶液，在28℃恒温培养箱中培养1h；Gen造模组2ml培养水中加入终浓度为125μM的Gen，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组2ml培养水中首先加入30μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1h，然后同时加入终浓度为125μM的Gen和30μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
实验结果如图3、图4所示，在活体动物模型中，30μg/ml活性十肽可以有效减缓Gen诱导的听觉毛细胞的缺失。这说明该浓度下的活性十肽可以在机体内部，有效保护听觉毛细胞，能够改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例4：50μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
斑马鱼样本前处理、斑马鱼听觉毛细胞标记与听觉毛细胞数量统计同实施例1。
活性十肽处理：
采用实施例1人工合成方式合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽；
设置1个对照组，1个Gen造模组，1个活性十肽处理组。移除24孔板中的培养水，对照组加入2ml培养水溶液，在28℃恒温培养箱中培养1h；Gen造模组2ml培养水中加入终浓度为125μM的Gen，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组2ml培养水中首先加入50μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1小时，然后同时加入终浓度为125μM的Gen和50μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
实验结果如图5、图6所示，在活体动物模型中，50μg/ml活性十肽可以有效减缓Gen诱导的听觉毛细胞的缺失。上述结果表明该浓度下的活性十肽可以在机体内部，有效保护听觉毛细胞，能够改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例5：活性十肽样品可降低听觉毛细胞对Gen的吸收
斑马鱼样本前处理同实施例1。
活性十肽处理：
采用实施例1人工合成方式合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽；
德克萨斯红(Texas Red,TR)溶于DMSO中，配制成浓度为2mg/ml的溶液。将上述TR溶液与50mg/ml的Gen溶液以22：3(体积比)的比例混合后避光过夜，制得到德克萨斯红-庆大霉素(GTTR)共轭物。
设置1个GTTR造模组，1个活性十肽处理组。移除24孔板中的培养水，GTTR造模组2ml培养水中加入含终浓度为125μM Gen的GTTR共轭物，并在28℃恒温培养箱中避光孵育1h；活性十肽处理组首先在2ml培养水中分别加入不同浓度(10，30，50μg/ml)的活性十肽，在28℃恒温培养箱中孵育1h，然后同时加入含终浓度为125μM Gen的GTTR共轭物和不同浓度的活性十肽(10，30，50μg/ml)，并在28℃恒温培养箱中继续避光孵育1h。结束后用胚胎培养水清洗斑马鱼，并利用激光共聚焦显微镜采集呈现红色荧光的毛细胞图像。
实验结果如图7所示，该结果表明活性十肽能够减少毛细胞对于Gen的吸收，进一步明确了该活性十肽的听觉毛细胞保护作用机制。
实施例6：活性十肽样品处理后斑马鱼听觉毛细胞凋亡检测
采用实施例1人工合成方式合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽；
设置1个对照组，1个Gen造模组，1个活性十肽处理组。移除24孔板中的培养水，对照组加入2ml培养水溶液，并在28℃恒温培养箱中孵育1h；Gen造模组2ml培养水中加入终浓度为125μM的Gen，并在28℃恒温培养箱中孵育1h；活性十肽处理组2ml培养水首先分别加入不同浓度(10，30，50μg/ml)的活性十肽，并在28℃恒温培养箱中孵育1h，然后同时加入终浓度为125μM的Gen和不同浓度的活性十肽(10，30，50μg/ml)，并继续在28℃恒温培养箱中孵育1h。
毛细胞凋亡检测：
孵育结束后，将24孔板中的液体吸除，加胚胎培养水分别清洗各组斑马鱼，随后使用TUNEL凋亡检测试剂盒对上述各组斑马鱼毛细胞的凋亡情况进行检测。
实验结果如图8所示，该结果表明活性十肽能够减少毛细胞的凋亡，进一步证实了该活性十肽的听觉毛细胞保护作用机制。
参考文献：
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5.刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报,1999,5(2):110-112。
序列表
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 一种活性十肽及其在制备保护听觉毛细胞产品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 脉红螺(Rapana venosa)
<400> 1
Gly Thr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg
1 5 10

Claims (8)

1.一种活性十肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种提取权利要求1所述活性十肽的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将脉红螺去壳后，取全部软体组织部分，磨碎，然后加入软体组织重量1～10倍的酸溶液，酸溶液pH值1.0～4.0，然后加入软体组织重量5～20%的胃蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5h，然后调pH值至7.0～9.0，加入软体组织重量5～20%的胰蛋白酶和糜蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5 h，离心，取上清液，然后经浓缩、冻干，制得脉红螺多肽提取物；
（2）将步骤（1）制得的脉红螺多肽提取物用缓冲盐溶液复溶，用葡聚糖凝胶G25进行柱分离，pH值6.0～8.0 缓冲盐溶液为洗脱剂，洗脱5个柱体积，收集第3～5柱体积馏分，冻干，干粉盐水溶解，以Sephadex LH-20进行分离，以盐水为洗脱剂，按照10 mL/45min的速度收集样品，每45 min收集一份，将第14～20份的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物；
（3）将步骤（2）制得的多肽活性段粗提物用浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液溶解，经4.5 μm微孔膜过滤，然后经Welch HILIC Amide柱分离，二元流动相为乙腈和浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液，乙腈与乙酸铵缓冲液的体积比为85:15，流速为0.8ml•min-1，收集210nm处具有体外DPPH自由基清除活性的吸收峰的洗脱液，鉴定确定氨基酸组成，冻干，制得具有抗氧化应激损伤功能的活性十肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，胃蛋白酶酶解pH值2.0～3.0，胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解pH值为7.2～8.0。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，pH调节剂为盐酸和氢氧化钠。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶活比例为1：（0.2～5）。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，缓冲盐体系为磷酸盐缓冲体系，pH值6.8～7.2。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，鉴定确定氨基酸组成采用LC-MS蛋白鉴定技术。
8.权利要求1所述活性十肽作为药效成分在制备治疗耳部疾病药物中的应用，其特征在于，所述耳部疾病为因听觉毛细胞受损导致的耳部疾病。
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