CN111410580B - 用含胶质蛋白废弃物制备肽钙生物刺激素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种处理含胶原质类蛋白废弃物的方法：(1)粉碎废弃物：将含胶原质类蛋白废弃物脱水后粉碎，得含蛋白粉末；(2)溶解：将含蛋白粉末与含磷质子酸‑尿素复合液按质量比1:2～5比例混合，搅拌至溶解得蛋白溶解液；含磷质子酸‑尿素复合液为含磷质子酸与尿素按质量比10:2～5混合所得；含磷质子酸为浓度55％‑65％的正磷酸与多聚磷酸按质量比1:5～10混合所得。还公开了用含胶原质类蛋白废弃物制备的肽钙生物刺激素和制备方法及作为植物功能肥料的用途，制备方法为：(1)采用前述方法得蛋白溶解液；(2)加入含原子氧催化剂反应；(3)加入碱性钙中和pH值至3.0～4.0，反应，过滤得到液态肽钙生物刺激素。

Description

用含胶质蛋白废弃物制备肽钙生物刺激素的方法
技术领域
本发明属于涉及环境与资源利用技术领域，特别是一种处理含胶质蛋白废弃物的方法以及基于此制备肽钙生物刺激素的方法。
背景技术
生物刺激素(生物刺激剂)既不是农药，也不是传统肥料；生物刺激素的靶标是农作物本身，它可以改善植物的生理生化状态，提高农药效果和肥料的利用率，改善农作物抵抗逆境的水平，也改善农作物的最终产量和农产品品质。生物刺激剂主要是分为8个类别，包括腐植酸、复合有机物质、有益化学元素、无机盐、海藻提取物、甲壳素和壳聚糖衍生物(壳寡糖等)、抗蒸腾剂、游离氨基酸。
多种轻工业加工废料中含有大量的胶原类蛋白废弃物，比如水产加工中产生的鱼皮、鱼鳞等，畜禽屠宰加工产生的动物皮毛、肌腱等。据统计，水产及畜禽加工中产生的含胶原质蛋白类下脚料占加工总量的10-20％，然而此类蛋白废弃物有效利用率很低，大部分被作为沤肥或者低质化加工为饲料、肥料等，只有很少部分被用于提取胶原蛋白，以应用于食品、化妆品及医药产品的研究开发。因此，如何充分利用这些废弃资源中的胶原蛋白，具有重要的经济和社会意义。
胶原蛋白属于不溶性纤维型蛋白质，有着复杂的三重螺旋结构、结晶区及紧密的纤维结构，具有很强的韧性和强度，因此也造成其处理难度大于普通蛋白质。传统的胶原提取及水解工艺主要通过高温蒸煮、酸碱处理、酶解/发酵等手段，生产过程相对比较粗放，产生大量的酸碱废液等，资源利用率低，产品不够精细，且处理周期较长，成本高、效率低下。通常采用酸法提取动物制品废弃物中的胶原蛋白一般是利用乳酸、草酸、柠檬酸、盐酸等提取，但是其中的溶胀、抽提时间长达几十个小时，工作效率低。
目前鲜见有利用含胶原质蛋白类为主体的动物废弃物直接制备成生物刺激素的报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种产率高、工艺简单、生产效率高的用含胶原质类蛋白废弃物提取蛋白和制备肽钙生物刺激素的方法，并提供将制得的肽钙生物刺激素用于促进植物生长的应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
本发明的一方面提供一种处理含胶原质类蛋白废弃物的方法，包括如下步骤：
(1)粉碎废弃物：将含胶原质类蛋白废弃物脱水后粉碎，得到含蛋白粉末；
(2)溶解：将所得含蛋白粉末与含磷质子酸-尿素复合液按质量比1:2～5比例混合，在60～90℃下搅拌直至溶解得到蛋白溶解液；
所述含胶原质类蛋白废弃物为以胶原蛋白为主体的动物加工制品的下脚料；
所述含磷质子酸-尿素复合液为所述含磷质子酸与尿素按照质量比10:2～5混合所得；
所述含磷质子酸为浓度55％-65％的正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:5～10混合所得。
优选地，所述蛋白粉末为150～200目。
优选地，步骤(2)溶解，在70～90℃下搅拌溶解2～4小时。
本发明的另一方面，提供一种用含胶原质类蛋白废弃物制备肽钙生物刺激素的方法，包括如下步骤：
(1)采用前述的方法处理含胶原质类蛋白废弃物得到蛋白溶解液；
(2)催化降解：稀释所述蛋白溶解液，然后加入含原子氧催化剂在70～95℃温度下，进行催化降解；
(3)中和络合：加入碱性钙中和pH值至3.0～4.0，在50～70℃，优选60-70℃络合反应2～4小时，过滤得到液态肽钙生物刺激素。
上述制备肽钙生物刺激素的方法，所述催化剂与所述含蛋白粉末质量比为1:1～5，优选质量比为1:2；
优选所述含原子氧催化剂为过氧化钙、过氧化钾或过氧化氢中的一种；
优选所述蛋白溶解液被稀释2-10倍，在80-95℃温度下催化水解0.5～2.0小时。
所述碱性钙为氢氧化钙或氧化钙，或氢氧化钙与氧化钙按任意比例的混合物。
上述制备肽钙生物刺激素的方法，还包括对得到的液态肽钙生物刺激素进行过滤除杂，所述过滤除杂方法包括离心过滤、微滤或纳滤。
本发明的又一方面，提供一种肽钙生物刺激素，其为液态或粉状固态；其中液态肽钙生物刺激素为采用上述的方法制备得到；其中固态肽钙生物刺激素为对所述液体液态肽钙生物刺激素进行喷雾干燥制备而得。
优选地，所述液态肽钙生物刺激素中的钙质量浓度≥10-30g/L，多肽含量≥50-200g/L，体系pH值为3.0-4.0。
本发明的再一方面，提供上述的肽钙生物刺激素作为植物功能肥料的用途，所述植物功能肥料的有效成分为所述肽钙生物刺激素，或者所述液态肽钙生物刺激素的稀释液。
优选地，所述述植物功能肥料的有效成分为所述肽钙生物刺激素被稀释500-1000倍液，用作播种前浸种肥料；
或所述述植物功能肥料的有效成分为所述肽钙生物刺激素稀释500-1000倍液，用作灌根肥料；
或所述述植物功能肥料的有效成分为肽钙生物刺激素500-2000倍液，用作蔬菜作物或果树花期、坐果期的喷施肥料。
本发明的有益效果是：
(1)建立了含磷质子酸-尿素复合液体系，该复合液可有效打断蛋白质链间的氢键，缩短溶解时间，可将物料中胶原蛋白类快速降解为小分子肽，还对其进行磷酸脂化修饰，提高其激活植物细胞免疫功能及信号传导等生物活性。
(2)采用含原子氧催化剂对所形成的蛋白质水解液进行氧化催化降解的同时，其所含钙离子或钾离子可以被降解所得小分子肽链螯合，提高工艺效率；最后采用碱性钙络合，形成以磷酸化肽钙络合物为主要成分的肽钙生物刺激素。
(3)本产品原料来源于农产品加工副产物，生产过程添加的尿素、含磷、含钾、钙制剂等本身都是作物必须的营养元素，没有引入其它重金属及对农作物有安全隐患的物质，减少后续分离纯化工艺环节，所形成的磷酸化肽钙生物刺激素产品为一种新型生物肥料，其富含的小分子肽元素被植物根系和叶片吸收后，能激活植物吸收代谢系统，促根快发，增强根系对土壤中营养物质的充分吸收和利用，尤其是难以利用的矿物元素，从而减少肥料使用量，提高肥料利用率。其富含的钙是植物必须的中量元素，有“植物细胞代谢的总调节者”之称，可调节植物体的许多生理代谢过程，尤其在环境胁迫下，钙和钙调素参与胁迫信号的感受、传递、响应与表达，提高植物的抗逆性。因此本产品兼具植物诱导激活和肥料增效双重效果，适用于瓜果蔬菜等经济作物，具有广谱适用性。
(4)采用本申请方法处理含胶原质类蛋白废弃物和制备肽钙生物刺激素的产率高，工艺简单，无三废排放，反应时间短，生产效率高。
附图说明
图1为采用本发明肽钙生物刺激素进行喷施处理对番茄幼苗生长影响效果图。
图2为采用本发明肽钙生物刺激素进行根部灌施处理对水稻幼苗生长影响效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
试剂材料来源：
多聚磷酸(PPA)、正磷酸、过氧化钙、过氧化氢、过氧化钾、氢氧化钙、氧化钙、腐植酸钙、尿素为工业纯，商购可获得。
实施例1采用鱿鱼皮制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将鱿鱼皮脱去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至200目，得到含蛋白粉末粒。
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将65％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:8比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与尿素按照质量比10:3充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒50g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入含磷质子酸-尿素复合液100mL,在80℃条件下搅拌4小时得到蛋白溶解液，加入200mL水稀释，再搅拌加入25g过氧化钙，在90℃条件下反应1小时，然后加入氢氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在60℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。对得到的肽钙生物刺激素液体肥料进行进一步过滤除杂，包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为64.3g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为93.7g/L、平均分子量为1290道尔顿。
实施例2采用鱿鱼内脏制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将鱿鱼内脏去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至150目，得含蛋白粉末粒。
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将55％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:6比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与与尿素按照质量比10:2充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒50g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入含磷质子酸-尿素复合液100mL,在60℃条件下搅拌4小时得到蛋白溶解液，加入200mL水稀释，再搅拌加入20g过氧化钾，在80℃条件下反应1小时，然后加入氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在60℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。过滤除杂包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为29.2g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为50g/L、平均分子量为1480道尔顿。
实施例3采用罗非鱼皮制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将罗非鱼皮去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至200目，得含蛋白粉末粒；
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将65％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:5比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与尿素按照质量比10:2充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒50g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入磷质子酸-尿素复合液100mL,在70℃条件下搅拌4小时得到蛋白溶解液，加入1000mL水稀释，再搅拌加入10g过氧化氢，在90℃条件下反应1小时，然后加入氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在60℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。过滤除杂包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为40.6g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为88.6g/L、平均分子量为1220道尔顿。
实施例4采用猪皮制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将猪皮脱去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至200目，得含蛋白粉末粒。
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将65％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:10比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与尿素按照质量比10:5充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒50g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入含磷质子酸-尿素复合液100mL，在90℃条件下搅拌2小时得到酯化母液，加入200mL水稀释，再搅拌加入25g过氧化钙，在90℃条件下反应1小时，然后加入氢氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在70℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。过滤除杂包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为50.1g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为85.8g/L、平均分子量为1650道尔顿。
实施例5采用鱿鱼皮制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将鱿鱼皮脱去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至200目，得到含蛋白粉末粒。
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将65％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:5比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与尿素按照质量比10:3充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒20g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入含磷质子酸-尿素复合液100mL,在80℃条件下搅拌4小时得到蛋白溶解液，加入200mL水稀释，再搅拌加入10g过氧化钙，在95℃条件下反应0.5小时，然后加入氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在60℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。对得到的肽钙生物刺激素液体肥料进行进一步过滤除杂，包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为21.9g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为35g/L、平均分子量为1030道尔顿。
实施例6采用罗非鱼皮制备肽钙生物刺激素的方法
(1)粉碎废弃物：将鱿鱼皮脱去70％水分，并粗粉碎，然后用胶体磨将其粉碎至200目，得到含蛋白粉末粒。
(2)含磷质子酸-尿素复合液制备：将55％正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:5比例混合得到含磷质子酸，将含磷质子酸与尿素按照质量比10:4充分混合制得含磷质子酸-尿素复合液。
(3)制备肽钙生物刺激素：称取步骤(1)制得的含蛋白粉末粒30g于1000mL圆底烧瓶中，搅拌条件下缓慢加入含磷质子酸-尿素复合液100mL,在80℃条件下搅拌4小时得到蛋白溶解液，加入200mL水稀释，再搅拌加入30g过氧化钙，在90℃条件下反应1小时，然后加入氢氧化钙调节PH值至3.0-4.0，并在60℃条件下络合反应3小时，得到的产物通过离心过滤得到肽钙生物刺激素液体肥料。对得到的肽钙生物刺激素液体肥料进行进一步过滤除杂，包括离心过滤、微滤或纳滤。
采用EDTA滴定法测定产品中钙含量为24.5g/L，采用高效液相色谱法测定小分子肽含量为52.9g/L、平均分子量为1250道尔顿。
实施例7-10肽钙生物刺激素用作植物功能肥实施例7.浸种处理对番茄种子萌发影响
材料：本发明实施例1中制备的肽钙生物刺激素稀释500作为功能肥方法：
(1)选取本发明实施例1制备的肽钙生物刺激素，稀释500倍后作为试验样品，将番茄种子在试验样品中浸种24h处理，以纯水浸种24h作为对照，用滤纸吸干水分，将种子均匀的置于内垫双层滤纸的直径为15cm培养皿中，置于光照培养箱中25℃下培养。每天观察种子的发芽情况，以胚芽长度达到种子长度的1/2为种子发芽的判断标准，逐日记录种子的发芽数。计算种子的发芽势和发芽率。处理组和对照组均为4个重复，每重复100粒种子。
(2)数据计算及处理
发芽率＝14d发芽的种子数/供试验种子数×100％
发芽势＝9d发芽种子数/供试验种子数×100％
所有数据均取4次重复平均值。结果表明，采用肽钙生物刺激素样品处理后的种子发芽率为96.3％，高出对照组6.8个百分点；发芽势89.9％，高出对照组3.2个百分点；说明本发明产品可显著促进番茄种子的萌发，提高种子的发芽势和发芽率，通过使用肽钙生物刺激素浸种培育壮苗具有很强的可操作性和重要的意义。
实施例8.喷施处理对番茄幼苗生长影响
材料：本发明实施例2中制备的肽钙生物刺激素稀释500作为功能肥方法：
选择生长整齐一致的温室盆栽番茄幼苗，3片复叶平展期，选取本发明实施例2制备的肽钙生物刺激素，稀释500倍后作为试验样品，并设空白对照CK作为对比，处理组和对照组各100株。采用微型立体作物喷雾机对各处理进行茎叶5次喷雾施肥处理，每次施肥间隔3d。在施肥后第14天测量各处理平均株高，处理组番茄幼苗平均株高为16.6cm，比对照组高4.5cm，且番茄植株茎粗、叶片数量及生长性状均优于对照组，结果如图1所示。
实施例9.根部灌施处理对水稻幼苗生长影响
材料：本发明实施例3中制备的肽钙生物刺激素稀释500作为功能肥方法：
选择生长整齐一致的温室盆栽水稻幼苗，四叶一心期进行水稻幼苗作苗期试验。并设空白对照CK作为对比。选取本发明实施例3中制备的肽钙生物刺激素，稀释500倍后作为试验样品，对水稻幼苗进行灌根处理，每盆用量10mL，每次用肥间隔5天。在施肥后第14天测量各处理平均株高，处理组水稻幼苗平均株高为14.2cm，比对照组高2.8cm，且水稻秧苗植株茎粗、长势一致，株高均匀，生长性状均优于对照组，结果如图2所示。
实施例10.肽钙刺激素对脐橙产量的影响
材料：
本发明实施例4中制备的肽钙生物刺激素稀释500作为功能肥
对照试剂：腐殖酸钙
方法：
(1)试验地点：赣州瑞金市黄柏乡直坑村
(2)该试验作物品种纽荷尔脐橙，10年树龄，随机选取三个实验小区，每个实验小区面积3亩，选取本发明实施例4中制备的肽钙生物刺激素，稀释500倍后作为试验样品，实验处理为：A、喷施肽钙生物刺激素，500倍液。B、喷施腐殖酸钙，500倍溶液。C、喷施等量清水作为对照(CK)。每个处理分别于春梢期、盛花后10天、幼果期、果实膨大期、去袋后(10月1日)各喷2次，其它管理措施均相同。于11月中旬果实成熟后，每个小区取20株折合计产。
实验结果表明，脐橙喷施肽钙刺激素较对照每公顷增产6108kg，增产率达14.31％；喷施腐殖酸钙增产5360kg，增产率达11％。由此可以看出肽钙生物刺激素对脐橙增产效果明显，明显高于腐植酸钙效果。且喷施液肥肽钙刺激素后后脐橙树生长优势明显，叶片浓绿，增厚，光合效能增强，春梢旺长，花芽分化数量提高，果树抗病、抗旱性能提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用含胶原质类蛋白废弃物制备植物功能肥料肽钙生物刺激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）粉碎废弃物：将含胶原质类蛋白废弃物脱水后粉碎，得到含蛋白粉末；
（2）溶解：将所得含蛋白粉末与含磷质子酸-尿素复合液按质量比1:2～5比
例混合，在60～90℃下搅拌2～4小时直至溶解得到蛋白溶解液；
所述含胶原质类蛋白废弃物为以胶原蛋白为主体的动物加工制品的下脚料；
所述含磷质子酸-尿素复合液为所述含磷质子酸与尿素按照质量比10:2～5混合所得；
所述含磷质子酸为浓度55%-65%的正磷酸与多聚磷酸按照质量比1:5～10混合所得；
（3）催化降解：稀释所述蛋白溶解液，然后加入含原子氧催化剂在80～95℃温度下，进行催化降解0.5～2.0小时；所述蛋白溶解液被稀释2-10倍，所述催化剂与所述含蛋白粉末质量比为1:1～5，所述含原子氧催化剂为过氧化钙、过氧化钾或过氧化氢中的一种；
（4）中和络合：加入碱性钙中和pH值至3.0～4.0，在50～70℃络合反应2～4小时，过滤得到液态肽钙生物刺激素；所述碱性钙为氢氧化钙或氧化钙，或氢氧化钙与氧化钙按任意比例的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白粉末为150～200目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）溶解，在70～90℃下搅拌溶解2～4小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述催化剂与所述含蛋白粉末质量比为1:2；
所述步骤（4）中在60-70℃络合反应2～4小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对得到的液态肽钙生物刺激素进行过滤除杂，所述过滤除杂方法包括离心过滤、微滤或纳滤。
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