CN111406214A - 汗液恶臭的抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于筛选具有防止、治疗或减少体表恶臭发展能力的化合物的方法。特别地,该方法筛选具有防止由引起恶臭的挥发性酸化合物和/或引起恶臭的挥发性硫化合物引起的汗臭味发展的化合物。本发明基于一种灵敏的分析方法,以确定汗液中存在的引起恶臭的挥发性酸化合物和/或引起恶臭的挥发性硫化合物的前体的存在,所述前体的存在是由于细菌例如棒状杆菌或葡萄球菌代谢而产生引起恶臭的挥发性酸化合物以及引起恶臭的挥发性硫化合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月10日提交的国际专利申请PCT/CN2018/072100的优先权,其全部内容通过引用整体并入于此。
技术领域
本发明涉及筛选具有防止、治疗或减少体表上恶臭发展能力的化合物的方法。特别地,该方法筛选具有防止由引起恶臭的挥发性酸化合物和/或引起恶臭的挥发性硫化合物导致的汗臭味发展的化合物。本发明基于一种灵敏的分析方法,以确定汗液中存在的由挥发性酸化合物引起的恶臭和/或挥发性硫化合物引起的恶臭的前体的存在,所述前体被细菌,例如棒状杆菌(Cornybacteria)或葡萄球菌(Staphylococci)代谢而产生引起恶臭的挥发性酸化合物和引起恶臭的挥发性硫化合物。
背景技术
预防腋臭是科学努力的永恒目标。从顶泌汗腺分泌的汗水是无味的。然而,腋臭是由于某些细菌菌株的代谢活动发展而来的,这些细菌已进化为存活于腋窝中、并且非常适合在顶泌汗液中发现的无味前体的奇特混合物上生长。
然后,一种确定汗液中存在的引起恶臭的挥发性酸化合物和/或引起恶臭的挥发性硫化合物的前体的分析方法可以用于更有效地对抗受试者的腋臭的发展,例如,通过提供有效的筛选方法来抑制引起恶臭的挥发性酸化合物和/或引起恶臭的挥发性硫化合物形成的化合物。
发明内容
一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从受试者的腋窝的顶部空间收集包含至少一种引起恶臭的挥发性化合物的样品;
c.将所收集的样品吸附到吸附剂材料上;和
d.在已吸附的所收集的样品中,确定至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量,该挥发性化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)、以及3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过热解吸GC/MS进行的,并且
其中,与从未经治疗的受试者收集到的样品中的至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量较低,则该测试化合物防止、治疗或减少体表恶臭发展。
一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从获自受试者的衣物样品中收集包含至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的样品;
c.用溶剂从所收集的受试者的衣物样品中提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
d.形成该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯;
e.提取该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯,从而形成已提取的样品,和
f.在已提取的样品中,确定至少一种由恶臭引起的挥发性酸化合物的酯的量,该化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)和3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过GC-MS/MS进行的,并且
其中,与从未经治疗的受试者收集到的样品中的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的酯的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的酯的量较低,则则测试化合物防止、治疗或减少体表上恶臭的发展。
附图说明
图1显示了根据本发明提出的一些形态,通过来自棒状杆菌(Corynebacteria)的锌依赖性氨酰基酶或来自葡萄球菌(Staphylococci)的β-裂合酶的作用,从它们各自的前体形成的引起恶臭的挥发性化合物3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)的示意图。
图2显示了使用常规方法获得的3M2H样品的三个重复GC-MS/MS色谱图。
图3显示了根据本发明提出的一些形态的检测装置。在一些实施方案中,与附图中的描述不同,采样单元直接与皮肤接触,而不与衬衫接触。
图4显示了根据本发明提出的方法获得的代表性色谱图。
图5显出了根据本发明提出的一些形态的检测装置和方法。
图6显示了根据本发明提出的方法获得的代表性色谱图。
图7显示了根据本发明提出的方法获得的代表性重复色谱图。
图8显示了根据本发明提出的方法获得的代表性色谱图。
具体实施方式
在下面的描述中,参考了可以实践的特定实施例,其通过说明的方式示出。对这些实施例进行了详细描述,以使本领域技术人员能够实践本文所述的发明,并且应当理解,在不脱离本发明呈现的方面的范围的情况下,可以利用其他实施例并且可以进行逻辑改变。因此,示例实施例的以下描述不应被理解为限制性的,并且本发明提出的各个形态的范围由所附权利要求限定。
提供摘要以符合37C.F.R.§1.72(b)允许读者快速确定技术内容的性质和要旨。提交摘要时应理解为不会被用来解释或限制权利要求的范围或含义。
根据本发明提出的一些形态的检测方法:
参考图1,汗液包含某些无味的前体化合物,其包含谷氨酰胺的共轭物,或者在3-甲基-3-巯基己-1-醇的情况下,为3-甲基-3-巯基己-1-醇的半胱氨酸甘氨酸-S-共轭物。存在于受试者皮肤表面的细菌,例如棒状杆菌或葡萄球菌,将无味的前体化合物代谢为3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH),导致恶臭的形成。该新陈代谢由来自棒杆菌属的锌依赖性氨酰基酶或来自葡萄球菌的β-裂合酶催化。
不受限于任何特定理论,3M2H和HMHA的气味检测阈值很低(3M2H:挥发性-40μg/L,ODT-1.44~2.59x10-4μg/L;HMHA:挥发性–0.29μg/L,ODT–1.49~2.00x10-4μg/L)。因此,即使仅少量存在3M2H或HMHA,受试者也会感觉到强烈的恶臭。
不受限于任何特定理论,确定汗液中存在的引起恶臭的挥发性酸化合物的前体的存在的分析方法可用于,例如通过提供有效的筛选方法来抑制受试者中引起恶臭的挥发性酸化合物的形成。参照图2,用于检测3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)的现有方法的重现性和/或灵敏度是低的。导致重现性和/或灵敏度差的因素包括但不限于将引起恶臭的挥发性酸化合物吸附到检测装置上、汗液中存在少量等。图2显示了常规方法的重现性差,这可能是样品吸附到仪器金属表面上的结果。
本发明提供了分析方法,其通过减少引起恶臭的挥发性化合物在检测装置上的吸附提高了检测3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)的方法的灵敏度。本发明提供了直接检测和定量引起恶臭的挥发性化合物的两种方法。如本发明所用,术语“引起恶臭的挥发性化合物”包括酸,3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)(在本文中称为“引起恶臭的挥发性酸化合物”),以及3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)(在本文中称为“引起恶臭的挥发性硫化合物)”。
在一个形态中,本发明提供了一种方法,该方法通过具有选定的离子监测(SIM)模式的热解吸GC-MS直接检测和量化来自受试者腋窝顶部空间的引起挥发性恶臭的挥发性化合物。在另一个形态中,本发明提供了一种方法,该方法直接从受试者的衣物、或棉签或其他用于从受试者身上收集汗液样本的吸收性材料中检测并定量引起挥发性恶臭的挥发性酸化合物,其中通过GC-MS/MS对引起挥发性恶臭的挥发性酸化合物进行富集、衍生和定量。
在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~100ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~90ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~80ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~70ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~60ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~50ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~40ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~30ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~20ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~10ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~9ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~8ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~7ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~6ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~5ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~4ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~3ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~2ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.5~1ng的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性化合物。
在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~5μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~4μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~3μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~2μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~1μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.9μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.8μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.7μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.6μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.5μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.4μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.3μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.2μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.1μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.09μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.08μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.07μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.06μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.05μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.04μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.03μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。在一些形态中,本文提出的方法能够以0.01~0.02μg/ml的浓度检测至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。
在一些形态中,所述至少一种引起恶臭的挥发性化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)构成的群组中选出。
适用于通过本文介绍的方法检测的其他引起恶臭的挥发性化合物包括:C6-C11脂肪酸、(Z)-3-甲基-2-己酸(Z3M2H)、US 9,101,783公开的引起恶臭的挥发性酸化合物以及在国际专利申请公开WO 2006/079934A1中公开的引起恶臭的挥发性酸化合物。
在一些形态中,引起恶臭的挥发性酸化合物为3M2H。
在一些形态中,引起恶臭的挥发性酸化合物是HMHA。
在一些形态中,引起恶臭的挥发性硫化合物是MSH。
检测方法:参照实施例1、图3和图4,在一些形态中,本发明提供了一种方法,
其中该方法检测获自受试者的样品中的至少一种引起恶臭的挥发性化合物,
其中,该方法包括以下步骤:
a.从受试者的腋窝的顶部空间收集包含至少一种引起恶臭的挥发性化合物的样品;
b.将所收集的样品吸附到吸附剂材料上;和
c.在已吸附的所收集的样品中,确定至少一种从由3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)、以及3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)构成的群组中选出的引起恶臭的挥发性化合物的量,
其中确定步骤是通过热解吸GC/MS进行的。
参考图3,在一些形态中,使用采样设备收集包含至少一种引起恶臭的挥发性化合物的样品,该采样设备包括采样单元和空气泵,该采样单元具有开口端、包含吸附树脂的采样管,该采样管流体连接至采样单元,且其末端远离开口端,该空气泵被构造为通过采样单元和采样管吸入空气。在收集期间,受试者将采样单元放置在其腋窝下,采样单元的开口端与受试者的皮肤表面紧密接触。
在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达60分钟。
在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸15~60分钟。
在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达60分钟。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达50分钟。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达40分钟。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达30分钟。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达20分钟。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气被抽吸达10分钟。
在一些形态中,通过采样单元和采样管空气以100~200mL/min的速率吸入。在一些形态中,通过采样单元和采样管空气以150mL/min的速率吸入。
在一些形态中,重复收集步骤。可以在受试者的同一侧腋窝上重复该步骤,或者,在受试者的另一侧腋窝上重复该步骤。
在一些形态中,使用防止、减少或抑制所述至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物吸附到采样单元表面的试剂处理采样单元和/或采样管的表面。在一些形态中,该处理包括使表面与5%v/v的二氯二甲基硅烷(DMDCS)在甲苯中的溶液接触15分钟,然后用甲苯冲洗至少一次。
在一些形态中,吸附剂材料包括被构造为捕获挥发性化合物的材料,例如吸附剂树脂、玻璃棉、玻璃珠等。
在一些形态中,吸附剂材料包含从由:以商标名TENAX TA出售的吸附剂树脂、以商标名TENAX GR出售的吸附剂树脂、以商标名CARBOTRAP出售的吸附剂树脂、以商标名CARBOTRAP C出售的吸附剂树脂、以商标名CARBOSIEVE SIII出售的吸附剂树脂、以商标名CARBOXEN 569出售的吸附剂树脂构成的群组中选出的吸附剂树脂。
在一些形态中,吸附剂材料为以商标名TENAX TA出售的吸附剂树脂。
在一些形态中,吸附剂材料被预处理。预处理可能会增加检测方法的灵敏度。在一些形态中,预处理可以减少、防止或降低至少一种引起恶臭的挥发性化合物在采样单元和/或采样管的表面上的吸附。
在一些形态中,预处理包括第一处理,其使用试剂进行防止、减少或抑制至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物吸附到采样单元和/或采样管表面,随后进行第二处理。在一些形态中,第一处理包括使吸附剂材料与5%v/v的二氯二甲基硅烷(DMDCS)在甲苯中的溶液接触15分钟,然后用甲苯冲洗至少一次。
在一些形态中,在第一处理之后,使用惰性气体如N2干燥吸附剂材料。在一些形态中,第二处理包括用丙酮处理干燥的吸附剂材料,然后使用惰性气体进行干燥步骤。
在一些形态中,使用丙酮对吸附剂材料进行预处理,然后使用惰性气体如N2进行干燥步骤。
采样单元可由本领域普通技术人员容易选择的任何材料制成,例如玻璃、不锈钢等。
在一些形态中,通过热解吸GC/MS执行确定步骤,其中将所收集的样品通过分析色谱柱,并且通过选择的离子监测(SIM)模式对至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物进行定量。在一些形态中,将所收集的样品通过DB-wax色谱柱。或者,将所收集的样品通过DB-1、DB-5、DB-17、DB-23或DB-FFAP色谱柱。代表性色谱图如图4所示。
参照实施例2和图5,在一些形态中,本发明提供了一种方法,
其中该方法检测获自受试者的样品中的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物,
其中,该方法包括以下步骤:
a.从获自受试者的衣物样品中收集包含至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的样品;
b.使用溶剂从所收集的受试者的衣物样品中提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
c.形成该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯;
d.提取该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯,从而形成所提取的样品,和
e.在所提取的样品中,确定至少一种由恶臭引起的挥发性酸化合物的酯的量,该化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)和3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过GC-MS/MS进行的。
参照图5,在一些形态中,通过包括以下步骤的方法从受试者的衣物中提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物:
a.收集受试者所穿衣物的腋下部分;和
b.在溶剂中超声处理收集的衣物部分,从而获得已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。
在一些形态中,通过包括以下步骤的方法从诸如棉签等的吸附垫中提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。
a.将吸附垫施用于受试者皮肤的区域上足够长的时间,以收集受试者的汗液样品;和
b.在溶剂中超声处理含有受试者汗液样品的吸附垫,从而获得已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物。
在一些形态中,所述溶剂为在水中的5%v/v乙醇溶液。
在一些形态中,调节已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的pH,以确保所述至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物为阴离子。在一些形态中,pH范围为pH 5.6~pH9。
在一些形态中,将已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物用缓冲液进一步处理,从而将已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的pH调节至pH 7。在一些形态中,缓冲液为50mM醋酸钠。
在一些形态中,将已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物施用于阴离子交换树脂。在一些形态中,在施加已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物之前,对阴离子交换树脂进行预处理。
在一些形态中,所述预处理包括用甲醇,然后用乙醇处理。
在一些形态中,阴离子交换树脂从由以商标名SPE出售的阴离子交换树脂、以商标名SAMPLIQ SAX出售的阴离子交换树脂、以商标名SAMPLIQ SAX出售的阴离子交换树脂、以商标名PHENOMENEX STRATA-XA出售的阴离子交换树脂、以商标名Agilent SAMPLIQ SAX出售的阴离子交换树脂、以商标名HYPERSEP SAX出售的阴离子交换树脂构成的群组中选出。
在一些形态中,阴离子交换树脂可以是具有与以商标名SPE出售的阴离子交换树脂相似的阴离子交换基团的任何阴离子交换树脂。
在一些形态中,已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物可以转化为甲基酯、乙基酯、丙基酯或丁基酯。在这些方面,可以使已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物与BF3和从甲醇、乙醇、丙醇和丁醇构成的群组中选出的醇反应。
在一些形态中,通过一种方法来实现已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物与BF3/醇的反应,该方法包括以下步骤:
a.在将已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物施用于SPE滤筒后,用2mL50mM醋酸钠洗涤该滤筒;
b.用6mL醇,然后用6mL醇和2%三氟乙酸(TFA)洗脱所述已被施用的已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
c.收集洗脱液;
d.用2mL三氟化硼(14%w/w)处理收集的洗脱液;
e.在连续搅拌下将处理过的洗脱液在60℃下培养3小时;
f.将所述培养的洗脱液冷却至室温,并通过向冷却的洗脱液中加入1ml水来终止反应;和
g.中和TFA,并通过添加0.5M NaHCO3将培养的洗脱液的pH范围调节至pH 6~pH7。
在一些形态中,通过一种方法来实现已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物与BF3/甲醇的反应,该方法包括以下步骤:
a.在将已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物施用于SPE滤筒后,用2mL50mM醋酸钠洗涤该滤筒;
b.用6mL MeOH,然后用6mL MeOH和2%三氟乙酸(TFA)洗脱所述已被施用的已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
c.收集洗脱液;
d.用2mL三氟化硼(14%w/w)处理所收集的洗脱液;
e.在连续搅拌下将处理过的洗脱液在60℃下培养3小时;
f.将经培养的洗脱液冷却至室温,并通过向冷却的洗脱液中加入1ml水来终止反应;和
g.中和TFA,并通过添加0.5M NaHCO3将经培养的洗出液的pH调节至pH 6~pH 7。
在一些形态中,所述已被施用的已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的洗脱可以通过乙醇或乙腈进行。
在一些形态中,所述已被施用的已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物以3~9mL的体积被洗脱。
在一些形态中,TFA的浓度为1~5%v/v。
在一些形态中,可以用甲酸或乙酸处理所收集的洗脱液。
在一些形态中,所收集的洗脱液具有1~5mL的三氟化硼(14%w/w)。
在一些形态中,通过添加2×10ml CH2Cl2来提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯。
在一些形态中,通过添加从由戊烷、庚烷和环己烷构成的群组中选出的溶剂来萃取所述至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯。
在一些形态中,培养时间为0.5小时~5小时。
在一些形态中,在使用GC-MS/MS进行分析之前,将所述已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯浓缩至最终体积为5mL。在一些形态中,GC-MS/MS处于优化的MRM转换之下。
在一些形态中,将所述已提取的至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯在惰性气体如N2下浓缩。
在一些形态中,确定步骤是通过GC/MS/MS进行的,其中使已收集的样品通过分析色谱柱,并且通过优化的MRM转换对所述至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯进行定量。在一些形态中,将已收集的样品通过DB-wax色谱柱。或者,将所收集的样品通过DB-1、DB-5、DB-17、DB-23或DB-FFAP色谱柱。使用合成体味获得的代表性色谱图如图6所示。重复色谱图如图7所示。
根据本发明提出的一些形态的筛选方法:
在一些形态中,本发明提供了一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从受试者的腋窝的顶部空间收集包含至少一种引起恶臭的挥发性化合物的样品;
c.将所收集的样品吸附到吸附剂材料上;和
d.在已吸附的所收集的样品中,确定至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量,所述挥发性化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过热解吸GC/MS进行的,并且
其中与从未经治疗的受试者收集到的样品中的所述至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量较低,则该测试化合物防止、治疗或减少体表上恶臭的发展。
在一些形态中,本发明提供了一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从获自受试者的衣物样品中收集包含至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的样品;
c.用溶剂从所收集的受试者的衣物样品中提取至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
d.形成该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯;
e.提取该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯,从而形成已提取的样品,和
f.在已提取的样品中,确定至少一种由恶臭引起的挥发性酸化合物的酯的量,该化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)和3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过GC-MS/MS进行的,和
其中与从未经治疗的受试者收集到的样品中的该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的酯的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的量较低,则该测试化合物防止、治疗或减少体表上恶臭的发展。
在一些形态中,测试化合物可以是美国专利9,101,783中公开的测试化合物。
在一些形态中,测试化合物可以是国际专利申请公开号WO 2006/079934A1中公开的测试化合物。
最好地说明了本发明,但本发明不限于以下实施例。
实施例
实施例1:来自个体受试者的引起恶臭的挥发性化合物的定量
使采样管和采样单元失活:将采样管和玻璃棉浸入到5%(v/v)的二氯二甲基硅烷(DMDCS)的甲苯溶液中15分钟,然后用甲苯冲洗两次。然后将漂洗的物品在甲醇中浸泡15分钟,之后用甲醇漂洗两次,然后用N2干燥。然后将吸附材料(例如TENAX)用丙酮冲洗,并用高纯度N2干燥。
使用顶空采样单元收集引起恶臭的挥发性化合物(图3)。参照图3,顶空采样单元的一侧与Tenax捕集阱相连,该捕集阱由真空泵泵出。受试者将采样单元紧紧地放在一个腋下,并从一侧以150mL/min的空气流速泵送20分钟,然后再从另一侧腋下泵送20分钟。
热解吸GC/MS在配备有OPTIC 4热解吸模块的7890A/5975C(Agilent)上进行。将已解吸的化合物在-50℃下冷冻聚焦在OPTIC 4中。解吸后,在60℃/s将OPTIC 4从-50℃程序升温到250℃(保持400sec),以将所捕获的化合物注入到DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm内径×0.25μm膜厚,J&W Scientific,Agilent Technologies,Foster City,CA)。DB-WAX色谱柱使用以下温度程序:50℃(保持7分钟),50℃~250℃(10℃/min,保持2分钟)。质谱仪的离子源温度为230℃,传输线温度为250℃。氦气以1mL/min的恒定流速用作运载气体,分流设置为10mL/min。
校准曲线,LOD,LOQ和再现性:通过热解吸GC/MS用E3M2H的选定的碎片离子100、113和128分析吸附样品中引起恶臭的挥发性酸化合物。使用具有外部标准曲线的所选离子100的面积对E3M2H进行定量,该离子由一系列0.5、1、2、5、10、20、30和50ng样品组成。标准曲线如下:y=126903x–140318,R2=0.9963。该分析方法灵敏度高,LOD和LOQ分别为0.2ng和0.5ng(表1)。该方法的重现性通过定量从标准溶液中释放的E3M2H进行评估。从其标准溶液和1:1稀释的E3M2H标准溶液样品中散发的E3M2H分别定量为26.5±3.7ng(n=6)和11.2±3.6ng(n=6)(表1)。
表1:通过顶空GC-MS分析的释放的E3M2H的LOD、LOQ、动态范围和重现性
通过顶空采样捕获了来自9名白人受试者的释放的E3M2H,并通过具有SIM模式的热解吸GC-MS进行了分析。该受试者释放的引起腋臭的挥发性酸化合物的色谱图如图4所示。除受试者6和受试者8之外,在6位受试者中检测到释放的E3M2H(表2)。在六个检测到的受试者中释放的E3M2H范围为0.72ng~30.52ng。
表2:受试者释放的E3M2H的量(ng)
受试者 | 性别 | 释放的E3M2H(ng) |
1 | 女 | 2.56 |
2 | 女 | 0.72 |
3 | 男 | 1.16 |
4 | 女 | 20.07 |
5 | 男 | 1.75 |
6 | 女 | ND |
7 | 男 | 30.52 |
8 | 女 | ND |
9 | 男 | 3.52 |
实施例2:来自个体受试者的衣物的引起恶臭的挥发性酸化合物的定量
受试者穿着洗过的白色棉质T恤24小时,并被要求在穿着T恤之前使用特定的沐浴露和非抗菌滚装产品。从破旧的T恤上切下一个大约10cm长×10cm宽的腋下区域,然后在20mL 5%EtOH中超声处理30分钟。
用50mM醋酸钠将萃取液的pH调节至7,然后装载到SPE滤筒(6cc/500mg,Oasis MAX滤筒,Waters,MA)上。在使用前,用10mL MeOH和15mL 5%EtOH(v/v)的水(调节至pH 7)对滤筒进行调节。
将滤筒用2mL 50mM醋酸钠洗涤,然后用6mL MeOH洗脱引起恶臭的挥发性酸化合物,之后再用6mL MeOH和2%(v/v)三氟乙酸(TFA)洗脱引起恶臭的挥发性酸化合物。然后用2mL三氟化硼(14%w/w)衍生来自6mL MeOH和2%TFA的洗脱液,并在连续搅拌下于60℃加热3小时。然后将反应冷却至室温,并添加1mL水以终止反应。
加入10mL 0.5M NaHCO3中和TFA(pH 6~7)。将E3M2H和HMHA甲酯用10mL CH2Cl2萃取两次,并在N2下浓缩至5mL,用于具有优化MRM转换的GC-MS/MS分析。
动态范围、LOD、LOQ、重现性和回收率:目标化合物E3M2H甲酯和HMHA甲酯用外标曲线定量,该外标曲线由一系列0.01、0.1、0.5、1和5μg/mL组成。E3M2H甲酯和HMHA甲酯的校准曲线分别为y=28080x-108.88,R2=0.9999,以及y=200203x-2262,R2=0.9999,其工作范围均为0.01~5μg/mL(表3)。E3M2H甲酯和HMHA甲酯的LOD和LOQ均为0.005μg/mL和0.01μg/mL(表3)。E3M2H和HMHA的灵敏度很高。
为了研究回收率,将0.5μg、1μg和5μg E3M2H和HMHA添加到T恤衫上。每个实验重复三次,标准偏差的回收率列于表4。E3M2H的回收率在93±7%~103±4%的范围内,HMHA的回收率在85±2%~88±4%的范围内(表4)。
准确称量10mg E3M2H甲酯和10mg HMHA甲酯样品,并将其转移到50mL容量瓶中。将样品溶解在30mL二氯甲烷中,将体积补足至50mL(200μg/mL储备液A)。将10mL的200μg/mL的储备液A稀释至20mL得到100μg/mL的储备液B。,将5mL的100μg/mL的储备液B稀释至50mL得到10μg/mL的储备液C。将10mL和5mL的10μg/mL储备液C分别稀释至20mL和50mL,以获得5μg/mL和1μg/mL的标准溶液。将10mL和5mL的1μg/mL标准溶液分别稀释至20mL和50mL,以获得0.5μg/mL和0.1μg/mL的标准溶液。将10mL和5mL的0.1μg/mL标准溶液分别稀释至20mL和50mL,以获得0.05μg/mL和0.01μg/mL的标准溶液。10mL的0.01μg/mL标准溶液稀释至20mL对于0.005μg/mL的标准溶液。
在GCMS TQ8030(Shimazu)上进行GC-MS/MS分析。使用DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm内径×0.25μm膜厚,J&W Scientific,Agilent Technologies,Foster City,CA)实现分离。DB-WAX色谱柱使用以下温度程序:50℃(保持1分钟)、50℃-250℃(25℃/min,保持1分钟)。GC的进样器温度为250℃,在不分流模式下进样量为1μL。质谱仪的离子源温度为200℃,传输线被加热到230℃。氦气以1.0mL/min的恒定流速用作载气。以MRM模式获取数据,MRM参数如下所示。
表3:GC-MS/MS测定的E3M2H甲酯和HMHA甲酯的LOD、LOQ和动态范围(μg/mL)
化合物 | LOD | LOQ | 动态范围 | 方程式 | R<sup>2</sup> |
E3M2H甲酯 | 0.005 | 0.01 | 0.01-5 | y=28080x-108.88 | 0.9999 |
HMHA甲酯 | 0.005 | 0.01 | 0.01-5 | y=200203x-2262 | 0.9999 |
表4:E3M2H和HMHA的回收率
感官评估:对受试者穿了24小时的T恤进行嗅闻,并评估腋臭的强度。强度描述如下:1.没有不好的气味;2.几乎闻不到臭味;3.极弱的臭味;4.臭味微弱;5.中度恶臭;6.强烈的恶臭;7.非常强烈的恶臭。E3M2H和HMHA的含量通常呈正相关,并与感官评估相一致。
E3M2H和HMHA由9名白人受试者从穿着的T恤衫的一侧定量,结果示于表5。图8示出了吸附在受试者的T恤衫上的腋臭的MRM色谱图。从所有9位白人受试者中检测到E3M2H和HMHA。9名受试者从穿着的T恤衫的一侧开始,E3M2H的范围为0.1μg~3.5μg,而HMHA的范围为0.2μg~9.8μg。为了比较9位受试者的顶空和T恤衫的收集结果,当受试者穿着T恤衫24小时后,应通过顶空迅速地收集腋臭化合物。除受试者7外(表2和表5),单个受试者通过顶空释放的高E3M2H也显示出大量的E3M2H吸附在T恤衫上。受试者7的T恤宽松,大多数腋酸没有保留在T恤上,不能很好地代表其含量。
表5:从T恤衫检测到并从腋窝释放的E3M2H和HMHA的含量
本文通篇所引用的出版物通过引用整体并入于此。尽管上面已经参考实施例和优选实施方案说明了本发明的各个形态,但是应当理解,本发明的范围并不由前述描述所限定,而是在专利法的原则下由适当解释的所附权利要求所限定。
Claims (2)
1.一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从受试者的腋窝的顶空收集包含至少一种引起恶臭的挥发性化合物的样品;
c.将所收集的样品吸附到吸附剂材料上;和
d.在已吸附的所收集的样品中,确定该至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量,该挥发性化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)、3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)和3-甲基-3-巯基己-1-醇(MSH)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过热解吸GC/MS进行的,并且
其中,与从未经治疗的受试者收集到的样品中的该至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性化合物的量较低,则该测试化合物防止、治疗或减少体表上恶臭的发展。
2.一种方法,
其中该方法鉴定具有防止、治疗或减少体表恶臭的发展的能力的化合物,该方法包括以下步骤:
a.使受试者与测试化合物接触;
b.从获自受试者的衣物样品中收集包含至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的样品;
c.用溶剂从所收集的衣物中提取该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物;
d.形成该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯;
e.提取该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的酯,从而形成已提取的样品,和
f.在已提取的样品中,确定该至少一种由恶臭引起的挥发性酸化合物的酯的量,该化合物从由3-甲基-2-己酸(3M2H)和3-羟基-3-甲基己酸(HMHA)构成的群组中选出,
其中确定步骤是通过GC-MS/MS进行的,并且
其中,与从未经治疗的受试者收集到的样品中的该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的酯的量相比,如果该至少一种引起恶臭的挥发性酸化合物的已提取的酯的量较低,则该测试化合物防止、治疗或减少体表上恶臭的发展。
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